© Alice Anaïs Varlet, 2018

Analyse fonctionnelle du remodelage des structures à base d'actine qui dirigent la division cellulaire par le

complexe chaperon HSPB8-BAG3

Thèse

Alice Anaïs Varlet

Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire

Philosophiæ doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

Analyse fonctionnelle du remodelage des structures à base d’actine qui dirigent la division cellulaire par le

complexe chaperon HSPB8-BAG3

Thèse

Alice-Anaïs Varlet

Sous la direction de :

Josée N. Lavoie, directrice de recherche

i

Résumé

Les changements dans la forme des cellules sont essentiels à de nombreux processus qui

déterminent le destin de la cellule, notamment la division cellulaire. Ils sont orchestrés par

le remodelage de structures mécanosensibles à base d’actine contrôlant la tension

cellulaire. Les évidences récentes laissent croire que le contrôle de qualité des protéines

pourrait contribuer à la régulation spatiotemporelle du remodelage des structures d’actine

par des mécanismes de séquestration, de recyclage et de dégradation protéiques. Les

chaperons moléculaires de la famille des HSPB apparaissent comme des modulateurs des

structures à base d’actine en conditions physiologiques. Durant un stress protéotoxique,

ces protéines séquestrent des composantes cellulaires endommagées afin de prévenir leur

agrégation. Bien que leur implication dans différentes pathologies soit démontrée, le mode

d’action des HSPB demeure encore peu compris. Les travaux effectués dans le cadre de

cette thèse adressent l’hypothèse centrale que le complexe chaperon formé d’HSPB8 et de

son co-chaperon BAG3 régule le remodelage des structures à base d’actine qui dirigent la

division cellulaire.

Nos travaux ont établi que lors de la mitose, BAG3, d’une manière dépendante de son

association avec HSPB8, facilite l’arrondissement mitotique requis pour le positionnement

du fuseau et la ségrégation adéquate des chromosomes. Nous montrons que la réduction

des niveaux d’HSPB8 ou de BAG3 interfère également avec le désassemblage de l’anneau

contractile d’actomyosine et l’abscission des cellules filles lors de la cytokinèse. Cet effet

est corrélé avec une augmentation de la prévalence de cellules multi-nucléées, laquelle est

restaurée à des niveaux contrôles par des drogues qui normalisent la dynamique de l’actine

dans les cellules déplétées en HSPB8. Ceci établit un lien de cause à effet entre la

dérégulation de la dynamique de l’actine et les défauts de division cellulaire observés dans

ces cellules. De plus, l’inhibition du désassemblage de l’anneau d’actomyosine est corrigée

par la rapamycine, une drogue qui active la dégradation par autophagie. Inversement, ce

phénotype est reproduit par les cellules contrôles traitées avec des drogues qui réduisent le

flux autophagique. Ces observations suggèrent que la régulation de la morphodynamique

mitotique par HSPB8-BAG3 impliquerait sa fonction dans l’autophagie sélective. En outre,

ii

pendant la mitose et la cytokinèse, HSPB8-BAG3 limiterait la polymérisation de l’actine

branchée. Notamment, HSPB8-BAG3 semble faciliter l’arrondissement mitotique et la

dynamique d’un réseau sous-cortical d’actine qui dépend d’Arp2/3, en modulant la

déacétylase HDAC6 et son substrat la cortactine, tous deux intervenants dans les processus

d’autophagie sélective.

L’ensemble de ces travaux contribue à une meilleure compréhension des mécanismes par

lesquels le complexe chaperon HSPB8-BAG3 facilite les transitions dans la forme des

cellules qui contrôlent des fonctions essentielles, notamment la division cellulaire. Ils

identifient de nouvelles cibles cellulaires du complexe chaperon impliquées dans le

remodelage des structures à base d’actine, lesquelles pourraient contribuer au

développement de pathologies associées avec une dérégulation du complexe, notamment à

la progression tumorale.

iii

Abstract

Changes in cell shape are essential to key cellular processes that determine the cell fate,

including cell division. They are orchestrated by the remodeling of mechanosensitive actin-

based structures guiding cellular tension. Recent data suggest that protein quality control

may contribute to the spatiotemporal remodeling of actin-based structures through protein

sequestration, recycling and degradation mechanisms. Incidentally, the molecular

chaperones of the HSPB family appear as modulator of actin-based structures under

physiological processes. These proteins are known to sequester damaged cellular

constituents to prevent their toxic aggregation during proteotoxic stress. Whilst their

implications in human pathologies have been clearly established, their mode of action is

still poorly understood. The work presented in this thesis addresses the central hypothesis

that the chaperone complex formed by HSPB8 and its co-chaperone BAG3 would facilitate

the remodeling of actin-based structures, which is deemed instrumental for proper mitotic

progression.

We have shown that during mitosis, BAG3, in a manner requiring its association with

HSPB8, facilitates mitotic rounding, spindle positioning and accurate chromosomes

segregation. We further showed that depletion of HSPB8 or BAG3 silencing also interferes

with disassembly of the contractile actomyosin ring during cytokinesis, thereby impairing

daughter cells abscission. Such an effect is correlated with accumulation of multinucleated

cells, a defect which is corrected by drugs that normalize actin dynamics in HSPB8-

depleted cells. These results established a cause-effect relationship between deregulation

of actin dynamics and the cell division defects induced by HSPB8 silencing. Further, we

found that such a phenotype can be rescued by rapamycin, a drug that stimulates

autophagy, while it is recapitulated in control cells by inhibitors of autophagic degradation.

These results, and others presented in this thesis, suggest that the regulation of cell shape

remodelling by HSPB8-BAG3 may involve their function in the selective targeting of

proteins for autophagic degradation. Finally, evidence was obtained that during mitosis,

like during cytokinesis, HSPB8-BAG3 would act by limiting branched actin

polymerization. We found that HSPB8-BAG3 can modulate mitotic rounding and the

iv

dynamics of an Arp2/3-dependent subcortical actin pool that contributes to spindle

positionning, by restricting the activity of HDAC6 deacetylase maybe on its target

cortactin, both having a role in selective autophagy processes.

Together, this work contributed to a better understanding of the mechanisms by which the

chaperone complex HSPB8-BAG3 would facilitate transitions in cell shape during cell

division and uncovered novel targets of HSPB8-BAG3 that may be implicated in the

development of human disorders associated with deregulation of the chaperon complex,

notably cancer.

v

Table des matières

Résumé ................................................................................................................................ i

Abstract ............................................................................................................................. iii

Table des matières ............................................................................................................. v

Liste des tableaux .............................................................................................................. x

Liste des figures ................................................................................................................ xi

Liste des abréviations .................................................................................................... xiii

Dédicace .......................................................................................................................... xvi

Remerciements .............................................................................................................. xvii

Avant-propos ................................................................................................................... xx

1. Chapitre 1 : Introduction ......................................................................................... 1

1.1. Rôle du cytosquelette d’actine dans la réponse cellulaire aux forces mécaniques . 1 1.2. Les chaperons de la famille HSPB et la régulation de la dynamique et de

l’intégrité des structures d’actine ............................................................................................. 3 1.2.1. Le contrôle de qualité des protéines et les chaperons moléculaires ...................... 3 1.2.2. Modèle prévalent des HSPB : l’oligomérisation pour prévenir de l’agrégation

protéique 6 1.2.3. Les HSPB dans le contrôle de la dynamique de l’actine et les pathologies

associées 7 1.3. Le complexe chaperon HSPB8-BAG3 dans la régulation de structures

contractiles d’actine et de l’autophagie sélective .................................................................. 13 1.3.1. HSPB8 : un membre particulier de la famille des HSPB avec une spécificité de

substrats? 13 1.3.2. Structure et fonctions du co-chaperon BAG3 ...................................................... 15 1.3.3. Les fonctions assurées par BAG3 en tant que protéine d’échafaudage ............... 17

1.3.3.1. Le co-chaperon BAG3 module l’apoptose à travers la régulation de la stabilité de

facteurs anti-apoptotiques ................................................................................................................ 18 1.3.3.2. BAG3 régule l’adhésion, la motilité cellulaire et la transition

épithéliomésenchymateuse .............................................................................................................. 19

vi

1.3.3.3. Lien fonctionnel entre l’activité signalétique de BAG3 et son rôle en tant que co-

chaperon d’HSP70 ........................................................................................................................... 21 1.3.4. Fonctions assurées par BAG3 lors d’un stress protéotoxique ............................. 22

1.3.4.1. L’Autophagie sélective et ses déterminants p62/SQSTM1 et HDAC6 ....................... 23 1.3.4.2. BAG3 cible les protéines poly-ubiquitinées ou dénaturées à la dégradation par

autophagie sélective ......................................................................................................................... 27 1.3.5. Régulation de structures contractiles d’actine par le complexe chaperon HSPB8-

BAG3 31 1.3.5.1. BAG3 assure l’intégrité des myofibrilles musculaires grâce à sa fonction de co-

chaperon d’HSP70 ........................................................................................................................... 31 1.3.5.2. Régulation de l’intégrité du cytosquelette d’actine dépendant de l’autophagie sélective

induite par HSPB8-BAG3 dans la cellule musculaire ..................................................................... 32 1.4. Contrôle de la division cellulaire par le remodelage des structures à base d’actine

35 1.4.1. Les régulateurs de la dynamique de l’actine impliqués dans la division cellulaire

37 1.4.1.1. Le nucléateur de l’actine banchée : le complexe Arp2/3 ............................................. 37 1.4.1.2. Les formines et la formation de faisceaux d’actine ...................................................... 39 1.4.1.3. La myosine II et la contractilité cellulaire .................................................................... 40 1.4.1.4. Les Rho GTPases ......................................................................................................... 43

1.4.2. L’arrondisssement mitotique et son implication dans l’orientation du fuseau

mitotique et la ségrégation des chromosomes ....................................................................... 45 1.4.2.1. Démantèlement des adhésions focales et mise en place des fibres de rétraction ......... 48 1.4.2.2. Fonctions essentielles de RhoA et de la myosine II dans la mise en place et le maintien

de la tension corticale à l’orgine de l’arrondissement mitotique ..................................................... 49 1.4.2.3. Contrôle du positionnement du fuseau mitotique par le nuage sous-cortical d’actine et

l’implication du complexe Arp2/3 dans ce processus ..................................................................... 52 1.4.2.4. Promotion de la rigidité corticale et du positionnement du fuseau mitotique par les

protéines ERM ................................................................................................................................. 54 1.4.3. Les mécanismes de contrôle de l’anneau contractile en cytokinèse .................... 56

1.4.3.1. Spécification et formation de l’AC : un rôle crucial pour RhoA et mDia2 ................. 57 1.4.3.2. La contraction de l’anneau contractile ......................................................................... 60 1.4.3.3. Désassembler l’AC pour permettre l’abscission .......................................................... 61

1.4.4. Rôle émergeant de la dégradation ciblée de protéines comme mécanisme de

contrôle spatiotemporel du remodelage de l’actine pendant la division cellulaire ............... 65

vii

1.4.5. Un rôle pour le complexe chaperon HSPB8-BAG3 dans la dynamique de

l’actine, l’orientation du fuseau mitotique et la ségrégation des chromosomes pendant la

mitose 68 1.5. Objectifs de travail ..................................................................................................... 72

2. Chapitre 2: Fine-tuning of actin dynamics by the HSPB8-BAG3 chaperone

complex facilitates cytokinesis and contributes to its impact on cell division ........... 74

2.1. Avant-propos .............................................................................................................. 75 2.2. Résumé ........................................................................................................................ 77 2.3. Abstract ....................................................................................................................... 78 2.4. Introduction ................................................................................................................ 79 2.5. Material and methods ................................................................................................ 81

2.5.1. Cell culture, synchronization, drug treatments and siRNA experiments ............. 81 2.5.2. Transfection, infection, adenovirus and vectors .................................................. 82 2.5.3. Antibodies and chemicals .................................................................................... 82 2.5.4. Immunofluorescence and live-cell imaging ......................................................... 83 2.5.5. Western blotting ................................................................................................... 84 2.5.6. Statistical analyses ............................................................................................... 85

2.6. Results .......................................................................................................................... 85 2.6.1. Silencing of HSPB8 or BAG3 perturbs abscission of daughter cells .................. 85 2.6.2. Knockdown of HSPB8 causes abnormal F-actin accumulation at the ICB ......... 88 2.6.3. Down modulation of actin dynamics can normalize F-actin accumulation at the

ICB and correct cytokinetic defects caused by depletion of HSPB8 .................................... 92 2.6.4. Inhibition of Arp2/3 complex can normalize F-actin at the ICB in HSPB8-

depleted cells ......................................................................................................................... 95 2.6.5. Drugs that affect lysosomal function recapitulate the HSPB8-dependent

phenotype, whereas induction of autophagy signaling can restore the F-actin defects caused

by depletion of HSPB8 .......................................................................................................... 98 2.7. Discussion .................................................................................................................. 101 2.8. References ................................................................................................................. 105

3. Chapitre 3 : Le complexe chaperon HSPB8-BAG3 facilite le remodelage des

structures mitotiques à base d’actine en modulant l’activité d’HDAC6 ................. 113

viii

3.1. La déplétion de l’une ou l’autre des protéines du complexe mitotique HSPB8-

BAG3-p62/SQSTM1 interfère avec la dynamique du nuage sous-cortical d’actine qui

dépend du complexe Arp2/3 ................................................................................................. 114 3.2. De faibles doses d’un inhibiteur d’HDAC6 peut normaliser la dynamique du

nuage sous-cortical d'actine et l'arrondissement mitotique dans les cellules déplétées en

BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1 .......................................................................................... 121 3.3. L’activité d’HDAC6 et son association à la cortactine sont régulées de façon

mitose-spécifique, d’une manière qui pourrait impliquer l’intervention du complexe

chaperon HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 ............................................................................... 126 3.4. Modification du phénotype BAG3-dépendant par l’expression de mutants

cortactine acétyl-mimétique et non-acétylable ................................................................... 131 3.5. Figures supplémentaires .......................................................................................... 137 3.6. Matériel et méthode .................................................................................................. 138

3.6.1. Culture cellulaire, synchronisation, traitements et transfection de siARN ........ 138 3.6.2. Transfection, infection, vecteurs et adénovirus ................................................. 139 3.6.3. Anticorps et produits chimiques ........................................................................ 141 3.6.4. Immunoprécipitation et immunobuvardage de type « Western » ...................... 142 3.6.5. Immunofluorescences, PLA (« proximity ligation assay »), imagerie en temps

réel, microscopie et statistiques ........................................................................................... 142 3.6.6. Analyses statistiques .......................................................................................... 144

4. Chapitre 4 : Lien fonctionnel entre l’activité autophagique du complexe

chaperon HSPB8-BAG3 et la régulation de structures à base d’actine pendant la

division cellulaire .......................................................................................................... 145

4.1. La déplétion d’ATG7 récapitule les défauts de remodelage de l’actine observés

suivant la déplétion de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1 lors de la division cellulaire ... 146 4.2. La déplétion d’HSPB8 interfère avec le flux autophagique dans les cellules en

cytokinèse ............................................................................................................................... 155 4.2.1. La déplétion d’HSPB8 cause une augmentation de l’intensité et du volume des

vésicules LC3 ...................................................................................................................... 155 4.2.2. La déplétion d’HSPB8 est associée avec une accumulation de protéines poly-

ubiquitinées sur K63 dans les cellules en cytokinèse .......................................................... 160 4.3. L’inhibition d’HDAC6 normalise l’intensité et le volume des autophagosomes

ainsi que l’accumulation de F-actine au PI dans les cellules déplétées en HSPB8 .......... 164

ix

4.4. Matériel et méthode .................................................................................................. 170 4.4.1. Culture cellulaire, synchronisation, traitements et transfection de siARN ........ 170 4.4.2. Anticorps et drogues .......................................................................................... 171 4.4.3. Immunobuvardage de type « Western » ............................................................ 171 4.4.4. Immunofluorescence, microscopie et analyses statistiques ............................... 172

5. Chapitre 5 : Discussion ......................................................................................... 174

5.1. HSPB8-BAG3 agit en limitant la polymérisation de l’actine et/ou en stimulant son

renouvellement pendant la division cellulaire .................................................................... 174 5.2. Le complexe HSPB8-BAG3 facilite le remodelage des structures mitotiques à base

d’actine à travers la modulation d’HDAC6 ........................................................................ 179 5.3. Implication potentielle de l’autophagie sélective dépendante d’HSPB8-BAG3

dans la progression de la division cellulaire ........................................................................ 182

6. Conclusion ............................................................................................................. 186

7. Bibliographie ......................................................................................................... 187

8. Annexes .................................................................................................................. 259

8.1. Annexe 1 .................................................................................................................... 259 8.2. Annexe 2 .................................................................................................................... 291 8.3. Annexe 3 .................................................................................................................... 313

x

Liste des tableaux Chapitre 1 Tableau 1.1 : Tableau récapitulatif des fonctions de certaines HSPB associées à la progression tumorale et au développement de pathologies présentant une désorganisation du cytosquelette d’actine.

xi

Liste des figures Chapitre 1 Figure 1.1 : Schéma représentatif de l’axe de signalisation p38MAPK/MAPKAPK2 à l’origine de la phosphorylation d’HSP27. Figure 1.2 : Modèle décrivant comment HSPB1 faciliterait la motilité à base d'actine. Figure 1.3 : Schéma représentatif des différents domaines qui constituent les protéines BAG humaines. Figure 1.4 : Schéma de la structure modulaire du co-chaperon BAG3, mettant en évidence des interactions avec des partenaires impliqués dans la signalisation intracellulaire, le remodelage du cytosquelette d’actine, et l’autophagie sélective. Figure 1.5 : Les étapes de formation et de dégradation de l’autophagosome. Figure 1.6 : Schéma représentant le mécanisme par lequel le co-chaperon BAG3 aiderait au ciblage de protéines endommagées ou poly-ubiquitinées à la machinerie autophagique. Figure 1.7 : Schéma du mécanisme moléculaire de la CASA. Figure 1.8 : Schématisation des différentes étapes de la division cellulaire. Figure 1.9 : Schéma du mécanisme par lequel le complexe Arp2/3 induit la polymérisation d’un nouveau filament d’actine le long d’un filament préexistant. Figure 1.10 : Schéma structurel d’un dimère de myosine II. Figure 1.11 : Schéma du mouvement assuré par la myosine le long du filament d’actine. Figure 1.12 : Représentation schématique des fonctions assurées par les microtubules et leurs protéines motrices dans le positionnement du fuseau mitotique et la ségrégation des chromosomes. Figure 1.13 : Schéma représentatif de la voie de signalisation impliquée dans la formation du cortex mitotique et le maintien de sa rigidité. Figure 1.14 : Schéma modèle du mouvement du nuage sous-cortical d’actine durant la mitose. Figure 1.15 : Modèle selon lequel la Myo10 assure la communication des fibres de rétraction, du cortex et du nuage sous-cortical d’actine avec le centrosome. Figure 1.16 : Représentation schématique de la voie de signalisation dépendante du complexe « centralspindlin » et responsable de la spécification et de la formation de l’AC. Figure 1.17 : Modèle traditionnel de la contraction de l’AC. Figure 1.18 : Mécanismes moléculaires de désassemblage de l’AC dépendant des GTPases Rab11 et Rab35. Figure 1.19 : Modèle selon lequel SCFFbxw5 régule les niveaux d'Eps8 pour contrôler la dynamique de l'actine pour une progression mitotique normale. Figure 1.20 : Réprésentation schématique du ciblage de la forme active de RhoA (RhoA-GTP) par p62/SQSTM1 à l’autophagie sélective au sillon de clivage. Chapitre 2 Figure 2.1: Depletion of HSPB8 or BAG3 perturbs daughter cells spreading and ICB disappearance during cytokinesis. Figure 2.2: Silencing of HSPB8 interferes with cytokinetic abscission and markedly decreases the mitotic levels of BAG3.

xii

Figure 2.3: Silencing of HSPB8 causes abnormal F-actin accumulation at the ICB. Figure 2.4: Down modulation of actin dynamics can rescue phenotypes caused by depletion of HSPB8. Figure 2.5: Co-distribution of abnormal F-actin and Arp2/3, and restoration of F-actin organization at the ICB in HSPB8-depleted cells upon inhibition of Arp2/3 complex. Figure 2.6: Inhibition of lysosomal function mimics, whereas autophagic signaling can correct, the cytokinetic defect in F-actin caused by depletion of HSPB8. Chapitre 3 Figure 3.1 : La déplétion de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1 perturbe le nuage sous-cortical d’actine qui dépend d’Arp2/3. Figure 3.2 : L’activité d’HDAC6 régule la dynamique du nuage sous-cortical d’actine : la réduction de l’activité de HDAC6 par de faibles doses de tubacine peut normaliser les défauts mitotiques associés à la déplétion de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1. Figure 3.3 : L’activité d’HDAC6 et son association à la cortactine sont régulées de façon différentielle en mitose ; un rôle pour le complexe chaperon HSPB8-BAG3. Figure 3.4 : Les mutants cortactine-9KQ et 9KR restaure et mime respectivement les défauts d’organisation du cytosquelette d’actine associés à la déplétion de BAG3 ou d’HSPB8. Figure S3.1 : Mesure de l’efficacité de la déplétion de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1 par immunobuvardage de type « Western ». Figure S3.2 : L'inhibition d’Arp2/3 normalise les défauts d'arrondissement des cellules mitotiques dans les cellules HeLa déplétées en BAG3. Chapitre 4 Figure 4.1: La déplétion d’ATG7 se traduit par un réarrangement du cytosquelette d’actine en interphase. Figure 4.2: Effet de la déplétion d’ATG7 sur la progression mitotique des cellules HeLa. Figure 4.3 : La déplétion d’ATG7 conduit à l’accumulation de cellules partiellement arrondies en métaphase. Figure 4.4: La déplétion d’ATG7 augmente la proportion de cellules présentant une accumulation anormale de F-actine au PI. Figure 4.5: La déplétion d’HSPB8 interfère avec le flux autophagique en cytokinèse. Figure 4.6: Les cellules déplétées en HSPB8 présentent une accumulation d’agrégats K63. Figure 4.7 : L’inhibition de l’activité d’HDAC6 restaure un flux autophagique normal et normalise la quantité de F-actine au PI dans les cellules déplétées en HSPB8.

xiii

Liste des abréviations ABP « Actin Binding Proteins » AC Anneau contractile d’actomyosine aPKC « atypical protein kinase C » Arf6 « ADP-ribosylation factor 6 » Arp2/3 « Actin related proteins 2 and 3» ATG « AuTophaGy » BAG « Bcl2-associated athanogen » BAG3 « Bcl2-associated athanogen 3 » Bcl-2 « B-cell lymphoma 2 » Bcl-XL « B-cell lymphoma-extra large » Cas9 « CRISPR associated protein 9 » CASA « Chaperone-Assisted Selective Autophagy » CCN1 « Cyr61- CTGF- NOV protein 1 » CCT « Chaperonin Containing T-complex polypeptide » Cdc42 « cell division cycle 42 » CDK1 « Cyclin-Dependent Kinase 1 » CHIP « Carboxyl terminus of Hsc70-Interacting Protein » CK2 « Casein Kinase 2 » CRIB « Cdc42-Rac interactive binding » CRISPR « Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats » DAAM « Dishevelled-Associated Activators of Morphogenesis » DEPDC1B « DEP domain containing 1B » Dia « Diaphanous » ECT2 « Epithelial Cell Transforming 2 » ERK « Extracellular-Related Kinase » ERM Ezrine-Radixine-Moésine ESCRT-III «Endosomal Sorting Complexes Required for Transport II» FAK « Focal Adhesion Kinase » FH1 « Formin Homology domain 1 » FHOD « Formin-Homology Domain proteins » FIP3/FIP4 « rab11 Family of Interacting Proteins 3/4 » FLN Filamine FMN Formine FRAP « Fluorescence Recovery After Photobleaching » FRL « Formin-Related proteins in Leukocytes » GAP « GTPase Activating Proteins » GDI « Guanine nucleotide Dissociation Inhibitor » GEF « Guanine nucleotide Exchange Factor » HDAC Histone DéAcétylases HDAC6 Histone DéAcétylase 6 HSC70 « Heat Shock Cognate 70 » HSF-1 « Heat Schock Factor 1 » HSP « Heat Shock Protein »

xiv

HSP70 « Heat Shock Protein 70 » HSPB « Heat Shock Protein familly B » HSPB8 « Heat Shock Protein familly B member 8 » Htt43Q « Huntigtin 43 glutamin » INF « INverted-Formin » IQGAP1 « IQ Motif Containing GTPase Activating Protein 1 » Keap1 « Kelch-like ECH-associated protein 1 » LC3 « microtubule-associated protein 1A/1B-Light Chain 3 » LGN Leucine–Glycine–Asparagine LIMK1 « LIM motif-containing protein Kinase 1 » LIR « LC3 Interacting Region » MAPKAPK2 « p38 MAP kinase-activated protein kinase 2 ») Mcl-1 « Myeloid cell leukemia sequence 1 » MEF « Mouse Embryonic Fibroblast » MICAL1 « Molecule Interacting with CasL 1 » MKLP1 « Mitotic Kinesin-Like Protein 1 » MLC2 « Myosin Light Chain 2 » MLCK « Myosin Light Chain Kinase » MMP-2 « Matrix Metalloproteinase-2 » MRCK «Myotonic dystrophy kinase-Related Cdc42-binding Kinase» MTOC « MicroTubules Organization Center » mTORC1 « mammalian Target Of Rapamycin Complex 1 » MyoII Myosine II Myo10 Myosine X NBR1 « Next to BRCA1 gene 1 protein » NDP52 « Nuclear Dot 52 kDa Protein » NF-kB « Nuclear Factor-kappa B » NPF « Nucleation-Promoting Factor » Nrf2 « Nuclear Factor (Erythroid-Derived 2)-Like 2 » NTA « N-Terminal Acidic domain » NuMA « Nuclear and Mitotic Apparatus » OCRL « OculoCerebroRenal syndrome of Lowe » OPTN « OPTiNeurin » p38MAPK « p38 Mitogen Activated Protein Kinase » PAK « p21-activated kinase » PAR6 « partitioning-defective protein 6 » PB1 Phox et Bem 1 PDZGEF2 «PDZ Domain-Containing Guanine Nucleotide Exchange Factor 2» PE PhosphatidylÉthanolamine PI Pont Intercellulaire PI3K « PhosphatIdylinositol-4,5-bisphosphate 3-Kinase » PI3KC3–C1 « class III PI 3-Kinase Complex I » PI(3)P PhosphatIdylinositol-3-Phosphate PI(4,5)P2 PhosphatIdylinositole 4,5 biPhosphate

xv

PIP5K « PhosphatIdylinositol 4-Phosphate 5-Kinase » PKCd « Protein Kinase C delta » PLCg Phospholipase C gamma PTPRF « receptor Protein Tyrosine Phosphatase, Receptor type, F » Rab11/35 « Ras-related protein 11 or 35 » Rac1 « Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 » Rap1 « Ras-proximate-1 » ou « Ras-related protein 1 » RhoA « Ras homolog gene family, member A » ROCK « Rho-associated, Coiled-coil containing protein Kinase » SCAMP2/3 « Secretory Carrier-Associated Membrane Protein 2 and 3 » SCAR « Suppressor of cAMP Receptor » SCFFbxw5 « Skp1–Cul1–F-box F-Box and WD Repeat Domain Containing 5 » SH3 « Src Homology 3 Domain » SLK « Sterile 20-Like Kinase » SOD1 « Super Oxyde Dismutase 1 » SQSTM1 SeQueSTosoMe 1 SSH1 « SlingSHot 1 » STAT3 « Signal Transducer and Activator of Transcription 3 » STX 17 Syntaxine 17 SYNPO2 SYNaptoPOdine-2 TAX1BP1 « TAX1 Binding Protein 1 » TAZ « Tafazzin » TSC1/2 « Tuberous SClerosis 1/2 » UBA « UBiquitin Association » UBL « UBiquitin-Like » ULK1 « Unc-51-Like autophagy activating Kinase 1 » WASP « Wiskott–Aldrich Syndrome Protein » WAVE « WASP-family VErprolin-homologous protein » YAP « Yes-Associated Protein »

xvi

Dédicace

« Il n’y a rien dont la patience ne vienne à bout quand elle est secondée de persévérance »

Tite-Live, Maximes et sentences, Ier siècle ap. J-C

xvii

Remerciements

Je tiens, en premier lieu, à remercier chaudement ma directrice de thèse Josée N. Lavoie.

Je la remercie de m’avoir accueilli dans son laboratoire et de m’avoir permis de m’y

épanouir au fils des années. Je lui suis extrêmement reconnaissante pour la confiance

qu’elle m’a témoignée, tout au long de ces années, qui m’a permis de développer ma

confiance et mon « savoir faire ». Je la remercie pour son écoute attentive tant sur le plan

professionnel que personnel. Je lui suis reconnaissante de ses conseils avisés et de sa

minutie qu’elle emploi au quotidien et qu’elle m’a enseignée durant ces six années de

doctorat. Grâce à sa passion pour la recherche et son habileté à la transmettre, je me sens

aujourd’hui grandie de mon expérience et en confiance pour mon avenir.

Je tiens également à remercier le Dr Jacques Landry pour m’avoir dirigé lors des

premières années de mon doctorat, en co-direction avec Dre Josée N. Lavoie, et pour

m’avoir introduit au monde des petites HSP.

Je souhaite également remercier l’ensemble des membres, passés et présents, du

laboratoire Lavoie. En particulier Herman Lambert et Margit Fuchs, les professionnels de

recherche du laboratoire, qui ont toujours répondu présents lorsque j’avais besoin d’eux ;

qui m’ont donné énormément de conseils pour m’assurer de l’efficacité et de la

reproductibilité de mes expériences ; qui ont tendu l’oreille durant les jours sombres de

mon doctorat et qui ont toujours su apporter des réponses à mes questions. À Émilie Pic,

post-doctorante du laboratoire, avec qui je pouvais m’exprimer dans mon patois lorrain.

Merci pour ses conseils, son écoute et ses blagues cocasses. Merci à Marc-Antoine

Rodrigue, étudiant au doctorat du laboratoire, qui porte toujours au party de Noël des

pulls qui font jaser. Un grand merci à ma collègue et amie, Solenn Guilbert, alias « Soso »,

pour les discussions scientifiques et les soirées passées à décompresser. Je ne remercierai

jamais assez mes deux collègues et amies Carole Luthold, alias « Zozo », et Claire

Dziengelwski, alias « Clairon », qui ont été mes piliers durant mon doctorat. J’ai toujours

pu compter sur leur soutien, leur écoute et leurs conseils. Même à distance elles ont

répondu à mes interrogations, m’ont donné des conseils avisés et m’ont soutenu durant les

xviii

moments difficiles. Merci à elles de m’avoir souvent ouvert leur porte les jours où je

n’avais pas le courage de rentrer chez moi ou lorsque je devais commencer tôt le « lab ».

Merci à Claire de rire à mes « jokes plates » et de m’avoir appris à relativiser faces aux

problèmes du quotidien. Je tiens également à remercier Carole, avec qui je forme un duo

inébranlable. Elle m’a apporté bien plus que du réconfort, grâce à elle j’ai appris à être

confiante, positive et davantage minutieuse. Merci à elle pour nos discussions

interminables concernant nos projets scientifiques et de vies, et pour avoir été ma

collaboratrice dans différents projets qui ont notamment menés à une étude qui sera

présentée dans cette thèse.

Je suis également très reconnaissante de l’ensemble des personnes qui m’ont formé et

supporté à un moment de mon doctorat, notamment Carl Saint-Pierre de la plateforme

d’imagerie. Je remercie aussi le Dr Norman Marceau pour ses conseils avisés à une

période où je ne croyais plus en moi. Je pense aussi à Anne Loranger qui m’a apporté des

conseils lors de mes séances au microscope et qui m’a également permis de partager ma

passion pour la recherche à des jeunes du primaire et du secondaire.

Tout ce travail n’aurait pu voir le jour sans l’aide et le soutien de mes amis et de mes

proches. Je pense tout d’abord à ma famille et particulièrement à mes parents, qui ont su

rendre la distance moins pénible par leurs appels hebdomadaires, leurs visites « icite » et

leurs colis remplis de douceurs. Merci à ma mère qui a toujours eut, à sa façon, les mots

pour me pousser à me surpasser. Merci à ma grand-mère, Lucie, qui a été d’un grand

soutien moral et financier. Merci à mes oncles, tantes, cousins et cousines, pour les petits

mots de réconfort, les visites qu’ils m’ont faites et les repas de famille auxquels ils m’ont

fait participer même à plus de 6000 km de distance. Je remercierai aussi Nicolas, « mon

cha », pour avoir été mon partenaire de vie, pour tout le soutien moral qu’il m’a apporté

durant les dernières années de mon doctorat. Merci à lui de m’avoir offert un toit, du

réconfort quotidien, des bons petits plats, de magnifiques vacances en France et une

famille (avec notre chien Junior) qui m’ont aidé à passer au travers des jours sombres du

doctorat. Merci à mes « P », Sophie et Céline, je leur suis reconnaissante de leur soutien,

de leur écoute et surtout de leur grain de folie qui m’a souvent aidé à décompresser. Merci

xix

à Lucile, alias « Boulette » et Lucie-Marie, alias « Lulu », elles sont à mes côtés depuis le

Lycée et le sont restées durant mon doctorat. Merci à elles pour leur écoute et leurs petits

messages qui m’ont réconforté et m’ont remonté plus d’une fois le moral. Je suis également

très reconnaissante du soutien que mes amis rencontrés à Québec m’ont apporté :

Alexandra, alias « mon Roux », et Gaëlle, dont le grain de folie a été un réconfort bien des

fois ; Emmanuelle, alias « Manu », et Mélany, alias « Poussin », dont l’humour, l’écoute

et les conseils ont été importants ; Clémence et Sébastien, alias « Sebounet », avec qui les

discussions et les soirées autour d’un bon petit plat ont toujours été d’une grande aide.

Merci à ma colocataire et amie Françoise et à son fils Noah, qui m’ont transmis leur

énergie positive durant cette période éprouvante qu’est la rédaction. Je souhaite également

remercier mes amis de l’épicerie J.A Moisan, avec qui j’ai travaillé durant mes 6 derniers

mois de vie à Québec, qui ont été une vraie bouffée d’air frais dans mon quotidien et qui

m’ont aidé à penser à d’autres choses que la thèse et l’incertitude qu’elle implique.

Pour finir, je remercierai les membres de mon jury, à savoir le Dr Jacques Huot, le Dr

Marc-Étienne Huot et le Dr Steve Jean, pour avoir accepté d’évaluer mon travail.

Bonne lecture !

xx

Avant-propos

Au cours de mon doctorat, j’ai participé à la rédaction d’un manuscrit en tant que première

auteure, d’un chapitre de livre en tant que co-première auteure et j’ai contribué à

l’élaboration d’un second manuscrit en tant que co-seconde auteure.

Le premier objectif de mon projet de doctorat, qui fait l’objet du chapitre 2, a été de

déterminer l’importance de la modulation du cytosquelette d’actine par le complexe

chaperon HSPB8-BAG3 lors de la division cellulaire. J’ai montré que le complexe

chaperon facilite le désassemblage d’une structure d’actine appelée anneau comtractile en

cytokinèse, que cette fonction contribue à la séparation adéquate des cellules filles et

qu’une telle fonction pourrait nécessiter la modulation de la machinerie autophagique par

HSPB8-BAG3. Ces travaux ont donné naissance à un article publié dans le journal Cell

stress and Chaperones. (Varlet, A.A., Fuchs, M., Luthold, C., Lambert, H., Landry, J.,

Lavoie, J.N. (2017) Fine-tuning of actin dynamics by the HSPB8-BAG3 chaperone

complex facilitates cytokinesis and contributes to its impact on cell division. Cell stress

and chaperones, doi:10.1007/s12192-017-0780-2). Le format PDF de cet article se trouve

dans l’Annexe 3.

Le second objectif de mon doctorat, qui fait l’objet du chapitre 3, a été de caractériser le

mécanisme moléculaire par lequel le complexe chaperon HSPB8-BAG3 pourrait réguler

la dynamique du cytosquelette d’actine pendant la mitose. Ces travaux ont montré

qu’HSPB8-BAG3, en association avec le récepteur autophagique p62/SQSTM1, pourrait

moduler l’activité de la déacétylase HDAC6 et qu’une telle modulation pourrait impliquer

une cible majeure d’HDAC6 : la cortactine, dont la dynamique d’activation/inhibition

semble être nécessaire à la régulation de structures d’actine en mitose.

Le Dre Lavoie m’a également laissé l’opportunité d’analyser plus en détail l’existence d’un

lien fonctionnel entre la régulation du cytosquelette d’actine par le complexe chaperon

HSPB8-BAG3 et sa fonction autophagique. Ces travaux exploratoires font l’objet du

chapitre 4.

xxi

À mon arrivée au laboratoire, j’ai eu également la chance de participer activement aux

travaux montrant que le complexe chaperon HSPB8-BAG3 module des structures à base

d’actine qui dirigent le positionnement du fuseau mitotique et la progression en mitose des

cellules cancéreuses. L’article issu de ces recherches, où je suis co-deuxième auteure, a été

publié dans le journal PLoS Genetics et est disponible à l’Annexe 1. (Fuchs, M., Luthold,

C., Guilbert, M., Varlet, A.A., Lambert, H., Jetté, A., Elowe, S., Landry, J., Lavoie, J.N.

(2015) A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle

Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genet. 23;11(10):

e1005582.)

Le Dre Lavoie m’a aussi donné la possibilité de participer à la rédaction d’un chapitre de

livre qui porte sur l’implication des chaperons moléculaires de la famille de petites

protéines de choc thermique (HSPB) dans la régulation de la dynamique d’actine. Ce

chapitre, disponible dans l’Annexe 2, a été effectué pour le livre The Big Book on Small

Heat Shock Proteins (Tanguay, R.M., Hightower, L.E., Springer, 2015 - 610 p). (Varlet,

A.A., Guilbert, S.M., Fuchs, M., Lambert, H., Landry, J., Lavoie, J.N. (2015) Regulation

of Actin-Based Structure Dynamics by HspB Proteins and Partners. The Big Book on

Small Heat Shock Proteins, Volume 8 of the series Heat Shock Proteins pp 435-456)

L’ensemble de ces travaux n’aurait pu voir le jour sans l’aide des co-auteurs cités ci-dessus.

1

1. Chapitre 1 : Introduction

1.1. Rôle du cytosquelette d’actine dans la réponse cellulaire aux forces mécaniques

Les changements morphologiques de la cellule sont nécessaires au bon déroulement

d’activités cellulaires cruciales telles que la migration et l’adhésion cellulaires, la transition

épithéliomésenchymateuse, la polarisation cellulaire ou encore la division et la

différenciation cellulaires. La morphodynamique cellulaire est déterminée par des

transitions dans l’organisation des réseaux d’actine. Par exemple, lors de la transition

épithéliomésenchymateuse, le réseau cortical d’actine se réorganise en structures rigides

appelées fibres de stress qui promouvoient la migration et l’adhésion cellulaires (Shankar

et Nabi 2015; Haynes et al. 2011; Bhowmick et al. 2001). Le cytosquelette d’actine est au

cœur du contrôle de la mécanique cellulaire en assurant la rigidité cellulaire et la

transmission des forces perçues par la cellule. En effet, à travers la formation de structures

à base d’actine, telles que le cortex ou les fibres de stress, le cytosquelette d’actine assure

la résistance cellulaire face aux tensions mécaniques (Chalut et Paluch 2016). Notamment,

la réorganisation du cytosquelette d’actine en un cortex d’actomyosine rigide permet à la

cellule mitotique de s’arrondir contre son environnement et de maintenir une géométrie

optimale pour la progression mitotique (Lancaster et al. 2013). En outre, des éléments du

cytosquelette d'actine, comprenant les moteurs de myosine et des agents de reticulation

d'actine comme la filamine, se remodèlent et activent des voies de signalisation en réponse

aux contraintes mécaniques qui permettront à la cellule d’y répondre (Kee et al. 2012;

Chowdhury et al. 2010; Ehrlicher et al. 2011; Effler et al. 2006). Par exemple, la contrainte

mécanique augmente l’interaction de la filamine aux intégrines, ce qui conduit à un

renforcement des adhésions focales en raison du maintient de l’activation des intégrines

(Ehrlicher et al. 2011).

Ainsi, la morphodynamique des cellules implique un contrôle spatiotemporel fin de la

dynamique de l’actine. Les composantes majeures ainsi que les régulateurs clés des

2

structures à base d’actine ont été bien caractérisés suite à d’innombrables études.

Cependant, comment toutes ces protéines fonctionnent comme un ensemble intégré et

modulable par la signalisation intracellulaire reste peu compris (Roybal et al. 2016). Peu

d’éléments sont connus quand aux mécanismes qui assurent la ségrégation des différents

complexes multi-protéiques responsables du remodelage spatiotemporel de structures

distinctes à l’intérieur d’une même cellule. De plus, les mécanismes par lesquels la cellule

assure le maintien de l’intégrité de telles structures soumises à des cycles

d’assemblage/désassemblage et des stress mécaniques, demeurent méconnus. Bien qu’on

suppose l’existence de mécanismes de contrôle de qualité protéique régulant l’intégrité de

telles structures, ceux-ci demeurent peu étudiés à ce jour (Baird et al. 2014).

Notre laboratoire s’intéresse aux fonctions des chaperons moléculaires dans le contrôle de

qualité des structures à base d’actine et dans la régulation spatiotemporelle des réseaux

d’actine. Pour étudier ces fonctions, nous avons choisi un modèle d’étude paradigme qui

implique un remodelage drastique et rapide des structures à base d’actine : la division

cellulaire. Ce processus par lequel une cellule mère donne deux cellules filles dépend d’une

régulation spatiotemporelle fine de la dynamique du cytosquelette d’actine par des

mécanismes qui sont peu compris (section 1.4). Cette thèse s’inscrit dans l’optique

d’approfondir notre compréhension des mécanismes qui assurent une régulation

spatiotemporelle fine des transitions dans l’organisation des structures à base d’actine lors

de la division cellulaire. Pour ce faire, nous avons adressé le rôle et le mode d’action d’un

complexe chaperon formé des protéines HSPB8 et BAG3 durant la division cellulaire.

Dans ce chapitre, les notions de base et les concepts émergeants concernant le rôle des

chaperons de la famille HSPB dans le remodelage du cytosquelette d’actine seront

présentés (section 1.2). Nous décrirons ensuite les fonctions connues du chaperon HSPB8

et celles de son co-chaperon BAG3 dans le contrôle de qualité des protéines, la

signalisation et le remodelage de l’actine, et nous discuterons des questions actuellement

soulevées par ces travaux (section 1.3). Finalement, nous présenterons les mécanismes

moléculaires impliqués dans le remodelage des structures à base d’actine qui dirigent la

division cellulaire et les questions non résolues dans ce domaine (section 1.4).

3

1.2. Les chaperons de la famille HSPB et la régulation de la dynamique et de l’intégrité

des structures d’actine

1.2.1. Le contrôle de qualité des protéines et les chaperons moléculaires

La fonction des protéines est gouvernée par leur structure tridimensionnelle assurée par le

repliement adéquat de la chaîne polypeptidique qui les constitue. Un repliement incorrect

ou une dénaturation de la structure tridimensionnelle des protéines affecte leur fonction et

peut conduire à des conséquences catastrophiques au niveau tissulaire. En effet, dans la

cellule, les protéines mal repliées peuvent avoir des activités délétères de « gain de

fonction », en partie en raison de leur tendance accrue à l'agrégation, et mener à des

dysfonctionnements importants des activités cellulaires (Dubnikov, Ben-Gedalya, et

Cohen 2017; Kumar et al. 2016). Bien que les mécanismes précis de la toxicité ne soient

pas bien compris, il est clair que les protéines dénaturées s'engagent dans des interactions

inappropriées avec d'autres composantes cellulaires et peuvent s'accumuler dans des

inclusions potentiellement toxiques de protéines (Lansbury et Lashuel 2006). La

dénaturation protéique apparaît ainsi comme un mécanisme majeur de maladies humaines,

comme le souligne la liste croissante de « maladies conformationnelles », résultant de

l'accumulation cellulaire de protéines mal repliées (Muchowski 2002; Sakahira et al. 2002;

Dubnikov, Ben-Gedalya, et Cohen 2017; Kumar et al. 2016). Parmi celles-ci, on peut citer

une gamme substantielle de pathologies, comme le cancer, la fibrose kystique, ou encore

de nombreux troubles neurodégénératifs tels que la maladie d'Alzheimer, les maladies de

Parkinson et d’Huntington (Morimoto 2011; Manecka et al. 2017; Klaips, Jayaraj, et Hartl

2017; Chiti et Dobson 2017; Hartl 2017; Sontag, Samant, et Frydman 2017). Ces

pathologies mettent donc en évidence l’importance de maintenir l’intégrité du protéome

quelles que soient les conditions environnementales auxquelles la cellule est soumise : il

s’agit du contrôle de l’homéostasie protéique ou du contrôle de qualité des protéines

(Sontag, Samant, et Frydman 2017).

Le maintien de l’intégrité du protéome est assuré par un ensemble de mécanismes de

contrôle de qualité, qui sont sous la gouverne des chaperons moléculaires. Ils contrôlent le

4

repliement protéique, aident à l’assemblage de complexes protéiques et dirigent les

protéines endommagées vers la dégradation protéique. La cellule dispose de deux voies de

dégradation qui appartiennent aussi au système de contrôle de qualité des protéines: la

dégradation par le système ubiquitine-protéasome et par la machinerie autophagique

(section 1.3.4.1). Ainsi, un chaperon moléculaire se définit par ses capacités à intéragir et

à aider au repliement d’une protéine ou à l’assemblage d’un complexe protéique, ou de

structures polymériques comme celles qui contrôlent l’organisation des cytosquelettes,

sans être une partie intégrante de leurs structures finales.

Les chaperons moléculaires de la famille des protéines de choc thermique ou HSP (« Heat

Shock Protein ») sont des régulateurs clés de l’homéostasie protéique. Il s’agit pour la

plupart de protéines de stress induites en réponse à une variété de stimuli externes ou

internes qui endommagent la structure des protéines. Le facteur de transcription du stress

cellulaire HSF-1 (« Heat Shock Factor 1 ») contrôle l’expression des protéines de choc

thermique (DiDomenico, Bugaisky, et Lindquist 1982; Goldenberg et al. 1988). Il existe

deux classes de chaperons moléculaires essentiels : les chaperons à activité dépendante ou

indépendante de l’ATP. Les chaperons moléculaires à domaine ATPase sont ceux qui vont

stimuler le repliement des protéines dénaturées lors de cycles d’hydrolyse de l’ATP

souvent régulés par des co-chaperons, ou les diriger vers les voies de dégradation le cas

échéant. Il s’agit des chaperons HSP40, HSP60, HSP70, HSP90 ou encore HSP100.

Les chaperons moléculaires dont la fonction est indépendante de l’ATP forment la famille

des petites protéines de choc thermique ou HSPB (« Heat Shock Protein familly B »). Ces

chaperons moléculaires se caractérisent par la présence d’un domaine a-cristallin

hautement conservé et flanqué de séquences N- et C-terminales variables et peu conservées

(de Jong, Caspers, et Leunissen 1998; Kriehuber et al. 2010; van Montfort et al. 2001). Le

domaine a-cristallin se caractérise par un empilement de feuillets b dont la structure est

essentielle à la fonction des HSPB (Baranova et al. 2009; K. K. Kim, Kim, et Kim 1998).

Les HSPB ont été trouvées dans toutes les niches évolutives où leurs nombres et leurs poids

moléculaires varient de 12 à 42 kDa selon les espèces (de Jong, Caspers, et Leunissen

1998). Chez l’humain, dix HSPB ont été identifiées (HSPB1 à 10) et leur expression dans

5

l’organisme peut être ubiquitaire, comme c’est le cas pour HSPB1 (aussi connue sous le

nom d’HSP27) et HSPB8, ou spécifique à un tissu comme HSPB9 retrouvée

majoritairement dans les testicules (Morrow et Tanguay 2012).

Fonctionnellement, ces chaperons moléculaires forment la première ligne de défense de la

cellule lors d’un stress protéotoxique où ils préviennent l'agrégation irréversible des

protéines dénaturées indépendamment de l'ATP. De ce fait, les HSPB ont été impliquées

dans la prévention de l’agrégation de protéines impliquées dans différentes pathologies

comme la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson (Shammas et al. 2011; King et

al. 2009; Cox et Ecroyd 2017; Dehle et al. 2010; Golenhofen et Bartelt-Kirbach 2016). En

outre, certaines HSPB ont été impliquées dans la séquestration de protéines agrégées. En

effet, les cellules ont développé un certain nombre de mécanismes pour résister à

l’accumulation de protéines endommagées dont la séquestration de celles-ci dans des

inclusions cellulaires localisées à des endroits précis dans la cellule (Wolff, Weissman, et

Dillin 2014). C’est le cas par exemple de l’aggrésome qui est formé lors d’une surchage du

protéasome (Johnston, Ward, et Kopito 1998). Ce mécanisme de compartimentation de

dépôts agrégés permet à la cellule de séquestrer les protéines endommagées, de se protéger

de leur toxicité et facilite leur élimination par dégradation. Ainsi, il a été noté qu’HSP42

agit par son domaine N-terminal pour se co-agréger avec des protéines mal repliées et peut-

être les relier à d'autres facteurs de tri chez la levure S. cerevisiae (Specht et al. 2011).

Par ailleurs, en conditions physiologiques, il apparaît qu’HSPB1, le membre prototype de

cette famille, pourrait constituer un réservoir de monomères d’actine qui serait mobilisé de

façon dépendante de la signalisation intracellulaire, suivant sa phosphorylation (During et

al. 2007; Lavoie, Hickey, et al. 1993; Huot et al. 1995; Lavoie et al. 1995; Lavoie, Hickey,

et al. 1993; Lavoie, Gingras-Breton, et al. 1993; McLaughlin et al. 1996; Huot et al. 1995;

Stokoe et al. 1992; Ahlers et al. 1994; Zhou, Lambert, et Landry 1993). En somme, on

attribue aux membres de cette famille des rôles grandissants dans la signalisation cellulaire.

Cependant, leur mode d’action demeure peu caractérisé. Dans cette section, nous

présenterons le modèle prévalent quant à leur fonction en réponse au stress protéotoxique

6

et nous décrirons les données montrant une fonction encore peu comprise des HSPB dans

la régulation de la dynamique du cytosquelette d’actine.

1.2.2. Modèle prévalent des HSPB : l’oligomérisation pour prévenir de

l’agrégation protéique

En général, les HSPB sont très poly-dispersées, ce qui signifie qu'elles peuvent exister sous

la forme de dimères considérés comme le « bloc de construction » pour des homo- ou

hétéro-oligomères qui comportent jusqu'à 50 sous-unités (Dudich et al. 1995). La

formation des dimères est dépendante du domaine a-cristallin qui les caractérisent et d’un

motif IXI/V (isoleucine-X-isoleucine ou valine) localisé en C-terminal des HSPB essentiel

à l’oligomérisation (Pasta et al. 2004; Zhou et al. 2016). La formation des larges oligomères

est aussi dépendante des extrémités N- et C-terminales des HSPB qui déterminent la taille

des oligomères (Ghosh, Shenoy, et Clark 2006; Salerno et al. 2003; Lindner et al. 2000;

Hilton et al. 2013;Heirbaut et al. 2017; Rutsdottir et al. 2017; Moutaoufik et al. 2017;

Strózecka et al. 2012; Chen et al. 2010; McDonald et al. 2012; Mani et al. 2016).

L’oligomérisation est suggérée être le mode d’action canonique de la famille des HSPB où

les oligomères forment des réservoirs d’intermédiaires de repliement qui seront pris en

charge par les chaperons moléculaires dépendant de l’ATP (Lee et al. 1997; Ehrnsperger

et al. 1997; Żwirowski et al. 2017; Ungelenk et al. 2016; Leroux et al. 1997).

L'oligomérisation est un processus très dynamique et l'échange de sous-unités peut être

accéléré par des contraintes mécaniques, thermiques, ou encore de pH. Dans les cellules,

des modifications post-traductionnelles (en particulier des phosphorylations) sont

supposées stimuler davantage la dynamique d’oligomérisation qui, selon toute

vraisemblance, permettra aux HSPB de répondre de façon appropriée aux stimuli de stress.

En effet, plusieurs membres de la famille HSPB contiennent des sites de phosphorylation

qui conduit généralement à une dissociation des oligomères en dimères, tandis que la

déphosphorylation favorise l’oligomérisation en espèces de haut poids moléculaires

(Arrigo et Gibert 2012; Lanneau et al. 2008; Parcellier et al. 2005; Rogalla et al. 1999;

Sluchanko, Chebotareva, et Gusev 2015; Suss et Reichmann 2015; Haslbeck et Vierling

7

2015). Ainsi, la formation de différentes structures (dimères ou oligomères) pourrait

fournir un mécanisme de régulation de l’activité et/ou de la localisation des HSPB (van

Montfort et al. 2001; Acunzo, Katsogiannou, et Rocchi 2012; Boncoraglio, Minoia, et

Carra 2012, 2012; Bakthisaran et al. 2016; Aquilina et al. 2004; Hayes et al. 2009) .

Cependant, il apparaît que tous les chaperons de la famille HSPB ne peuvent pas

s’oligomériser in vivo. En effet, certains membres de la famille, dont HSPB8, n’arborent

pas de motif IXI/V essentiel à leur oligomérisation (Zhou et al. 2016; Studer et al. 2002;

Quinlan et al. 2013; Carra et al. 2008). De ce fait, ces HSPB sont retrouvées principalement

sous la forme de dimères (Carra et al. 2008). Il semble donc que le mode d’action des

HSPB ne soit pas ubiquitaire à tous les membres de la famille. Cela soulève la question de

savoir quel est le mode d’action des HSPB qui ne forment pas de larges oligomères et si ce

mode d’action est commun à toutes les HSPB.

1.2.3. Les HSPB dans le contrôle de la dynamique de l’actine et les pathologies

associées

En conditions physiologiques, il apparaît que les membres de la famille HSPB pourraient

avoir des fonctions dans la régulation de la dynamique des cytosquelettes, notamment celle

du cytosquelette d’actine. En effet, il a été mis en évidence qu’HSPB1, le membre le plus

étudié et utilisé comme paradigme de la famille, module la dynamique du cytosquelette

d’actine en séquestrant les monomères d’actines dans de larges complexes qui sont

dissociés en réponse à un stimulus de stress ou physiologique (Annexe 1).

Les études pionières de Lavoie et al. ont mis en évidence pour la première fois qu’HSPB1

pourrait favoriser la survie cellulaire en présence de l'inhibiteur de la polymérisation

d'actine : cytochalasine D, de manière dépendante de sa phosphorylation (Lavoie, Gingras-

Breton, et al. 1993). Ces effets protecteurs ont été corrélés avec des changements dans

l'organisation du cytosquelette d’actine lors de la surexpression d’HSPB1, fournissant un

argument pour une activité du chaperon moléculaire sur l'actine (Lavoie et al. 1995). En

outre, Lavoie et al. trouva que la phosphorylation d’HSPB1 agit non seulement pour

8

prévenir les altérations sévères de l'architecture du cytosquelette d'actine en réponse à

différents stress, mais aussi pour moduler le remodelage de l’actine et la dynamique de la

membrane induits par des facteurs de croissance (Lavoie et al. 1995; Lavoie, Hickey, et al.

1993). Ces travaux apportèrent les premières évidences d’un rôle physiologique d’HSPB1

dans la régulation du remodelage de l’actine.

Il fût aussi noté que l'activité inhibitrice de la polymérisation de l’actine par HSPB1 dépend

du degré de sa phosphorylation et de son organisation structurelle (Benndorf et al. 1994).

Effectivement, in vitro, les monomères non phosphorylés inhibent la polymérisation de

l'actine, alors que les monomères phosphorylés et les particules multimériques non

phosphorylées en sont incapables. Ces travaux ne concordaient donc pas avec ceux

obtenues in vivo montrant que l’expression de la forme sauvage d’HSPB1 stimule le

remodelage de l’actine alors qu’un mutant non phosphorylable d’HSPB1 exerce un effet

dominant négatif sur cette fonction du chaperon (Lavoie et al. 1995; Lavoie, Hickey, et al.

1993). Malgré cette incohérence, il fût proposé qu’HSPB1 sous sa forme non phosphorylée

inhibe l'assemblage de l’actine en coiffant l’extrémité à croissance rapide des filaments

d’actine (Benndorf et al. 1994; Mounier et Arrigo 2002).

Ce modèle fût contesté à la suite des travaux de During et al. qui décryptèrent le mécanisme

moléculaire par lequel HSPB1 contrôle la dynamique d’actine in vivo (During et al. 2007).

En effet, à la suite des nombreux travaux qui ont contribué à identifier l’axe de signalisation

p38MAPK (« p38 Mitogen Activated Protein Kinase ») /MAPKAPK2 (« p38 MAP kinase-

activated protein kinase 2 ») comme étant le signal responsable de la phosphorylation

d’HSPB1 (Figure 1.1), l’équipe du Dr Southwick utilisa la toxine létale de l’anthrax comme

modèle d’induction du remodelage de l’actine (During et al. 2005, 2007; McLaughlin et

al. 1996; Rouse et al. 1994; Huot et al. 1995; Stokoe et al. 1992; Ahlers et al. 1994; Zhou,

Lambert, et Landry 1993).

9

Figure 1.1 : Schéma représentatif de l’axe de signalisation p38MAPK/MAPKAPK2 à l’origine de la phosphorylation d’HSPB1.

Les travaux montrèrent notamment que l’inhibition de l’assemblage d’actine par la toxine

est médiée par le blocage de la phosphorylation d’HSPB1 et qu’un tel processus pouvait

être reproduit suite à l’inhibition de la p38MAPK. De façon remarquable, les auteurs

notèrent que la forme non-phosphorylée d’HSPB1 interagit et séquestre les monomères

d’actine in vitro. In vivo, les résultats montrèrent que la déplétion d’HSPB1 conduisait à

une réduction des effets de l’anthrax sur le cytosquelette d’actine. Un tel phénotype fut

restauré par l’induction de l’expression d’HSPB1 WT mais pas d’un mutant non

phosphorylable. Ainsi, ces travaux mirent en évidence le mode d’action d’HSPB1 qui sous

la forme d’oligomères dans la cellule fournirait un réservoir de monomères d’actine

localisé dans la région péri-nucléaire (Figure 1.2) (During et al. 2007). Suite à la

phosphorylation du chaperon moléculaire, par la MAPKAPK 2/3, les oligomères se

dissocieraient en dimères capables de larguer l’actine monomérique aux sites de

polymérisation de la F-actine comme par exemple au front de migration (Figure 1.2). Grâce

à cette étude, la phosphorylation d’HSPB1 a été fermement établie comme un mécanisme

10

clé pour réguler la motilité dans les cellules non musculaires, 20 ans après la découverte

initiale de son activité modulatrice de l’actine.

Figure 1.2: Modèle décrivant comment HSPB1 faciliterait la polymérisation de l’actine et la motilité cellulaire (adapté de Guilbert et al. 2015).

Une telle fonction pourrait être commune aux autres membres de la famille des HSPB

puisque certains d’entre eux arborent, tout comme HSPB1, un rôle protecteur du

cytosquelette d’actine (Mounier et Arrigo 2002; Clarke et Mearow 2013; Miron, Wilchek,

et Geiger 1988; Verschuure et al. 2002; Brophy, Lamb, et Graham 1999). En outre, les

HSPB exercent un rôle modulateur clé lors de processus impliquant un remodelage de

l’actine comme la migration, l’adhésion et la différenciation cellulaires, ou encore la

transition épithéliomésenchymateuse, l’angiogénèse et l’apoptose (Tableau 1.1)

11

(Montagna, Matuschewski, et Buscaglia 2012; Shimizu, Tanaka, et Atomi 2016; Park et

al. 2016; Davidson et Morange 2000; Lahvic et al. 2013; Lee et al. 2008; Piotrowicz,

Hickey, et Levin 1998). Via ces rôles de modulateurs du cytosquelette d’actine, les HSPB

qui sont souvent suractivées dans des lignées cancéreuses, sont associées à la progression

et l’invasion tumorales (Tableau 1.1) (Wei et al. 2011; Matsushima-Nishiwaki et al. 2016;

M. Suzuki et al. 2015; Doshi, Hightower, et Lee 2009; Piccolella et al. 2017; Tessier et al.

2003; Huang et al. 2013; Moyano et al. 2006; Schootbrugge et al. 2013). De plus, des

mutations des HSPB ont largement été associées au développement de pathologies sévères

présentant une désorganisation du cytosquelette d’actine comme des neuropathies et des

myopathies (Tableau 1.1) (Cappola et al. 2010; Stoevring, Frederiksen, et Christiansen

2007; Irobi et al. 2004; Evgrafov et al. 2004; Bova et al. 1999).

Malgré toutes ces évidences, le mode d’action des autres membres HSPB sur la régulation

de la dynamique de l’actine reste élusif mais pourrait être distinct de celui utilisé par

HSPB1. Notamment, dans des modèles in vitro et in vivo de fibrillation auriculaire, une

étude a démontré que certaines HSPB pouvaient prévenir les réarrangements du

cytosquelette d’actine associés à ce processus (Ke et al. 2011). Les auteurs ont observé que

la surexpression d’HSPB1, HSPB6, HSPB7 et HSPB8 protègent du remodelage de l’actine

dans un tel contexte. Les résultats suggèrent qu’HSPB1, HSPB6 et HSPB7 préviennent la

formation de F-actine en empêchant l’insertion de la G-actine dans les filaments, alors

qu’HSPB8 réduirait l’activation de RhoA. En outre, HSPB8 a récemment émergé en tant

que membre particulier de cette famille avec un mode d'action clairement distinctif pour la

régulation des structures cellulaires à base d'actine. Des études qui ont révélé des relations

fonctionnelles entre l’élimination de protéines par autophagie sélective et le contrôle de

l’organisation du cytosquelette d’actine seront décrites dans la section 1.3.5.2.

12

HSPB Fonctions cellulaires Pathologies Références

HSPB1 Remodelage de l’actine, Stabilisation de protéines, Migration cellulaire, Apoptose, Angiogenèse, Transition épithéliomésenchy-mateuse

Maladie de Charcot Marie Tooth et neuropathie ; Cancer du sein, colon, de la prostate, poumon, des os, de la tête et du cou, nasopharyngiale, des ovaires, hépatique

(Ylikallio et al. 2015; Evgrafov et al. 2004; James, Rankin, et Talbot 2008; Capponi et al. 2011; Kang et al. 2008; O’Callaghan-Sunol, Gabai, et Sherman 2007; Andrieu et al. 2010; Vahid et al. 2016; Guo et al. 2009; Wei et al. 2011; Rocchi et al. 2005; Lu et al. 2016; Xu, Chen, et Bergan 2006; Doshi, Hightower, et Lee 2009; Choi et al. 2014; Pavan et al. 2014; Voll et al. 2014)

HSPB5 Remodelage de l’actine, Migration cellulaire, Angiogenèse, Transition épithélio-mésenchymateuse

Dystrophie musculaire et myopathie ; Cancer des ovaires, poumons, de la prostate, lymphome métastaique

(Sitterding et al. 2008; Malin et al. 2015; Schootbrugge et al. 2013; Del Bigio et al. 2011; Forrest et al. 2011)

HSPB6 Remodelage de l’actine, Apoptose

Cardiomyopathie ; Carcinome hépatique

(Nicolaou et al. 2008; Nagasawa et al. 2014)

HSPB8 Remodelage de l’actine, Migration cellulaire

Maladie de Charcot Marie Tooth et neuropathie ; Cancer de l’ovaire

(Capponi et al. 2011; Irobi et al. 2004; Tang et al. 2005; Wilhelmus et al. 2006; Kim et al. 2006; Suzuki et al. 2015)

Tableau 1.1 : Tableau récapitulatif des fonctions de certaines HSPB associées à la progression tumorale et au développement de pathologies présentant une désorganisation du cytosquelette d’actine.

13

1.3. Le complexe chaperon HSPB8-BAG3 dans la régulation de structures contractiles

d’actine et de l’autophagie sélective

1.3.1. HSPB8 : un membre particulier de la famille des HSPB avec une spécificité

de substrats?

HSPB8, dont le poids moléculaire est de 22 kDa, appartient à la famille des petites

protéines de choc thermique. Historiquement, HSPB8 fût identifiée comme la protéine

kinase H11 similaire à la sérine-thréonine kinase ICP10 du virus de l’herpès (Smith et al.

2000). Plus tard, l’activité kinase de H11 fût discutée et des analyses d’homologies

établirent qu’H11 était en réalité un chaperon moléculaire de la famille HSPB (Kappé et

al. 2001; Gober, Depre, et Aurelian 2004; Kim, Seit-Nebi, et Gusev 2004). L’activité

chaperon d’HSPB8 fût ensuite caractérisée in vitro par (Chowdary et al. 2004) et in vivo

par (Carra et al. 2005). HSPB8 est considérée comme ubiquitaire et sa surexpression dans

différents types de cancers a été associée à la progression et la résistance tumorales

(Tableau 1.1) (Yu et al. 2001; Xiao-shan Li et al. 2014; Suzuki et al. 2015; Hamouda et al.

2014; Piccolella et al. 2017). Comme pour les autres membres de sa famille, des mutations

d’HSPB8, les mutations K141E et K141N situées dans le domaine a-cristallin de la

protéine, ont largement été associées au développement de maladies neurologiques et de

myopathies sévères dont la maladie de Charcot-Marie Tooth (Tableau 1.1) (Irobi et al.

2004; Tang et al. 2005; Wilhelmus et al. 2006; Kim et al. 2006; Hu et al. 2007).

Cependant, HSPB8 est un membre particulier de sa famille. En effet, bien qu’il présente

un domaine a-cristallin caractéristique de sa famille, ce chaperon moléculaire ne dispose

pas des motifs IXI/V essentiels à l’oligomérisation (Zhou et al. 2016; Studer et al. 2002;

Quinlan et al. 2013). Les travaux du laboratoire du Dr Landry ont permis d’établir

qu’HSPB8 existe principalement dans les cellules sous la forme d’un complexe stable avec

le co-chaperon BAG3 (« Bcl2-associated athanogen 3 ») (Carra et al. 2008), bien que des

études récentes suggèrent que le complexe est régulé de façon dynamique en réponse au

stress (Guilbert et al. 2018). Par des expériences de co-sédimendation, les auteurs ont noté

que le complexe HSPB8-BAG3 présentait la stoechiométrie de deux molécules d’HSPB8

14

pour une molécule de BAG3. De plus, par des expériences de déplétion à l’aide de siARN,

l’équipe montra que le co-chaperon BAG3 est essentiel à la stabilité d’HSPB8.

Effectivement, la déplétion de BAG3 mène à une réduction importante des niveaux

d’expression du chaperon HSPB8; cependant l’inverse n’est pas observé. Dans la plupart

des conditions, la déplétion d’HSPB8 a peu d’effet sur les niveaux d’expression de BAG3

(à l’exception de la mitose, voir Chapitre 2, Figure 2.2F). Par la suite, Fuchs et al. ont

identifié deux motifs de type IPV dans la région N-terminale du co-chaperon BAG3 avec

lesquels HSPB8 peut intéragir directement (Figure 1.3) (Fuchs et al. 2009). Cette étude

montra que la présence de ces motifs de BAG3 est essentielle pour maintenir l’activité

chaperon d’HSPB8. Ainsi, les résultats du laboratoire du Dr Landry suggèrent que les

fonctions cellulaires d’HSPB8 dépendent de BAG3. À l’inverse, BAG3 possède des

fonctions dépendantes et indépendantes d’HSPB8. Cependant, le rôle exact d’HSPB8 au

sein des fonctions de BAG3 demeure très peu compris et peu d’études s’y sont intéressées.

À titre de complexe, HSPB8-BAG3 est principalement associé au contrôle de qualité des

protéines. Notamment, le complexe est impliqué dans la régulation de la dégradation ciblée

de protéines par un processus appelé macroautophagie (autophagie) (section 1.3.4.1); ces

études seront décrites dans la section 1.3.4 (Carra et al. 2008; Crippa, Sau, et al. 2010;

Crippa, Carra, et al. 2010). Plus récemment, nous avons précisé l’action d’HSPB8 au sein

du complexe pendant un stress protéotoxique. Nous avons montré qu’HSPB8, en

coopération avec BAG3, coordonne la séquestration de protéines nuisibles et la réponse

cellulaire adaptative lors de l’inhibition du protéasome, ce qui faciliterait leur transport à

l’agrésome (Guilbert et al. 2018). Mécanistiquement, nos travaux suggèrent qu’HSPB8

pourrait agir en amont de BAG3, dans la régulation de la fonction de p62/SQSTM1, une

protéine d’échafaudage impliquée dans la formation d’inclusions cellulaires pour la

séquestration de protéines polyubiquitinées (section 1.3.4.1). La déplétion d’HSPB8 inhibe

la phosphorylation de p62/SQSTM1 et la formation de micro-aggrégats de protéines

ubiquitinées, ce qui interfère avec leur ciblage à l’agrésome via un mécanisme qui implique

BAG3. En outre, une étude récente suggère que le complexe chaperon, via l’action

d’HSPB8 en amont de BAG3, pourrait également participer au désassemblage de structures

agrégées nommées granules de stress, de façon indépendante de son activité autophagique

15

(Ganassi et al. 2016). Ces travaux suggèrent qu’HSPB8 et BAG3 peuvent agir

indépendemment de leur association. Dans ce contexte, il est critique de déterminer leur

rôle exact en tant que complexe protéique.

Dans le cadre de cette thèse, ce sont les fonctions physiologiques d’HSPB8 en association

avec BAG3 qui nous ont intéressées, notamment dans le remodelage des structures à base

d’actine. En effet, BAG3 a été impliquée dans de nombreux processus via sa structure

modulaire qui pourrait lui permettre, en principe, de relier le contrôle de qualité des

protéines à la signalisation et aux processus de remodelage de l’actine. De telles fonctions

de BAG3 seront présentées dans les sections suivantes et nous soulèverons les questions

que ces travaux ont mis en avant.

1.3.2. Structure et fonctions du co-chaperon BAG3

BAG3 fait partie d’une famille de protéines nommée BAG (« Bcl2-associated athanogen »)

qui sont connues pour moduler la fonction des systèmes chaperons HSP70 (Antoku et al.

2001; Doong, Vrailas, et Kohn 2002). Chez l’humain, il existe six protéines BAG (BAG1

à BAG6) qui possèdent toutes un domaine BAG situé dans leur région C-terminale, à

l’exception de BAG5 qui en possède quatre (Figure 1.3). Fonctionnellement, le domaine

BAG permet aux membres de cette famille de moduler négativement l’activité d’HSP70.

Une telle fonction des protéines BAG les implique dans le triage des substrats du chaperon

moléculaire. Par exemple, BAG1 a été largement impliquée dans l’induction de la

dégradation des substrats d’HSP70 par le protéasome (Lüders, Demand, et Höhfeld 2000;

Alberti et al. 2002; Demand et al. 2001). La différence entre les protéines BAG réside dans

la diversité de leur extrémité N-terminale qui leur permet de cibler HSP70 à différentes

localisations et machineries cellulaires (Figure 1.3). Notamment, BAG1 et BAG6 arborent

un domaine UBL (« ubiquitin-like ») qui leur permet d’intéragir avec et d’induire la

dégradation des cibles d’HSP70 par le protéasome (Lüders, Demand, et Höhfeld 2000).

BAG3 est unique parmi les membres de sa famille puisqu’elle est la seule à arborer des

motifs IPV, ainsi qu’un domaine riche en motifs PxxP et un domaine WW (Figure 1.3). En

outre, il est à noter que BAG3 est la seule membre de sa famille dont l’expression est

16

induite au cours d’un stress protéotoxique par l’intermédiaire du facteur de transcription

HSF-1, suggérant une fonction importante de ce co-chaperon dans le contrôle de qualité

des protéines au cours d’un stress (Franceschelli et al. 2008; Du et al. 2009; Wang et al.

2008). En tant que co-chaperon d’HSP70, il est reconnu que BAG3 inhibe son activité dans

le ciblage de ses substrats au protéasome et pourrait conduire à leur redirection à la

machinerie autophagique (section 1.3.4.1). L’implication de l’association à HSPB8 dans

une telle fonction de BAG3 a été suggérée par différentes études que nous décrirons dans

la section 1.3.4. De ce fait, BAG3 est perçue comme une plateforme unique qui pourrait

relier deux systèmes chaperons (HSP70 et HSPB8) (Rauch et al. 2016). BAG3 pourrait

coordonner leurs fonctions notamment pendant les processus d’autophagie sélective.

Cependant, les évidences mécanistiques qui mettent en avant une telle fonction de BAG3

sont encore déficientes.

Figure 1.3 : Schéma représentatif des différents domaines qui constituent les protéines BAG humaines.

17

Outre sa fonction dans la dégradation ciblée des protéines, BAG3 est reconnue comme une

protéine d’échafaudage qui intervient dans de nombreux processus de signalisation. Par ses

différents domaines, BAG3 est capable d’intéragir avec des enzymes de signalisation,

notamment PLCg (Phospholipase C gamma), la kinase oncogénique Src et des protéines

associées à l’actine (Figure 1.4) (Doong et al. 2000; Colvin et al. 2014). Ces interactions

vont l’impliquer dans des processus biologiques majeurs, c'est-à-dire l'apoptose, le

développement, l'organisation du cytosquelette d’actine et l'autophagie sélective (Figure

1.4). Une telle fonction de BAG3 permettrait de diriger les réponses adaptées des cellules

aux stimuli stressants. En outre, un nombre grandissant d’évidences laissent croire que ces

fonctions de BAG3 contribuent à soutenir la survie cellulaire, la résistance au traitement

et/ou la motilité et la progression métastatique dans différents types de cancer (Habata et

al. 2015; Liu et al. 2009; Ammirante et al. 2011; Habata et al. 2016; Rosati et al. 2015;

Zhang et al. 2012; Guerriero et al. 2014; Esposito et al. 2017; Festa et al. 2011; Maria

Fiammetta Romano et al. 2003; Shi et al. 2016; Lee et al. 2014; Franco et al. 2012; Yang

et al. 2016; Huayuan Zhu et al. 2014; Boiani et al. 2013).

1.3.3. Les fonctions assurées par BAG3 en tant que protéine d’échafaudage

De part sa structure particulière, le co-chaperon BAG3 a été impliqué dans la modulation

de différentes voies de signalisation intracellulaire (Figure 1.4) (Chen et al. 2013).

Toutefois, on se doit de souligner que peu d’études ont adressé le rôle des chaperons

associés à BAG3 dans de telles fonctions. BAG3 intervient notamment dans la voie de

signalisation dépendante de la kinase ERK (« Extracellular-Related Kinase ») où il module

la phosphorylation et en conséquence l’activation de la kinase (Falco et al. 2012; Yunoki

et al. 2015). Une telle fonction de BAG3 a été impliquée dans la régulation de

l’angiogénèse et de la transition épithéliomésenchymateuse. De plus, une étude suggère

que BAG3 est impliquée dans la modulation de la concentration intracellulaire de calcium

à travers son interaction avec PLCg (Figure 1.4) (Doong et al. 2000). Dans les sections ci-

après, nous nous intéresserons aux fonctions signalétiques de BAG3 associées aux

processus qui requièrent un remodelage de structures à base d’actine. Nous discuterons

18

également d’un potentiel rôle fonctionnel entre l’activité signalétique de BAG3 et son rôle

en tant que co-chaperon d’HSP70 et d’HSPB8.

Figure 1.4 : Schéma de la structure modulaire du co-chaperon BAG3 mettant en évidence des interactions avec des partenaires impliqués dans la signalisation intracellulaire, le remodelage du cytosquelette d’actine et l’autophagie sélective. Les nombres représentent les positions des acides aminés dans la séquence de BAG3; P209L correspond à la mutation liée à une myopathie sévère chez l'homme (adapté de Guilbert et al. 2015).

1.3.3.1. Le co-chaperon BAG3 module l’apoptose à travers la régulation de la

stabilité de facteurs anti-apoptotiques

BAG3 a été associée à la régulation de l’apoptose dans différents types de lignées

cancéreuses telles que des cellules du cancer de l’ovaire, de glioblastome, de carcinome

pulmonaire et de neuroblastome ( Zhang et al. 2012; Romano et al. 2003; Lee et al. 1999;

Jacobs et Marnett 2009; Chiappetta et al. 2007; Boiani et al. 2013). Une telle fonction de

BAG3 a été corrèlée à sa capacité à stabiliser des facteurs anti-apoptotiques dont Bcl-2

(« B-cell lymphoma 2 »), Bcl-XL (« B-cell lymphoma-extra large ») et Mcl-1 (« Myeloid

cell leukemia sequence 1 ») ( Zhang et al. 2012; Lee et al. 1999; Karpel-Massler et al. 2015;

19

Jacobs et Marnett 2009; Habata et al. 2016; Boiani et al. 2013). La stabilisation de ces

facteurs anti-apoptotiques passe par une interaction de BAG3 avec ceux-ci. Il est à noter

que les expériences de co-immunoprécipitation de BAG3 avec ces facteurs anti-

apoptotiques ont révélé la présence d’HSP70 dans les immunocomplexes. En outre,

l’interaction de BAG3 avec Bcl-2 implique le domaine BAG du co-chaperon (Antoku et

al. 2001). De ce fait, il est proposé que la fonction anti-apoptotique de BAG3 requiert son

activité de co-chaperon. Cependant, aucune évidence à l’heure actuelle n’a mis en avant

un lien fonctionnel entre l’activité anti-apoptotique de BAG3 et sa fonction de co-chaperon

d’HSP70 ou d’HSPB8.

1.3.3.2. BAG3 régule l’adhésion, la motilité cellulaire et la transition

épithéliomésenchymateuse

BAG3 a également été impliquée dans la signalisation de l’adhésion et de la motilité

cellulaires. Notamment, la surexpression de BAG3 induit une réduction de la migration

cellulaire, de la quantité d’adhésions focales et en conséquence de l’adhésion cellulaire

(Kassis et al. 2006). Ces résultats suggèrent que BAG3 peut réguler négativement

l'adhérence, l'assemblage d'adhésions focales, la signalisation et la migration via son

domaine PxxP. Une telle fonction de BAG3 impliquerait le contrôle de l’expression de la

protéine CCN1 (« Cyr61- CTGF- NOV protein 1 »), une protéine qui interagit avec et

augmente l’activité des adhésions focales, provoquant ainsi un phénotype adhésif (Chen et

al. 2004; Kassis et al. 2009).

Les travaux d’Iwasaki et al. s’opposent à ces conclusions. En effet, les auteurs notèrent que

la surexpression de BAG3 dans des lignées cancéreuses augmente leur mobilité alors que

sa déplétion la réduit (Iwasaki et al. 2007). En outre, des cellules MEF (« mouse embryonic

fibroblast ») KO pour BAG3 présentent un retard dans la formation de filopodes et des

adhésions focales, et une réduction de la motilité cellulaire. Dans ce contexte, la réduction

de la mobilité cellulaire a été associée à une réduction de l’activation de la GTPase Rac1.

Les auteurs ont observé que cette fonction dépendait du domaine WW de BAG3, puisque

la surexpression d’un mutant de ce domaine réduit la motilité cellulaire (Iwasaki et al.

20

2010). Ces derniers résultats indiquent que par ce domaine BAG3 est capable d’intéragir

et de réguler l’activité de la GEF de Rap1 (« Ras-proximate-1 » ou « Ras-related protein

1 ») : PDZGEF2 (« PDZ Domain-Containing Guanine Nucleotide Exchange Factor 2 »).

De cette manière, BAG3 contrôlerait l’activation de Rap1 et la mise en place des adhésions

focales et de leur signalisation subséquente (Figure 1.4).

Bien que les résultats d’Iwasaki et al. et de Kassis et al. soient contradictoires, il est possible

d’envisager que la surexpression ou la déplétion de BAG3 débalance les complexes

protéiques régulés par le co-chaperon. De cette façon, suivant le contexte du protéome

(cellules cancéreuses, MEF, cellules épithliales immortalisées, etc…), des complexes

favorisant ou inhibant l’adhésion et/ou la motilité cellulaires vont se former

majoritairement donnant lieu à des effets cellulaires contradictoires.

D’autre part, BAG3 a été impliquée dans la progression tumorale à travers sa fonction dans

la régulation de la transition épithéliomésenchymateuse dans des lignées de cancer

thyroïdien, hépatique ou de gliome (Li et al. 2013; Xiao et al. 2014; Lee et al. 2014; Meng

et al. 2014). Notamment, BAG3 régulerait positivement ce processus de façon dépendante

de sa phosphorylation par PKCd (« Protein Kinase C delta ») (Li et al. 2013). Une telle

fonction de BAG3 serait également reliée à sa capacité à moduler l’expression de

marqueurs mésenchymateux comme la N-cadhérine et la vimentine (Xiao et al. 2014; Shi

et al. 2016). De plus, BAG3 stabiliserait le facteur de transcription STAT3 (« Signal

transducer and activator of transcription 3 ») impliqué dans la transition

épithéliomésenchymateuse (Im et al. 2016; Yuan, Zhang, et Niu 2015). Par cette fonction,

BAG3 interviendrait dans la régulation de gènes codant pour des marqueurs

mésenchymateux tels que SNAIL et la métaloprotéinase MMP-2 (« Matrix

Metalloproteinase-2 »).

Dans l’ensemble de ces études, l’activité co-chaperon de BAG3 n’a pas été abordée

directement. Bien que le domaine BAG et les motifs IPV de BAG3 n’aient pas été étudiés

dans sa fonction régulatrice de l’adhésion et de la migration cellulaires ou de la transition

épithéliomésenchymateuse, il est envisageable que son activité co-chaperon soit requise

21

pour de telles fonctions. L’implication de la stabilisation de facteurs tels que STAT3 par

BAG3 suggère que son rôle de co-chaperon pourrait être impliqué. Ces hypothèses restent

à être testées.

1.3.3.3. Lien fonctionnel entre l’activité signalétique de BAG3 et son rôle en tant

que co-chaperon d’HSP70

Mise à part nos travaux récents (Fuchs et al. 2015; Annexe 1; section 1.4.5), une seule

étude, à notre connaissance, s’est intéressée à l’implication fonctionnelle de l’activité de

co-chaperon de BAG3 dans sa fonction signalétique. Cette étude a démontré que le

complexe formé de BAG3 et d’HSP70 est impliqué dans la modulation de plusieurs voies

de signalisation associées à la progression tumorale (Colvin et al. 2014). Notamment, les

auteurs, par des expériences de co-immunoprécipitation et de « pull-down », ont montré

que BAG3 interagit avec la kinase oncogénique Src de façon dépendante d’HSP70. En

effet, un mutant ponctuel de BAG3, le mutant R480A qui n’interagit plus avec HSP70,

n’est plus capable d’intéragir avec le domaine SH3 (« Src Homology 3 ») de Src. De même,

cette interaction entre BAG3 et Src est perdue lorsque le domaine PxxP de BAG3 est délété.

En outre, la déplétion de BAG3 ou d’HSP70 interfère avec la phosphorylation activatrice

de Src. La déplétion d’HSP70 induit une activation de la voie de signalisation Src, alors

que la déplétion de BAG3 n’induit pas d’activation de Src, mais l’action d’HSP70 sur Src

requiert BAG3. Ce résultat suggère donc qu’HSP70 régule négativement la voie de

signalisation Src et que cette fonction du chaperon moléculaire est modulée par son

association à BAG3. Dans cette même étude, les auteurs se sont aussi intéressés à l’impact

du complexe BAG3-HSP70 sur l’activation de la voie de signalisation NF-kB (« Nuclear

Factor-kappa B »). Comme pour la voie de signalisation Src, les auteurs ont montré que la

déplétion d’HSP70 induit une activation de la voie NF-kB qui peut être inhibée suivant la

déplétion de BAG3.

En résumé, ces résultats indiquent que le complexe chaperon formé d’HSP70 et de BAG3

est impliqué dans la régulation d’un réseau complexe de signalisation, qui comprend

notamment Src et NF-kB, dans un contexte de lignées cancéreuses. De façon importante,

22

cette étude a démontré pour la première fois un lien fonctionnel entre l’activité signalétique

de BAG3 et sa fonction de co-chaperon d’HSP70. Cette étude identifia également un petite

molecule inhibitrice de l’interaction de BAG3 à HSP70 dont l'administration in vivo est

suffisante pour supprimer la croissance tumorale chez la souris. Néanmoins, l’ensemble

des études analysant la fonction signalétique de BAG3 suggère, mais n’a jamais démontré,

que l’activité de co-chaperon de BAG3 pouvait être impliquée. De même, ces études n’ont

pas analysé le rôle fonctionnel de l’association de BAG3 à HSPB8 dans ces processus

cellulaires.

Ainsi, les fonctions cellulaires du complexe chaperon HSPB8-BAG3 sont très peu étudiées

dans un contexte physiologique, ou dans les cellules cancéreuses qui surexpriment BAG3

et HSPB8. Les fonctions d’HSPB8-BAG3 ont été caractérisées principalement dans un

contexte de stress protéotoxique où il est impliqué dans le ciblage sélectif de protéines à la

machinerie autophagique. C’est ce que nous allons décrire dans les prochaines sections.

1.3.4. Fonctions assurées par BAG3 lors d’un stress protéotoxique

L’activité de co-chaperon assurée par BAG3 a été étudiée majoritairement dans un contexte

de stress protéotoxique où son expression est induite par HSF-1 (Franceschelli et al. 2008;

Du et al. 2009; Wang et al. 2008). Ainsi, la plupart des études initiales sont basées sur la

surexpression de BAG3, considérant qu’elle reproduit les conditions d’un stress

protéotoxique. Il convient donc de mentionner ici que certains partenaires potentiels de

BAG3 dans ces fonctions pourraient en principe se retrouver en quantités limitantes,

compliquant l’interprétation de ces données.

La fonction de co-chaperon de BAG3 fut étudiée pour la première fois par l’équipe du Dre

Kohn E.C. qui montra que la surexpression de BAG3 prévient la perte de la kinase Akt et

d’autres clients connus d’HSP70, suite au traitement avec la geldanamycine (un inhibiteur

d’HSP90), tandis que la surexpression d’un mutant de délétion du domaine BAG de BAG3

est inactif (Doong et al. 2003). Cette étude suggérait donc que BAG3 intervient comme un

inhibiteur de la dégradation des substrats d’HSP70 par le protéasome en condition de stress

23

cellulaire. Suite à cette étude, il fut noté qu’HSPB8-BAG3 module la dégradation de

protéines par la machinerie autophagique (section 1.3.4.2) (Carra et al. 2008). Ces travaux

ont par la suite été corroborés dans d’autres systèmes comme le vieillissement, l’hypoxie

et la réponse à l’agrésome (Minoia et al. 2014; Rapino, Jung, et Fulda 2014; Gamerdinger

et al. 2011, 2009; Zhang et al. 2016). Cela dit, dans l’ensemble de ces études, le rôle exact

d’HSPB8 demeure imprécis bien qu’il ait été montré que la surexpression d’HSPB8 peut

reproduire le phénotype BAG3 sur la dégradation de substrats par autophagie (Carra et al.

2008; Minoia et al. 2014). En revanche, la déplétion d’HSPB8 n’inhibe pas l’action de

BAG3 surexprimée, suggérant qu’HSPB8 n’est pas requise, ou bien qu’elle pourrait agir

en amont de BAG3, comme le suggère nos plus récents travaux (Guilbert et al. 2018).

Le rôle physiologique d’HSPB8-BAG3 dans l’autophagie sélective a été étudié dans le

contexte du muscle squelettique où les deux protéines sont abondamment exprimées

(section 1.3.5.2). Avant de passer en revue ces études et leur implication, il convient de

présenter les généralités concernant la dégradation par autophagie sélective.

1.3.4.1. L’Autophagie sélective et ses déterminants p62/SQSTM1 et HDAC6

Historiquement, l’autophagie a été décrite comme un processus non sélectif conduisant à

l’engouffrement du contenu cytoplasmique et à sa dégradation lysosomale pour soutenir

les besoins métaboliques de la cellule (Auteri et al. 1983). De nombreux travaux ont ensuite

décrit que le mécanisme d’autophagie n’était pas unique et qu’il pouvait se diviser en trois

types différents : la macroautophagie (nommée ci-après autophagie), la microautophagie

et l’autophagie dépendante des chaperons (Schneider et Cuervo 2014).

L’autophagie implique la formation d’une vésicule à double membrane appelée

autophagosome autour du cargo cytoplasmique qui sera transportée vers le lysosome pour

sa dégradation (Figure 1.5). Il s’agit d’un flux qui se divise en trois étapes dépendantes des

protéines ATG (« AuTophaGy »). Ces étapes consistent en l’initiation de l’autophagosome,

l’allongement membranaire et la maturation de l’autophagosome, et la fusion de

l’autophagosome avec le lysosome (Figure 1.5). Il est à noter que la maturation de

24

l’autophagosome implique l’insertion dans sa double membrane de la protéine LC3

(« microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 ») sous sa forme lipidée (passage de

LC3 I à LC3 II; Figure 1.5; Tanida et al. 2004, 2002; Ichimura et al. 2000; Kirisako et al.

2000). Ce processus permet de suivre la maturation du phagophore en autophagosome

biochimiquement ou par immunofluorescence.

Figure 1.5 : Les étapes de formation et de dégradation de l’autophagosome (de http://www.invivogen.com/autophagy). L’initiation de l’autophagie dépend de l’activation de deux complexes majeurs : le complexe ULK1 (« Unc-51-Like autophagy activating Kinase 1 ») et le complexe PI3KC3–C1 (« class III PI 3-Kinase Complex I »). Leurs activation et relocalisation permettent la création d’une région membranaire enrichie en PI(3)P (phosphatidylinositol-3-phosphate). Une fois l’initiation engagée, la membrane enrichie en PI(3)P se courbe pour former le précurseur de l’autophagosome appelé phagophore. À la suite de l’étape d’initiation, le phagophore est enrichi des marqueurs autophagiques spécifiques ATG12 et LC3, c’est l’étape de maturation. Au cours de l'enrichissement de ces marqueurs à la membrane, le phagophore s’allonge et englobe la cargaison cytoplasmique. La fermeture de la double membrane du phagophore conduit à la formation de l'autophagosome. Enfin, l'autophagosome fusionne avec le lysosome, formant le compartiment de dégradation connu sous le nom d'autophagolysosome, dans lequel la cargaison engloutie sera digérée par les enzymes lysosomales.

L'autophagie peut être sélective ou non sélective. L'autophagie non sélective est déclenchée

par la privation des cellules en nutriments et elle est essentielle pour le maintien d'un apport

cellulaire de lipides, d'acides aminés, de glucides et de nucléotides en situation de stress.

25

Ce processus permettrait aux cellules cancéreuses de survivre dans les régions hypoxiques

des tumeurs solides (Zhu et al. 2014; Vitale et al. 2015; Feng et al. 2016; Tan et al. 2016;

Marcucci, Ghezzi, et Rumio 2017). L'autophagie sélective, quant à elle, constitue un

mécanisme de contrôle de qualité cellulaire : elle permet l’élimination et le recyclage de

matériaux nocifs ou simplement inutiles à la cellule. Ceux-ci comprennent les agrégats de

protéines, les mitochondries endommagées, les peroxysomes et les ribosomes en excès, le

réticulum endoplasmique et les endosomes, les gouttelettes lipidiques, les agents

pathogènes intracellulaires et les protéines poly-ubiquitinées sur K63 (Zaffagnini et

Martens 2016; Tan et al. 2008; F. Huang et al. 2013; Clough et al. 2016; McKeon et al.

2015). C’est ainsi qu’actuellement différents types d’autophagies sélectives sont retrouvés

et nommés d’après la nature du cargo, incluant la mitophagie (mitochondies), l’agréphagie

(agrégats protéiques), la réticulophagie (réticulum endoplasmique), la pexophagie

(péroxisome) etc. (Kissová et al. 2004; Schuck, Gallagher, et Walter 2014; Zientara-Rytter

et Subramani 2016a; Anding et Baehrecke 2017; Galluzzi et al. 2017). Des défauts dans ce

mécanisme de contrôle de qualité cellulaire sont associés au développement de nombreuses

pathologies dont le cancer, l’infection chronique ou encore la neurodégénérescence

(Mancias et Kimmelman 2016).

Ainsi, l’autophagie sélective implique la reconnaissance de cargos spécifiques. Cela

suppose que la cellule exprime des récepteurs spécifiques qui pourront reconnaître ces

cargos et les cibler à la machinerie autophagique. Ce sont les adaptateurs autophagiques

qui comprennent la protéine NBR1 (« Next to BRCA1 gene 1 protein »), TAX1BP1

(« TAX1 Binding Protein 1 »), NDP52 (« Nuclear Dot 52 kDa Protein »), OPTN

(« Optineurin ») et p62/SQSTM1 (Sequestosome 1) (Rogov et al. 2014).

La protéine p62/SQSTM1 est le premier adapteur identifié et donc le plus étudié. Elle

comprend plusieurs domaines structurels dont le domaine UBA (« Ubiquitin Association »)

qui lui permet de lier des protéines poly-ubiquitinées et le domaine PB1 (Phox et Bem 1)

impliqué dans l’auto-oligomérisation de la protéine (Vadlamudi et al. 1996; Lamark et al.

2003; Isogai et al. 2011). Il a été noté, in vitro, que par son domaine UBA p62/SQSTM1

se lie préférentiellement aux protéines poly-ubiquitinées sur K63, une marque post-

26

traductionnelle qui permet le ciblage à la dégradation par autophagie (Tan et al. 2008;

Huang et al. 2013; Clough et al. 2016; McKeon et al. 2015; Xu et al., 2009). De plus, in

vivo, la phosphorylation sur la sérine 403 de p62/SQSTM1 par CK2 (« Casein Kinase 2 »)

stimule une telle liaison (Wooten et al. 2008). p62/SQSTM1 arbore aussi un domaine LIR

(« LC3 Interacting Region ») qui permet à l’adaptateur d'intéragir directement avec la

protéine LC3 sur la membrane de l’autophagosome (Pankiv et al. 2007; Ichimura et al.

2008). De façon générale, les trois domaines de p62/SQSTM1 sont essentiels pour sa

fonction dans l’autophagie sélective. En effet, p62/SQSTM1, grâce à son domaine UBA,

reconnaît les protéines marquées par l’ubiquitine K63 et déclenche leur agrégation par

auto-oligomérisation à travers son domaine PB1. Puis, p62/SQSTM1 cible les agrégats de

protéines vers l'autophagosome via son domaine LIR (Wurzer et al. 2015; Bjørkøy et al.

2005; Ciuffa et al. 2015; Paine et al. 2005).

Les processus d’autophagie sélective semblent faire intervenir également l’action d’une

déacétylase cytoplasmique : HDAC6 (« Histone deacetylase 6 »). En effet, HDAC6 est

fortement impliquée dans le contrôle de qualité des protéines. Cette fonction a été établie

dans le contexte de la formation de l’agrésome, une structure de protection cellulaire où

sont recrutées les protéines poly-ubiquitinées en réponse à un stress protéotoxique extrême

(Johnston, Ward, et Kopito 1998). Dans ce contexte, la formation d'agrégats de protéines

est stimulée de façon active, via une aggrégation dite fonctionnelle, ce qui les rend plus

enclines à la dégradation par autophagie (agréphagie). Les études ont montré qu’HDAC6

est en mesure de reconnaître les protéines ubiquitinées et dénaturées à travers son domaine

BUZ. HDAC6 charge alors ces protéines sur la dynéine qui se déplace vers le MTOC

(« microtubules organization center ») afin de former l’agrésome (Ouyang et al. 2012; Liu

et al. 2012; Kawaguchi et al. 2003; Olzmann et al. 2007; Gal et al. 2013; Du et al. 2010;

Into et al. 2010). Ceci suggère qu’HDAC6 est impliquée dans des voies de signalisation

régulatrices de l’autophagie sélective. Dans ce sens, il a été suggéré que la modulation de

la stabilité des microtubules par HDAC6 est utilisée par les cellules pour stabiliser les

microtubules et promouvoir le transport des vésicules autophagiques (Iwata et al. 2005).

Par la suite, des travaux ont indiqué qu’HDAC6 facilite la dégradation de substrats

protéiques potentiellement nocifs par la voie autophagique et ont impliqué une telle

27

fonction dans la protection neuronale (Pandey et al. 2007, 2007). Cependant, ces travaux

n’avaient pas encore élucidé le mécanisme moléculaire par lequel HDAC6 module

l’autophagie.

Ce sont (Lee et al. 2010) qui ont suggéré qu’HDAC6 est une composante centrale de

l'autophagie sélective. Ces travaux ont montré qu’HDAC6 favorise l'autophagie en

recrutant une machinerie de remodelage d'actine dépendante de la cortactine qui, à son

tour, stimule l’assemblage d’un réseau de F-actine qui promouvoit la fusion des

autophagosomes avec le lysosome. Ces travaux remarquables ont aussi démontré que

l'assemblage de F-actine dépendant d’HDAC6 et sa cible cortactine est entièrement

dispensable pour l'autophagie non sélective alors qu’il est requis pour l’agréphagie. Il est

intéressant de noter que dans ce contexte, p62/SQSTM1 régulerait négativement l’activité

déacétylase d’HDAC6 suggérant que p62/SQSTM1 joue probablement un double rôle dans

l'autophagie sélective, non seulement dans la formation de l'autophagosome, mais aussi

dans la régulation de la fusion des autophagosomes avec le lysosome dépendante

d’HDAC6 (Yan et al. 2013).

En résumé, l’autophagie sélective dépend d’un ciblage sélectif assuré par des adaptateurs

autophagiques aux autophagosomes. Ce processus repose également sur la régulation de la

dynamique de l’actine par la déacétylase HDAC6 via la modulation de la cortactine.

Cependant, les mécanismes d’activation et les voies de signalisation à l’origine de

l’induction de la dégradation sélective de substrats par autophagie restent encore très peu

connus.

1.3.4.2. BAG3 cible les protéines poly-ubiquitinées ou dénaturées à la dégradation

par autophagie sélective

Ce sont Carra et al. qui notèrent pour la première fois que le co-chaperon BAG3 module la

dégradation de protéines par autophagie. En effet, la surexpression de BAG3 se traduit par

une accélération de la dégradation de la protéine Htt43Q (« Huntigtin 43 glutamin »), une

forme pathogène de la protéine huntingtine qui s’agrège spontanément (Carra et al. 2008).

28

L’inhibition de l’autophagie, à l’aide d’inhibiteurs, diminue considérablement la

dégradation de Htt43Q dans les cellules surexprimant BAG3 ou HSPB8, suggérant que la

dégradation de la protéine mutante est dépendante de la machinerie autophagique. Aussi,

ces travaux ont montré que la réduction de l’expression de BAG3 réduit la lipidation de

LC3 tandis que sa surexpression ou celle de son partenaire HSPB8 induit une augmentation

du niveau de LC3 II. Ces résultats suggéraient alors que le complexe chaperon HSPB8-

BAG3 pourrait réguler la dégradation autophagique de protéines agrégées au cours d’un

stress protéotoxique.

Dans la même période, l’équipe du Dr Behl montra qu’une telle fonction de BAG3 était

induite au cours du vieillissement cellulaire (Gamerdinger et al. 2009). En effet, en criblant

les différences d'expression des co-chaperons de la famille BAG pendant le vieillissement

des cellules humaines, Gamerdinger et al. identifièrent une réduction de l'expression de

BAG1 en faveur de celle de BAG3 durant le vieillissement cellulaire ainsi que dans des

conditions de stress oxydatif ou protéasomal (Gamerdinger et al. 2009). Ce transfert

d’expression des co-chaperons fut associé à un passage fonctionnel de l'activité

protéasomale médiée par BAG1 à l'activité autophagique médiée par BAG3 (Gamerdinger

et al. 2009; Minoia et al. 2014). Ce changement de BAG1 vers BAG3 pour le contrôle de

la dégradation des protéines poly-ubiquitinées serait lié à une compétition des deux co-

chaperons pour l’interaction avec HSP70 (Minoia et al. 2014). De plus, une telle fonction

de BAG3 semble être dépendante de l’adaptateur autophagique p62/SQSTM1 avec lequel

le co-chaperon interagit à travers une région indéterminée actuellement. Cette observation

suggère donc que BAG3 via son association à p62/SQSTM1 est impliquée dans la

modulation de l’autophagie sélective (Figure 1.6).

Plus tard, Gamerdinger et al. utilisèrent la réponse à l’agrésome comme modèle d’étude de

la fonction autophagique de BAG3. Cette étude montra que BAG3 facilite la formation de

l’agrésome en y dirigeant spécifiquement les substrats d’HSP70 via le chargement des

protéines dénaturées sur la protéine motrice dynéine (Gamerdinger et al. 2011). Ces

travaux suggérèrent que le domaine PxxP est important pour l’interaction de BAG3 avec

la dynéine et que le ciblage des protéines dénaturées requérait son domaine BAG.

Cependant, l’interaction de BAG3 avec la dynéine fût par la suite montrée pour être

29

également dépendante de son association avec la protéine adaptatrice 14-3-3 (Figure 1.6)

(Xu et al. 2013). En effet, 14-3-3 participe au ciblage de protéines qui s’agrègent

spontanément de façon dépendante de son interaction à la dynéine et à BAG3 via les sérines

phosphorylées 136 et 173 localisées dans la région N-terminale du co-chaperon. Par

ailleurs, le domaine WW de BAG3 a également été impliqué dans sa fonction autophagique

lors d’une étude dans des cellules de gliome (Figure 1.6) (Merabova et al. 2015).

Figure 1.6 : Schéma représentant le mécanisme par lequel le co-chaperon BAG3 aiderait au ciblage de protéines endommagées, agrégées ou poly-ubiquitinées à la machinerie autophagique.

Le mécanisme moléculaire par lequel BAG3 module l’activation de la dégradation par

autophagie est encore peu connu à l’heure actuelle. Cependant, certaines évidences sont

apparues dans les dernières années. Notamment, des travaux ont montré que le niveau

30

d’expression de BAG3 affecte la lipidation de LC3 suggérant que BAG3 pourrait contrôler

ce mécanisme moléculaire essentiel au maintien d’un flux autophagique (Carra et al. 2008;

Merabova et al. 2015; Liu et al. 2013). Il semble qu’une telle fonction de BAG3 implique

également sa capacité à réguler la traduction de l’ARNm codant pour LC3 sans affecter ni

la transcritpion de son gène, ni la dégradation de la protéine par le protéasome ou par

autophagie (Rodríguez et al. 2016). Par ailleurs, une étude très récente a démontré que

BAG3 coordonne la synthèse protéique et l'autophagie par la régulation spatiale de

mTORC1 (« mammalian Target Of Rapamycin Complex 1 ») qui gère de multiples voies

de biosynthèse et favorise la croissance cellulaire lorsque les nutriments sont en abondance

et dont l’inhibition est essentielle à l’activation de l’autophagie (Dibble et Manning 2013;

Dunlop et Tee 2014; Kathage et al. 2016). Les résultats obtenus dans cette étude seront

détaillés davantage dans la section 1.3.5.2.

En résumé, il semble que les trois domaines d’interaction de BAG3 : BAG, PxxP et WW

soient importants pour la fonction autophagique de BAG3 (Figure 1.6). Les résultats de

Carra et al. suggèrent que l’association de BAG3 à HSPB8, incluant ainsi les motifs IPV

de BAG3, est impliquée dans sa fonction autophagique (Carra et al. 2008). De même que

la nécessité de l’association de BAG3 à p62/SQSTM1 pour assurer la fonction

autophagique du co-chaperon suggère que ce dernier est impliqué dans le ciblage sélectif

de protéines à l’autophagie. Bien que certaines évidences soient apparues dans les dernières

années, le mécanisme moléculaire par lequel BAG3 module l’autophagie est encore à

élucider. La démonstration la plus probante pour un mécanisme a été faite dans le contexte

des cellules musculaires lors de la contraction musculaire. Dans ce contexte, il semble que

BAG3, en association avec HSPB8 et HSP70, soit requise pour le ciblage d’une protéine

de réticulation du cytosquelette d’actine, la filamine (FLN), à la dégradation autophagique

(section 1.3.5.2). C’est ce que nous allons présenter dans les prochaines sections.

31

1.3.5. Régulation de structures contractiles d’actine par le complexe chaperon

HSPB8-BAG3

1.3.5.1. BAG3 assure l’intégrité des myofibrilles musculaires grâce à sa fonction

de co-chaperon d’HSP70

Le co-chaperon BAG3 régulerait la polymérisation du cytosquelette d’actine à travers des

mécanismes moléculaires impliquant sa fonction de co-chaperon d’HSP70. En effet, il a

été démontré, dans le contexte du muscle squelettique, que BAG3 régule la stabilité de la

myofibrille, la structure de contraction du muscle squelettique constituée d’actine et de

myosine notamment (Hishiya, Kitazawa, et Takayama 2010; Schafer, Hug, et Cooper

1995). En absence de BAG3, l’intégrité des myofibrilles soumises à une contraction

mécanique est perturbée. Un tel phenotype a été associé à une promotion par BAG3 de

l’association de CapZb1 à HSC70 (« Heat Shock Cognate 70 ») ce qui assurerait sa stabilité

et sa bonne localisation. La déplétion de BAG3 conduit à une dégradation de CapZ par le

système ubiquitine-protéasome, suggérant que BAG3 pourrait inhiber le ciblage de la

protéine de coiffe au protéasome par HSC70. Ainsi, BAG3 est cruciale pour le maintien de

l'intégrité du cytosquelette d’actine de la cellule musculaire lors d’un stress mécanique en

assurant la stabilité de la sous-unité β1 de CapZ, entrainant ainsi l'association et la

stabilisation de la F-actine par la protéine de coiffe.

Par ailleurs, le domaine BAG de BAG3 a également été impliqué dans la modulation de la

polymérisation de la F-actine. En effet, il a été démontré qu’à travers ce domaine BAG3

interagit avec la protéine CCT (« Chaperonin Containing T-complex polypeptide »), un

chaperon de la G-actine (Fontanella et al. 2010). De cette manière, BAG3 pourrait réguler

la migration cellulaire et influencer le repliement de l’actine monomérique dépendante de

CCT.

Par ces fonctions de régulation de l’intégrité du cytosquelette d’actine, des mutations de

BAG3 ont été associées au développement de myopathies présentant une désorganisation

myofibrillaire (Homma et al. 2006; Lee et al. 2012; Arimura et al. 2011; Selcen et al. 2009).

32

Notamment, la mutation P209L de BAG3 a été corrélée au développement d’une

myopathie myofibrilaire fulgurante chez l’être humain (Selcen et al. 2009; Figure 1.4). Du

fait que cette mutation soit localisée dans le second motif IPV de BAG3, les études

proposent que l’association de BAG3 à HSPB8 est requise pour sa fonction de modulateur

du cytosquelette d’actine (Figure 1.4). Cependant, aucune de ces études n’ont démontré

une dépendance de BAG3 à HSPB8 pour une telle fonction. De plus, l’impact réel de la

mutation P209L sur l’association de BAG3 à HSPB8 n’a pas été démontré. Des travaux

récents du laboratoire suggèrent que la mutation n’abolit pas l’association de BAG3 à

HSPB8, mais qu’elle pourrait la déréguler (Guilbert et al. 2018). En outre, les études

n’avaient pas encore analysé un lien fonctionnel entre l’activité autophagique de BAG3 et

sa fonction de modulateur du cytosquelette d’actine. Récemment, des travaux pionniers ont

adressé un lien potentiel entre HSPB8 et BAG3 et l’activité de BAG3 dans le ciblage de

protéines du cytosquelette d’actine à l’autophagie et seront présentés dans la section ci-

après.

1.3.5.2. Régulation de l’intégrité du cytosquelette d’actine dépendant de

l’autophagie sélective induite par HSPB8-BAG3 dans la cellule musculaire

C’est l’équipe du Dr Höfheld J. qui a établi que BAG3 régule l’intégrité du cytosquelette

d’actine dans les cellules musculaires, de façon dépendante de sa fonction autophagique

lorsque la cellule est soumise à une tension mécanique (Arndt et al. 2010; Ulbricht et al.

2013; Kathage et al. 2016).

En effet, dans ces travaux, les auteurs ont montré que BAG3 contrôle la formation d’un

complexe chaperon multiprotéique constitué d’HSC70, HSPB8, de la E3 ubiquitine ligase

CHIP (« Carboxyl terminus of Hsc70-Interacting Protein ») et de l’adaptateur autophagique

p62/SQSTM1 lors d’un stress mécanique (Arndt et al. 2010; Ulbricht et al. 2013) Figure

1.7). L’équipe démontra dans un premier temps que ce complexe chaperon aide au ciblage

de la protéine dénaturée FLN à la dégradation par autophagie sélective de façon dépendante

de son ubiquitination impliquant CHIP et nomma ce mécanisme moléculaire CASA

(« Chaperone-Assisted Selective Autophagy ») (Arndt et al. 2010). Dans un second temps,

33

l’équipe montra que la CASA est une voie d'autophagie sélective induite par la tension,

essentielle à la mécano-transduction dans les cellules musculaires (Ulbricht et al. 2013).

Dans cette étude, les auteurs ont montré que la formation d'autophagosomes pendant la

CASA dépend d'une interaction de BAG3 avec la SYNPO2 (Synaptopodine-2), une

protéine adaptatrice du cytosquelette d’actine qui se lie à la FLN, via son domaine WW

(Figure 1.7). De plus, ces travaux révèlent que BAG3 utilise également son domaine WW

pour s'engager dans la voie de signalisation YAP (« Yes-associated protein »)/TAZ

(« Tafazzin »). Grâce à cette voie, le co-chaperon contribue à la translocation des facteurs

YAP/TAZ au noyau et stimule ainsi la transcription de la FLN (Figure 1.7). Un tel

mécanisme moléculaire permet donc d’une part, l’élimination de la FLN partiellement

dénaturée par le stress mécanique, et d’autre part, son remplacement via la transcription

dépendante de YAP/TAZ.

Figure 1.7: Schéma du mécanisme moléculaire de la CASA (tiré de Ulbricht et Höhfeld 2013). Le seul substrat démontré de la CASA est la protéine de réticulation de l’actine FLN, qui devient dénaturée et endommagée sous la tension mécanique, ce qui conduit à sa reconnaissance par HSPB8 en association avec BAG3, et à son ubiquitination par le

34

complexe CASA. Au cours de la dégradation de la FLN, la formation d'autophagosomes est déclenchée par la coopération entre BAG3 et SYNPO2 qui facilite le ciblage et la fusion des autophagosomes. BAG3 utilise également son domaine WW pour contacter LATS1/2 qui sont impliquées dans la séquestration cytoplasmique des régulateurs transcriptionnels YAP et TAZ (WWTR1). La liaison de BAG3 à LATS1/2 abroge la séquestration YAP/TAZ et induit la transcription FLN sous tension. Ig, type immunoglobuline; ECM, matrice extracellulaire.

Plus récemment, il a été montré que lors de la contrainte mécanique dans les cellules

musculaires lisses, BAG3 pourrait coordonner la synthèse protéique et la dégradation par

autophagie par la régulation spatiale de mTORC1 (Kathage et al. 2016). En effet, il a été

montré que par son domaine WW le co-chaperon interagit avec la protéine TSC1

(« Tuberous sclerosis 1 ») qui fonctionne comme un inhibiteur de mTORC1 en association

avec TSC2 (« Tuberous sclerosis 2 »). Cette interaction entraînerait un recrutement de

complexes TSC dans des fibres de stress, où les complexes inhibent une sous-population

de vésicules mTOR positives associées au cytosquelette d’actine. Ainsi, l'inhibition locale

de mTORC1 permettrait d’initier l'autophagie sur les sites de dénaturation de la FLN. Dans

le même temps, la séquestration de TSC1/TSC2 médiée par BAG3 soulage l'inhibition de

mTORC1 dans le cytoplasme restant, ce qui stimule la traduction des protéines. Ceci

suggère un modèle selon lequel une fonction de BAG3 dans la séquestration des protéines

permettrait une régulation spatiotemporelle de la signalisation cellulaire et de l’autophagie.

En résumé, ces observations indiquent un rôle central de BAG3 dans l’induction de la

dégradation par autophagie sélective de la FLN afin d’assurer l’organisation du

cytosquelette d’actine au cours d’un stress mécanique. Dans l’ensemble de ces travaux, les

auteurs suggèrent que le chaperon moléculaire HSPB8 est impliqué dans le mécanisme de

la CASA et aiderait à la reconnaissance de la FLN dénaturée. Néanmoins, aucun résultat

ne l’a démontré de façon probante. Ainsi, dans le contexte d’un stress mécanique, il semble

exister un lien fonctionnel entre l’activité signalétique de BAG3 et sa fonction dans

l’autophagie sélective qui permet au co-chaperon de moduler le cytosquelette d’actine. Il

reste à savoir si la CASA pourrait cibler d’autres substrats, comme des protéines

« mécanosensibles », et si son implication peut être élargie aux cellules non-musculaires.

35

Dans ce contexte, nous nous sommes demandés si certaines des activités de BAG3 dans le

remodelage du cytosquelette d’actine pourraient être spécifiées par HSPB8 dans les

cellules cancéreuses, et pourraient faire intervenir son action dans l’autophagie sélective.

Pour répondre à cette question, nous avons choisi comme modèle paradigme : la division

cellulaire. En effet, durant ce processus cellulaire, les structures à base d’actine sont

soumises à des forces mécaniques importantes. Nous avons donc émis l’hypothèse, que

BAG3, en association avec HSPB8, participe au maintien et à l’organisation des structures

à base d’actine qui dirigent la division cellulaire. Ainsi, les prochaines sections auront pour

but d’introduire les mécanismes moléculaires et les régulateurs clés qui assurent la

formation et l’intégrité des structures contractiles d’actine lors de la division cellulaire.

1.4. Contrôle de la division cellulaire par le remodelage des structures à base d’actine

La division cellulaire est le processus par lequel une cellule mère donne deux cellules filles.

Cet événement est gouverné par l’activation de la kinase CDK1 (« cyclin-dependent kinase

1 »), dépendante de son association à la cycline B, qui régule l’engagement de la cellule

dans la division cellulaire, assure la progression mitotique et la ségrégation correcte du

matériel génétique (Lindqvist, Rodríguez-Bravo, et Medema 2009). La mitose se divise en

trois étapes : la prophase, la prométaphase et la métaphase (Figure 1.8). Elle est suivie de

la cytokinèse qui se divise en deux étapes : l’anaphase et la télophase dont l’aboutissement

conduit à l’étape d’abscission c’est-à-dire la séparation physique des cellules filles (Figure

1.8). Deux processus clés qui gouvernent la mitose et la cytokinèse, respectivement,

dépendent d’un remodelage précis de structures à base d’actine : l’arrondissement

mitotique à l’entrée des cellules en mitose, et la formation de l’anneau contractile

d’actomyosine (AC) qui contrôle la cytokinèse. Ces processus, ainsi que les régulateurs

clés identifiés à ce jour, seront décrits dans les sections suivantes.

36

Figure 1.8: Schématisation des différentes étapes de la division cellulaire. La mitose se divise en cinq étapes. En prophase, l’ADN se condense, l’enveloppe nucléaire se rompt et les pôles du futur fuseau mitotique appelés centrosomes se séparent. En prométaphase, les chromosomes sont capturés au niveau des kinétochores par les microtubules. Une fois que ces derniers sont attachés aux deux centrosomes via les microtubules appelés fibres k, ils s’alignent à la plaque métaphasique en métaphase. À ce stade les deux centrosomes sont positionnés de part et d’autre de la cellule de façon symétrique grâce aux microtubules astraux et à la protéine motrice dynéine. Les chromatides sœurs sont séparées et tractées vers les centrosomes en anaphase A. En anaphase B, une séparation physique du matériel génétique des futures cellules filles est assurée par la formation du fuseau central fait de microtubules antiparallèles appelés microtubules intermédiaires enchevêtrés à la zone médiane. Durant cette phase, l’AC se forme et contracte le cortex formant ainsi le sillon de clivage. En télophase, l’anneau se contracte jusqu’à former une structure compacte bordée de microtubules denses formant le PI (pont intercellulaire) séparé en deux par une structure dense formée d’un échafaudage de protéines appelé « midbody ring ».

37

1.4.1. Les régulateurs de la dynamique de l’actine impliqués dans la division

cellulaire

In vitro, la polymérisation des filaments d’actine se déroule selon un processus nommé

« treadmilling » qui consiste en l’allongement et la dissociation du filament simultanés aux

extrémités (+) et (-) du filament respectivement (Lodish et al. 2000). La polymérisation de

l’actine pendant le « treadmilling » est extrêmement lente et ne peut pas expliquer à elle

seule la dynamique de structures à base d’actine qui dirigent les propriétés mécaniques de

la cellule et les changements morphologiques qui y sont associés. Il est donc évident que

la cellule a développé différentes stratégies pour pouvoir modeler le cytosquelette d’actine

face aux contraintes et aux stimuli environnementaux. Pour ce faire, la cellule dispose d’un

grand nombre de protéines particulières appelées ABP (« Actin Binding Proteins »)

(Pollard, Blanchoin, et Mullins 2000). Ces protéines interagissent directement avec l’actine

et peuvent d’une manière ou d’une autre modifier les propriétés dynamiques et/ou

structurales du cytosquelette d’actine. Plus de 60 familles de protéines ABP ont été

identifiées chez les eucaryotes comprenant des protéines de coiffe et des nucléateurs de

l’actine. Dans les sections suivantes nous décrirons des ABP qui sont impliquées dans la

progression de la division cellulaire.

1.4.1.1. Le nucléateur de l’actine banchée : le complexe Arp2/3

Le complexe Arp2/3 constitué de 7 sous-unités, dont les protéines Arp2 et Arp3, fût le

premier nucléateur de l’actine découvert par Machesky et al. 1994. Ce nucléateur permet

de créer un réseau branché d’actine requis dans une multitude de fonctions biologiques.

Notamment, ces réseaux branchés sont requis pour la formation du lamellipode au front de

migration cellulaire, la phagocytose, l’établissement de la polarité cellulaire, ou encore la

division asymétrique (Lai et al. 2008; Sun et al. 2011; Georgiou et al. 2008; Insall et al.

2001; May et al. 2000; Machesky et al. 1997; Suraneni et al. 2012; Hable et Kropf 2005;

Xiong, Mohler, et Soto 2011; Bailly et al. 2001). Le complexe Arp2/3 régule également la

motilité intracellulaire des endosomes, des lysosomes, des vésicules pinocytaires et des

38

mitochondries (Boldogh et al. 2001; Georgiou et al. 2008; Moore et al. 2016; Insall et al.

2001; Zhou, Sumigray, et Lechler 2015; Moreau et al. 1997; Duleh et Welch 2010).

Biochimiquement, il a été montré qu’Arp2/3 se lie sur le côté des filaments d’actine où il

initie la polymérisation d’un nouveau filament avec un angle d’environ 70° (Figure 1.9)

(Bailly et al. 2001; Mullins, Heuser, et Pollard 1998). In vivo, l’activation d’Arp2/3 est

dépendante de facteurs favorisant la nucléation (NPF : « Nucleation-Promoting Factor »)

(Symons et al. 1996; Rohatgi et al. 1999a; Ma, Rohatgi, et Kirschner 1998; Torres et Rosen

2006; Ten Klooster et al. 2006). Les NPF comprennent des membres de la famille des

protéines du syndrome de Wiskott-Aldrich comme les protéines WASP (« Wiskott–

Aldrich syndrome protein »), SCAR (« suppressor of cAMP receptor »), et WAVE

(« WASP-family verprolin-homologous protein »), lesquelles sont régulées par les petites

GTPases de la famille Rho en réponse à la signalisation cellulaire (section 1.4.1.4) (Welch

et Mullins 2002; Goode et Rodal 2001). L'ajout d’un NPF à Arp2/3 induit des

réarrangements structurels majeurs du complexe qui lui permettent de former une pseudo-

actine servant de base pour la nucléation de l’actine (Figure 1.9) (Volkmann et al. 2001;

Rouiller et al. 2008; Goley et al. 2004; Rodal et al. 2005).

Il est à noter que la cortactine, une protéine n’appartenant pas à la famille des NPF, peut

également intéragir et activer le complexe Arp2/3 (Weed et al. 2000; Uruno et al. 2001;

Weaver et al. 2001). En effet, la cortactine est une protéine adaptatrice qui possède un

domaine NTA (« N-terminal acidic domain ») commun aux NPF lui permettant d’intéragir

avec le complexe Arp2/3 (Wu et al. 1991; Weed et al. 2000). De plus, la cortactine lie

l’actine ce qui lui permettrait de contribuer à la stabilisation des filaments branchés formés

suite à l’activation du complexe Arp2/3 (Wu et Parsons 1993; Weaver et al. 2001; Weed

et al. 2000). Il est à noter que la cortactine possède également un domaine SH3 qui lui

permet de s’associer avec une multitude de partenaires l’impliquant de cette manière dans

un grand nombre de processus physiologiques comme la migration cellulaire et la mise en

place des jonctions cellulaires (Helwani et al. 2004; Kowalski et al. 2005; Zhang et al.

2009). Notamment, son association et sa phosphorylation par la kinase Src contribuent à

stimuler son association à Arp2/3 et son activation subséquente (Wu et al. 1991; Tehrani

39

et al. 2007). Un tel mécanisme a été associé à la migration et l’invasion tumorale (Mader

et al. 2011; Wu et al. 2016; Mezi et al. 2012; Oser et al. 2010). La cortactine est également

acétylée et déacétylée par différentes enzymes dont la déacétylase HDAC6 (Zhang et al.

2007). L’acétylation de la cortactine empêche son association à la F-actine et induit sa

localisation nucléaire ce qui réduierait la migration cellulaire (Zhang et al. 2007; Ito et al.

2015).

Figure 1.9: Schéma du mécanisme par lequel le complexe Arp2/3 induit la polymérisation d’un nouveau filament d’actine le long d’un filament préexistant. Le complexe Arp2/3 se lie sur le côté d’un filament d’actine dans un état inactif, la liaison du complexe à un NPF ou à la cortactine conduit à un changement de conformation du complexe lui permettant d’acquérir une structure proche d’un noyau d’actine à partir de laquelle un nouveau filament sera polymérisé le long du filament préexistant avec un angle de 70 °.

1.4.1.2. Les formines et la formation de faisceaux d’actine

Dans les cellules animales, les formines sont connues pour la conduite de l'assemblage de

filaments et de faisceaux d'actine linéaires dans les filopodes, les lamellipodes, ou encore

les fibres de stress (Watanabe et al. 2008; Satoh et Tominaga 2001; Yang et al. 2007;

Schirenbeck et al. 2005; Pellegrin et Mellor 2005; Block et al. 2008). Des études proposent

que la polymérisation des filaments d’actine conduite par les formines est à l’origine de la

production des forces requisent pour la déformation des membranes dans le filopode et le

lamellipode (Schirenbeck et al. 2005). En outre, les réseaux linéaires d’actine produits par

les formines servent d’échafaudage pour les protéines motrices de l’actine : les myosines

40

(section 1.4.1.3). Ces réseaux linéaires d’actine contenant des myosines génèrent ainsi de

fortes contraintes de traction à l’origine des forces motrices et de la contraction cellulaire

(Aratyn-Schaus, Oakes, et Gardel 2011; Case et Waterman 2015).

Au niveau structurel, les formines se caractérisent par la présence de domaines conservés

FH1 (« formin homology domain 1 ») et FH2 dans leur région C-terminale qui ont été

impliqués dans l’interaction des formines avec l’actine et les microtubules (Castrillon et

Wasserman 1994). Ces protéines se répartissent en sept sous-classes différentes basées sur

la divergence de la séquence du domaine FH2: Dia (« Diaphanous »), FRL (« Formin-

Related proteins in Leukocytes »), DAAM (« Dishevelled-Associated Activators of

Morphogenesis »), FHOD (« Formin-Homology Domain proteins »), FMN (Formine),

Delphilin et INF (« Inverted-Formin ») (Higgs et Peterson 2005).

Biochimiquement, les domaines FH2 se lient aux extrémités barbées des filaments

d’actines et agissent comme des coiffes processives sur les filaments en élongation. En

conséquence, les formines préviennent de l’arrêt de l’élongation induit par d’autres

protéines de coiffe (Harris, Li, et Higgs 2004; Romero et al. 2004). Le domaine FH1 des

formines permet d’accélérer la vitesse de polymérisation de la F-actine en aidant à la

livraison rapide des formines à l'extrémité barbée (+) de la F-actine (Paul et al. 2008; Paul

et Pollard 2009). Grâce à cette interaction, les formines peuvent ainsi accélérer de 19 fois

l’ajout de monomères d’actine à l’extrémité barbée coiffée (Kovar et al. 2006; Romero et

al. 2004; Vidali et al. 2009).

1.4.1.3. La myosine II et la contractilité cellulaire

Les myosines sont les protéines motrices de l’actine qui utilisent de l'énergie dérivée de

l’hydrolyse de l'ATP pour générer de la force et des mouvements le long des filaments

d'actine. Chez l’humain, 38 gènes codant pour des myosines séparées en douze classes

(classes I à XII) ont été identifiés (Masters, Kendrick-Jones, et Buss 2017). La myosine II

(MyoII) présente un intérêt particulier pour nos travaux puisqu’elle est fortement impliquée

dans les mécanismes de régulation du cytosquelette d’actine lors de la division cellulaire.

41

De plus, elle gouverne la contractilité des réseaux d’actine et la tension cellulaire dans les

cellules non musculaires. Ainsi, la MyoII est essentielle pour la motilité et l’adhésion

cellulaires, la morphogénèse tissulaire ainsi que l’invasion tumorale et la progression

métastatique (Franke, Montague, et Kiehart 2005; Bertet, Sulak, et Lecuit 2004; Franke,

Montague, et Kiehart 2005; Beningo et al. 2001; Walker et al. 2010; Even-Ram et al. 2007;

Vicente-Manzanares et al. 2009; Betapudi, Licate, et Egelhoff 2006).

Toutes les myosines sont composées d'une ou deux chaînes lourdes qui peuvent dimériser

et de plusieurs chaînes légères qui régulent l’activité ATPase des myosines. La MyoII est

constituée de deux chaînes lourdes associées à deux chaînes légères régulatrices (Figure

1.10). Comme toutes les chaînes lourdes des myosines, celles de la MyoII contiennent trois

domaines structurellement et fonctionnellement différents (Figure 1.10). Le domaine de la

tête globulaire contient des sites de liaison à l’actine et à l’ATP et est responsable de la

génération de forces (Mornet et al. 1979; Cope et al. 1996). À côté du domaine de la tête

se trouve la région du col α-hélicoïdal qui est associée aux chaînes légères régulatrices

(Figure 1.10). Le domaine de la queue contient une hélice a super-enroulée importante

pour la dimérisation de la MyoII. Il est à noter que dans les cellules les dimères de MyoII

se rassemblent dans des filaments bipolaires de taille variable (de 14 à 300 myosines) qui

vont contribuer à l’organisation et à la contraction de structures à base d’actine.

Figure 1.10 : Schéma structurel d’un dimère de myosine II (adapté de Walck-Shannon et Hardin 2014). La myosine peut être divisée en trois parties : (1) la tête qui contient le domaine moteur et le domaine de liaison à l’actine, (2) le col constitué des chaînes légères qui contribuent à

42

la stabilité de la protéine et à la régulation de son activité, (3) et la queue principalement constituée d’hélices a super-enroulées impliquées dans la dimérisation de la myosine.

Le mouvement assuré par la MyoII se fait suite à un cycle d’hydrolyse de l’ATP par les

têtes du dimère qui va contrôler son association à l’actine (Figure 1.11) (Whittaker et al.

1995; Jontes, Wilson-Kubalek, et Milligan 1995; Uyeda, Abramson, et Spudich 1996). Ce

modèle de mouvement de la myosine est appelé « swinging lever-arm » et permet à la

myosine de faire glisser le filament d’actine et ainsi de créer un mouvement de ce dernier

conduisant à la contraction du cytosquelette d’actine (Figure 1.11) (Holmes 1997).

Figure 1.11: Schéma du mouvement assuré par la myosine le long du filament d’actine. Initialement, la protéine motrice est dans l'état de rigueur c’est-à-dire liée à l'actine mais pas au nucléotide ATP. La liaison à ce dernier provoque le détachement du domaine moteur de l'actine et son hydrolyse bloque le domaine moteur qui revient à l'actine. La libération du phosphate inorganique déclenche l'exécution du mouvement du bras levier de la myosine. Finalement l’ADP est relâché.

Il est intéressant de noter qu’en plus d’assurer la motricité de la F-actine, la MyoII serait

aussi impliquée dans le contrôle de son renouvellement par un mécanisme dépendant de sa

concentration (Wilson et al. 2010; Haviv et al. 2008). En effet, un examen attentif de la

dynamique de certains processus cellulaires a révélé une relation intime entre l'activité

ATPase de la MyoII et le taux de renouvellement de l'actine (Pelham et Chang 2002;

Medeiros, Burnette, et Forscher 2006; Guha, Zhou, et Wang 2005; Murthy et Wadsworth

2005; Zumdieck et al. 2007; Miklavc et al. 2015). Notamment, la MyoII joue un rôle dans

le renouvellement des filaments d’actine dans les neurones en croissance et dans le

recyclage de ceux-ci pendant la cytokinèse (voir section 1.4.3.2).

43

L’activité motrice, l’activation et l’état d’assemblage de la MyoII sont déterminés par la

phosphorylation de ses chaînes légères. En effet, chez les mammifères, la phosphorylation

des chaînes légères régulatrices de MyoII stimule son activité enzymatique et déclenche

son assemblage en des filaments d'ordre supérieur (Matsumura 2005). Les résidus

hautement conservés sérine 19 (S19) et thréonine 18 (T18) des chaînes légères constituent

respectivement les sites de phosphorylation primaire et secondaire responsables de la

régulation des myosines. In vitro, il a été montré que la mono-phosphorylation de S19

améliore l'activité ATPase de la myosine, son activité motrice ainsi que l'assemblage des

filaments (Somlyo et Somlyo 2003; Kim et al. 2005; Scholey, Taylor, et Kendrick-Jones

1980; Sellers, Pato, et Adelstein 1981). La di-phosphorylation simultanée de T18 et S19

améliore d’avantage l'activité ATPase et l'assemblage des filaments (Umemoto, Bengur, et

Sellers 1989; Ikebe, Koretz, et Hartshorne 1988). Il est à noter que les kinases

phosphorylant les chaînes légères de la MyoII peuvent être activées par deux voies de

signalisation : la voie de signalisation dépendante de la calmoduline/Ca2+ ou la voie de

signalisation des GTPases RhoA ou Cdc42 (section 1.4.1.4). Ces kinases comprennent les

enzymes MLCK (« Myosin Light Chain Kinases »), la kinase ROCK (« RHO-associated,

Coiled-coil Containing Protein Kinase ») ou encore la MRCK (« Myotonic dystrophy

kinase-Related Cdc42-binding Kinase ») (Ikebe et Hartshorne 1985; Amano et al. 1996;

Leung et al. 1998).

1.4.1.4. Les Rho GTPases

La famille des Rho GTPases est une famille conservée de 20 petites GTPases qui agissent

comme des interrupteurs moléculaires régulant de nombreux processus cellulaires

essentiels, notamment ceux qui dépendent de la dynamique de l'actine. La plupart des Rho

GTPases se situent entre un état actif, reliées au GTP et un état inactif, liées au GDP. Dans

leur conformation active (liée au GTP), les Rho GTPases s’associent avec des membranes

cellulaires et peuvent intéragir avec et activer des protéines effectrices spécifiques, ce qui

entraîne des effets localisés sur le cytosquelette d’actine.

44

Les Rho GTPases sont activées par des facteurs d'échange de nucléotides (GEF : « guanine

nucleotide exchange factor ») et sont inactivées par des protéines stimulant leur activité

GTPase (GAP : « GTPase activating proteins ») (Hodge et Ridley 2016). De plus, les

inhibiteurs de dissociation de nucléotides (GDI : « guanine nucleotide dissociation

inhibitor ») contribuent à l'inactivation des Rho GTPases en les extrayant de la membrane

plasmique, en liant les GTPases inactives et en empêchant leur réactivation et leur

dégradation. Par conséquent, l'emplacement et l'étendue de l'activité des Rho GTPases et

leur signalisation dépendent fortement de la localisation et de l'activité des GEF, GAP et

GDI, ainsi que de la disponibilité de leurs effecteurs.

La famille des Rho GTPases chez les mammifères comprend huit membres dont RhoA

(« Ras homolog gene family, member A »), Cdc42 (« cell division cycle 42 ») et Rac1

(« Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 ») qui sont les plus étudiés (Jansen et al.

2017). Il est à noter que les Rho GTPases présentent une myriade de protéines effectrices

qui vont assurer leur fonction de régulation de la dynamique du cytosquelette d’actine. Par

exemple, RhoA est connue pour activer les myosines via l’activation de la kinase ROCK

ce qui lui permet de médier la contractilité de l'actomyosine par la phosphorylation de la

chaîne légère de la myosine (Amano et al. 1996; Kimura et al. 1996; Kureishi et al. 1997).

RhoA active également la polymérisation de l’actine via l’activation des formines

(Watanabe et al. 1997). La plupart des effecteurs de Cdc42 et Rac1 arborent un domaine

typique CRIB (« Cdc42-Rac interactive binding ») qui permet leur ciblage spécifique par

ces GTPases et leur activation subséquente (Burbelo, Drechsel, et Hall 1995). Ce motif a

été retrouvé dans de nombreuses protéines interagissant avec ces GTPases comme les

kinases régulatrices du cytosquelette d’actine PAK (« p21-activated kinase »), PI3K

(« phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase ») et MRCK, ou encore les protéines

d’organisation de ce cytosquelette telles que IQGAP1 (« IQ Motif Containing GTPase

Activating Protein 1 »), les formines, WAVE et WASP (Cotteret et Chernoff 2002;

Bagrodia, Laudano, et Shalloway 1994; Vidal et al. 2002; Bashour et al. 1997; Rohatgi et

al. 1999b; Higgs et Pollard 2000; Eden et al. 2002).

45

Grâce à ces nombreuses protéines effectrices, il est admis que RhoA régule l’assemblage

des fibres de stress, Rac1 contrôle la polymérisation de l’actine à la périphérie de la cellule

pour produire les lamellipodes, alors que Cdc42 stimule la formation des filopodes (Ridley

et al. 1992; Ridley et Hall 1992; Kozma et al. 1995; Nobes et Hall 1995; Puls et al. 1999).

De plus, ces trois GTPases sont impliquées dans la formation des adhésions focales qui

sont intimement liées au cytosquelette d’actine (Nobes et Hall 1995; Hotchin et Hall 1995).

En outre, RhoA et Cdc42 présentent également des fonctions importantes durant la division

cellulaire (description dans les sections 1.4.2.2 et 1.4.3.1).

1.4.2. L’arrondisssement mitotique et son implication dans l’orientation du fuseau

mitotique et la ségrégation des chromosomes

Il a longtemps été pensé que la séparation adéquate du matériel génétique lors de la division

cellulaire reposait uniquement sur le contrôle du cytosquelette de microtubules. En effet,

ce processus implique la capture des chromosomes au niveau des kinétochores par des

kinésines situées sur les fibres k (Figure 1.12) (West, Malmstrom, et McIntosh 2002;

Wargacki et al. 2010; Mayr et al. 2007; Tolić 2017). La capture des chromosomes dépend

également du positionnement adéquat du fuseau mitotique dépendant des microtubules

astraux et de la protéine motrice dynéine (Figure 1.12) (Kiyomitsu et Cheeseman 2012,

2012; Laan et al. 2012; Kotak, Busso, et Gönczy 2012; Lee et al. 2000). Cependant, des

études récentes ont fourni des informations importantes sur la façon dont les

réarrangements du cytosquelette d’actine en mitose sont impliqués dans la fidélité de la

ségrégation chromosomique.

46

Figure 1.12 : Représentation schématique des fonctions assurées par les microtubules et leurs protéines motrices dans le positionnement du fuseau mitotique et la ségrégation des chromosomes. La dynéine grâce à sa capacité de motricité vers l’extrémité (-) des microtubules produit des forces qui tirent les microtubules astraux vers le cortex cellulaire et contribue de cette manière à tirer sur les centrosomes du fuseau mitotique pour le positionner de façon adéquate. Les kinésines localisées sur les fibres k du fuseau mitotique interagissent spécifiquement avec les kinétochores (cercles rouges) des chromosomes leur permettant ainsi la capture des chromosomes et leur transport vers le centrosome. Les flèches indiquent la direction des protéines motrices.

Notamment, l'arrondissement mitotique des cellules, dépendant du cortex d’actomyosine,

contribue à créer une géométrie optimale pour l'assemblage et le positionnement du fuseau

mitotique, facilitant la capture et l’alignement des chromosomes par les microtubules

(Kiyomitsu et Cheeseman 2012; Cadart et al. 2014; Fink et al. 2011; Nestor-Bergmann,

Goddard, et Woolner 2014; Minc, Burgess, et Chang 2011; Bird, Heald, et Weis 2013;

Théry et al. 2005; Magidson et al. 2011; Lancaster et Baum 2014; Magidson et al. 2011;

Cattin et al. 2015; Rosa et al. 2015). Ce processus important est observé tant dans les

cellules en culture qu’à l’intérieur d’un tissu où il a été associé à la morphogénèse des

vilosités intestinales, la régulation de la croissance et de la forme des cavités épithéliales

ainsi que l’invagination épithéliale (Freddo et al. 2016; Kondo et Hayashi 2013; Hoijman

et al. 2015).

47

Aussi, en conditions de culture cellulaire, le positionnement du fuseau mitotique dépend

du désassemblage des adhésions focales et de la mise en place de structures adhésives

d’actine appelées fibres de rétraction, qui permettent de faire un lien entre le substrat (i.e.

la matrice extracellulaire) et le cortex de la cellule. Le positionnement du fuseau mitotique

est aussi contrôlé par une structure hautement dynamique nommée nuage sous-cortical

d’actine, influencée par les fibres de rétraction (Mitsushima et al. 2010; Fink et al. 2011;

Théry et al. 2005).

Ainsi, interférer avec la formation de l’une de ces trois structures à base d’actine altère le

positionnement du fuseau mitotique et affecte la capture, l’alignement et la ségrégation des

chromosomes conduisant à une instabilité génétique. De ce fait, le positionnement du

fuseau mitotique doit être finement régulé et définit le contenu, la position et le devenir des

cellules filles dans les tissus (Siller et Doe 2009). Sa dérégulation a été corrélée avec

différentes pathologies, y compris la microcéphalie et le cancer (Noatynska, Gotta, et

Meraldi 2012). Il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires associés

au positionnement du fuseau mitotique.

Bien que l’arrondissement mitotique, la mise en place des fibres de rétraction et le nuage

sous-cortical d’actine aient été identifiés comme des processus impliqués dans le

positionnement du fuseau mitotique, les mécanismes moléculaires à l’origine de leur

formation et de leur maintien sont encore peu compris. Notamment, les voies de

signalisation spécifiques qui contrôlent la dynamique de l’actine dans de telles structures

sont peu étudiées. Comment est régulée la communication entre le cytosquelette d’actine

et les microtubules reste à être déterminé. Comment la dynamique de l’actine est régulée

dans le temps et dans l’espace au sein de ces structures demeure peu compris. Dans les

sections suivantes nous présenterons les processus moléculaires qui contrôlent

l’arrondissement mitotique et discuterons des questions encore non résolues.

48

1.4.2.1. Démantèlement des adhésions focales et mise en place des fibres de

rétraction

Le désassemblage des adhésions focales est la première étape conduisant à

l’arrondissement mitotique et au positionnement du fuseau. Interférer avec ce processus

altère l’arrondissement mitotique, la morphologie du fuseau mitotique, la ségrégation

chromosomique et la progression mitotique (Lancaster et al. 2013). Un joueur important

dans le démontage mitotique des adhésions focales est la petite GTPase Rap1 (Dao et al.

2009). En effet, l'inactivation de Rap1 par un mécanisme encore inconnu est nécessaire

pour le désassemblage des adhésions focales puisqu’une forme constitutivement active de

Rap1 inhibe un tel désassemblage et force les cellules en culture à maintenir une

morphologie plus plate tout au long de la mitose (Dao et al. 2009; Lancaster et al. 2013).

Il est intéressant de souligner ici que Rap1 a été identifiée comme étant un partenaire de

BAG3, impliquée dans ses effets sur l’adhérence cellulaire (Iwasaki et al. 2010).

De plus, le désassemblage des adhésions focales requiert également la protéine DEPDC1B

(« DEP domain containing 1B ») (Marchesi et al. 2014). En effet, DEPDC1B s'accumule

spécifiquement à la phase G2 du cycle cellulaire et inhibe le recrutement et l'activation de

RhoA par la protéine associée aux adhésions focales PTPRF (« receptor protein tyrosine

phosphatase, receptor type, F »). Par ce mécanisme, DEPDC1B fonctionne comme un

inhibiteur de la voie de signalisation RhoA/ROCK/MLC2 (« Myosin Light Chain 2 »)

pendant la transition G2/M, ce qui permet le démantèlement des adhésions focales et le

détachement des cellules.

Bien que le désassemblage des structures d’adhésion soit un prérequis à l’arrondissement

mitotique, les cellules mitotiques en culture doivent garder un contact avec leur substrat.

Ce contact est dépendant de la mise en place de structures d’actine hautement dynamiques

qui permettraient de faire un pont entre le substrat et le cortex mitotique : les fibres de

rétraction. En effet, par le contrôle de la répartition spatiale de la matrice extracellulaire

sur le substrat et donc du positionnement des fibres de rétractions, l’équipe de Bornens M.

démontra que cette répartition joue un rôle dans l'orientation du fuseau mitotique des

49

cellules HeLa (Théry et al. 2005). Les résultats de l’équipe indiquèrent que la matrice

extracellulaire contrôle l'emplacement de la dynamique de l'actine à la membrane en dictant

la répartition hétérogène de composants corticaux impliqués dans cette dynamique comme

l’ezrine (voir section 1.4.2.4). Les auteurs conclurent que les fibres de rétractions

permettent de lier le substrat au cortex d’actomyosine en mitose et assurent la

« communication » entre ces deux structures.

Ceci fût confirmé par des expériences d'ablation au laser qui montrèrent que la répartition

polarisée des fibres de rétraction pendant la mitose constitue une mémoire du modèle

d'adhérence en interphase et influence l'orientation du fuseau mitotique (Fink et al. 2011).

Le mécanisme moléculaire par lequel les fibres de rétraction contrôlent le positionnement

du fuseau mitotique implique la régulation spatiotemporelle de la dynamique du nuage

sous-cortical d’actine. Ceci sera décrit dans le pargaraphe 1.4.2.3. Il est à noter qu’à l’heure

actuelle, la composition des fibres de rétraction est inconnue. Seules quelques protéines

ont été localisées par immunofluorescence dans de telles structures notamment la F-actine,

l’ezrine et la cortactine (Théry et al. 2005).

Ainsi, de nos jours, bien que leur importance ait été établie, les mécanismes moléculaires

contrôlant le démantèlement des adhésions focales et la mise en place et le contrôle de la

dynamique des fibres de rétraction restent encore à être élucidés.

1.4.2.2. Fonctions essentielles de RhoA et de la myosine II dans la mise en place et

le maintien de la tension corticale à l’orgine de l’arrondissement mitotique

En parallèle avec le démantèlement des structures d’adhérence, les structures d'actine

interphasiques, telles que les fibres de stress, se désassemblent et se réorganisent en un

cortex riche en actomyosine sous la membrane plasmique (Maddox et Burridge 2003). Ce

réseau cortical d'actomyosine contribue à l'augmentation de la rigidité corticale requise

pour l'arrondissement mitotique contre son environnement que ce soit en culture ou dans

un tissu (Sorce et al. 2015). En outre, le cortex mitotique fournit des sites de fixation pour

les microtubules astraux, aidant ainsi à positionner et à séparer les centrosomes du fuseau

50

mitotique (Rosenblatt et al. 2004; Busson et al. 1998; O’Connell et Wang 2000). En

conséquence, le cortex mitotique contribue à la formation d’une géométrie cellulaire

favorable au positionnement du fuseau mitotique et à la ségrégation adéquate des

chromosomes (Cadart et al. 2014; Minc, Burgess, et Chang 2011; Lancaster et al. 2013).

RhoA, à travers la régulation de la MyoII, a un rôle majeur à jouer dans la formation et le

maintien de la rigidité du cortex d'actomyosine en mitose (Figure 1.13). En conséquence,

dès l’entrée des cellules en mitose, l’activité de RhoA doit être inhibée au niveau des

adhésions focales, mais stimulée au niveau du cortex cellulaire (Matthews et al. 2012;

Maddox et Burridge 2003). L’activation de RhoA à l’entrée en mitose dépend d’une part

de l'inactivation de son inhibiteur p190RhoGAP, et d’autre part de l’activation de la GEF

ECT2 (« epithelial cell transforming 2 ») (Tatsumoto et al. 1999; Niiya et al. 2006; Maddox

et Burridge 2003). Une étude réalisée chez la mouche indique que l’activation de la GEF

ECT2 conduit à l’activation de RhoA et de Cdc42 (Figure 1.13) (Rosa et al. 2015). Dans

ce contexte, RhoA est essentielle à l’activation de MyoII, tandis que Cdc42, en

collaboration avec les protéines de polarité PAR6 (« partitioning-defective protein 6 ») et

aPKC (« atypical protein kinase C »), contrôle la localisation et l’activation corticale de

mDia1 (Figure 1.13). Ainsi, RhoA agit sur l'arrondissement mitotique et la rigidité corticale

par l'activation de la kinase ROCK et la phosphorylation subséquente des chaînes légères

de la MyoII. L’activation locale de mDia1 par Cdc42 quant à elle permet d’induire la

polymérisation de l’actine et de former un réseau d’actine favorable au recrutement de

MyoII au cortex (Ramanathan et al. 2015).

Il est à noter que dans cette même étude, les auteurs ont également démontré, par imagerie

en temps réel, qu’il existe un changement d’organisation de l’actine corticale à l’entrée des

cellules en mitose qui devient strictement dépendant de mDia1 et non plus d’Arp2/3. En

conséquence, il semblerait que le complexe Arp2/3 ne soit pas nécessaire à la formation du

cortex mitotique et au maintien de la rigidité corticale en mitose (Bovellan et al. 2014). En

revanche, Arp2/3 a récemment été impliqué dans le positionnement du fuseau mitotique en

contrôlant la dynamique du nuage sous-cortical d’actine (section 1.4.2.3).

51

Figure 1.13 : Schéma représentatif de la voie de signalisation impliquée dans la formation du cortex mitotique et le maintien de sa rigidité.

En résumé, l’activation de la MyoII par RhoA, de concert avec une architecture de l’actine

favorable dépendante de mDia1 et de Cdc42, contribuent à l’arrondissement mitotique et

au maintien d’une tension optimale du cortex mitotique requise pour le positionnement

adéquat du fuseau mitotique. Ainsi, un mécanisme moléculaire à l’origine de la formation

du cortex mitotique a émergé des récentes études. Cependant, les données obtenues chez

la mouche, quant à l’activation et la localisation de mDia1 dépendante de Cdc42, n’ont pas

encore été corrélées chez les mammifères. L’activité de Cdc42 est-elle limitée à l’activation

de mDia1 ou d’autres cibles de la GTPase sont-elles requises pour la formation du cortex

mitotique, est une question non répondue également. De plus, le mécanisme moléculaire à

l’origine de l’inactivation de p190RhoGAP n’a pas encore été élucidé. Une question

critique qui demeure concerne les mécanismes par lesquels la régulation spatiotemporelle

52

de différents types de structures d’actine, notamment via la ségrégation des activités Rho

GTPases, est assurée.

1.4.2.3. Contrôle du positionnement du fuseau mitotique par le nuage sous-cortical

d’actine et l’implication du complexe Arp2/3 dans ce processus

Comme mentionné précédemment, le complexe Arp2/3 ne serait pas essentiel à la

formation du cortex mitotique. En revanche, l’activité d’Arp2/3 est nécessaire pour réguler

la dynamique du nuage sous-cortical d’actine impliqué dans le positionnement du fuseau

mitotique (Mitsushima et al. 2010).

En effet, des travaux ont montré que ce nuage d'actine est hautement dynamique durant la

métaphase. Le renouvellement rapide de l'actine dans les filaments se déroulerait partout

dans le nuage et serait également nécessaire pour sa rotation pendant la mitose (Figure

1.14). La rotation du nuage est en réalité liée à une dynamique de

polymérisation/dépolymérisation locale qui serait dépendante du nucléateur puisque la

déplétion d’Arp3 abolie la formation du nuage sous-cortical. La fonction mitotique de ce

nuage d'actine est de contribuer à l'orientation du fuseau mitotique. Effectivement, des

analyses dynamiques suggèrent que le nuage régule la rotation du fuseau mitotique d'une

manière dépendante des microtubules astraux (Fink et al. 2011). En outre, par des

expériences d'ablation au laser, il a été montré que la répartition des fibres de rétraction

influence la distribution et les mouvements polarisés de ces nuages d'actine.

53

Figure 1.14 : Schéma modèle du mouvement du nuage sous-cortical d’actine durant la mitose. La zone (rose) dans la partie inférieure de la cellule indique la zone dans laquelle la polymérisation de l'actine et la dépolymérisation se produisent activement. Rose, filaments d'actine; Flèches jaunes, la direction du mouvement de rotation. Inspiré de Mitsushima et al. 2010.

La communication du nuage sous-cortical d’actine avec les microtubules astraux passerait

par la myosine non conventionnelle myosine X (Myo10) (Figure 1.15). En effet,

récemment, Kwon et coll ont noté que la liaison directe de Myo10 aux microtubules est

essentielle pour son rôle dans le positionnement des centrosomes (Kwon et al. 2015). Leurs

analyses quantitatives démontrèrent que Myo10 régule la dynamique des microtubules

astraux et est requise pour les interactions des microtubules avec le cortex. Ainsi, ces

résultats suggérèrent que Myo10 couple les forces dépendantes des fibres de rétraction et

les nuages sous-corticaux d'actine aux centrosomes, afin de permettre le positionnement

adéquat du fuseau mitotique (Figure 1.15).

54

Figure 1.15 : Modèle selon lequel la Myo10 assure la communication des fibres de rétraction, du cortex et du nuage sous-cortical d’actine avec le centrosome.

L’ensemble de ces résultats met en évidence un rôle majeur de la dynamique de l’actine

dans le contrôle du positionnement du fuseau mitotique, négligé pendant plusieurs années.

Il semble de plus en plus clair qu’une régulation spatiotemporelle fine des différents

intervenants du remodelage de l’actine est cruciale pour la progression normale de la

mitose. Cependant, les mécanismes moléculaires qui les dirigent demeurent peu compris.

La découverte du nuage sous-cortical d’actine soulève plusieurs questions laissées sans

réponses à ce jour. Par quelle voie de signalisation la cellule mitotique régule-t-elle

l’activation d’Arp2/3 dans le nuage sous-cortical? Comment la dynamique de

polymérisation/dépolymérisation locale est-elle contrôlée? La Myo10 est-elle la seule

protéine couplant les forces dépendantes des fibres de rétraction et les nuages sous-

corticaux d'actine aux centrosomes?

1.4.2.4. Promotion de la rigidité corticale et du positionnement du fuseau mitotique

par les protéines ERM

Comme nous l’avons décrit précédemment, il est connu que la MyoII est responsable du

maintien de la rigidité corticale dans les cellules en mitose grâce à son recrutement

55

dépendant de mDia1 et de RhoA. De récentes études suggérèrent que les protéines ERM

(Ezrine-Radaxine-Moésine) favorisent la rigidité corticale en se liant aux filaments

corticaux d'actine (Kunda et al. 2008; Carreno et al. 2008).

Les protéines ERM sont une famille d'agents de réticulation de l’actine et de la membrane

plasmique qui contrôlent la rigidité et la stabilité du cortex cellulaire (Fehon, McClatchey,

et Bretscher 2010). En mitose, il a été noté que la réduction des niveaux d’expression de

moésine, le seul membre de la famille présent chez la drosophile, conduit à une instabilité

corticale massive et à un bourgeonnement des cellules. Il en résulte des oscillations

exagérées du fuseau mitotique et un mauvais positionnement de ce dernier (Kunda et al.

2008; Carreno et al. 2008). Ceci fût confirmé dans les cellules de mammifères où les

membres de la famille ERM sont cruciaux pour organiser le cortex mitotique (Carreno et

al. 2008; Kunda et al. 2008; Machicoane et al. 2014). En effet, lors de l'entrée en mitose,

les ERM sont activées par la kinase SLK (« sterile 20-like kinase ») et aident alors à

l'interaction entre la membrane plasmique et le réseau d'actomyosine (Machicoane et al.

2014). Ainsi, grâce à leur capacité de réticulation, les protéines ERM assurent la répartition

de la tension corticale, empêchant ainsi la contraction locale du cortex et en conséquence

la déformation cellulaire.

De plus, les protéines ERM ont récemment été étudiées pour leur rôle dans l'orientation du

fuseau mitotique dans les cellules de vertébrés. Lorsque des cellules humaines sont

cultivées sur des matrices micro-fabriquées en forme de L, les protéines ERM sont réparties

asymétriquement, avec un enrichissement dans le domaine cortical face aux fibres de

rétraction (Théry et al. 2005; Machicoane et al. 2014). La réduction des niveaux

d’expression des trois protéines ERM ainsi que l'altération de leur activation par déplétion

de la kinase SLK entraînent une désorientation du fuseau mitotique dans l'espace

(Machicoane et al. 2014). Ce phénotype a été associé à la perte de la localisation corticale

de LGN (leucine–glycine–asparagine) et de NuMA (« nuclear and mitotic apparatus »), qui

ont des fonctions centrales dans l'orientation et le positionnement du fuseau mitotique

(Morin et Bellaïche 2011). Ces observations suggèrent que les protéines ERM activées sont

nécessaires pour le recrutement cortical du complexe LGN ou sa stabilité dans ce contexte.

56

Il est important de noter que, contrairement aux effets observés lors de la déplétion de la

moésine dans la mouche, la réduction des niveaux protéiques des protéines ERM ne génère

pas d'altération évidente de la forme cellulaire et de la morphologie du fuseau mitotique

dans les cellules humaines, argumentant dans le sens d'un rôle spécifique de ces protéines

dans l’orientation du fuseau par le contrôle de la localisation du complexe LGN. Par

ailleurs, des évidences montrent que les protéines ERM peuvent aussi contrôler le

positionnement du fuseau mitotique en stabilisant l'interaction des microtubules astraux

avec le cortex (Kunda et al. 2008; Solinet et al. 2013).

En résumé, un rôle des protéines ERM dans le maintien de la rigidité corticale et le

positionnement du fuseau en mitose émerge depuis les dernières années. Cependant, de

telles fonctions sont encore peu comprises. Le complexe est-il vraiment requis pour le

positionnement du fuseau mitotique ? Est-ce leur capacité de réticulation qui leur permet

de maintenir la tension corticale en mitose ? Comment la localisation des ERM en mitose

est-elle contrôlée ? Sont-elles impliquées dans la « communication » entre les fibres de

rétraction et le nuage sous-cortical d’actine ? Telles sont les questions qui restent à être

élucidées.

1.4.3. Les mécanismes de contrôle de l’anneau contractile en cytokinèse

Une fois que le fuseau mitotique est positionné et les chromosomes capturés correctement,

la cycline B est progressivement dégradée permettant ainsi l’engagement de la cellule dans

la cytokinèse (Wheatley et al. 1997; Sigrist et al. 1995). Cette étape requiert la séparation

du matériel génétique assurée par les microtubules du fuseau mitotique ainsi que la

formation des futures cellules filles qui dépend du contrôle accru de la dynamique du

cytosquelette d’actine spatialement et temporellement. En effet, ce processus se caractérise

par la formation et la contraction de l’AC, au centre de la cellule en division (Figure 1.8).

La division cellulaire facilitée par un anneau contractile d’actomyosine est une

caractéristique presque universelle dans toutes les niches évolutives.

57

Le processus de cytokinèse peut être divisé en quatre étapes distinctes. Tout d'abord, la

cellule doit spécifier un emplacement pour placer l’AC afin d’assurer une séparation

adéquate du contenu de la cellule en deux cellules filles. Deuxièmement, la cellule doit

pouvoir transporter toutes les composantes nécessaires dans cette région et construire un

AC de manière fiable et efficace. Troisièmement, l’AC doit générer un stress contractile

de manière régulée, pour cliver physiquement la cellule mère en deux cellules filles. Enfin,

l'anneau doit être désassemblé pour permettre le recrutement de la machinerie de

l'abscission et en conséquence permettre la séparation physique des cellules filles.

Ainsi, l’échec de l’une de ces quatre étapes conduit immanquablement à l’avortement de

l’abscission, à une forte instabilité génétique et à une augmentation de l’aneuploïdie

(Sagona et Stenmark 2010; Urzúa et al. 2016; McKenzie et D’Avino 2016; Lv et al. 2012).

Les principaux régulateurs et les questions actuelles concernant les 4 étapes de la

cytokinèses seront décrits ci-après.

1.4.3.1. Spécification et formation de l’AC : un rôle crucial pour RhoA et mDia2

Dans les cellules de métazoaires, la sélection du site de division se produit au cours de

l'anaphase et dépend du ciblage de la forme active de RhoA à la membrane équatoriale

(Bement, Benink, et von Dassow 2005). En effet, l’inhibition de RhoA ou l’expression

d’un dominant négatif de la GTPase inhibe la formation du sillon de clivage en cytokinèse

dans de multiples systèmes comme la drosophile, l’embryon de xénoppe et les cellules de

mammifères (Kishi et al. 1993; Prokopenko et al. 1999; Drechsel et al. 1997; Crawford et

al. 1998; Moore et al. 1994; Zhong et al. 2005). Des études d’immuno-localisation ont

montré que la protéine RhoA s'accumule au niveau du sillon de clivage avant même que la

cellule ne commence à se contracter (Takaishi et al. 1995; Madaule et al. 1998; Nishimura

et Yonemura 2006; Yüce, Piekny, et Glotzer 2005; Kamijo et al. 2006). Cette localisation

spatiale et temporelle de la GTPase suggérait alors que la protéine devait spécifier le plan

de division de la cellule.

58

Deux mécanismes moléculaires ont été associés à la spécification de ce plan par le contrôle

du ciblage de RhoA: les microtubules astraux et le complexe « centralspindlin ». En effet,

des études ont montré qu'un sous-ensemble de microtubules astraux stables fournit des

composantes du sillon de clivage au cortex pour spécifier la position de la GTPase

(Canman et al. 2003; Foe et von Dassow 2008; Odell et Foe 2008). À l’inverse, les

microtubules astraux dynamiques permettraient d’exclure des pôles cellulaires la MyoII et

RhoA (Rankin et Wordeman 2010; Zanin et al. 2013). De cette façon, il est proposé que

les microtubules astraux permettent de recruter au sillon de clivage des facteurs clés dans

l’assemblage et la constriction de l’AC, tels que la MyoII et RhoA.

Le complexe « centralspindlin » est également l’un de ces facteurs clés qui contribue

majoritairement à l’activation locale de la GTPase RhoA au sillon de clivage. Il s’agit d’un

hétéro-tétramère formé de la kinésine MKLP1 (« mitotic kinesin-like protein 1 ») et de la

protéine CYK-4 (ou MgcRacGAP). La découverte d'une interaction directe entre la sous-

unité CYK4 et ECT2 a immédiatement conduit à une voie linéaire pour l'induction de la

formation de l’AC: « centralspindlin » → recrutement d’ECT2 → activation de RhoA →

induction de l’AC (Figure 1.16) (Yüce, Piekny, et Glotzer 2005; Nishimura et Yonemura

2006; Kamijo et al. 2006; Dean et al. 2005; Zhao et Fang 2005).

L’activation de RhoA se traduit alors par l’activation de la kinase ROCK et de la formine

mDia2 au sillon de clivage (Figure 1.16) (Castrillon et Wasserman 1994; Watanabe et al.

2008)). En effet, des travaux ont montré que la déplétion de mDia2, qui se localise au sillon

de clivage en anaphase et télophase, conduit à une augmentation de la quantité de cellules

binuclées caractérisant une abscission inefficace et provoque une contraction dans des sites

aberrants (Watanabe et al. 2008). Dans cette même étude, les auteurs ont noté que le

traitement avec la blebbistatine, un inhibiteur de la MyoII, en plus de supprimer cette

contraction anormale, corrige également la localisation de la GTPase RhoA et de la MyoII.

Cette étude révéla également que la quantité de F-actine dans la région équatoriale pendant

l'anaphase/télophase est significativement diminuée suite à la déplétion de mDia2. Ces

résultats démontrèrent ainsi que la formine est essentielle pour la cytokinèse des cellules

de mammifères. Le réseau de F-actine conduit par mDia2 forme un échafaudage pour les

59

protéines de l’AC et permet le maintien de la position de l’AC au centre de la cellule en

division.

Il est à noter que bien d’autres protéines sont impliquées dans la formation et l’organisation

de l’AC. Notamment, l’ancrage de l’AC à la membrane plasmique serait assuré par

l’anilline (D’Avino 2009; Field et al. 2005). Cette protéine d’échafaudage est aussi

importante pour l'organisation et le recrutement de protéines structurales et de signalisation

dans l'AC (Maddox et al. 2005; Hickson et O’Farrell 2008; Piekny et Glotzer 2008;

Maddox et al. 2005; Thomas et Wieschaus 2004).

Figure 1.16: Représentation schématique de la voie de signalisation dépendante du complexe « centralspindlin » et responsable de la spécification et de la formation de l’AC.

En somme, il apparaît que la GTPase RhoA joue un rôle prédominant dans la spécification

et la formation de l’AC. Le contrôle précis de la localisation et de l’activation de RhoA au

sillon de clivage est nécessaire pour le recrutement et l’activation des protéines mDia2 et

MyoII à l’AC. Un échec du positionnement ou de l’activation de RhoA ou de ses effecteurs

au sillon de clivage conduit immanquablement à un avortement de l’abscission. Il est

important de noter que les protéines effectrices de RhoA dans le contexte de l’AC sont les

60

mêmes que celles requises pour l’arrondissement mitotique, à savoir une formine et la

MyoII, suggérant un mécanisme commun aux deux processus. Cependant, aucune étude à

l’heure actuelle n’a démontré un tel mécanisme. De plus, l’implication des GTPases Cdc42

et Rac1 dans le positionnement et la formation de l’AC restent encore mal comprise. En

effet, la surexpression de mutants dominant positif de Cdc42 ou de Rac1 conduisent aussi

à un échec de l’abscission (Dutartre et al. 1996; Muris et al. 2002). Ces observations

suggèrent qu’un contrôle fin de l’activité des GTPases de la famille Rho et de la dynamique

de l’actine qui en découle doit avoir lieu durant le positionnement et la formation de l’AC.

1.4.3.2. La contraction de l’anneau contractile

Une fois que la position de l’AC est spécifiée et que celui-ci est formé, l’AC se contracte

progressivement. Le modèle traditionnel de la contraction de l’AC est que les filaments

bipolaires de MyoII utilisent leur activité motrice pour se déplacer le long de deux

filaments antiparallèles d'actine, causant ainsi un glissement des filaments d’actines

(Figure 1.17). Dans le cadre d'un AC, de nombreux moteurs MyoII glissant sur de multiples

filaments d'actine conduiraient à une constriction de l’AC.

Figure 1.17: Modèle traditionnel de la contraction de l’AC.

L’implication de la MyoII dans la contraction de l’AC a été largement confirmée dans

différentes espèces où son inactivation stoppe la cytokinèse (Mabuchi et Okuno 1977;

61

Straight et al. 2003). Fait important, à mesure que l'anneau se rétrécit, la section

transversale de l'anneau contractile reste constante, ce qui suggère que le désassemblage

de la F-actine doit équilibrer la polymérisation en cours (Schroeder 1972). En effet, l'actine

et la myosine s’échangent rapidement au sein du sillon de clivage avec leur « pool »

cytoplasmique, ce qui implique que leur concentration locale dépend d'un équilibre

dynamique entre polymérisation/recrutement et dépolymérisation/dissociation (Yumura

2001; Murthy et Wadsworth 2005; Chew et al. 2017; Oelz, Rubinstein, et Mogilner 2015;

Oelz et Mogilner 2016; Stachowiak et al. 2014). Le mécanisme précis par lequel la

dépolymérisation de l'actine est contrôlée au sillon de clivage reste controversé. Il semble

cependant que l'activité de séparation des filaments d'actine de la cofiline et l'activité

ATPase de la MyoII soient nécessaires pour le désassemblage de la F-actine dans l’AC

(Mendes Pinto et al. 2012; Gunsalus et al. 1995).

En somme, les composantes de l’AC sont hautement dynamiques. Ceci suggère l’existence

de mécanismes, encore méconnus, de contrôle du renouvellement des composantes de l’AC

qui contribuent à la contraction de cette structure.

1.4.3.3. Désassembler l’AC pour permettre l’abscission

À la suite de la contraction de l’AC, les protéines rémanentes de cette structure à base

d’actine, dont la F-actine, doivent être enlevées pour permettre l’abscission. Ceci permet

vraisemblablement d'amincir le PI reliant les cellules filles. L’élimination des structures

d'actine serait également nécessaire pour permettre le recrutement de la machinerie

impliquée dans la fusion des membranes plasmiques opposées et donc l’abscission.

Notamment, interférer avec le démantèlement de l’AC en cytokinèse inhibe le recrutement

du complexe ESCRT-III (« endosomal sorting complexes required for transport III ») qui

coordonne les événements de remodelage de la membrane et du cytosquelette essentiels à

l'achèvement de la division cellulaire (Eikenes et al. 2015; Stoten et Carlton 2017). Les

mécanismes moléculaires contrôlant le désassemblage de l’AC en fin de cytokinèse sont

encore peu compris, mais des études récentes indiquent un rôle important pour le

métabolisme des phosphatidylinositols et le trafic membranaire.

62

Il a été montré que la modification de l’organisation de la membrane lipidique est requise

pour signaler le désassemblage de l’AC (Emoto et Umeda 2000). En effet, il a été constaté

que le PE (phosphatidyléthanolamine) est exposé à la surface cellulaire uniquement durant

les stades tardifs de la cytokinèse (Emoto et al. 1996; Emoto et Umeda 2000). Sa

perturbation mène à une inhibition du désassemblage de l’actine au sillon de clivage et à

la fusion ultérieure des membranes, suggérant que la redistribution des phospholipides de

la membrane plasmatique est une étape cruciale pour la cytokinèse. Il a été démontré que

l'immobilisation du PE à la surface cellulaire par un peptide de liaison bloque l'inactivation

de RhoA au stade tardif de la cytokinèse (Emoto et al. 2005).

De plus, il a été observé que le PI(4,5)P2 (Phosphatidylinositole 4,5 biphosphate) accumule

au sillon de clivage de façon dépendante de la kinase effectrice de RhoA PIP5K

(« Phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase ») (Emoto et al. 2005; Field et al. 2005).

Cette accumulation contribue à la stabilisation de l’AC, ainsi que la liaison du cytosquelette

d'actine à la membrane plasmique en vertu de sa liaison aux protéines septines et ERM

(Janetopoulos et Devreotes 2006). Conformément à cela, les niveaux de PI(4,5)P2 au PI

diminuent lorsque le cytosquelette d'actine est démantelé avant que les cellules ne

progressent vers l'abscision (Wong et al. 2005).

Les travaux de (Dambournet et al. 2011) ont permis de découvrir un mécanisme

moléculaire par lequel les niveaux de PI(4,5)P2 sont réduits en cytokinèse tardive. Après

avoir déterminé dans une première étude le recrutement et l’importance de la petite GTPase

Rab35 (« Ras-related protein 35 ») au sillon de clivage lors des étapes tardives de la

cytokinèse, les auteurs ont démontré que la phosphatase OCRL (« oculocerebrorenal

syndrome of Lowe ») est un effecteur de Rab35 (Figure 1.18) (Kouranti et al. 2006). OCRL

est une PI(4,5)P2-phosphatase dont la déplétion est marquée par une inhibition de

l'abscission, une accumulation locale de PI(4,5)P2 et une accumulation anormale de F-

actine au PI (Dambournet et al. 2011).

63

Par ailleurs, très récemment, il a été proposé que l’oxydation de la F-actine est requise pour

le démantèlement de l’AC en cytokinèse tardive et que ceci nécessite également la GTPase

Rab35 (Frémont et al. 2017). Cette étude montra que l'oxydation médiant la

dépolymérisation de l'actine par l'enzyme oxydante MICAL1 (« Molecule Interacting with

CasL 1 ») est nécessaire au recrutement des effecteurs de l’abscission comme le complexe

ESCRT-III. MICAL1 serait recrutée sur le site d'abscission via une interaction directe avec

la GTPase Rab35 (Figure 1.18). Sur le plan mécanistique, les essais in vitro sur des

filaments d'actine uniques démontrèrent que MICAL1 est activée par Rab35. De plus, dans

les conditions expérimentales employées, MICAL1 n'agit pas comme une enzyme de

séparation des filaments d’actine, comme cela avait été montré initialement, mais induit

plutôt la dépolymérisation de la F-actine à partir de ses deux extrémités (Hung, Pak, et

Terman 2011; Grintsevich et al. 2016).

Un rôle pour la GTPase Rab11 a également été proposé pour la dépolymérisation de

l’actine au sillon de clivage en cytokinèse tardive. En effet, il a été démontré que les

endosomes de recyclage, associés à Rab11, sont importants pour la cytokinèse dans les

cellules de mammifères (Pelissier, Chauvin, et Lecuit 2003; Riggs et al. 2003; Wilson et

al. 2005). Une série d'études, a notamment observé que les protéines de liaison à Rab11 :

FIP3 et FIP4 (« Rab11 Family of Interacting Proteins 3 and 4 ») se localisent au PI et

interagissent simultanément avec Rab11 ainsi qu'une autre petite GTPase, Arf6 (« ADP-

ribosylation factor 6 ») (Wilson et al. 2005; Fielding et al. 2005; Hickson et al. 2003).

L'analyse spatiotemporelle des endosomes contenant FIP3 pendant la cytokinèse a

démontré que ces derniers sont une sous-population spécifique d'endosomes de recyclage

qui sont dirigés au PI au cours de la télophase tardive et qui sont nécessaires pour générer

une constriction secondaire du PI permettant l'achèvement complet de l'abscission (Schiel

et al. 2011; Wilson et al. 2005; Schiel et al. 2012; Simon et al. 2008). Il a été montré que

les protéines transportées par les endosomes Rab11-FIP3 : SCAMP2/3 (« Secretory carrier-

associated membrane protein 2 and 3 ») et p50RhoGAP, ont des rôles importants dans la

dépolymérisation de la F-actine corticale au PI pour permettre la constriction secondaire

du pont intercellulaire (Figure 1.18) (Schiel et al. 2012). p50RhoGAP permet

vraisemblablement de réduire la polymérisation de la F-actine en inactivant la petite

64

GTPase RhoA, tandis que le mécanisme moléculaire impliquant SCAMP2/3 reste peu

défini.

Figure 1.18: Mécanismes moléculaires de désassemblage de l’AC dépendant des GTPases Rab11 et Rab35.

Finalement, la protéine de coiffe cofiline qui stimule la dépolymérisation de l’actine est

également impliquée dans le désassemblage de l’AC en cytokinèse. En fait, son activité,

régulée par phosphoryaltion, apparaît contrôlée de façon mitose-spécifique par la kinase

LIMK1 (« LIM motif-containing protein kinase 1 »). La phosphorylation par LIMK1 de la

cofiline est importante en mitose pour le positionnement précis du fuseau mitotique

dépendant de la stabilité de l’actine corticale (Kaji, Muramoto, et Mizuno 2008).

Cependant, il a été établi que sa déphosphorylation et son activation subséquente en

cytokinèse sont requises pour la progression des cellules et leur abscission efficace (Amano

et al. 2002; Kaji et al. 2003). En effet, il a été montré qu’une expression ectopique de la

kinase LIMK1, impliquée dans la réorganisation du cytosquelette d’actine en inactivant la

cofiline, conduit à une accumulation de cellules multinuclées (Normand et King 2010;

Amano et al. 2002). Il a été mis en avant que la déphosphorylation de la cofiline en

cytokinèse dépend de l’activation de la phosphatase SSH1 (« Slingshot 1 ») dont la

déplétion conduit aux mêmes phénotypes que la surexpression d’un mutant

65

phosphomimétique de la cofiline et à l’accumulation aberrante de F-actine au PI (Amano

et al. 2002; Kaji et al. 2003). Ces travaux suggérèrent donc que la cofiline et la phosphatase

SSH1 sont impliquées dans le désassemblage de l’AC en cytokinèse.

Toutes ces observations montrent la complexité par laquelle est contrôlé le désassemblage

de l’AC en cytokinèse et la modulation subséquente de l’abscission. Le désassemblage

d’une telle structure pourrait aussi impliquer d’autres mécanismes à l’origine du contrôle

de la dynamique du cytosquelette d’actine. Notamment, on peut imaginer que le

démantèlement de l’AC implique des voies de dégradation des protéines. Certains travaux

ont mis en évidence l’implication de ces voies de dégradation dans la régulation de la

dynamique d’actine durant la division cellulaire. C’est ce dont nous discuterons dans la

section suivant.

1.4.4. Rôle émergeant de la dégradation ciblée de protéines comme mécanisme de

contrôle spatiotemporel du remodelage de l’actine pendant la division

cellulaire

De façon intéressante, le système ubiquitine-protéasome a été impliqué dans le remodelage

du cytosquelette d’actine au cours de la mitose. En effet, des travaux ont montré que

l’arrondissement cellulaire nécessite la dégradation de la protéine de coiffe Eps8 par le

protéasome de façon dépendante de son ubiquitination par SCFFbxw5 (« Skp1–Cul1–F-box

F-Box And WD Repeat Domain Containing 5 ») (Disanza et al. 2004; Werner et al. 2013).

Les auteurs ont notamment observé qu’interférer avec la dégradation d’Eps8 en phase G2,

par inhibition du protéasome ou déplétion de SCFFbxw5, prolonge sa localisation au cortex

cellulaire, retarde considérablement l'arrondissement mitotique des cellules et prolonge la

durée de la prométaphase. De plus, pendant les stades tardifs de la mitose et de la

cytokinèse, une activité de coiffe de la F-actine d’Eps8 semble être nécessaire pour éviter

les déformations de la membrane et de la forme de la cellule. En effet, l’expression d’un

dominant négatif d’Eps8 pour son activité de coiffe induit une instabilité corticale qui se

traduit par des déformations de la membrane et des déformations de la forme des cellules

(i.e. bourgeonnements membranaires) en anaphase et en télophase.

66

Ainsi, ces résultats identifient la fluctuation des niveaux d’Eps8 comme un mécanisme

important qui contribue aux changements de forme cellulaire lors de l'entrée et de la sortie

de la mitose (Figure 1.19). Ces résultats mettent aussi en évidence, un mécanisme

moléculaire de contrôle de la dynamique d’actine en mitose dépendant du contrôle fin

spatiotemporel de la dégradation d’une protéine de coiffe de l’actine.

Figure 1.19 : Modèle selon lequel SCFFbxw5 régule les niveaux d'Eps8 pour contrôler la dynamique de l'actine pour une progression mitotique normale. Inspiré de Werner et al. 2013.

En outre, il a longtemps été assumé que l’activité autophagique était fortement diminuée

durant la mitose et reprenait en cytokinèse tardive (Eskelinen et al. 2002; Furuya et al.

2010). Cependant, de récents travaux ont montré que le flux autophagique est maintenu

lors de la mitose bien que le nombre d’autophagosomes soit réduit durant cette période (Li

et al. 2016). Cette étude a notamment démontré que le flux autophagique est très actif en

mitose dans différentes lignées cellulaires y compris les cellules HeLa. Les auteurs ont

également noté que de multiples protéines impliquées dans l’autophagie, comme la

protéine LC3, sont induites lors de la mitose. Loukil et al. ont aussi observé que LC3,

p62/SQSTM1 et des marqueurs lysosomaux localisent avec des foyers de cycline A2

pendant la mitose et ont constaté que l'autophagie contribue partiellement à la dégradation

mitotique de la cycline A2 (Loukil et al. 2014). Ces travaux ont ainsi révélé que

l’autophagie reste active au cours de la division cellulaire et supposent que l’autophagie

sélective pourrait être requise dans le contrôle de la progression mitotique.

67

Dans ce sens, en cytokinèse, l’adaptateur autophagique p62/SQSTM1 est impliqué dans le

contrôle de cette étape à travers la régulation de la dynamique d’actine dépendante de RhoA

(Figure 1.20) (Belaid et al. 2013). En effet, par inhibition de la machinerie autophagique

(déplétion de la protéine ATG5 ou ATG7 ou KO de la v-ATPase a3), il a été établi que

l’autophagie est le mécanisme le plus important pour restreindre l’activité de la GTPase

RhoA au PI en cytokinèse (Figure 1.20). L’inhibition du flux autophagique a permis

d’observer l'accumulation de RhoA-GTP dans des autolysosomes, proches du PI de

cellules en cytokinèse. Au niveau moléculaire, les résultats de l’étude démontrèrent que la

GTPase est séquestrée sous sa forme active de façon dépendante de l’adaptateur

autophagique p62/SQSTM1 (Figure 1.20). En conséquence, interférer avec un tel

mécanisme, par inhibition de l’autophagie ou par déplétion de p62/SQSTM1, conduit à une

accumulation au PI de RhoA-GTP et à son expansion en dehors de cette zone (Figure 1.20).

Des cellules ayant subi ces traitements se caractérisent alors par des aneuploïdies

conséquentes à une accumulation nucléaire caractéristique d’un avortement de

l’abscission.

Figure 1.20: Réprésentation schématique du ciblage de la forme active de RhoA (RhoA-GTP) par p62/SQSTM1 à l’autophagie sélective au sillon de clivage.

En somme, seulement deux études ont clairement associé le ciblage de protéines aux voies

de dégradation aux mécanismes de remodelage de l’actine durant la division cellulaire. En

68

mitose, la dégradation de la protéine de coiffe Eps8 a été associée à la progression mitotique

en aidant au remodelage du cytosquelette d’actine requis pour l’arrondissement mitotique.

En cytokinèse, l’autophagie sélective semble être impliquée dans la régulation spatiale de

l’activité de la GTPase RhoA au PI. Ces observations suggèrent donc que les voies de

dégradation protéique et le contrôle de qualité des protéines qui y est associé seraient des

mécanismes utilisés pour le remodelage fin spatiotemporel des structures à base d’actine

qui dirigent la division cellulaire. Ces résultats soulèvent de nombreuses questions. Quelles

sont les voies de signalisation qui régulent ces mécanismes moléculaires durant la division

cellulaire? Ces fonctions sont-elles requises durant d’autres processus cellulaires

dépendant du remodelage de l’actine? Ces mécanismes de remodelage de l’actine font-ils

appel aux chaperons de la famille des HSPB? Est-ce que l’autophagie est contrôlée de

façon cycle cellulaire-dépendante?

1.4.5. Un rôle pour le complexe chaperon HSPB8-BAG3 dans la dynamique de

l’actine, l’orientation du fuseau mitotique et la ségrégation des chromosomes

pendant la mitose

Nous avons vu que les multiples étapes de la division cellulaire sont dépendantes d’une

régulation spatiotemporelle fine du cytosquelette d’actine qui depend en partie du ciblage

de protéines aux voies de dégradation protéique. Or, le co-chaperon BAG3 présente une

implication forte dans le remodelage du cytosqulette d’actine de façon dépendante de son

activité autophagique en condition de stress mécanique. De plus, il est important pour

assurer la stabilité d’HSPB8, un chaperon de la famille des HSPB qui émergent comme

des régulateurs du remodelage et de l’intégrité des structures d’actine en conditions

physiologiques. Ainsi, notre laboratoire a émis l’hypothèse que le complexe chaperon

HSPB8-BAG3 pourrait contribuer au remodelage des structures à base d’actine lors de la

division de cellules à croissance rapide telles que les cellules cancéreuses. À mon arrivée

au laboratoire, des évidences que le co-chaperon BAG3 est impliqué dans la progression

mitotique avaient déjà été obtenues. J’ai pu contribuer à la progression de ces travaux qui

sont présentés dans l’annexe 1 de cette thèse et qui seront résumés dans cette section.

69

En premier lieu, nous avons découvert que le co-chaperon BAG3 est hyperphosphorylé à

l’entrée des cellules en mitose et que ceci s’accompagne d’une relocalisation de la protéine

aux pôles du fuseau mitotique (Annexe 1, Figure 1). Nous avons ensuite investigué si la

déplétion du co-chaperon interfère avec la progression des cellules dans la division

cellulaire (Annexe 1, Figure 2). Nous avons notamment observé que la déplétion de BAG3

s’accompagne d’une élévation des anomalies nucléaires (micronoyaux et multi-nucléation)

suggérant un rôle du co-chaperon dans la modulation de la ségrégation des chromosomes

et de l’abscission. De plus, plus de 60% des cellules déplétées en BAG3 présentent des

défauts en métaphase et ceci se traduit par un retard considérable des cellules en

prométaphase-métaphase (Annexe 1, Figure 2). Par des expériences d’imagerie en temps

réel, nous avons également montré que la déplétion de BAG3 interfère considérablement

avec l’alignement des chromosomes à la plaque métaphasique et le positionnement du

fuseau mitotique qui subit des rotations anormales dans ces conditions (Annexe 1, Figure

3). Ces observations indiquent donc que le co-chaperon BAG3 est requis pour la

progression mitotique des cellules HeLa et qu’il interviendrait dans le contrôle du

positionnement du fuseau mitotique et l’alignement des chromosomes en métaphase.

Pour renforcer notre étude, nous avons réalisé une analyse structure-fonction de BAG3 en

mitose. Nous avons donc exprimé des mutants des domaines d’interaction de BAG3 et

analysé leur effet sur le positionnemment du fuseau mitotique, par déplétion-restoration de

phénotypes (Annexe 1, Figure 3). Nous avons pu voir de façon surprenante que le domaine

BAG n’est pas requis pour la fonction mitotique de BAG3. En effet, comme la protéine

WT, l’expression du mutant du domaine BAG est capable de restaurer le positionnement

du fuseau mitotique dans les cellules déplétées en BAG3 (Annexe 1, Figure 3). À l’inverse,

l’expression des protéines BAG3 mutées pour les motifs IPV ou le domaine PxxP sont

incapables de restaurer ce phénotype dans les cellules déplétées en BAG3 (Annexe 1,

Figure 3). Ceci nous indique donc que l’interaction de BAG3 à HSPB8 à travers ses motifs

IPV et son association à des voies de signalisation à travers son domaine PxxP sont

essentielles, tandis que son interaction avec HSP70 est dispensable pour sa fonction

mitotique. Ceci contraste avec une grande majorité des fonctions précédemment décrites

pour BAG3 qui dépendent d’HSP70.

70

Pour confirmer l’importance d’HSPB8 dans la fonction mitotique de BAG3, nous avons

analysé l’impact de la déplétion du chaperon sur la progression mitotique. Ainsi, nous

avons vu que la déplétion d’HSPB8, tout comme celle de BAG3, interfère avec le

positionnement du fuseau mitotique dans les cellules en métaphase (Annexe 1, Figure 4).

De plus, la déplétion du chaperon s’accompagne d’une délocalisation de BAG3 aux

centrosomes ainsi que d’une réduction de son hyperphosphorylation (Annexe 1, Figure 4).

Ces résultats argumentent dans le sens qu’HSPB8 est requise pour la fonction mitotique de

BAG3 en aidant à sa bonne localisation et à sa phosphorylation adéquate en mitose.

De façon intéressante, par des expériences de co-immunprécipitation, nous avons mis en

avant qu’HSPB8, p62/SQSTM1 et HDAC6 s’associent préférentiellement avec BAG3 en

mitose (Annexe 1, Figure 5). Ces observations nous suggèrent que l’hyperphosphorylation

de BAG3 s’accompagne d’une modulation de ses partenaires en mitose. Ces changements

de partenariat pourraient être requis pour la fonction mitotique de BAG3. Pour appuyer

cette hypothèse, nous avons par la suite évalué l’impact de la déplétion de p62/SQSTM1

sur le positionnement du fuseau mitotique. Ainsi, nous avons montré que comme la

déplétion de BAG3 ou d’HSPB8, celle de p62/SQSTM1 interfère avec le positionnment

correct du fuseau mitotique en métaphase (Annexe 1, Figure 5). Ces résultats tendent donc

à suggérer que les partenaires de BAG3 en mitose, à savoir HSPB8 et p62/SQSTM1, sont

requis pour sa fonction mitotique.

Finalement, comme le co-chaperon BAG3 est impliqué dans la modulation du remodelage

du cytosquelette d’actine, nous avons investigué si une telle fonction de BAG3 était requise

en mitose. Nous avons donc évalué l’effet de la déplétion de BAG3 sur l’arrondissement

mitotique, la dynamique des fibres de rétraction et la rigidité corticale. Ainsi, nos résultats

montrent que la déplétion de BAG3 s’accompagne d’un défaut d’arrondissement

mitotique, de dynamique des fibres de rétraction et de rigidité corticale qui se traduit par

un bourgeonnement excessif du cortex des cellules en métaphase (Annexe 1, Figure 6). De

façon remarquable, la dynamique des fibres de rétraction et la rigidité corticale sont

également altérés suivant la déplétion de p62/SQSTM1 ou d’HSPB8 (Annexe 1, Figure 6).

Ces observations nous suggèrent donc que BAG3 facilite le remodelage des structures à

71

base d’actine en mitose, et que cette fonction pourrait faire intervenir ses partenaires

mitotiques HSPB8 et p62/SQSTM1.

L’arrondissement mitotique, la dynamique des fibres de rétraction et la rigidité corticale

sont requis pour le positionnement du fuseau mitotique ainsi que la capture et la ségrégation

des chromosomes. Nous avons voulu savoir si de tels défauts observés suivant la déplétion

de BAG3 pouvaient être la cause des défauts de positionnement du fuseau mitotique. Pour

ce faire, nous avons restauré la rigidité corticale des cellules déplétées en BAG3 à l’aide

de la concaviline A et analysé son effet sur le positionnement du fuseau mitotique. De

façon intéressante, nous avons vu que le positionnement du fuseau mitotique est largement

restauré dans les cellules déplétes en BAG3 suite à leur traitement avec la concaviline A

(Annexe 1, Figure 7). Ainsi, ce résultat tend à suggérer que les défauts de rigidité corticale

observés suite à la déplétion de BAG3 contribuent aux anomalies de positionnement du

fuseau mitotique et d’alignement des chromosomes en métaphase.

En résumé, ces travaux ont permis pour la première fois d’établir une fonction pour le

complexe chaperon HSPB8-BAG3 dans la régulation de la progression mitotique. Ces

observations suggèrent que cette activité pourrait être reliée à la capacité du complexe à

réguler le remodelage des structures d’actine qui dirigent le positionnment du fuseau

mitotique et l’alignement des chromosomes en métaphase. Une telle fonction d’HSPB8-

BAG3 impliquerait l’association du complexe à l’adaptateur autophagique p62/SQSTM1

et à des protéines encore non identifiées via le domaine PxxP de BAG3. De plus, ces

travaux ont pour la première fois mis en évidence un système (la mitose) dans lequel

l’association de BAG3 au chaperon moléculaire HSP70 est dispensable alors que son

association à HSPB8 est requise. Ces travaux ont donc établi la mitose comme un modèle

paradigme pour étudier les fonctions de BAG3 qui dépendent du chaperon HSPB8 et le

lien fonctionnel avec le remodelage de l’actine, offrant un modèle unique pour disséquer

le mode d’action du complexe chaperon.

72

1.5. Objectifs de travail

De plus en plus d’études suggèrent que les chaperons moléculaires soutiennent la survie

des cellules cancéreuses. Cependant, les mécanismes moléculaires associés à une telle

fonction des chaperons moléculaires sont très peu connus. HSPB8-BAG3 est un complexe

chaperon responsable du ciblage de protéines endommagées à la machinerie autophagique

lors d’un stress protéotoxique. BAG3 a été impliquée dans la progression tumorale via sa

fonction régulatrice du cytosquelette d’actine dans différentes lignées cancéreuses.

Toutefois, l’importance de son association au chaperon HSPB8 n’a jamais été étudiée. Des

travaux du laboratoire auxquels j’ai participé ont montré que BAG3, de façon dépendante

d’HSPB8, régule la progression mitotique et le remodelage de structures d’actine qui

contrôlent le positionnement adéquat du fuseau mitotique et la ségrégation des

chromosomes.

Nous avons émis l’hypothèse que le complexe chaperon HSPB8-BAG3 facilite la division

cellulaire via son activité dans le remodelage des structures à base d’actine. Nous avons

postulé que cette activité fait intervenir, du moins en partie, l’activité de son partenaire

mitotique HDAC6 et le rôle du complexe chaperon dans l’autophagie sélective.

Ainsi, l’objectif principal de mon doctorat était de déterminer l’importance de la

modulation du cytosquelette d’actine par le complexe chaperon HSPB8-BAG3 sur la

division cellulaire et d’explorer les mécanismes moléculaires à l’origine de cette

modulation pouvant impliquer HDAC6.

1) Déterminer la contribution du remodelage de l’actine dans la régulation de la division

cellulaire par le complexe HSPB8-BAG3.

Pour cet objectif, nous avons étudié l’effet de la déplétion, dans des cellules HeLa,

d’HSPB8 et de BAG3 sur la progression de la cytokinèse : une phase de la division

cellulaire où la dynamique d’actine est hautement régulée. Nous avons testé l’effet de

drogues inhibant la dynamique d’actine et l’autophagie sur les phénotypes mis en évidence

dans cette étude. Cette étude est présentée au chapitre 2 et suggère que le complexe

73

chaperon agit en partie, en limitant la polymérisation de l’actine dépendante d’Arp2/3 et/ou

en stimulant son renouvellement et en facilitant la dégradation par autophagie sélective.

2) Étudier l’importance du partenariat entre HSPB8-BAG3 et HDAC6 dans la modulation

de la dynamique d’actine au cours de la mitose

Dans cette étude, nous avons validé l’impact du complexe sur la polymérisation de l’actine

dépendante d’Arp2/3 et mis en évidence un rôle pour la déacétylase HDAC6 et son substrat

cortactine, comme cibles de l’action mitotique du complexe chaperon dans la régulation

du remodelage des structures à base d’actine. Ces travaux sont présentés au chapitre 3 et

suggèrent un rôle important pour le complexe HSPB8-BAG3 dans la régulation spatiale de

l’activité d’HDAC6 pendant la mitose.

3) Explorer l’effet du complexe sur l’activité autophagique au cours de la mitose et le lien

potentiel avec sa fonction mitotique.

Pour ce dernier objectif, nous avons analysé l’influence de l’inhibition du flux

autophagique sur la dynamique du cytosquelette d’actine au cours du cycle cellulaire,

observé l’effet de la déplétion d’HSPB8 sur le flux autophagique, et étudié l’impact de

l’inhibition d’HDAC6 sur le flux autophagique et la dynamique d’actine en cytokinèse

après déplétion d’HSPB8 (Chapitre 4).

L’ensemble de ce travail vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels le complexe

chaperon HSPB8-BAG3 peut soutenir la progression tumorale et identifier de potentielles

nouvelles cibles thérapeutiques.

74

2. Chapitre 2: Fine-tuning of actin dynamics by the HSPB8-BAG3 chaperone

complex facilitates cytokinesis and contributes to its impact on cell division

Alice Anaïs Varlet 1, 2, Margit Fuchs 1, 2, Carole Luthold 1 ,2 , Herman Lambert 1, 2,

Jacques Landry 1, 2, 3 and Josée N. Lavoie 1, 2, 3 *

1 Centre de recherche sur le cancer de l’Université Laval & 2 Oncology, Centre de

recherche du CHU de Québec-Université Laval, Canada, G1R 3S3 ; 3 Département de

biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie Université Laval, Québec, Canada,

G1V OA6

Running Head: HSPB8 Regulates F-actin Dynamics during Cytokinesis

Keywords: cytokinesis, BAG3, HSPB8, actin, autophagy,

* Author for correspondence (josee.lavoie@crchudequebec.ulaval.ca)

75

2.1. Avant-propos

Lorsque j’ai commencé mon doctorat, le complexe chaperon HSPB8-BAG3 avait été

impliqué dans le ciblage des protéines agrégées et poly-ubiquitinées à la machinerie

autophagique. Les travaux de Arndt et al. 2010 suggéraient un rôle pour le complexe

chaperon dans le contrôle de l’intégrité du cytosquelette d’actine dans des cellules

musculaires soumises à un stress mécanique. Au laboratoire, le Dre Fuchs M. avait mis en

évidence l’implication de BAG3 dans la progression mitotique et sa déplétion avait été

associée à une dérégulation du positionnement du fuseau mitotique et une élévation de

l’instabilité génétique. L’importance de son partenariat avec HSPB8 et le mécanisme par

lequel le complexe contrôle la progression mitotique n’avaient pas encore été découverts.

C’est dans ce contexte que nous avons investigué l’impact d’une déplétion d’HSPB8 ou de

BAG3 sur la progression de la division cellulaire et évalué le mécanisme par lequel le

complexe chaperon facilite celle-ci. En collaboration avec le Dre Fuchs M., j’ai réalisé des

expériences d’imagerie en temps réel de cellules HeLa déplétées en BAG3 ou en HSPB8

dans le but d’analyser l’impact de la déplétion de BAG3 ou d’HSPB8 sur l’étape ultime de

la division cellulaire : l’abscission. J’ai ensuite analysé en temps réel la dynamique du

cytosquelette d’actine dans des cellules synchronisées en cytokinèse et déplétées en

HSPB8. Puis, par des protocoles que j’ai développés, j’ai tenté de restaurer ou de mimer

les phénotypes associés à la déplétion d’HSPB8 à l’aide de drogues inhibant la

polymérisation de l’actine ou inhibant/activant l’autophagie. Les résultats obtenus ont

démontré pour la première fois que le complexe chaperon HSPB8-BAG3 aide à la

progression des cellules cancéreuses dans la division cellulaire en limitant la dynamique

de l’actine. Ces travaux suggèrent également que le complexe chaperon pourrait faciliter

la dynamique d’actine au cours de la division cellulaire de façon dépendante de sa fonction

dans l’autophagie sélective.

J’ai participé activement à la conception de cet article et j’ai réalisé l’ensemble des figures

qui y sont présentées, à l’exception de la figure 2.2F réalisée par Mr Lambert H. Les

expériences d’imagerie en temps réel de la progression mitotique de cellules déplétées en

76

BAG3 ont été réalisées par le Dre Fuchs M. Ce projet a donné lieu à un article publié dans

le journal Cell Stress and Chaperones publié en mars 2017.

Le format PDF de ces travaux est disponible en Annexe 3.

77

2.2. Résumé

La petite protéine de choc thermique HSPB8 et son co-chaperon BAG3 ont été associés au

contrôle de l’intégrité du cytosquelette d’actine dans le contexte d’un stress mécanique. Ici,

nous montrons qu’HSPB8-BAG3 est essentiel au démantèlement de l’anneau contractile

lors de la cytokinèse, un processus nécessaire pour permettre l'abscission des cellules filles.

Nous avons noté qu’une diminution considérable de la forme hyperphosphorylée de BAG3,

qui contribue à son rôle crucial en mitose, accompagne la réduction des niveaux endogènes

d’HSPB8 par ARN interférence dans les cellules HeLa. En outre, les cellules déplétées en

HSPB8 sont retardées dans la cytokinèse, restent connectées par un pont intercellulaire (PI)

désorganisé et présentent une incidence accrue d'anomalies nucléaires résultant d’un échec

de l’abscission (à savoir bi- et multi-nucléation). De tels phénotypes ont été associés à une

accumulation anormale de F-actine au PI des cellules en télophase. De façon remarquable,

la drogue séquestrant les monomères d’actine, la latrunculine A, et l'inhibiteur d’Arp2/3,

le CK666, normalisent la F-actine au PI pendant la cytokinèse. La latrunculine A restaure

également l’incidence des anomalies nucléaires dans les cellules appauvries en HSPB8,

impliquant une dynamique d'actine dérégulée comme cause d'échec de l’abscision. De plus,

l’accumulation anormale de F-actine au PI semble être corrigée par la rapamycine, une

drogue activant l'autophagie, alors qu'elle est mimée par des drogues inhibant le flux

autophagique. Ensemble, ces résultats appuient le rôle du complexe chaperon HSPB8-

BAG3 dans le contrôle de qualité de la dynamique de structures à base d'actine qui sont

soumises à de fortes tensions, notamment lors de la cytokinèse. Ils développent une

connexion jusqu'à maintenant très peu appréciée entre l'autophagie sélective et les

changements morphologiques qui guident la division cellulaire.

78

2.3. Abstract

The small heat shock protein HSPB8 and its co-chaperone BAG3 are proposed to regulate

cytoskeletal proteostasis in response to mechanical signaling in muscle cells. Here, we

show that in dividing cells, the HSPB8-BAG3 complex is instrumental to the accurate

disassembly of the actin-based contractile ring during cytokinesis, a process required to

allow abscission of daughter cells. Silencing of HSPB8 markedly decreased the mitotic

hyperphosphorylated forms of BAG3 in HeLa cells, supporting its crucial role in BAG3

mitotic functions. Cells depleted of HSPB8 were delayed in cytokinesis, remained

connected via a disorganized intercellular bridge and exhibited increased incidence of

nuclear abnormalities that result from failed cytokinesis (i.e. bi-, multi-nucleation). Such

phenotypes were associated with abnormal accumulation of F-actin at the intercellular

bridge of daughter cells at telophase. Remarkably, the actin sequestering drug latrunculin

A, like the inhibitor of branched actin polymerization CK666, normalized F-actin during

cytokinesis and restored proper cell division in HSPB8-depleted cells, involving

deregulated actin dynamics as a cause of abscission failure. Moreover, this HSPB8-

dependent phenotype could be corrected by rapamycin, an autophagy-promoting drug,

whereas it was mimicked by drugs impairing lysosomal function. Together, the results

further support a role for the HSPB8-BAG3 chaperone complex in quality control of actin-

based structure dynamics that are put under high tension, notably during cell cytokinesis.

They expand a so-far under-appreciated connection between selective autophagy and

cellular morphodynamics that guide cell division.

79

2.4. Introduction

Fine-tuned protein quality control (PQC) systems are governed by molecular chaperones

of the heat shock protein (HSP) family. Chaperones of the small HSP family (HSPB)

formed an eclectic family of proteins, which differ in their expression profiles and

biochemical properties. Nonetheless, they are proposed to act mainly as ATPase-

independent holdase or unfoldase by virtue of their dynamic quaternary structure, to

segregate damaged proteins and prevent their irreversible aggregation. In addition to their

cytoprotective function under proteotoxic stress conditions, they appear to be instrumental

to the normal functioning of complex proteinous structures of the cytoskeleton during

biological processes relying on acute cellular remodeling. For instance, a phosphorylation-

regulated function of HSPB1 has been reported, which regulates actin polymerization and

cancer cell migration. Furthermore, HSPB8 has been involved in the recognition of

damaged filamin during muscle cell contraction and its segregation for degradation by

selective autophagy (Ulbricht, Arndt, et Höhfeld 2013). The later mechanism is proposed

to maintain muscle fibers integrity by promoting clearance of actin-binding proteins

undergoing partial misfolding in response to mechanical strain. Expectedly, several HSPB

chaperones are up-regulated in cancer cells where they could contribute to the fitness of

actin-based structures that support the tumor phenotype. Thus, by enabling targeted protein

storage, recycling or degradation, HSPB proteins would play important roles in

cytoskeletal PQC, to maintain the integrity of cytoskeletal structures during stress, as well

as to facilitate cellular morphodynamics that guide cell division and differentiation. In line

with this concept, we have recently uncovered a unique role for HSPB8 in mitotic cell

remodelling (Fuchs et al. 2015).

In spite of their known implications in human diseases such as cancer, the mechanisms

underlying the contribution of HSPB proteins to cytoskeletal dynamics/proteostasis is

poorly understood. In that regard, the co-chaperone and scaffold protein BCL2-associated

athanogene 3 (BAG3) is of particular interest. In the context of cancer cells, BAG3 is

viewed as a molecular scaffold owing to its interactions with signaling proteins and several

regulators of actin dynamics, and its implication in key biological processes, including

80

apoptosis, development, cell motility and cell division (Behl 2016; Rosati et al. 2011). Yet,

the significance of defined chaperone partners for BAG3 functions in intracellular

signaling has remained unexplored. BAG3 can associate with several HSPB proteins but

shows a preferred association with, and regulates the stability of HSPB8 (Carra et al. 2008;

Fuchs et al. 2010; Taipale et al. 2014). BAG3 also acts as a co-chaperone for

HSC70/HSP70 chaperone system and modulates its function in proteasomal degradation

and aggrephagy (Chen et al. 2013; Gamerdinger et al. 2009; Gamerdinger et al. 2011;

Minoia et al. 2014). Accumulating evidence suggests that BAG3 serves to bridge important

components of the chaperone network (Rauch et al. 2017). Nonetheless, BAG3 may

function without recruiting HSPB8 in aggrephagy (Minoia et al. 2014). In contrast, its

interaction with HSPB8 may be instrumental in typifying BAG3 functions in cytoskeletal

remodelling. This is supported by our recent findings that BAG3 regulates remodelling of

the mitotic actin-based structures that guide spindle orientation in a manner that requires

its physical binding to HSPB8, but not to HSC70/HSP70 (Fuchs et al. 2015). Because the

same mitotic phenotype can be recapitulated by depletion of HSPB8, BAG3 or the

autophagic receptor p62/SQSTM1, which shows enhanced mitotic association with BAG3,

we have proposed that they act within a so-far unrecognized cytoskeletal PQC mechanism

during mitosis. Evidence suggests that targeted cytoskeletal protein degradation can

provide a mechanism to limit signaling pathways in time and space during mitotic cell

remodelling. Little is known, however, on the mechanism of quality control autophagy that

provides “built in” selectivity for components of cytoskeletal remodelling pathways.

Whether the HSPB8-BAG3 chaperone complex may contribute for such mechanism during

mitosis remains to be demonstrated.

Here, we investigate the impact of HSPB8 in cytoskeletal PQC during cytokinesis, a

process that is orchestrated by highly organized actin-based structures that are put under

high tensile forces. We show that HSPB8 regulates BAG3 levels during mitosis and the

accurate dynamics of the cytokinetic actin ring, via a mechanism that may involve effects

on branched actin nucleation and autophagy signaling. Importantly, strong evidence is

provided that first link HSPB8 function in cytoskeletal PQC to its modulation of mitotic

cell division in cancer cells.

81

2.5. Material and methods

2.5.1. Cell culture, synchronization, drug treatments and siRNA experiments

Parental HeLa cells, HeLa-GFP-H2B cells (gift from Laurence Pelletier) and HeLa-RFP-

H2B cells (gift from Sabine Elowe) (Klebig et al. 2009), were maintained in a-minimal

essential medium supplemented with 10% foetal bovine serum. All cell lines were grown

in a humidified atmosphere with 5% CO2 at 37°C. Cells were synchronized by a double

thymidine block and were released for 8 h to 10h in fresh medium, as described previously

(Fuchs et al. 2015). For knockdown experiments, HeLa cells were transfected with 25 nM

to 50 nM siRNA duplexes in calcium-phosphate transfection buffer (125 mM MgCl2, 140

mM NaCl, 25 mM HEPES, 0.75 mM Na2HPO4) overnight. Analyses were performed 48 h

to 88 h later by western blot, immunofluorescence or live cell imaging. For cell cycle

analyses of the impact of HSPB8-specific siRNAs on BAG3 protein levels, HeLa cells

were synchronized in G2/M or M-phase by a 16 h-treatment with the selective Cdk1

inhibitor (RO3306, 8 µM) or with nocodazole (400 ng/ml), respectively, and mitotic cells

were recovered by a mitotic shake-off, as described before (Fuchs et al. 2015). Cells were

lysed by 3 cycles of freezing/thawing in 4 volumes of lysis buffer (20 mM TRIS-HCl pH

7.6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% IGEPAL, 1 mM NaVO4, 10 mM NaF, 40 mM β-

glycerophosphate, 1X Complete [Roche], 1 mM DTT), centrifuged at 15,000 g for 15 min,

and the supernatants were processed for western blot analyses. The following drugs were

added to cells that have been synchronized in mitosis with a double thymidine block, during

the last hour of second release period before cell fixation as followed: latrunculin A, 20

nM; CK666, 40 µM; rapamycin, 150 nM; E-64D and pepstatin A, 10 µg/ml; bafilomycin

A1, 200 nM. For multinucleation assays, unsynchronized HeLa-GFP-H2B cells were

grown in the presence of 1 nM latrunculin A for 48 h before cell fixation. The siRNA

duplexes were based on human sequences and were purchased from Qiagen (HPP grade

siRNA) or Thermo Fisher Scientific (standard A4 grade). Sequences of the sense strands

are as followed: siBAG3 #1: CGAAGAGTATTTGACCAAA -3’;

siBAG3 #2: 5’-GCAAAGAGGTGGATTCTAA-3’;

siHSPB8 #1: 5’-CAGATAGGCTAGTGGTATT-3’;

82

siHSPB8 #2: 5’-GCAGTGAATGCAAGGGTTATT-3’;

siHSPB8 #3: 5’-CAGAGGAGTTGATGGTGAATT-3’.

si AllStars Negative Control, target sequence: 5’-CAGGGTATCGACGATTACAAA-3’.

2.5.2. Transfection, infection, adenovirus and vectors

HeLa cells were seeded on fibronectin-coated dishes and were synchronized by the double

thymidine block method. During the second release period, cells were transfected with

GFP-Arp3 (human Arp3 in pEGFP-N1 vector, gift from Dr John A. Cooper, ST Louis,

USA) (Welch et al. 1997) using Lipofectamine 2000 at the ratio Lipo:DNA of 2:1 and

following the manufacturer’s instructions (Invitrogen) for a 10 h-period before cell

fixation. To follow actin dynamics in vivo, cells were seeded on fibronectin-coated glass

dishes (MatTek Corp.) and synchronized by the double thymidine block method.

Adenofection was performed during the first thymidine block using Ad-LifeAct-TagGFP2

(60121, IBIDI) at a multiplicity of infection (MOI) of 1 plaque-forming units per cell

(pfu/cell), BacMam 2.0 reagents at 4 pfu/cell in a-MEM-minus and siRNAs in calcium-

phosphate transfection buffer, using the method described in (Fuchs et al. 2016). Sixteen

hours after adenofection, cells were washed 3 times with HEPES (6.7 mM KCl, 150 mM

NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.3) and were released in fresh medium for 8 h before adding

back 2mM thymidine.

2.5.3. Antibodies and chemicals

The following antibodies were used for western blot analyses: rabbit anti-BAG3 LP11 was

raised against full length recombinant human BAG3 fused with glutathione S transferase

(LP11) (Fuchs et al. 2015), rabbit anti-HSPB8 against a C-terminal peptide

(NELPQDSQEVTCT) (Carra et al. 2008); anti-Vinculin (V9131) was from Sigma-

Aldrich; anti-Arp3 (ab49671) was from Abcam; anti-Calreticulin (#612136) was from BD

Biosciences; and anti-GAPDH Clone 6C5 (Fitzgerald, #10R-G109a) was from Millipore.

Secondary antibodies (anti-mouse-HRP 115-035-146 and anti-rabbit-HRP 111-055-003)

were from Jackson ImmunoResearch. The following antibodies were used for

83

immunofluorescence: anti-aurora B (ab2254) was from Abcam; Alexa-Fluor® 488

Phalloidin (A12379) and Texas Red®-X Phalloidin (T-7471 were from Molecular

Probes/Thermo Fisher. Goat-anti-rabbit-594 (A11037) was from Molecular Probes.

Hoechst Bisbenzimide H 33342 (B2261), thymidine (T9250), fibronectin (F1141-5 mg),

RO-3306 (SML0569), E-64D (E8640), pepstatin A (P5318), bafilomycin A1 (B1793) and

CK666 (SML0006) were from Sigma-Aldrich; latrunculin A (428021-100UG) was from

Calbiochem.

2.5.4. Immunofluorescence and live-cell imaging

Cells were gently washed once with LUFTIG (0,2 M sucrose, 35 mM Pipes, pH 7,4, 5 mM

EGTA, 5 mM MgSO4) and fixed with 3,7 % formaldehyde in LUFTIG or 4% PFA in PBS

(137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4) for 20 min at room

temperature. DNA was stained with cell permeable Hoechst (150 ng/mL). Specimens were

processed for immunofluorescence as described (Lavoie et al. 2000) and were post-fixed

with 3.7% formaldehyde in PBS for 20 min at room temperature. Phenotypes were

monitored routinely by at least two independent investigators by visual inspection of fixed

specimens, using an AxioObserver Z1 system using a 60x 1.25NA objective and a charged-

coupled device (CCD) camera Axiocam MRm controlled by the Zen software (Carl Zeiss).

Confocal microscopy in live cells and fixed samples was performed with a PerkinElmer

Life Science Ultraview Spinning Disk Confocal microscope, equipped with a 40x 0,75NA

objective, an EMCCD cooled charge-coupled camera at -50°C (Hamamatsu Photonics K.

K) and driven by Volocity software version 6.01. The system was equipped with a

humidified/5% CO2 /thermoregulated chamber. Bi- and Multi-nucleation was scored as the

number of cells presenting 2, or >2 nuclei per cell; single cells were delineated by staining

of the cortex with F-actin. To quantify abnormal F-actin accumulation at the intercellular

bridge, we scored the number of daughter cells connected by a bridge labelled by Aurora

B staining that had completely de-condensed DNA (late telophase) and abnormal F-actin

structures at the bridge.

84

Long-term live-cell imaging was performed using a Nikon TE-2000 inverted microscope

equipped with CO2/thermo-regulated chamber with a 40x 0.6 NA objective. Images were

captured as 16-bit TIFF files with a photometrix Collsnap FX cooled CCD camera (-30°C)

(Rooper Scientific, Tuscon AZ) driven by the Metaview software version 4.5 (Universal

Imaging Corp., Downington, PA). Images were acquired at 90 sec intervals for a 48 h-

period, or at 10 min intervals for a 72h period, starting at 40 h after siRNA transfection.

Phenotypes associated with cytokinesis were estimated by visual inspection of time-

sequences. Spreading of daughter cells and ICB disappearance were evaluated by

monitoring the time spent between closure of the actin and cell spreading, or between AR

closure and disappearance of the dense midbody ring, respectively. Defects in daughter cell

spreading were considered as followed: (1) prolonged cortex blebbing; (2) uncoordinated

spreading of daughter cells; (3) no spreading. To quantify the number of cells that re-

entered mitosis synchronously, we determined that cells are derived from the same mother

cell by visual inspection of time-sequences; cells were considered synchronized if they

entered mitosis at the same time-point, or separated by less than 2 time-points. AR

thickness and width were expressed as the mean intensities from F-actin staining and were

evaluated by delineating AR manually on confocal slices determined as the center of the

cell, using the volocity software version 6.0 (Quorum Technologies); cells were considered

only after AR closure and DNA de-condensation. To quantify GFP-Arp3 recruitment, AR

and daughter cells were delineated manually using F-actin staining as the reference for cell

shape using the same software. The mean fluorescence intensities of GFP-Arp3 at AR and

in the cytoplasm were measured from confocal image stacks acquired at 0,5 µm z-steps

and expressed as a ratio of AR over cytoplasm. The volocity software version 6.0 (Quorum

Technologies) and Image J 1.48v (National Institute of Health) were used for processing

entire images before cropping to emphasize the main point of the image. Processing was

limited to background subtraction and brightness/contrast adjustment.

2.5.5. Western blotting

Cells were lysed in SDS sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.3% SDS, 10%

glycerol, 5% β-mercaptoethanol, 0.05% bromphenol blue, 1 mM phenylmethylsulfonyl

85

fluoride), equal amounts of protein from whole cell lysates were separated by SDS-PAGE

on 10% acrylamide gels and transferred onto nitrocellulose membranes. Immunoblotting

was performed as described (Champagne et al. 2004). Protein concentrations were

determined with DC protein assay reagent and densitometric analyses were performed from

FluorS MAX MultiImager-captured images using the QuantityOne software version 4.5.0

(Bio-Rad Laboratories).

2.5.6. Statistical analyses

For experiments examining (a) the time spent for daughter cells spreading or (b) AR

thickness/width, the mean values from individual cells from at least 3 independent

experiments were analyzed using the Mann Whitney test, which is a non-parametric test

that compares two unpaired groups of ordinal or numerical variables. For experiments

examining the proportions of cells with: (a) cell spreading defects (b) ICB defects, (c)

persistent connections (d) synchronized daughter cell mitosis, (e) nuclear abnormalities

and (f) abnormal F-actin accumulation at the ICB, data from individual experiments were

analyzed using the Fisher's exact test, which is used for small sample sizes with

nominal/categorical variables. Statistical calculations were performed using Prism 6.0

(GraphPad Software) statistical software. P-values <0.05 considered significant (*, p<0.05;

**, p<0.01; ***, p<0.001 ; ****, p<0,0001).

2.6. Results

2.6.1. Silencing of HSPB8 or BAG3 perturbs abscission of daughter cells

We sought to characterize the function of HSPB8-BAG3 chaperone complex in the

extreme cell morphodynamic changes that guide cytokinesis. To that end, unsynchronized

HeLa-GFP-H2B were treated with control small interfering RNA (siRNA), or HSPB8- or

BAG3-specific siRNAs that achieved >75% depletion of the protein in these cells, and

were imaged for a period of 72 h starting at 40 h after transfection of siRNAs (Figure 2.1A).

In agreement with our previous findings, cells depleted of HSPB8 or BAG3 eventually

86

progressed through anaphase, but exhibited higher incidence of defects during cytokinesis

(Fuchs et al. 2015). Such defects were associated with 2 major phenotypes: delayed cell

spreading at telophase, and delayed abscission of daughter cells. HSPB8-depleted cells

showed a ~1.3-fold increase in the mean time required to achieve spreading (35 min;

siHSPB8) relative to control cells (26 min; siCtl) (Figure 2.1B, 2.1C), frequently associated

with prolonged cortex blebbing (Figure 1B, siBAG3 490’; supplemental movies S1-S3).

This phenotype was observed in 24% to 30% of HSPB8- or BAG3-depleted cells,

respectively, as compared to 12% of the control cell population (Figure 2.1C). The data are

consistent with previous work involving BAG3 in modulation of cell adhesion, a function

that may engage its association with HSPB8 at mitotic exit (Iwasaki et al. 2007; Iwasaki et

al. 2010; Kassis et al. 2006).

Most remarkably, depletion of HSPB8 or BAG3 was associated with increased occurrence

of abnormally thick and long intercellular bridges (ICB) connecting nascent daughter cells,

which persisted for longer periods of time (Figure 2.1D, arrowheads; Figure 2.1E;

supplemental movies S4-S6). Indeed, BAG3-depleted cells showed a ~1.7-fold increase in

the mean time required for ICB disappearance relative to control cells (Figure 2.1E).

Moreover, a larger proportion of HSPB8-depleted cells remained connected by an ICB

comprising a typical midbody ring (Figure 2.2A, red arrowhead and inset), and even re-

entered mitosis synchronously (Figure 2.2B, 2.2C). These phenotypes are typical of cells

that fail abscission and were also observed in BAG3-depleted cells (not shown) (Belaid et

al. 2013; Schiel et al. 2012). In further support, a significant proportion of cells transfected

with 2 distinct HSPB8-specific siRNA sequences exhibited bi-nucleation, a defect that

arises upon cytokinetic failure and collapsing back into a single bi-nucleated cell, which

may be due to impairment of abscission (Figure 2.2D, 2.2E). Together, these observations

suggest that HSPB8, in complex with BAG3, facilitates some late steps during cytokinesis

that control the abscission of daughter cells.

87

Figure 2.1: Depletion of HSPB8 or BAG3 perturbs daughter cells spreading and ICB disappearance during cytokinesis. (A) Representative western blot of HeLa-GFP-H2B cells lysed in SDS-sample buffer, showing the efficiency of HSPB8 and BAG3 depletion after transfection with HSPB8- and BAG3-specific siRNAs. Depletion was estimated at > 75% by loading increasing amounts of control extracts (siCtl). Western blot analysis was performed with anti-HSPB8 and anti-BAG3 antibodies; GAPDH: loading control. (B) Unsynchronised HeLa-GFP-H2B cells were depleted of HSPB8 or BAG3 using the indicated siRNAs and were imaged starting 40 h post-transfection for 72 h at 10 min intervals. First row of panels: representative time sequence of a control cell showing normal daughter cells spreading; second and third rows of panels: representative time sequences of HSPB8- or BAG3-depleted cells showing delayed spreading. Scale bar, 10

88

µm. (C) On the left: graph showing the average time of daughter cells spreading for control (siCtl) versus HSPB8 depleted cells (siHSPB8). Data are the means +/- SE from 3 independent experiments; the Mann-Whitney’s test was performed relative to control ****, p < 0.0001. On the right: graph depicting the percentage of cells with abnormal daughter cells spreading in HSPB8- (siB8) or BAG3-depleted cells (siBAG3) compared to control cells (siCtl), means +/- SE from 2 or 3 independent experiments. *, p < 0.05 compares siHSPB8 #3 to siCtl by the Fischer exact test. (D) Representative time sequences of HeLa-GFP-H2B cells transfected with the indicated siRNAs and imaged for 72 h starting at 40 h after transfection. Enlarged views of the boxed regions emphasize the structure of the ICB, which is abnormally long and/or thick in cells depleted of HSPB8 or BAG3, as designated by the white and red arrows, respectively; time sequences are in min; Bars, 10 µm. (E) Graphs depicting the percentages of cells with abnormal ICB (on the left) or the time spent between early telophase and disappearance of the ICB (on the right); the data are the means +/- SE of 2 to 3 independent experiments as indicated. **, p < 0.01 and ****, p < 0.0001 compare siHSPB8 to siCtl by the Fisher exact test.

2.6.2. Knockdown of HSPB8 causes abnormal F-actin accumulation at the ICB

Having shown that silencing of either BAG3 or HSPB8 causes similar cytokinetic defects,

and considering that HSPB8 levels depend on BAG3 (Fig 2.1A) (Carra et al. 2008),

subsequent analyses were performed in HSPB8-depleted cells. Besides, we found that

depletion of HSPB8 reduced BAG3 levels by ~ 50% to 75% in cells arrested at the G2/M

border and at the M-phase, respectively (Figure 2.2F, G2/M and M). In mitotic cells, BAG3

was mainly detected as a supershifted, hyperphophorylated protein band on SDS-PAGE as

previously shown (Figure 2.2F, red arrow) (Fuchs et al. 2015). This was contrasting with

the modest reduction of BAG3 levels seen upon silencing of HSPB8 in asynchronous cells

(~ 30%), as shown before (Figure 2.2F, AS) (Carra et al. 2008). Together with our previous

findings that HSPB8 facilitates BAG3 phosphorylation and localization at mitotic entry

(Fuchs et al. 2015), these results suggest that cell mitosis offers a unique model to uncover

the HSPB8-dependent functions of BAG3.

89

Figure 2.2: Silencing of HSPB8 interferes with cytokinetic abscission and markedly decreases the mitotic levels of BAG3. (A) Unsynchronized HeLa-GFP-H2B cells transfected with various HSPB8-specifique siRNA sequences were imaged for 72 h at 10 min intervals. The red arrowhead designates a persistent ICB connecting sister cells, comprises a dense midbody (emphasized in the enlarged view); bar 10 µm. The graph shows the percentage of cells remaining connected by an ICB; means +/- SE. *, p < 0.05 compares siHSPB8 #3 to siCtl by the Fisher exact test. (B) Time-sequences showing sister cells entering mitosis synchronously (red arrowheads); bar 20 µm; P: prophase; M: metaphase; T: telophase. (C) Graph depicting the percentages of cells undergoing synchronous mitosis; means +/- SE. ***, p < 0.001 compares siHSPB8 #3 to siCtl by the Fisher exact test. (D) Representative western blot of HeLa-GFP-H2B cells that have been lysed in SDS-sample buffer extracts, showing the efficiency of HSPB8 depletion, 88 h after transfection of the indicated siRNA sequences; calreticulin: loading control. (E) Confocal image of HeLa-GFP-H2B cells transfected with HSPB8-specific siRNAs, showing multi-nucleation; F-actin was stained with Texas-Red-Phalloidin; bar 30 µm. The graph shows

90

the incidence of bi- and multi-nucleation; means +/- SE from 3 independent experiments. ****, p < 0.0001 compares siHSPB8 #2 to siCtl, and **, p < 0.01 compares siHSPB8 #3 to siCtl by the Fisher exact test. (F) Representative western blot of HeLa cells extracts isolated from unsynchronized cells (As), or cells that have been synchronized at the G2/M border (G2/M), or M-phase (M), after transfection with HSPB8-specific siRNA or control siRNA (siCtl) for 88 h, showing the levels of BAG3, HSPB8 and GAPDH (loading control). Cells have been lysed by 3 cycles of freezing/thawing in 4 volumes of 0.1% IGEPAL lysis buffer.

Based on our previous work linking BAG3-HSPB8 to the remodelling of actin-based

structures at mitotic entry (Fuchs et al. 2015), we then sought to determine the impact of

HSPB8 on actin dynamics during cytokinesis. In animal cells, cytokinesis begins with the

assembly and contraction of an actomyosin ring that leads to the formation of an

intercellular bridge (von Dassow and Bement 2005). Final cleavage and fusion of this

intercellular bridge requires thinning of the ICB (secondary ingression) that critically relies

on actin depolymerization within the ICB (Schiel et al. 2013; Schiel et al. 2012). We

hypothesized that the chaperone complex might assist in accurate assembly and/or

disassembly of actin-based cytokinetic structures.

To test this idea, we took advantage of LifeAct-GFP — a probe that binds to F-actin (Riedl

et al. 2008), to visualize the dynamics of actin at the actomyosin ring by spinning confocal

microscopy. HeLa-RFP-H2B cells were adenofected with recombinant adenovirus driving

the expression of LifeAct-GFP together with control or HSPB8-specific siRNAs, and then

synchronized by a double thymidine block, using a method developed for knockdown-

rescue experiments (Figure 2.3A) (Fuchs et al. 2016). Live cell imaging revealed that

assembly and constriction of the actomyosin was not significantly perturbed by depletion

of HSPB8 (Figure 2.3C). Nonetheless, in HSPB8-depleted cells, the AR appeared

abnormally enriched in F-actin. This was revealed by an increase of AR thickness at

telophase (Figure 2.3C, supplemental movies S7-S8). Remarkably, higher proportions of

HSPB8-depleted cells (~ 43% +/- 2.5; 43% +/- 4.2; 58% +/-2.5) displayed abnormal F-

actin accumulation at the ICB marked by Aurora B (Murata-Hori et al. 2002) — a mitotic

kinase that relocates to the ICB at telophase, as compared to cells transfected with control

siRNAs (~ 24% +/- 1.3). Such disorganized actin structures persisted after cell spreading

and DNA de-condensation, and were observed using 3 different HSPB8-specific siRNA

91

sequences in depletion experiments. The data suggest that HSPB8-BAG3 chaperone

complex facilitates accurate AR dynamics to enable timely abscission of daughter cells.

Figure 2.3: Silencing of HSPB8 causes abnormal F-actin accumulation at the ICB. (A) Schematic of the protocol used for adenofection of HeLa-RFP-H2B cells with Ad-LifeAct-GFP together with HSPB8-specific siRNAs. (B) Western blot of HeLa-RFP H2B cell extracts prepared in SDS-sample buffer showing the efficiency of HSPB8 depletion 48 h after transfection of the indicated HSPB8-specific siRNAs; depletion was estimated at >

92

75% by loading increasing amounts of control extracts (1/4, ½, 1, siCtl); vinculin: loading control. (C) Live-cell imaging was performed for a 2 h-period at 5 min intervals by spinning disk confocal microscopy. Representative time-sequences show F-actin organization at the actin ring (pointed by white arrowheads) in cells transfected with control siRNAs (siCtl) compared to cells transfected with HSPB8-specfic siRNAs; bar, 10 µm. Quantification of the actin ring thickness over width; means +/- SE from 3 independent experiments. The Mann-Whitney’s test was performed relative to siCtl; ****, p < 0.0001. (D) Confocal images of HeLa-RFP-H2B cells that have been synchronized in mitosis after transfection with HSPB8-specific siRNAs, showing abnormal F-actin accumulation stained by Alexa-488-phalloidin at the ICB (green) marked by immunostaining of Aurora B (red). White arrowheads designate enlarged viewed that emphasize actin organization at the bridge of daughter cells; bar, 10 µm. The graph shows the percentages of cells with abnormal F-actin accumulation at the ICB in late cytokinesis, means +/- SE from 3 independent experiments. ****, p < 0.0001 compares HSPB8-specific siRNAs to siCtl by the Fischer exact test.

2.6.3. Down modulation of actin dynamics can normalize F-actin accumulation at

the ICB and correct cytokinetic defects caused by depletion of HSPB8

Abnormal accumulation of F-actin at the ICB suggested that HSPB8 depletion could

perturb actin dynamics, i.e. polymerization-depolymerization. To obtain evidence for a

causal relationship, we used the actin drug latrunculin A (LatA), which inhibits actin

dynamics by sequestering G-actin, hence limiting the actin pool available for F-actin

assembly (Coue et al. 1987; Morton et al. 2000). Cells were treated with a low

concentration (20 nM) during the last hour of the release period before cell fixation. Under

these conditions, the organization of F-actin in control cells was not noticeably affected.

Significantly, such treatment inhibited F-actin accumulation at the ICB in HSPB8-depleted

cells, bringing it in line with cells transfected with control siRNAs (Figure 2.4B, 4C). The

results suggest that HSPB8-depleted cells have deregulated actin polymerization at the ICB

that can be normalized by limiting the pool of G-actin.

We then took advantage of the hypersensibility of HSPB8-depleted cells to LatA to

examine the cause-effect relationship between deregulated actin dynamics and cytokinetic

failure, by measuring the occurrence of bi- and multi-nucleation. We determined that

incubation of HeLa-GFP-H2B cells in the presence of 1 nM LatA for a 48 h-period of time

modestly affected cell division and increased the incidence of nuclear abnormalities by

~1.8-fold (Figure 2.4D, siCtl LatA). However, this treatment reduced the incidence of bi-

93

and multi-nucleation in HSPB8-depleted cells to a level comparable to the one observed in

cells transfected with control siRNAs (Fg. 2.4D, siB8 LatA). Thus, the data suggest that

perturbation of actin dynamics upon depletion of HSPB8 contributes to its impact on cell

division.

94

Figure 2.4: Down modulation of actin dynamics can rescue phenotypes caused by depletion of HSPB8. (A) Schematic of the protocol used to modulate actin dynamic in HeLa-RFP-H2B cells synchronized in late mitosis that have been transfected with HSPB8-specific or control siRNAs. (B) Representative confocal images of fixed HSPB8-depleted HeLa-RFP-H2B cells, showing normalized F-actin at the ICB (emphasized in enlarged views pointed by white arrowheads), after treatment with latrunculin A (LatA, 20 nM); immunostaining of Autora B (red) was performed to detect ICB and F-actin was stained

95

with Alexa-488-phalloidin (green). Bar, 10 µm. (C) The graph depicts the percentages of cells with abnormal F-actin accumulation at the ICB; means +/- SE from 4 independent experiments. ****, p < 0.0001 compares siHSPB8 #3 treated with the vehicle (DMSO) to siCtl + DMSO by the Fisher exact test; n.s.: non significant compares siHSPB8 #3 + LatA to siCtl + LatA. (D) Unsynchronized HeLa-GFP-H2B that have been transfected with HSPB8-specific or control siRNAs (siB8 vs siCtl) were grown in the presence of 1 nM LatA for 48 h and the percentages of nuclear abnormalities were scored; means +/- SE from 3 independent experiments. ****, p < 0.0001 compares siHSPB8 #2 treated with the vehicle (DMSO) to siCtl + DMSO by the Fisher exact test; n.s.: non significant difference between siHSPB8 #3 + LatA and siCtl + LatA.

2.6.4. Inhibition of Arp2/3 complex can normalize F-actin at the ICB in HSPB8-

depleted cells

Accurate assembly and disassembly of the cortical AR during cytokinesis is proposed to

rely on the combined action of two F-actin nucleators: the formin Diaphanous (Dia) and

the Arp2/3 complex and require dynamic actin turnover at the equatorial AR (Bovellan et

al. 2014; Murthy and Wadsworth 2005). We noted that the BAG3 interactome from HeLa

cells contains proteins that could link BAG3 to Arp2/3 complex, notably ArpC2, a

component of Arp2/3 complex, and ELMO1, which provides a connection with upstream

regulators (Chen et al. 2013). To explore a potential relationship with the Arp2/3 complex,

we first analyzed its subcellular distribution during cytokinesis. Low amounts of a

fluorescent probe, GFP-Arp3, were expressed in HeLa cells for a short period of time after

silencing HSPB8 to avoid perturbing actin dynamics. The subcellular distribution of GFP-

Arp3 was analyzed by confocal microscopy after cell fixation (Figure 2.5A, experimental

scheme; Figure 2.5B). Cells transfected with control siRNAs undergoing cytokinesis

exhibited a rather diffuse localization of Arp3-GFP with no significant enrichment at the

ICB (Figure 2.5C). This was revealed by quantification of the GFP fluorescence ratio of

ICB over cytoplasm (Figure 2.5C, ~0.89). In marked contrast, in cells transfected with

HSPB8-specific siRNAs, GFP-Arp3 accumulated at the ICB and co-distributed with

aberrant F-actin structures, as revealed by a ~1.6-fold increase in the ICB/cytoplasmic GFP

fluorescence ratio (Figure 2.5C, arrowhead).

96

We then sought to acutely perturb Arp2/3 activity as cells entered cytokinesis and monitor

the impact on ICB-associated aberrant F-actin. To that end, HSPB8-depleted cells that have

been synchronized in mitosis-cytokinesis were incubated in the presence of the selective

Arp2/3 inhibitor CK666 (Nolen et al. 2009) or with the vehicle only, during the last hour

of the released period from the thymidine-block. Using this protocol, inhibition of the

Arp2/3 complex did not impact cytokinesis in cells treated with control siRNAs, consistent

with recent findings (Bovellan et al. 2014; Rosa et al. 2015). Nonetheless, such treatment

inhibited the occurrence of abnormal F-actin at the ICB in HSPB8-depleted cells (Figure

2.5D). These data suggest that by limiting Arp2/3-mediated actin polymerization, an

accurate balance between actin assembly and turnover at the ICB can be restored in

HSPB8-depleted cells.

97

Figure 2.5: Co-distribution of abnormal F-actin and 1 Arp2/3, and restoration of F-actin organization at the ICB in HSPB8-depleted cells upon inhibition of Arp2/3 complex. (A) Schematic of the protocol used to visualize Arp2/3 localization in Hela-RFP-H2B cells during cytokinesis. (B) Western blot of HeLa-RFP-H2B cell extracts prepared in SDS-sample buffer showing the levels of transfected GFP-Arp3 and endogenous Arp3; calreticulin levels are shown as loading control. (C) Representative confocal images of HSPB8-depleted HeLa-RFP-H2B cells, showing accumulation of GFP-Arp3 together with F-actin; staining of Aurora B (purple) was performed to localize ICBs that are emphasized

98

in enlarged views designated by white arrowheads; bar, 10 µm. Quantification of the fluorescence intensity ratios of GFP-Arp3 is shown on the right graph, means +/- SE of at least 98 cells from 4 independent experiments. The Mann- Whitney’s test was performed relative to control; ****, p < 0.0001. (D) Confocal images showing synchronized HeLa-RFP-H2B cells depleted of HSPB8 treated with the vehicle only (DMSO) or with a selective Arp2/3 inhibitor (CK666, 40 µM) 1 h before cell fixation. F-actin organization at the ICB (phalloidin staining: green, Aurora B staining: red) is emphasized in the enlarged views designated by white arrowheads; bar, 10 µm. A schematic of the protocol used is shown below. The graph depicts the percentages of cells with abnormal F-actin accumulation at the ICB; means +/- SE from 2 or 4 independent experiments; n.s.: non-significant difference between siHSPB8 #3 + CK666 versus siCtl + CK666 by the Fisher exact test.

2.6.5. Drugs that affect lysosomal function recapitulate the HSPB8-dependent

phenotype, whereas induction of autophagy signaling can restore the F-actin

defects caused by depletion of HSPB8

A specialized role for a multichaperone complex organized by BAG3 has been proposed

in the clearance of damaged proteins undergoing partial misfolding in response to

mechanical strain during skeletal muscle contraction (Arndt et al. 2010; Ulbricht et al.

2013). Given that the actin-based AR is also put under high tensile forces during

cytokinesis, we hypothesized that HSPB8-BAG3 could be mobilized to facilitate the

autophagic clearance of components of actin-based cytokinetic structures.

To explore this idea, we used two distinct experimental approaches. We first asked whether

impairing lysosomal function could interfere with AR dynamics. HeLa cells that have been

synchronized in mitosis by a double thymidine block were incubated in the presence of

drugs that are commonly used to disrupt the autophagic flux; these include bafilomycin A

(BafA), which inhibits V-ATPases and blocks autophagosome-lysosome fusion, or

pepstatin A and E64D, two inhibitors of lysosomal proteases (Klionsky et al. 2016). The

drugs were added during the last hour of the release period before cell fixation, and cells

in late cytokinesis were detected by immunostaining of the ICB using anti-Aurora B

antibody. Analysis of F-actin distribution revealed that a larger proportion of cells treated

with the drugs accumulated aberrant actin structures at the ICB that persist after cell

spreading and DNA de-condensation relative to cells treated with the vehicle only (~1.8-

99

fold increase; Figure 6A). Thus, the data suggest that inhibition of vacuolar acidification

or lysosomal enzymes, like depletion of HSPB8, can recapitulate similar defects in actin

dynamics at the ICB.

As a second approach, we submitted HSPB8-depleted cells that have been synchronized in

late mitosis to a 1 h-incubation period with rapamycin — a drug that inhibits mTORC1 and

stimulates autophagy signaling (Crespo and Hall 2002). Remarkably, such treatment

corrected F-actin accumulation at the ICB and brought the proportions of HSPB8- depleted

cells bearing F-actin defects in line with cells transfected with control siRNAs (Figure 6B).

Collectively, our results suggest that defects in the dynamics of the actin-based AR caused

by depletion of HSPB8 may result, at least in part, from its function in the segregation of

cytoskeletal protein clients to selective autophagy.

100

Figure 2.6: Inhibition of lysosomal function mimics, whereas autophagic signaling can correct, the cytokinetic defect in F-actin caused by depletion of HSPB8. (A, B) Representative confocal images of HeLa-RFP-H2B cells unstransfected (A) or transfected with HSPB8-specific siRNA (siB8, B) that have been synchronized in late mitosis and treated with the indicated compounds for a 1 h-period before cell fixation; bafilomycin A1 (BafA, 200 nM), pepstatin A and E-64D (Pep + E64D, 10 µg/mL), rapamycin (150 nM). F-actin was stained with phalloidin (green) and immunostaining of Aurora B was performed to detect the ICB (red). F-actin organization at the ICB is emphasized in the enlarged views designated by white arrowheads; bars 10 µm. The percentages of cells exhibiting abnormal F-actin accumulation at the ICB are shown on the right graphs; means

101

+/- SE 1 from 3 independent experiments. ****, p < 0.0001, compare BafA or Pepstatin + E64D to DMSO, or siB8 + DMSO to siCtl by the Fisher exact test; n.s.: non significant difference by comparing siB8 + rapamycin to siCtl + rapamycin.

2.7. Discussion

BAG3, in association with its chaperone partners, has been linked to the selection of

damaged proteins for autophagic degradation during proteotoxic stress and muscle cell

contraction (Minoia et al. 2014; Ulbricht et al. 2013). While BAG3 controls the stability of

HSPB8, it may also function without HSPB8 during stress, questioning the exact role of

HSPB8 (our unpublished data) (Ganassi et al. 2016; Minoia et al. 2014). Recently, we

uncovered an HSPB8-dependent function of BAG3 in a basic and fundamental activity of

cancer cells: mitosis, in the remodelling of actin-based structures that guide spindle

dynamics (Fuchs et al. 2015). In the current study, we present further evidence that in

response to mitotic signaling, HSPB8 and BAG3 act together to modulate actin dynamics

during cytokinesis and facilitate abscission of daughter cells. Because drugs that selectively

perturb actin polymerization can correct the multinucleation phenotype caused by

depletion of HSPB8, which also depletes the mitotic forms of BAG3, we suggest that an

HSPB8-BAG3 complex promotes accurate cell division mainly by limiting actin

polymerization and/or promoting actin turnover. Whether such process may involve

HSPB8-BAG3 function in autophagic sequestration is suggested by some results presented

here, and further discussed below.

Our finding that HSPB8 maintains BAG3 levels mainly during M-phase suggests that it

may serve to stabilize particular conformations of BAG3 induced by mitotic

phosphorylation. This could promote interactions between BAG3 and client proteins that

would connect the chaperone complex to actin-based structures, perhaps, via BAG3 Pro-

rich motifs, which we have identified as crucial determinants of BAG3 mitotic activity in

previous work (Fuchs et al. 2015). BAG3 was reported to interact with several proteins that

could modulate actin assembly or promote actin turnover; for instance CapZ — an actin-

capping protein that prevents filament growth (Cooper and Schafer 2000; Hishiya et al.

2010; Pollard and Cooper 2009), or non muscle myosin II — the molecular motor that

102

generates forces for constriction of the actin-based AR (Hong et al. 2016; Maupin and

Pollard 1986; Schiel et al. 2013). It has been shown that actin at the AR is highly dynamic

and myosin II was involved in the dynamic turnover of actin during cytokinesis (Murthy

and Wadsworth 2005). Given that BAG3 can interact with a plethora of potential client

proteins in HeLa cells (Chen et al. 2013), its mitotic activity likely involves complex

interactions with client proteins that could be regulated in time and space by HSPB8 and

multisite phosphorylation of BAG3.

The results presented here provide important mechanistic clue by showing that silencing

of HSPB8 causes accumulation of branched actin at the ICB. Assembly of branched actin

networks is mediated by the actin nucleator complex Arp2/3 that appeared to accumulate

at the ICB of HSPB8-depleted cells (Goley and Welch 2006). Furthermore, inhibition of

Arp2/3 using CK666 can prevent abnormal F-actin accumulation at the ICB in these cells,

suggesting that HSPB8-BAG3 act by limiting Arp2/3 activity. It has been proposed that a

switch from Arp2/3 to Diaphanous-mediated actin nucleation is required to drive assembly

of a rigid actin cortex in metaphase cells (Rosa et al. 2015). Too much Arp2/3-mediated

actin polymerization may also lead to cytokinesis failure (Chircop 2014). Indeed,

deregulation of the antagonism between the Rho GTPases Rho and Rac, which is believed

to control AR dynamics during cytokinesis, lead to defective cytokinesis and aberrant

distribution of F-actin (D'Avino et al. 2004). We have shown that depletion of HSPB8 or

BAG3 interferes with cell rounding and assembly of a mechanically rigid actin cortex at

mitotic entry, in addition to its perturbing effect during cytokinesis (Fuchs et al. 2015).

Based on the overall data, it can be argued that failure to accurately limit the activity of

Arp2/3 upon depletion of HSPB8 or BAG3 contributes to defects in mitotic cortical

rigidity, spindle positioning and cytokinesis, leading to impaired cell division and

multinucleation.

Our findings also suggest that a phosphorylation-activated function of HSPB8-BAG3

would promote actin turnover rather than enhancing actin polymerization, as it is the case

for HSPB1 (During et al. 2007; Lavoie et al. 1995). This is in line with the proposed role

of HSPB8-BAG3 within a pathway induced by mechanical cues for the clearance of

103

cytoskeletal protein in the muscle sarcomere — the actin contractile unit of myofibrils

(Ulbricht and Hohfeld 2013). Such pathway could be mobilized in dividing cells by mitotic

signaling, via BAG3 phosphorylation, to facilitate accurate turnover of non muscle

contractile structures that are submitted to high tensile forces. It has been hypothesized that

the organization of actin and myosin II in the cytokinetic AR is similar to that seen in

muscle sarcomere; recent evidence supports a sliding filament-based purse string

contraction mechanism for AR constriction (Fenix et al. 2016; Pollard and Wu 2010).

Although it has been established that the AR needs to be disassembled to allow final

abscission of daughter cells, the mechanisms remain poorly understood. A role for selective

autophagy has been proposed, in the localized inactivation of RhoA involving the

autophagic receptor p62/SQSTM1 (Belaid et al. 2014; Mizuno 2013; Piekny et al. 2005;

Theriot 1997). In further support of a role for autophagy, we observed here that treatment

of cells with commonly used inhibitory drugs recapitulated abnormal accumulation of F-

actin at the ICB, similar to the phenotype caused by depletion of HSPB8. Recently, we

have shown that HSPB8, BAG3 and p62/SQSTM1 form a mitotic complex and that

depletion of any of the proteins resulted in the same phenotypes in early mitosis (Fuchs et

al. 2015). Here, we provide further evidence for a connection between the activity of

HSPB8-BAG3 during cytokinesis and autophagy signaling by showing that treatment of

HSPB8-depleted cells with rapamycin could prevent F-actin accumulation. This is in line

with recent work suggesting that BAG3 modulates the spatial activity of mTORC1 — the

target of rapamycin and a key regulator of autophagy signaling, in addition to its direct

interaction with the selective autophagic machinery via p62/SQSTM1 (Gamerdinger et al.

2011; Kathage et al. 2016). Overall, though the exact mechanism whereby HSPB8 and

BAG3 promote disassembly of cytokinetic actin structures remain to be established, we

think that we can reasonably speculate that the chaperone complex could act in the

autophagic sequestration of proteins that regulate assembly of actin networks, a function

that would be modulated by BAG3 mitotic phosphorylation.

In conclusion, the present study further supports a specialized role for HSPB chaperones

as members of a quality control network that would assist in the assembly and disassembly

of macromolecular complexes controlling the dynamic architecture of actin during various

104

mechanical processes, including cell-shape changes that guide mitosis in cancer cells

(Guilbert et al. 2015). Deciphering the mitotic interactome of BAG3 and the molecular

impact of BAG3 multisite phosphorylation is crucial to our understanding of HSPB8-

BAG3 function in actin dynamics and is the object of our current work. Given that HSPB8

and BAG3 are expressed in a wide variety of cancer cell types, their activity in cell division

may sustain tumor expansion (Rosati et al. 2011). Thus, uncovering their mode of action

is of great interest for the development of targeted therapeutic approaches to inhibit the

HSPB8-dependent function of BAG3 and further enhance mitotic stress in cancer cells.

105

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113

3. Chapitre 3 : Le complexe chaperon HSPB8-BAG3 facilite le remodelage des

structures mitotiques à base d’actine en modulant l’activité d’HDAC6

Nous avons établi que la mitose représente un modèle paradigme pour étudier les fonctions

de BAG3 qui dépendent d’HSPB8 dans le remodelage des structures à base d’actine (Fuchs

et al. 2015 ; Annexe 1). En effet, au cours de la mitose, nous avons montré que la

localisation, la phosphorylation et la stabilité du co-chaperon BAG3 dépendent de son

chaperon HSPB8 (Fuchs et al., 2015 ; Annexe 1 ; Chapitre 2). Lors de la cytokinèse, le

complexe HSPB8-BAG3 semble agir en partie en limitant la dynamique de l’actine

dépendante d’Arp2/3 (Chapitre 2). Nous avons également démontré qu’en mitose, BAG3

est associée préférentiellement à p62/SQSTM1 et que la déplétion de l’adaptateur

autophagique peut récapituler les mêmes phénotypes sur le remodelage des structures

d’actine, suggérant qu’HSPB8, BAG3 et p62/SQSTM1 agissent ensembles (Gamerdinger

et al. 2009; Fuchs et al. 2015); Annexe 1). En outre, HDAC6, un partenaire de

p62/SQSTM1, est également recrutée par le complexe mitotique (Fuchs et al. 2015 ;

Annexe1, Figure 6D). Il a été rapporté que p62/SQSTM1, en s’associant avec HDAC6,

régule négativement l’activité catalytique de la déacétylase pendant un stress protéotoxic,

et ce faisant, contrôle le processus d’assemblage de F-actine entourant l’agrésome (Yan et

al. 2013).

Sur la base de ces résultats, nous avons émis l'hypothèse qu’un complexe mitotique formé

de BAG3-HSPB8 et p62/SQSTM1 pourrait moduler l’activité mitotique d’HDAC6, ce qui

faciliterait le remodelage des structures à base d’actine pendant la mitose. Ceci implique

que l’activité d’HDAC6 soit modulée par des signaux mitotiques et qu’elle contribue

normalement à réguler l’assemblage/désassemblage des structures mitotiques à base

d’actine. HDAC6 a été impliquée en G2/M où elle est requise pour le démantèlement du

cil primaire préalablement à l’entrée des cellules en mitose (Ran et al. 2015). Notamment,

la surexpression d’HDAC6 stimule le désassemblage du cil primaire dans les cellules

synchronisées en G2/M alors que sa déplétion interfère avec ce processus. Cependant, à

notre connaissance, une étude systématique de son activité à l’entrée des cellules en mitose

n’a pas été réalisée jusqu’à maintenant. Nous avons donc étudié la relation entre

114

l'expression de BAG3, HSPB8 et p62/SQSTM1 et l'activité d’HDAC6 sur le remodelage

des structures mitotiques à base d'actine.

Dans ce chapitre, nous présenterons des résultats suggérant que le complexe chaperon

HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 limite l’activité d’Arp2/3 dans une structure hautement

dynamique d’actine qui dirige le positionnement du fuseau mitotique : le nuage sous-

cortical d’actine. Des résultats indiquant que l’activité d’HDAC6 est requise pour la

formation et la dynamique du nuage sous-cortical d’actine seront ensuite montrés. Nous

montrerons aussi que les défauts de dynamique du nuage sous-cortical d’actine et

d’arrondissement mitotique peuvent être corrigés par l’inhibition d’HDAC6. Nous

présenterons ensuite des résultats qui supportent une interaction fonctionnelle entre le

complexe chaperon, HDAC6 et la cortactine, laquelle pourrait limiter l’activité spatiale de

la cortactine sur la polymérisation de l’actine dépendante d’Arp2/3, en inhibant la

déacétylation de la cortactine.

J’ai réalisé la majorité des expériences qui sont présentées dans ce chapitre, en

collaboration avec Carole Luthold. Ces travaux feront l’objet d’une publication ou nous

serons co-premières auteurs. Spécifiquement, les résultats présentés dans les figures 3.2,

3.4, S3.1 ont été obtenus par cette collaboration. Les données présentées dans la figure 3.1

ont été obtenues par Carole Luthold et celles présentées dans la figure 3.3A et 3.3C, par

Herman Lambert. J’ai réalisé les expériences présentées dans la figure 3.3B.

3.1. La déplétion de l’une ou l’autre des protéines du complexe mitotique HSPB8-

BAG3-p62/SQSTM1 interfère avec la dynamique du nuage sous-cortical d’actine

qui dépend du complexe Arp2/3

Un contrôle serré du positionnement du fuseau mitotique parallèle au substrat dépend de

structures hautement dynamiques d’actine : les fibres de rétraction (Mitchison 1992; Fink

et al. 2011). Celles-ci pemettraient des connections physiques entre la matrice

extracellulaire et le fuseau mitotique, assurant ainsi la transmission des signaux de tension

provenant de la matrice aux pôles du fuseau mitotique. Notamment, il a été montré que les

115

forces émises par les fibres de rétraction influencent la dynamique du nuage sous-cortical

d’actine en mitose (Fink et al. 2011). Le nuage sous-cortical d’actine est une structure

hautement dynamique soumise à un renouvellement rapide par

polymérisation/dépolymérisation résultant en un mouvement circulaire (Chapitre 1, Figure

1.14). La formation et le positionnement du nuage sous-cortical d’actine qui dépendent de

l’activité d’Arp2/3, produirait des forces de traction sur le fuseau mitotique et faciliterait

son positionnement en fonction des forces transmises par les fibres de rétraction

(Mitsushima et al. 2010; Fink et al. 2011). Nous avons montré dans notre première étude

que la déplétion de BAG3, qui organise le complexe mitotique HSPB8-BAG3-

p62/SQSTM1, interfère avec l’organisation des fibres de rétraction et conduit à des

oscillations anormales du fuseau mitotique ce qui perturbe la progression mitotique (Fuchs

et al. 2015; Annexe 1). En outre, les travaux présentés dans le chapitre 2 suggèrent

qu’HSPB8-BAG3 facilite le remodelage de l’actine en partie en limitant l’activité d’Arp2/3

(Chapitre 2, Figure 2.5). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que le complexe chaperon

HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 pourrait réguler la dynamique d’actine associée à la

polarisation du nuage sous-cortical d’actine, en limitant l’activité d’Arp2/3.

Pour tester notre hypothèse, nous avons réalisé des expériences d’imagerie en temps réel

dans des cellules HeLa synchronisées en mitose, déplétées en BAG3 et exprimant la sonde

LifeAct-GFP spécifique de la F-actine. Notez que les niveaux de déplétion protéique

obtenus avec les différents siARN utilisés dans cette étude sont présentés dans la figure

supplémentaire S3.1. En accord avec les travaux précédemment publiés, dans les cellules

contrôles, nous avons observé la présence d’un regroupement de F-actine situé sous le

cortex cellulaire et dont la dynamique au cours du temps suit un mouvement circulaire, i.e.

polarisé (Figure 3.1A, flèches blanches) (Mitsushima et al. 2010). En effet, il a été décrit

que la dynamique du nuage suit une rotation constante qui est due à la dynamique spatiale

de polymérisation/dépolymérisation qui semble déplacer le nuage de façon circulaire. La

structure sous-corticale dynamique de F-actine a été retrouvée dans ~60 % des cellules

contrôles, dont une majorité ~42 % présentait un mouvement polarisé (Figure 3.1B, siCtl,

DMSO). Pour déterminer si cette structure d’actine correspond au nuage sous-cortical

d’actine décrit par Mitsushima et al., nous avons traité les cellules avec le CK666, un

116

inhibiteur d’Arp2/3, 30 min avant l’acquisition en temps réel (Nolen et al. 2009;

Mitsushima et al. 2010). Le traitement des cellules contrôles avec le CK666 a conduit à

une augmentation de 1,5 fois du pourcentage de cellules n’arborant plus de structure sous-

corticale dynamique de F-actine (>60 % ; Figure 3.1B). Ce résultat montre que la formation

de cette structure peut être inhibée rapidement suivant une réduction de l’activité d’Arp2/3,

en accord avec les travaux de Mitsuchima et al. (Mitsushima et al. 2010).

Figure 3.1 : La déplétion de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1 perturbe le nuage sous-cortical d’actine qui dépend d’Arp2/3. (A) Séquences temporelles d’images confocales de cellules HeLa-RFP-H2B traitées avec des siARN et exprimant la sonde LifeAct-GFP, montrant un mouvement polarisé (siCtl, panel du haut) comparé à un mouvement désordonné et erratique (siBAG3_3, panel du bas) du nuage sous-cortical d’actine. Les cellules ont été synchronisées en mitose et l’acquisition s’est faite sur 75 min à un intervalle de 90 secondes. Les flèches blanches indiquent le nuage sous-corticale d'actine et les flèches jaunes son mouvement ; barres d'échelle, 10 µm. (B) Le graphique décrit le pourcentage de cellules présentant un mouvement polarisé ou erratique du nuage sous-cortical d’actine ou ne présentant pas de nuage sous-cortical d’actine (absent). Des cellules HeLa-RFP-H2B ont été synchronisées

117

en mitose, infectées avec l’Ad-Life-Act-GFP (1PFU) et le bacculovirus α-tubuline-RFP (4PFU) et transfectées avec un siCtl ou un siBAG3 (siBAG3_3). Trente minutes avant l’acquisition, les cellules ont été traitées avec du CK666 (40 µM) et les images ont été acquises par microscopie confocale de type « spinning disc » pendant une période de 75 minutes à des intervalles de 90 secondes. Les résultats +/- SEM sont représentatifs de 3 expériences indépendantes où 113 à 146 cellules ont été quantifiées. L'analyse statistique a été effectuée par le test de Fisher et compare les conditions indiquées à la condition siCtl DMSO. (C) Reconstitution 3D d’images confocales déconvoluées montrant des cellules HeLa-RFP-H2B en métaphase présentant une augmentation de la densité et une réorganisation de la F-actine en réponse à la déplétion de BAG3 (siBAG3_1) en comparaison aux cellules transfectées avec le siCtl. Des cellules HeLa-RFP-H2B ont été synchronisées en mitose et transfectées avec un siARN dirigé contre BAG3 (siBAG3_1) ou contrôle (siCtl). L’immunofluorescence a été réalisée avec un anti-a-tubuline pour marquer le fuseau mitotique et la phalloïdoine-488 pour marquer la F-actine ; barre d’échelle, 10 µm. (D) Graphique montrant le pourcentage de cellules présentant une mitose défectueuse (oscillation du fuseau mitotique et retard de la progression des cellules en prométa- et métaphase). Le protocole décrit en B a été employé pour l’obtention des résultats +/- SEM représentés provenant de 3 expériences indépendantes où ou au moins 112 cellules ont été quantifiées. L'analyse statistique a été effectuée par le test de Fisher et compare les conditions indiquées à la condition siCtl DMSO. (E) Histogramme représentant le pourcentage de cellules arborant un mouvement erratique du nuage sous-cortical d’actine. Des images de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en mitose, déplétées en BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1 et exprimant les sondes LifeAct-GFP et a-tubuline-RFP ont été acquises en temps réel par microscopie confocale de type « spinning disc » durant une période de 75 min à un intervalle de 90 secondes. Les résultats +/-SEM proviennent de 3 expériences indépendantes où au minimum 111 cellules ont été analysées. L'analyse statistique a été effectuée par le test de Fisher et compare les conditions indiquées à la condition siCtl. (F) Graphique montrant le pourcentage de cellules avec une mitose défectueuse (oscillation du fuseau mitotique et retard de la progression des cellules en prométa- et métaphase). Les résultats +/-SEM proviennent de 3 expériences indépendantes où au minimum 93 cellules ont été quantifiées. L'analyse statistique a été effectuée par le test de Fisher et compare les conditions indiquées à la condition siCtl.

Suivant la déplétion de BAG3, nous avons d’abord noté que le nuage sous-cortical d’actine

était observable dans une plus grande proportion de cellules ~90 % (Figure 3.1B). De façon

remarquable, plus de 50 % de ces cellules montraient un nuage d’actine « non-polarisé »

et « erratique » (Figure 3.1B, siBAG3_3, DMSO). En effet, tel que montré dans la figure

3.1A, le mouvement du nuage sous-cortical d’actine ne suivait pas une rotation soutenue

et montrait des changements désordonnés d’orientation, suggérant une dérégulation de la

dynamique de polymérisation/dépolymérisation de l’actine. L’augmentation de la présence

de la structure sous-corticale dynamique de F-actine dans les cellules déplétées en BAG3

pourrait donc refléter une dérégulation de la dynamique de l’actine qui se traduirait par des

118

mouvements anarchiques de celle-ci. A l’appui de cette hypothèse, le traitement avec le

CK666 des cellules déplétées en BAG3, a provoqué une augmentation du pourcentage de

cellules n’arborant aucun nuage sous-cortical d’actine (passage de ~15 % à ~32%),

corroborant ainsi la dépendance à Arp2/3. Cependant et de façon remarquable, nous avons

vu que pour les ~70 % des cellules déplétées en BAG3 et traitées avec le CK666 présentant

toujours un nuage sous-cortical d’actine, seulement ~25 % d’entre elles présentaient un

mouvement erratique du nuage sous-cortical d’actine comparé à plus de 50 % pour les

cellules traitées avec le contrôle DMSO (Figure 3.1B). Ainsi, le traitement avec le CK666

des cellules déplétées en BAG3 conduit à une réduction significative de la proportion de

cellules arborant un mouvement erratique du nuage sous-cortical d’actine se rapprochant

de la condition contrôle. Ces résultats indiquent qu’en réduisant l’activité Arp2/3 à l’aide

de l’inhibiteur CK666, on normalise la dynamique du nuage sous-cortical d’actine qui est

altérée en réponse à la déplétion de BAG3. Nos résultats suggèrent que les mouvements

erratiques du nuage sous-cortical d’actine seraient la conséquence d’une polymérisation

excessive de l’actine branchée induite par Arp2/3. Il semble donc que le co-chaperon

BAG3 pourrait réguler la dynamique d’actine au sein du nuage sous-cortical d’actine en

limitant l’activité d’Arp2/3, en lien avec les résultats présentés dans le chapitre 2 suggérant

que le complexe chaperon HSPB8-BAG3 limite l’activité d’Arp2/3 lors de la cytokinèse.

En outre, une accumulation ectopique de F-actine autour du fuseau mitotique a été

corroborée en marquant les structures d’actine endogènes à l’aide de la phalloïdine. Nous

avons noté que dans les cellules contrôles, la F-actine s’organise en de petits filaments fins

à l’intérieur du cytoplasme entourant le fuseau mitotique (Figure 3.1C). En revanche, dans

les cellules déplétées en BAG3, nous avons observé une élévation importante de l’intensité

du marquage de la phalloïdine montrant une augmentation de la densité de la F-actine dans

ces cellules (Figure 3.1C). De plus, nous avons vu que les filaments d’actine sont davantage

épais et nombreux en comparaison aux cellules contrôles et s’organisent en une structure

ectopique très dense apparaissant comme une cage entourant le fuseau mitotique que nous

appellerons dans les sections suivantes cage de F-actine (Figure 3.1C). Il est à noter ici que

le même genre de structure ectopique a été observé en réponse à la déplétion d’HSPB8

(Figure 3.2B). Ce résultat suggère que la polymérisation de l’actine se fait en excès dans

119

les cellules déplétées en HSPB8 et en BAG3. Il serait intéressant d’analyser si cette

structure ectopique d’actine endogène est la conséquence d’un excès de polymérisation

d’actine branchée. Pour cela, nous pourrions traiter des cellules déplétées en BAG3 ou en

HSPB8 avec du CK666. Une normalisation de la densité de F-actine dans la cage de F-

actine suggèrerait que cette structure est la conséquence d’une activation excessive

d’Arp2/3 comme cela est suggéré pour la dynamique du nuage sous-cortical d’actine.

Puisqu’il a été montré que le nuage sous-cortical d’actine dirige le positionnement du

fuseau mitotique et que la dynamique de celui-ci est dérégulée dans les cellules déplétées

en BAG3, nous avons souhaité savoir si cet effet contribue aux défauts de positionnement

du fuseau. Pour ce faire, nous avons analysé ce processus par imagerie en temps réel dans

des cellules HeLa synchronisées en mitoses déplétées en BAG3 et exprimant l’a-tubuline-

RFP ; 30 min avant l’acquisition en temps réel les cellules ont été traitées avec le CK666

afin de réduire l’activité du complexe Arp2/3. Dans les cellules traitées avec le contrôle

DMSO, nous avons observé que ~54 % des cellules déplétées en BAG3 présentent une

mitose défectueuse, caractérisée par des anomalies de positionnement du fuseau mitotique

et/ou des délais de la progression des cellules en mitose, contre seulement ~29 % des

cellules contrôles (Figure 3.1D), ce qui est consistent avec nos travaux précédents (Fuchs

et al. 2015 ; Annexe 1).

Suite au traitement avec le CK666, nous avons constaté une augmentation de 2 fois de la

proportion de cellules présentant une mitose défectueuse dans les cellules contrôles (Figure

3.1D). Cette observation montre que la disparition du nuage sous-cortical d’actine suite au

traitement avec le CK666 (Figure 3.1B) corrèle avec une augmentation de défauts

mitotiques dont des défauts de positionnement du fuseau. Ceci est en accord avec les

données de la littérature qui suggèrent que le nuage sous-cortical d’actine dirige le

positionnement du fuseau mitotique (Mitsushima et al. 2010). À l’inverse, les cellules

déplétées en BAG3 présentent une réduction de 1,5 fois de la proportion de cellules

présentant une mitose défectueuse en réponse au CK666 (Figure 3.1D). Ce résultat montre

qu’en réduisant l’activité Arp2/3, on peut normaliser les défauts de positionnement du

fuseau mitotique et les retards dans la progression mitotique conséquents à la déplétion de

BAG3. Ce résultat suggère que de tels défauts sont, au moins en partie, la conséquence

120

d’une dérégulation de l’activité d’Arp2/3, liés à la dynamique défectueuse du nuage sous-

cortical d’actine observée dans les cellules déplétées en BAG3.

Nous avons montré que la fonction de BAG3 en mitose dépend de son association avec

HSPB8 et pourrait impliquer l’adaptateur autophagique p62/SQSTM1 (Fuchs et al. 2015 ;

Annexe 1). Notamment, la déplétion de ces deux protéines conduit aux mêmes phénotypes

mitotiques que celle de BAG3. Nous avons donc voulu savoir si la fonction de BAG3 dans

la modulation de la dynamique du nuage sous-cortical d’actine implique ses partenaires

mitotiques p62/SQSTM1 et HSPB8. Pour cela, nous avons effectué des expériences

d’imagerie en temps réel de cellules HeLa synchronisées en mitose, déplétées en BAG3,

en HSPB8 ou en p62/SQSTM1 et exprimant les sondes LifeAct-GFP et a-tubuline-RFP

(Figure supplémentaire S3.1). Comme nous l’avons montré précédemment, la déplétion

d’une de ces trois protéines se traduit par une élévation de défauts mitotiques (i.e.

oscillation du fuseau mitotique et/ou retard dans la progression mitotique) montrant que

BAG3, HSPB8 et p62/SQSTM1 facilitent la progression mitotique (Figure 3.1F ; Fuchs et

al. 2015 ; Annexe 1). De façon remarquable, nous avons noté que la déplétion d’HSPB8

ou de p62/SQSTM conduit à une augmentation de presque 3 fois de la proportion de

cellules arborant un mouvement erratique du nuage sous-cortical d’actine en comparaison

aux cellules contrôles (Figure 3.1E). Ces observations montrent que comme la déplétion

de BAG3, la déplétion d’HSPB8 ou de p62/SQSTM1 interfère avec le mouvement polarisé

du nuage sous-cortical d’actine.

En conclusion, nos résultats sont en accord avec les résultats présentés dans le chapitre 2

qui suggèrent que le complexe chaperon HSPB8-BAG3 facilite le remodelage de l’actine

en limitant l’activité d’Arp2/3 (Chapitre 2, Figure 2.5). En effet, nos travaux montrent que

le co-chaperon BAG3 facilite la polarisation du nuage sous-cortical d’actine la seule

structure mitotique décrite dans la littérature comme étant dépendante du complexe Arp2/3

(Mitsushima et al. 2010). Nous concluons que le complexe chaperon HSPB8-BAG3-

p62/SQSTM1 pourrait faciliter le positionnement du fuseau mitotique à travers la

limitation de l’activité d’Arp2/3 requise pour la polarisation du nuage sous-cortical

d’actine.

121

Afin d’adresser le mécanisme impliqué nous nous sommes tournés vers l’étude de la

contribution potentielle d’HDAC6, un partenaire du complexe chaperon HSPB8-BAG3 en

mitose.

3.2. De faibles doses d’un inhibiteur d’HDAC6 peut normaliser la dynamique du nuage

sous-cortical d'actine et l'arrondissement mitotique dans les cellules déplétées en

BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1

HDAC6 est une déacétylase unique qui présente des fonctions importantes dans le contrôle

de la migration cellulaire (Valenzuela-Fernández et al. 2008; Zhang et al. 2014; Kanno et

al. 2012; Zuo et al. 2012). Cette fonction implique notamment la régulation de la

dynamique de l'actine à travers la modulation de l'acétylation de la cortactine, une protéine

liant l'actine et activant le complexe Arp2/3 (Zhang et al. 2007; Uruno et al. 2001; Weaver

et al. 2001). De plus, il a été montré dans le contexte de la réponse à l’agrésome que

p62/SQSTM1 agit comme un inhibiteur de l’activité d’HDAC6 en interagissant avec la

déacétylase (Yan et al. 2013). Ainsi, nous avons postulé que le complexe chaperon HSPB8-

BAG3 par son association avec p62/SQSTM1 et HDAC6, pourrait limiter l’activité

d’Arp2/3 en partie, en limitant la déacétylation de la cortactine.

Nos résultats préliminaires ont indiqué que la déplétion d’HDAC6 perturbe

significativement l’entrée des cellules en mitose, rendant irréalisable cette approche

(résultats non montrés). En conséquence, nous avons tiré avantage de la tubacine, une

drogue qui est hautement sélective pour HDAC6, pour inhiber l’activité de la déacétylase

sur de courts temps et évaluer son effet sur la dynamique du nuage sous-cortical d’actine

(Haggarty et al. 2003; Schölz et al. 2015). Lorsque les cellules ont été traitées avec 5 µM

de tubacine, une dose qui inhibe l’activité d’HDAC6, pendant la seconde relâche d’un

double blocage à la thymidine sur une période de 8 h, la formation du nuage sous-cortical

d’actine a été inhibée dans plus de 70 % des cellules contrôles, comme dans les cellules

déplétées en BAG3 (Figure 3.2A ; Haggarty et al. 2003). Ainsi, ce résultat indique que

l’inhibition d’HDAC6 même sur de courts temps inhibe la formation du nuage sous-

122

cortical d’actine. En outre, ce traitement a causé la disparition des structures ectopiques

d’actine marquées par la phalloïdine dans les cellules mitotiques déplétées en HSPB8 ou

en BAG3 (Figure 3.2B). Ces résultats suggèrent fortement qu’HDAC6 est essentielle pour

la formation du nuage sous-cortical d’actine et que son activité est dérégulée suivant la

déplétion du complexe chaperon, causant une accumulation de F-actine.

Figure 3.2 : L’activité d’HDAC6 régule la dynamique du nuage sous-cortical d’actine : la réduction de l’activité de HDAC6 par de faibles doses de tubacine peut normaliser les défauts mitotiques associés à la déplétion de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1. (A) Histogramme représentant le pourcentage de cellules arborant un mouvement polarisé ou erratique du nuage sous-cortical d’actine ou ne présentant pas de nuage sous-cortical d’actine (absent) en réponse au traitement avec la tubacine (tub) ou le contrôle DMSO. Des cellules HeLa-RFP-H2B ont été synchronisées en mitose par un double blocage à la thymidine, infectées avec l’Ad-Life-Act-GFP (1PFU) et le bacculovirus α-tubuline-RFP (4PFU) et transfectées avec un siCtl ou un siBAG3 (siBAG3_3). Durant les 8 h de la seconde relâche les cellules ont été traitées avec la tubacine (5 µM) et les images ont été acquises par microscopie confocale de type « spinning disc » pendant une période de 75 minutes à des intervalles de 90 secondes. Les résultats sont représentatifs d’une expérience.

123

(B) Reconstitution 3D d’images confocales déconvoluées montrant des cellules HeLa-RFP-H2B en métaphase déplétées en HSPB8 présentant une normalisation de la densité de la F-actine en réponse au traitement avec la tubacine. L’immunofluorescence a été réalisée avec un anti-a-tubuline pour marquer le fuseau mitotique et la phalloïdoine-488 pour marquer la F-actine ; barre d’échelle, 10 µm. (C) Graphique représentant (gauche) le pourcentage de cellules arborant un mouvement polarisé ou erratique du nuage sous-cortical d’actine ou ne présentant pas de nuage sous-cortical d’actine (absent) et (droite) le pourcentage de cellules avec une mitose défectueuse, en réponse au traitement avec la tubacine (tub) ou le contrôle DMSO. Des cellules HeLa-RFP-H2B ont été synchronisées en mitose par un double blocage à la thymidine, infectées avec l’Ad-Life-Act-GFP (1PFU) et le bacculovirus α-tubuline-RFP (4PFU) et transfectées avec un siCtl ou un siBAG3 (siBAG3_3). 30 minutes avant l’acquisition en temps réel les cellules ont été traitées avec la tubacine (20 nM) et les images ont été acquises par microscopie confocale de type « spinning disc » pendant une période de 75 minutes à des intervalles de 90 secondes. Les résultats sont représentatifs d’une expérience. Les résultats +/- SEM sont représentatifs de 2 ou 3 expériences indépendantes où au moins 69 cellules ont été quantifiées. L'analyse statistique a été effectuée par le test de Fisher et compare les conditions indiquées à la condition siCtl DMSO (D) Images d'épifluorescence déconvoluées montrant une cellule MCF7 mitotique ronde typique (siCtl) par rapport à une cellule mitotique plate défectueuse (siBAG3_1); la F-actine a été marquée par la phalloïdine-488, le fuseau mitotique par l'anti-a-tubuline et l'ADN par le Hoechst; barres d'échelle, 10 µm. (F) Histogramme représentant le pourcentage de cellules HeLa-RFP-H2B et MCF7 avec des défauts d'arrondissement mitotique (cellules partiellement ou non arrondies) après 48 h de déplétion de BAG3 ou d’HSPB8 (gauche) avec les siBAG3_1, siBAG3_2 et siHSPB8_2 ou 24 h de déplétion d’HSPB8 et de p62/SQSTM1 (droite) avec les sip62_1, sip62_2 et siHSPB8_1. Les résultats +/- SEM sont représentatifs de 3 expériences indépendantes où 605 à 846 cellules ont été analysées. L'analyse statistique a été effectuée par le test de Fisher et compare les conditions indiquées à la condition siCtl DMSO.

En outre, nos observations nous ont indiqué que le nuage sous-cortical d’actine est très

sensible à des variations de l’activité d’HDAC6. Nous avons donc effectué des essais de

dose/réponse pour déterminer une dose ayant peu d’impact sur la formation du nuage sous-

cortical d’actine dans les cellules contrôles (résultat non montrés). Ainsi, nous avons établi

qu’un traitement avec 20 nM de tubacine 30 minutes avant l’acquisition d’images en temps

réel permet de préserver le nuage sous-cortical d’actine dans les cellules HeLa exprimant

les sondes LifeAct-GFP et a-tubuline-RFP synchronisées en mitose ; cependant, nous

avons observé une augmentation de la proportion de cellules montrant un mouvement

désordonné du nuage sous-cortical d’actine (Figure 3.2C, erratique).

124

Lorsqu’un même traitement a été appliqué aux cellules déplétées en BAG3, une réduction

de ~2 fois du pourcentage de cellules présentant un mouvement erratique du nuage sous-

cortical d’actine a été mesurée (Figure 3.2C). De plus, ce traitement a réduit la proportion

de cellules présentant des défauts mitotiques, notamment de positionnement du fuseau

mitotique dans les cellules déplététes en BAG3, alors qu’il a augmenté ces défauts

mitotiques dans les cellules contrôles (Figure 3.2C). Ces résultats indiquent qu’une

réduction de l’activité d’HDAC6 a un effet opposé dans les cellules contrôles versus les

cellules déplétées en BAG3, suggérant qu’un contrôle spatial fin de son activité est requis

pour favoriser la dynamique polarisée du nuage sous-cortical d’actine dirigée par la

polymérisation/dépolymérisation de l’actine branchée. Par conséquent, ce résultat suggère

que les mouvements erratiques du nuage sous-cortical d’actine sont en partie la

conséquence d’une dérégulation de l’activité d’HDAC6 suivant la déplétion de BAG3.

Nous avons montré que le complexe chaperon influence l’arrondissement mitotique (Fuchs

et al. 2015 ; Annexe 1, Figure 7A et B). Ce processus implique notamment une transition

dans l’activité des nucléateurs de l’actine, passant d’Arp2/3 à la formine mDia1 dont

l’activité est requise pour la formation du cortex mitotique (Rosa et al. 2015). Ainsi, il est

possible qu’un dérèglement de l’activité mitotique du complexe Arp2/3 interfère avec

l’arrondissement mitotique. Afin de déterminer si l’action du complexe chaperon sur

l’activité HDAC6 et Arp2/3 contribue à son effet sur l’arrondissement mitotique, les

cellules HeLa ou les cellules MCF7 ont été synchronisées en mitose et déplétées en BAG3,

HSPB8 ou p62/SQSTM1, puis traitées avec 5 µM de tubacine durant 8 h. Pour consolider

nos observations, nous avons utilisé deux séquences de siARN différentes pour chacune

des protéines ciblées dans les cellules HeLa ou MCF7 (Figure S3.1). Par

immunofluorescence, nous avons ensuite examiné la proportion de cellules arrondies en

mitose versus la proportion de cellules partiellement ou non arrondies (plate, Figure 3.2D).

Nous avons observé que le traitement avec la tubacine des cellules transfectées avec le

siCtl conduit à un doublement de la proportion de cellules avec des défauts

d’arrondissement mitotique dans les cellules HeLa ; par contre ce même traitement a eu

peu d’effet sur l’arrondissement mitotique des cellules MCF7 (Figure 3.2E). Puisque

l’arrondissement mitotique est dépendant entre autre de modifications dans les structures

125

d’adhérence cellulaire, il est possible que des effets dépendants du type cellulaires

interviennent (Marchesi et al. 2014; Margadant, Opstal, et Boonstra 2007). Par exemple,

une étude a suggéré qu’en contrôlant le niveau d’acétylation de la tubuline, HDAC6

pourrait aider au renouvellement des adhésions focales (Tran et al. 2007). Dans les cellules

HeLa, mais pas dans les cellules MCF7, ce processus pourrait être requis pour

l’arrondissement mitotique et pourrait expliquer l’effet différentiel du traitement avec la

tubacin dans les deux lignées cellulaires.

Par contre, que ce soit dans les cellules HeLa ou dans les cellules MCF7, nous avons

observé une augmentation significative du pourcentage de cellules avec des défauts

d’arrondissement mitotique en réponse à la déplétion de BAG3, d’HSPB8 ou de

p62/SQSTM1 (Figure 3.2E). Ce résultat corrobore nos travaux précédents et indique que

la déplétion de l’une de ces trois protéines interfère avec l’arrondissement mitotique dans

les deux lignées cellulaires (Fuchs et al. 2015 ; Annexe 1). Dans ces cellules, le traitement

avec la tubacine a causé une réduction significative d’au moins 2 fois de la proportion de

cellules présentant des défauts d’arrondissement mitotique (Figure 3.2E). Ceci suggère

qu’une réduction de l’activité d’HDAC6 peut normaliser les défauts d’arrondissement

mitotique observés en réponse à la déplétion des protéines BAG3, HSPB8 et p62/SQSTM1.

En outre, un inhibiteur de l’activité Arp2/3 peut également corriger les défauts

d’arrondissement mitotique dans les cellules HeLa (Figure supplémentaire S3.2).

Collectivement, les résultats suggèrent que le complexe chaperon HSPB8-BAG3-

p62/SQSTM1 pourrait faciliter le remodelage de l’actine en mitose à travers la modulation

de l’activité d’HDAC6. Une telle fonction pourrait aider à la régulation de l’activité

d’Arp2/3 requise pour la formation et la polarisation du nuage sous-cortical d’actine. La

modulation d’HDAC6 par HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 aiderait également aux processus

conduisant l’arrondissement mitotique. Récemment, l'activité d’HDAC6 a été impliquée

dans la progression de la cytokinèse puisque son inhibition ou sa déplétion se caractérise

par une inhibition de la formation de l’anneau contractile (Li et al. 2017). Il semble donc

que l'activité d’HDAC6 soit finement régulée pendant la progression du cycle cellulaire

126

par des mécanismes qui pourraient faire intervenir le complexe chaperon. Les résultats

présentés ci-après suggèrent que son activité sur la cortactine serait impliquée.

3.3. L’activité d’HDAC6 et son association à la cortactine sont régulées de façon

mitose-spécifique, d’une manière qui pourrait impliquer l’intervention du

complexe chaperon HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1

Jusque-là, nos résultats suggèrent qu’un débalancement de l’activité d’HDAC6 interfère

avec les processus de remodelage du cytosquelette d’actine en mitose et que le complexe

chaperon HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 pourrait intervenir dans sa régulation. Pour

appuyer ces résultats fonctionnels, nous avons d’abord tenté d’obtenir des évidences

biochimiques supportant la modulation d’HDAC6 dans les cellules en mitose. Pour ce

faire, nous avons traité des cellules asynchrones ou relâchées d’un double blocage à la

thymidine avec 5 µM de tubacine, pendant toute la seconde relâche (8 h), ou pendant les 4

dernières heures avant l’entrée des cellules en mitose. Les niveaux d’acétylation des

protéines totales, ainsi que les niveaux d’acétylation de la cortactine ont été analysés par

immunobuvardage de type « Western », en utilisant des anticorps anti-acétyl à large

spectre, ou spécifiquement dirigés contre la lysine 309 de la cortactine, déacétylée par

HDAC6 (Zhang et al. 2007).

Les résultats indiquent que le niveau total d'acétylation des protéines augmente

proportionnellement au temps de traitement avec la tubacine dans les deux conditions,

démontrant qu’HDAC6 est active dans les cellules asynchrones comme dans les cellules

mitotiques (Figure 3.3A, Ac-K totale). De manière intéressante, nous avons noté

l’apparition de bandes protéiques qui semblent plus fortement acétylées dans les cellules

mitotiques. Ceci suggère que l’activité d’HDAC6 sur ses différents substrats pourrait être

stimulée ou modulée dans les cellules en mitose (Figure 3.3A, M, Ac-K totale).

127

128

Figure 3.3 : L’activité d’HDAC6 et son association à la cortactine sont régulées de façon différentielle en mitose ; un rôle pour le complexe chaperon HSPB8-BAG3. (A) Des cellules HeLa-RFP-H2B asynchrones et synchronisées en mitose ont été traitées pendant 0, 4 ou 8 h avec de la tubacine (5 µM) puis extraites pour analyse par immunobuvardage de type « Western ». Les immunobuvardages de type « Western » ont été réalisés en utilisant un anti-acétylation totale (Ac-K), un anti-acétyl-cortactine (Ac-K309) ; niveaux de cycline B1 : contrôle de synchronisation mitotique; cortactine: contrôle de dépôt. (B) Images confocales de cellules transfectées avec le siCtl asynchrones (AS) et mitotiques (M) et de cellules mitotiques déplétées en BAG3 (siBAG3_1) ou en HSPB8 (siHSPB8_2) montrant des spots d'interaction entre HDAC6 et la cortactine par PLA. Des cellules MCF7 ont été synchronisées en mitose, déplétées en BAG3 ou HSPB8 avec des siARN spécifiques pendant 48 h et transfectées avec les vecteurs GFP-HDAC6 et myc-cortactine durant 24 h. Barre d'échelle, 10 µm. Le graphique montre le nombre de spots de PLA par cellule ; résultats +/- SEM représentatifs de 3 expériences indépendantes où 30 à 101 cellules ont été anaylisées et l’analyse statistique a été effectuée par le test de Mann Whitney. (C) Des cellules HeLa-RFP-H2B ont été synchronisées en mitose par un traitement de 16 h avec le nocodazole et ont été infectées avec des adénovirus recombinants conduisant l'expression de GFP ou de mutants BAG3-GFP (IPV et DPxxP) suivant la déplétion sur 48 h de BAG3 à l’aide d’un siARN spécifique. Les extraits cellulaires ont été préparés à partir des cellules asynchrones (AS) ou synchronisées en mitose et récupérées par une agitation mécanique (M). Pour toutes les conditions, les immunoprécipitations ont été obtenues en utilisant un anticorps anti-GFP. Des analyses en immunobuvardage de type « Western » ont été réalisées avec les anticorps indiqués. Les niveaux de GFP, BAG3, HSPB8, p62/SQSTM1, HDAC6 et cortactine dans les extraits cellulaires totaux sont montrés (Input).

Puisque HDAC6 régule la dynamique de l'actine dépendante du complexe Arp2/3 via la

déacétylation de la cortactine, nous avons également comparé les niveaux d'acétylation de

la cortactine en interphase et en mitose (Zhang et al. 2007; Gao et al. 2007; Kaluza et al.

2011; Kozyreva et al. 2014). En utilisant un anticorps dirigé contre la cortactine acétylée,

nous avons observé une augmentation de l'acétylation de la cortactine en réponse à

l’inhibition d’HDAC6 de façon proportionnelle au temps de traitement avec la tubacine

dans les extraits cellulaires asynchrones et mitotiques (Figure 3.3A, Ac-K309). Ce résultat

confirme que la déacétylase cible la cortactine dans les cellules en interphase et en mitose.

De façon surprenante, dans les cellules mitotiques, le taux d'acétyl-cortactine suivant

l’inhibition d’HDAC6 est substantiellement inférieur à celui des cellules asynchrones,

même après 8 heures de traitement avec la tubacine (Figure 3.3A, M, Ac-K309). Ce résultat

suggère que la déacétylation de la cortactine par HDAC6 est diminuée pendant la mitose ;

ceci est corroboré par un niveau d’acétylation plus important en mitose (Figure 3.3A, M, 0

129

h). Nous avons conclu que l'activité d’HDAC6 sur sa cible la cortactine est limitée à

l’entrée des cellules en mitose, et donc que l’activité de la cortactine pourrait être inhibée.

Pour investiguer l’implication du complexe chaperon HSPB8-BAG3, nous avons cherché

à corroborer la diminution d’activité HDAC6 sur la cortactine pendant la mitose à l’échelle

cellulaire, et ensuite évalué l’impact de la déplétion de BAG3 ou d’HSPB8. Pour ce faire,

nous avons effectué des expériences de PLA (« proximity ligation assay ») qui permettent

de visualiser in situ des interaction protéine-protéine (Söderberg et al. 2008). Nous avons

examiné l’interaction d’HDAC6 avec la cortactine dans des cellules MCF7 asynchrones

ou mitotiques exprimant des formes exogènes de GFP-HDAC6 et myc-cortactine, et

déplétées en HSPB8 ou en BAG3.

Les résultats indiquent qu’en moyenne 74 spots de PLA, représentant une potentielle

interaction entre HDAC6 et la cortactine, ont été dénombrés dans des cellules contrôles

asynchrones tandis que ~30 spots ont été quantifiés dans des cellules mitotiques (Figure

3.3B, siCtl AS versus siCtl M). Cette observation suggère qu’il y a une réduction

significative de l’interaction de la déacétylase HDAC6 avec sa cible la cortactine dans les

cellules mitotiques, corroborant l’augmentation d’acétylation de la cortactine (Figure 3.3A,

M, 0 h). Notamment, dans les cellules mitotiques, nous avons observé qu’une déplétion de

BAG3 ou d’HSPB8 se traduit par une augmentation significative d’au moins 2 fois du

nombre de spots de PLA en comparaison aux cellules contrôles (Figure 3.3B). Ce résultat

suggère que le complexe chaperon pourrait limiter l’association d’HDAC6 avec la

cortactine à l’entrée des cellules en mitose.

Pour analyser davantage la relation fonctionnelle entre le complexe chaperon HSPB8-

BAG3-p62/SQSTM1, HDAC6 et la cortactine durant la mitose, nous avons effectué des

expériences de co-immunoprécipitations de BAG3-GFP dans des cellules déplétées de

BAG3 endogène, afin d’identifier les domaines fonctionnels responsables de l’interaction

BAG3-HDAC6. Les immunoprécipitations ont été réalisées à partir d'extraits de cellules

HeLa asynchrones (AS) ou mitotiques (M), après déplétion de BAG3 et réintroduction de

protéines BAG3-GFP portant des mutations qui abolissent la liaison à HSPB8 (IPV) ou la

130

délétion des motifs PxxP (ΔPxxP) (Figure 3.3C ; Fuchs et al. 2015 ; Annexe 1). Comme

nous l'avons démontré dans notre première étude, HDAC6 et p62/SQSTM1 co-précipitent

préférentiellement avec BAG3-GFP WT dans les cellules mitotiques (Figure 3.3C, M ;

Fuchs et al., 2015 ; Annexe 1). De façon intéressante, nous avons observé que la cortactine

co-précipite également avec BAG3-GFP WT davantage dans les extraits cellulaires

mitotiques que dans les extraits cellulaires asynchrones comme HDAC6 et p62/SQSTM1

(Figure 3.3C, M). Ainsi, ce résultat montre que BAG3 interagit préférentiellement avec

p62/SQSTM1, HDAC6 et sa cible la cortactine pendant la mitose. Cette observation

soutient l'importance d'un complexe formé des quatre protéines dans la progression

mitotique.

Nous avons précédemment démontré que l’activité mitotique de BAG3 dépend des motifs

IPV qui médient sont interaction avec HSPB8 et des motifs PXXP, qui sont présumés

permettre l’association de BAG3 à des protéines de signalisation (Fuchs et al. 2015 ;

Annexe 1 ; Behl 2016). Nous avons donc évalué la contribution de ces domaines au

recrutement d’HDAC6 et de la cortactine. Les résultats indiquent que le mutant BAG3 IPV

semble avoir moins d’affinité pour HDAC6 dans les extraits mitotiques (Figure 3.3C, M).

Une diminution plus marquée de l'interaction BAG3-HDAC6 concernant le mutant du

domaine PxxP a également été observée dans les extraits mitotiques (Figure 3.3C, M). De

manière significative, la même diminution a été détectée pour les interactions des mutants

de BAG3 avec p62/SQSTM1 et la cortactine (Figure 3.3C, M). Ces résultats montrent que

les motifs IPV et le domaine PxxP de BAG3 régulent les interactions avec p62/SQSTM1,

HDAC6 et la cortactine. Puisque le mutant IPV est incapable d'interagir avec HSPB8, ces

résultats ont identifié l'association à HSPB8 et le domaine riche en motifs PxxP, qui sont

les domaines fonctionnels mitotiques de BAG3, comme déterminants pour son interaction

avec p62/SQSTM1, HDAC6 et la cortactine pendant la mitose. Ce résultat renforce

l’hypothèse d’une fonction importante pour le complexe HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1-

HDAC6-cortactine dans la progression mitotique.

En conclusion, nos résultats indiquent que l’activité d’HDAC6 est régulée de façon

différentielle en mitose en comparaison à l’interphase. De façon intéressante, l’activité

131

d’HDAC6 sur la cortactine est réduite en mitose à l’inverse d’un grand nombre des cibles

de la déacétylase. Ceci s’accompagne d’une réduction significative de l’association

d’HDAC6 à la cortactine. Nos résultats suggèrent que le complexe chaperon HSPB8-

BAG3 pourrait limiter l’association d’HDAC6 avec la cortactine en mitose par un

mécanisme qui reste à déterminer. Ce mécanisme pourrait impliquer un recrutement de la

déacétylase par BAG3 de façon dépendante de son association à HSPB8 et de son domaine

PxxP qui semble être essentiel à l’association de BAG3 avec HDAC6, cortactine et

p62/SQSTM1. Une protéine intermédiaire, qui interagit avec le domaine PXXP de BAG3,

pourrait jouer un rôle clé pour ponter ces interactions, laquelle reste à identifier.

Il nous faudra confirmer que le complexe chaperon module l’activité d’HDAC6 sur la

cortactine. Pour cela, nous pourrions analyser l’impact de la déplétion de BAG3 ou

d’HSPB8 sur les niveaux d’acétylation de la cortactine, par des expériences

d’immunobuvardage de type « Western », à partir d’extraits cellulaires mitotiques traités

ou non avec la tubacine. Une élévation des niveaux d’acétylation de la cortactine en

réponse à la déplétion de BAG3 ou d’HSPB8 et au traitement avec la tubacine confirmera

l’hypothèse. Cela dit, nos résultats préliminaires indiquent que cette approche pourrait

s’avérer mitigée, due aux effets hétérogènes mesurés sur une population cellulaire

présentant des phénotypes hypomorphes (i.e. déplétion de BAG3 ou de HSPB8). Pour

pallier à ces effets, nous pourrions tirer avantage de la technologie CRISPR (« Clustered

Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats »)/Cas9 (« CRISPR associated protein

9 ») pour obtenir des lignées cellulaires KO pour BAG3 ou HSPB8. Alternativement une

approche basée sur la détection des niveaux de cortactine acétylée in situ, par

immunofluorescence est envisageable.

3.4. Modification du phénotype BAG3-dépendant par l’expression de mutants

cortactine acétyl-mimétique et non-acétylable

Nos résultats suggèrent que le complexe chaperon HSPB8-BAG3 pourrait moduler

l'activité d’HDAC6 sur la cortactine pendant la mitose et qu’une telle fonction est

132

nécessaire pour le remodelage de l'actine dans les cellules mitotiques. Nous avons donc

tenté de valider ce modèle par l’utilisation de mutants de la cortactine.

La cortactine peut être acétylée dans des régions répétitives enrichies en lysines situées en

aval de son domaine NTA (Zhang et al. 2007). Il a été montré que son acétylation prévient

sa localisation au front de migration et inhibe la motilité cellulaire, tandis que sa

déacétylation par HDAC6 entraîne une liaison accrue de la cortactine à la F-actine et

stimule ainsi la migration cellulaire (Zhang et al. 2007). Ainsi, pour tester notre hypothèse,

nous avons tout d’abord étudié les effets de l'expression de mutants non-acétylable

(cortactine-9KR) ou acétyl-mimétique (cortactine-9KQ) de la cortactine sur la densité de

la F-actine et la cage de F-actine observée suivant la déplétion de BAG3 ou d’HSPB8

(Figure 3.1C ; Zhang et al. 2007). Pour cela, nous avons transfecté sur 32 h des cellules

HeLa synchronisées en mitose et déplétées en HSPB8 ou en BAG3 avec les mutants de

cortactine (Figure 3.4A). Comme le montre la figure 3.4B, l'expression du mutant

cortactine-9KQ n'induit pas de changements dans l'organisation de la F-actine dans les

cellules mitotiques contrôles. À l’inverse, l'expression du mutant cortactine-9KR conduit

à un enrichissement de F-actine dans une structure en forme de cage qui entoure le fuseau

mitotique dans les cellules mitotiques, mimant le phénotype observé suivant la déplétion

de l’une ou l’autre des protéines du complexe HSPB8-BAG3. De plus, alors que

l'expression du mutant cortactine-9KR n'affecte pas l'organisation de cette structure

d'actine dans les cellules déplétées en BAG3 ou en HSPB8, une réduction significative de

la densité en F-actine a été observée dans les cellules déplétées et exprimant le mutant

cortactine-9KQ (Figure 3.4B). Ce résultat montre que les structures d’actine ectopiques qui

s’accumulent autour du fuseau mitotique suivant la déplétion de BAG3 ou d’HSPB8

peuvent être normalisées par la surexpression du mutant acétyl-mimétique de cortactine

(9KQ).

133

134

Figure 3.4 : Les mutants cortactine-9KQ et 9KR restaure et mime respectivement les défauts d’organisation du cytosquelette d’actine associés à la déplétion de BAG3 ou d’HSPB8. (A) Immunobuvardage de type « Western » d’extraits protéiques de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en mitose et transfectées durant 32 h avec des vecteurs codant pour des mutants de cortactine (9KQ et 9KR) étiquetés 3X-FLAG et montrant leur niveau d'expression par rapport à l'expression endogène de la cortactine (EV). L'analyse par immunoburadage de type « Western » a été réalisée avec un anti-cortactine; GAPDH: contrôle de dépôt. (B) Reconstitution 3D d'images confocales déconvoluées de cellules traitées selon le protocole décrit en A et montrant une normalisation pour le mutant cortactine-9KR et un mime pour le mutant cortactine-9KQ de la densité et de l’organisation de la F-actine. L'immunofluorescence a été réalisée avec un anti-a-tubuline, la phalloïdine-488 et le Hoechst pour marquer respectivement le fuseau mitotique, la F-actine et l'ADN; barre d'échelle; 10 µm. (C) Les images déconvoluées d'épifluorescence de cellules traitées selon le protocole décrit en A montrent une restauration de l'arrondissement mitotique de cellules déplétées en BAG3 ou en HSPB8 après expression du mutant cortactine-9KQ et un mime du défaut d’arrondissement mitotique par les cellules contrôles (siCtl) après l'expression du mutant cortactine-9KR. L’immunofluorescence a été réalisée avec un anti-FLAG pour marquer la cortactine exogène, un anti-a-tubuline pour marquer les microtubules, la phalloïdine-488 pour marquer la F-actine et le Hoechst pour marquer l'ADN; barres d'échelle, 10 µm. (D) Le graphique représente le pourcentage de cellules arborant des défauts d'arrondissement mitotique après la transfection des mutants cortactine-9KR et 9KQ des cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en mitose et transfectées avec un siARN dirigé contre BAG3 (siBAG3_1) ou HSPB8 (siHSPB8_2) ou un contrôle (siCtl) ; résultats +/- SEM représentatifs de 3 expériences indépendantes où au moins 609 cellules ont été analysées. L’analyse statistique a été effectuée par le test de Fisher et compare les conditions indiquées à la conditiontion siCtl EV.

Nous avons également étudié l’impact des mutants de cortactine sur les défauts

d’arrondissement mitotique induits par la déplétion d’HSPB8 ou de BAG3. Pour cela, nous

avons transfecté des cellules HeLa synchronisées en mitose et déplétées en BAG3 ou en

HSPB8 avec les vecteurs codant pour les mutants de cortactine sur une période de 32 h.

Nous avons constaté que l’expression du mutant cortactine-9KR dans les cellules HeLa

mitotiques induit un doublement du pourcentage de cellules présentant des défauts

d'arrondissement mitotique par rapport aux cellules contrôles transfectées avec le vecteur

vide (EV) (Figure 3.4C et D). Ainsi, l'expression d'un mutant de cortactine non-acétylable

interfère avec l'arrondissement des cellules mitotiques tout comme le fait la déplétion de

BAG3 ou d’HSPB8 (Figures 3.4C et D). À l’inverse, l'expression du mutant cortactine-

9KQ ne semble pas induire de défauts d'arrondissement mitotique dans les cellules

contrôles (Figures 3.4C et D). De façon remarquable, nous avons noté que l'expression de

135

ce mutant corrige les défauts d'arrondissement mitotique dans les cellules déplétées en

BAG3 ou en HSPB8 (Figures 3.4C et D). Ces résultats indiquent qu’un mutant acétyl-

mimétique de cortactine peut restaurer l'arrondissement mitotique des cellules déplétées en

BAG3 ou en HSPB8.

Ensembles, ces résultats nous suggèrent qu’une perturbation de la régulation mitotique de

l’acétylation de la cortactine contribue aux défauts de réarrangement du cytosquelette

d’actine observés suivant la déplétion de BAG3 ou d’HSPB8. Ces observations sont en

accord avec l’hypothèse selon laquelle HSPB8-BAG3 en modulant l’activité d’HDAC6

sur la cortactine facilite le remodelage des structures à base d’actine qui conduisent la

progression mitotique. Nos résultats suggèrent que l’acétylation de la cortactine est requise

pour limiter la dynamique de l’actine dans les cellules mitotiques et pour l’arrondissement

mitotique. Ainsi, nos résultats suggèrent pour la première fois que la dynamique

d’acétylation de la cortactine doit être finement régulée lors de la progression mitotique.

Comme l’acétylation de la cortactine inhibe son activité sur la polymérisation de l’actine

dépendante d’Arp2/3, nos résultats associés aux données de la littérature suggèrent que le

complexe chaperon limiterait l’activité d’Arp2/3 en modulant l’activité d’HDAC6 sur la

cortactine (Zhang et al. 2007; Uruno et al. 2001; Weaver et al. 2001).

Pour confirmer cette hypothèse, nous pourrions analyser l’effet d’un mutant de cortactine

incapable d’activer Arp2/3 sur les défauts mitotiques associés à la déplétion de BAG3,

HSPB8 ou p62/SQSTM1. Une correction de l’arrondissement mitotique et de la dynamique

du nuage sous-cortical d’actine dans de telles conditions permettrait de confirmer notre

hypothèse.

En conclusion, dans la présente étude, nous fournissons des évidences que le complexe

chaperon, en recrutant p62/SQSTM1 à l'entrée en mitose, modulerait l'activité mitotique

d’HDAC6 sur la cortactine. Un modèle dans lequel la fonction de BAG3 dans la

séquestration des protéines permettrait la régulation spatiotemporelle de la signalisation

cellulaire et de l'autophagie a été récemment proposé par (Kathage et al. 2016). En effet,

les auteurs ont décrit que BAG3 par interaction avec TSC1 induit le recrutement de

136

complexes TSC dans des fibres de stress, où les complexes inhibent une sous-population

de vésicules mTORC1-positives associées au cytosquelette d'actine. Ainsi, l'inhibition

locale de mTORC1 déclencherait l'autophagie de la filamine, une protéine de réticulation

de l'actine, aux sites de dénaturation. En même temps, la séquestration de TSC1/TSC2

induite par BAG3 soulage l'inhibition de mTORC1 dans le cytoplasme, ce qui stimule la

traduction des protéines. Un tel processus pourrait être nécessaire pendant la mitose pour

contrôler spécifiquement dans le temps et l'espace l'activité d’HDAC6 sur la cortactine. En

séquestrant des complexes contenant p62/SQSTM1, HDAC6 et la cortactine, BAG3-

HSPB8 serait capable d'inhiber localement l'activité d’HDAC6 sur la cortactine et par

conséquent de limiter la polymérisation branchée de l'actine. Selon ce modèle, grâce à la

séquestration de ses partenaires mitotiques, BAG3-HSPB8 modulerait les transitions de

structures à base d'actine qui favorisent la progression mitotique.

137

3.5. Figures supplémentaires

Figure S3.1 : Mesure de l’efficacité de la déplétion de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1 par immunobuvardage de type « Western ». (A) Immunobuvardage de type « Western » représentatif d’extraits protéiques provenant de cellules HeLa-RFP-H2B montrant l'efficacité de la déplétion de BAG3, HSPB8 et p62/SQSTM1 48 h après la transfection de siRNAs spécifiques. Le niveau de déplétion a été estimé à plus de 75% par un dépôt de quantités croissantes d'extraits de contrôle (siCtl). L'analyse par immunobuvardage a été réalisée avec des anticorps anti-BAG3, anti-HSPB8 et anti-p62/SQSTM1 ; vinculine : contrôle de dépôt. (B) Immunobuvardage de type « Western » représentatif d’extraits protéiques provenant de cellules HeLa-RFP-H2B montrant l'efficacité de la déplétion de BAG3 et HSPB8, 48 h ou 24 h après la transfection de siRNAs spécifiques. La déplétion a été estimée à plus de 75% par un dépôt de quantités croissantes d'extraits de contrôle (siCtl). L'analyse par immunobuvardage a été réalisée avec des anticorps anti-BAG3 et anti-HSPB8 ; vinculine : contrôle de dépôt. (C) Immunobuvardage de type « Western » représentatif d’extraits protéiques provenant de cellules HeLa-RFP-H2B montrant l'efficacité de la déplétion de p62/SQSTM1 24 h après la transfection de siRNAs spécifiques. La déplétion a été estimée à plus de 75% par un dépôt de quantités croissantes d'extraits de contrôle (siCtl). L'analyse par immunobuvardage a été réalisée avec un anticorps anti-p62/SQSTM1 ; vinculine : contrôle de dépôt.

138

Figure S3.2 : L'inhibition d’Arp2/3 normalise les défauts d'arrondissement des cellules mitotiques dans les cellules HeLa déplétées en BAG3. L'histogramme montre le pourcentage de cellules mitotiques avec des défauts d’arrondissement (i.e. cellules partiellement ou non arrondies) dans des cellules HeLa-H2B-RFP transfectées avec un siRNA contrôle (siCtl) ou un siARN spécifique de BAG3 (siBAG3_1) pendant 48 h, synchronisées en mitose et traitées pendant 8 h avec le CK666 (40 µM).

3.6. Matériel et méthode

3.6.1. Culture cellulaire, synchronisation, traitements et transfection de siARN

Des cellules HeLa-RFP-H2B (don de Sabine Elowe) et des cellules MCF7 ont été

maintenues dans du milieu essentiel a-minimal (a-MEM) additionné de 10% de sérum

bovin fœtal. Les lignées cellulaires ont été cultivées dans une atmosphère humidifiée avec

5 % de CO2 à 37 °C. Les cellules ont été synchronisées par un double blocage à la

thymidine et ont été relâchées pendant 8 à 10 h dans du milieu frais, comme décrit

précédemment (Fuchs et al., 2015). Pour les expériences de déplétion, les cellules ont été

transfectées sur la nuit avec des siRNA duplex à 50 nM dans du tampon de transfection

calcium-phosphate (MgCl2 125 mM, NaCl 140 mM, HEPES 25 mM, Na2HPO4 0,75 mM)

pour les cellules HeLa et le réactif RNAimax (Invitrogen) en suivant les instructions du

fabricant pour les cellules MCF7. L'efficacité de la déplétion a été analysée 24 à 48 h plus

tard par immunobuvardage de type « Western » ou par immunofluorescence. Les siRNA

139

duplex sont basés sur les séquences humaines et ont été achetés auprès de Qiagen (siRNA

de qualité HPP) ou de Thermo Fisher Scientific (qualité A4 standard). Les séquences des

brins sens sont les suivantes : siBAG3_1 : 5’-CGAAGAGTATTTGACCAAA-3′ ;

siBAG3_2 : 5′-GCAAAGAGGTGGATTCTAA-3′ ; siBAG3_3 : 5’-

GATGTGTGCTTTAGGGAAT-3 ; siHSPB8_1 : 5′-CAGATAGGCTAGTGGTATT-3′ ;

siHSPB8_2 : 5′-GCAGTGAATGCAAGGGTTATT-3′ ; sip62_1 : 5’-

GGAAATGGGTCCACCAGGATT 3 ’; sip62_2 : 5’- AGACCAAGAACTATGACAT -

3’. La séquence cible du siCtl (si Allstars Negative Control) provient de Qiagen et est la

suivante : 5’-CAGGGTATCGACGATTACAAA-3’.

Pour évaluer la restauration de l'arrondissement mitotique et de la cage de F-actine et

l’activité d’HDAC6 par immunoburdage de type « Western », les drogues suivantes ont été

ajoutées aux cellules qui ont été synchronisées en mitose par un double blocage à la

thymidine, pendant 4 à 8 heures lors la seconde période de relâche avant la fixation

cellulaire ou l’extraction protéique : tubacine, 5 µM ou CK666, 40 µM. Pour analyser la

correction de la dynamique du nuage sous-cortical d'actine par imagerie en temps réel, les

drogues ont été ajoutées aux cellules qui ont été synchronisées en mitose par un double

blocage à la thymidine 30 min avant l'imagerie en temps réel comme suit : tubacine, 20

nM; CK666, 40 µM.

3.6.2. Transfection, infection, vecteurs et adénovirus

Les adénovirus recombinants conduisant l’expression de la protéine BAG3 étiquetée GFP

(WT, IPV [I9V/V98G/I208G/V210G] or ΔPXXP (Δ302–418) ; décrit dans Fuchs et al.

2015), pour les expériences de co-immunoprécipitation, ont été produits par Welgen Inc,

Worcester, MA, et ont été amplifiés dans des cellules HEK293VR, comme décrit dans

Fuchs et al. 2015. Tous les adénovirus recombinants ont été confirmés par séquençage des

séquences insérées. Les titres de virus ont été déterminés en utilisant le kit de titrage

AdenoX Rapid (Clontech Laboratories, #631028) en suivant les instructions du fabricant.

Des cellules HeLa-RFP-H2B ont été infectées avec les adénovirus Ad-BAG3-GFP à une

multiplicité d'infection (MOI) de 2 unités formant des plaques par cellule (pfu/cellule) dans

140

de l'a-MEM complet comme décrit dans Fuchs et al. 2016. Deux heures plus tard, un

tampon de transfection calcium-phosphate a été ajouté au milieu. La transfection-infection

simultanée permet une transduction virale efficace à faible MOI. Seize heures après

l'infection, les cellules ont été lavées trois fois avec de l'HEPES (KCl 6,7 mM, NaCl 150

mM, HEPES 10 mM, pH 7,3) et ont été laissées dans du milieu a-MEM frais pendant 8h

avant de rajouter du nocodazole (400 ng/ml) pour une période de 16h.

Pour suivre la dynamique de l'actine et de la tubuline par imagerie en temps réel, des

cellules ont été ensemencées sur des pétris à fond de verre recouvertes de fibronectine

(MatTek Corp.) et synchronisées par la méthode de double blocage à la thymidine.

L'infection a été réalisée dans l'a-MEM-minus au cours du premier blocage à la thymidine

en utilisant l’adénovirus Ad-LifeAct-TagGFP2 (60121, IBIDI) à une MOI de 1 pfu/cellule

et le bacculovirus Bac-RFP-αtubuline (C10614) à 4 pfu/cellule dilué dans le réactif

BacMam 2.0. Le siARN dirigé contre BAG3 a été transfecté durant la même période dans

un tampon de transfection calcium-phosphate, en utilisant la méthode décrite dans Fuchs

et al., 2016. 16 h après l'infection et la transfection simultanées, les cellules ont été lavées

trois fois avec de l'HEPES et ont été relâchées dans du milieu frais pendant 8 h avant de

rajouter 2 mM de thymidine. Pour les expériences de PLA le vecteur d’expression

peGFP.N1-HDAC6 WT provenant d’Addgene (#36188) et le vecteur d’expression myc-

cortactin WT don du Dr Zhan, Department of Experimental Pathology, Jerome H. Holland

Laboratory for the Biomedical Sciences, American Red Cross, Rockville, MD 20855,

USA, ont été utilisés ; les constructions 3XFLAG-cortactine (9KQ or 9KR; les lysines (K)

situées dans des régions de répétition ont été mutées en glutamine (Q) ou en arginine (R)

utilisées pour les expériences de restauration de l’arrondissement mitotique et de la cage

de F-actine sont un don du Dr Seto, Washington University School of Medicine and Health

Sciences, Washington, DC 20037, USA. Pour induire la surexpression de la cortactine et

d’HDAC6 pour les expériences de PLA, des MCF7 ont été synchronisées par un double

blocage à la thymidine et transfectées durant la seconde période de blocage à la thymidine

en utilisant la Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en suivant les instructions du fabricant. 16

h après la transfection les cellules ont été lavées avec du PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl,

4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4) et relâchées dans du milieu frais durant 8 à 9 h avant

141

d’être fixées. Pour induire la surexpression des mutants 3X-FLAG de cortactine pour les

expériences de restauration de l'arrondissement mitotique et de la structure ectopique

enrichie en F-actine entourant le fuseau mitotique, des cellules HeLa-RFP-H2B

synchronisées en mitose par un double blocage à la thymidine ont été transfectées durant

la première période de relâche en utilisant la Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en suivant

les instructions du fabricant. 8 h après la transfection le milieu des cellules a été changé et

2 mM de thymidine y ont été ajoutés.

3.6.3. Anticorps et produits chimiques

Les anticorps suivants ont été utilisés pour les expériences de co-immunoprécipitation et

les analyses par immunobuvardage de type « Western » : l'anticorps anti-BAG3 LP11 de

lapin a été développé contre un BAG3 recombinant humain complet fusionné avec la

glutathion S transférase (LP11) (Fuchs et al., 2015), anti-HSPB8 de lapin contre un peptide

C-terminal (NELPQDSQEVTCT) (Carra et al. 2008) ; anti-p62/SQSTM1 (sc-28359) et

anti-GFP utilisé pour les immunobuvardages de type « Western » (sc-9996) proviennent

de Santa Cruz ; anti-HDAC6 (# 7612) et anti-lysines-acétylées (ac-K-100, #9814)

proviennent de Cell Signaling Technologies ; anti-GFP employé pour les essais de co-

immunoprécipitation (A-11120) provient de Molecular Probes/Thermo Fisher; anti-

Vinculin (V9131) provient de Sigma-Aldrich ; l'anti-cortactine (IF et WB) (ab33333)

provient d'Abcam ; anti-acétyl-cortactine K309 (ABT1378) provient de Millipore. Les

anticorps secondaires (anti-souris-HRP 115-035-146 et anti-lapin-HRP 111-055-003)

proviennent de Jackson ImmunoResearch. Les anticorps suivants ont été utilisés pour

l'immunofluorescence et le PLA : l'anti-GFP (sc-9996) provient de Santa Cruz ; anti-a-

tubulin souris (T5168) provient de Sigma Aldrich et anti-a-tubulin lapin (ab18251)

provient d’Abcam ; la Alexa-Fluor® 488 Phalloidin (A12379) provient de Molecular

Probes/Thermo Fisher. La tubacine (S2239) provient de Selleckchem ; le bisbenzimide H

33342 de Hoechst (B2261), la thymidine (T9250), la fibronectine (F1141-5 mg) et le

CK666 (SML0006) proviennent de Sigma-Aldrich ; le nocodazole (487928) provient de

Calbiochem.

142

3.6.4. Immunoprécipitation et immunobuvardage de type « Western »

Des quantités égales de cellules ont été lavées dans du PBS glacé et ont été lysées par 3

cycles de congélation/décongélation dans 4 volumes de tampon de lyse (20 mM TRIS-HCl

pH 7.6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% IGEPAL, 1 mM NaVO4, 10 mM NaF, 40 mM

β-glycerophosphate, 1X Complete [Roche], 1 mM DTT). Les extraits cellulaires ont été

centrifugés à 15 000 g pendant 15 min, les surnageants ont été transférés dans un tube

propre et incubés avec un anticorps spécifique pendant 60 min à 4 °C, après quoi ils ont

été transférés dans un tube contenant des billes magnétiques recouvertes de protéine A

(Dynabeads protien A, Life Technologies) préalablement équilibrées dans le tampon de

lyse. Après incubation pendant 30 minutes sous agitation douce, les immunocomplexes ont

été recueillis en utilisant un support magnétique et lavés trois fois dans du tampon de lyse.

Des quantités égales de complexes immuns ont été chargées sur SDS-PAGE et analysées

par immunobuvardage de type « Western ».

Pour les immunobuvardage de type « Western », les cellules ont été lysées dans un tampon

SDS (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.3% SDS, 10% glycérol, 5% β-mercaptoéthanole,

0.05% bleu de bromphénole, 1 mM phénylméthylsulfonylfluoride) et des quantités

équivalentes de protéines provenant des lysats cellulaires totaux ont été séparés par

électrophorèse SDS-PAGE de gels à 8 % d’acrylamide puis transférés sur membranes de

nitrocellulose. L’immunobuvardage a été effectué selon le protocole décrit par Champagne

et al., 2004. La concentration protéique des échantillons a été déterminée à l’aide du kit «

DC protein assay » (Laboratoires Bio-Rad) et l’analyse densitométrique a été effectuée à

partir d’images acquises avec l’appareil FluorS MAX MultiImager contrôlé par le logiciel

QuantityOne version 4.5.0 (Laboratoires Bio-Rad).

3.6.5. Immunofluorescences, PLA (« proximity ligation assay »), imagerie en

temps réel, microscopie et statistiques

Pour les expériences d’immunofluorescence et de PLA, les cellules ont été lavées dans du

PBS avec précaution puis fixées dans un tampon contenant 4% de formaldéhyde dans 0,2%

143

de Triton X-100, 20 mM Pipes, pH 6,8, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA, pH 8,0, pendant 10

min à température pièce. L'ADN a été marqué avec le Hoechst perméable aux cellules et

la F-actine a été marquée avec la phalloïdine. Les spécimens ont ensuite été traités pour

l’immunofluorescence comme décrit dans Lavoie et al., 2000, en utilisant les anticorps

primaires indiqués et les anticorps anti-lapin, anti-chèvre ou anti-chèvre Alexa Fluor. Pour

les essais de PLA, les échantillons ont été incubés avec des anticorps secondaires fournis

par le kit in situ Duolink (Invitrogen, DUO92002-100RXN ; anti-mouse minus #82004;

anti-rabbit plus #82002) durant 1 h à 37 °C dans du PBS 1 % lait. Les spécimens ont été

lavés trois fois pendant 5 minutes dans du tampon A (Tris 0,001 M, NaCl 0,15 M, 0,05%

de Tween 20) et incubés avec la ligase (Invitrogen, # 82027) à 0,025 U/µl dans un tampon

de ligation (# 82009) fourni par le Kit de réactifs de détection rouge (Invitrogen,

DUO92008-100RXN) pendant 30 minutes à 37 °C. Après trois lavages pendant 2 minutes

dans le tampon A, les échantillons ont été incubés avec la polymérase (# 82028) à 0,1 U/µl

dans du tampon rouge d'amplification (# 82011) pendant 90 minutes à 37 ° C. Enfin, les

échantillons ont été lavés trois fois dans du tampon B (Tris 0,2 M, NaCl 0,1 M) pendant

10 min puis lavés deux fois dans le tampon B 0,001X. Le montage des lamelles de verre a

été effectué à l'aide du milieu de montage fourni par le kit.

Les phénotypes ont été observés en routine par au moins deux investigateurs indépendants

par inspection visuelle d'échantillons fixés et ont été quantifiés de manière aveugle au

traitement, en utilisant un système AxioObserver Z1 utilisant un objectif 60x 1,25 NA et

une caméra CCD Axiocam MRm contrôlée par le logiciel Zen (Carl Zeiss). Les images

d'épifluorescence ont été acquises avec le même système de microscope en utilisant un

objectif 40x Plan-Neofluoar 0.6 NA. La microscopie confocale des cellules vivantes et

fixées a été réalisée avec un appareil Spinning Disc Confocal Perkin Elmer UltraVIEW

(40x 0,75 NA ou 60x huile 1,4 NA, respectivement), équipé d'une caméra à couplage de

charge refroidie par EMCCD à -50 ° C (Hamamatsu Photonics KK) et piloté par la version

6.01 du logiciel Volocity. Le système était équipé d'une chambre humidifiée à 5 % CO2 et

thermorégulée. Pour l'imagerie en temps réel, les images ont été acquises à des intervalles

de 90 secondes pendant une période de 75 minutes commençant à 48 heures après la

transfection des siARN. Les versions des logiciels Volocity 6.01 (technologies de Quorum)

144

et Image J 1.48v (institut national de la santé) ont été employées pour le traitement sur des

images entières avant le recadrage pour accentuer le point principal de l'image. Le

traitement s'est limité à la soustraction de l'arrière-plan, à l'ajustement de la luminosité/du

contraste et à la déconvolution. L’outil « 3D opacity » du logiciel Volocity a servi à la

reconstitution 3D des images confocales.

Les défauts d'arrondissement mitotique ont été estimés par inspection visuelle des défauts

de la mitose comme suit : cellules mitotiques partiellement arrondies ou plates et ont été

estimées à partir d'expériences indépendantes. Les phénotypes de nuage sous-cortical

d’actine ont été estimés par inspection visuelle des séquences temporelles comme suit :

mouvement rotatif unidirectionnel = polarisé ; changements dans la direction du

mouvement de rotation pendant la mitose = erratique ; immobile ou absent = absent. Les

phénotypes de défauts mitotiques ont été estimés par inspection visuelle des séquences

temporelles comme suit : oscillation du fuseau mitotique et retard dans la progression en

prométa- et métaphase. Le nombre de spots PLA ont été quantifiés en utilisant l'outil « Find

object » du logiciel Volocity. Un seuil minimal de volume d'objets de 0,1 µm3 a été calibré

et les cellules ont été considérées selon un seuil d'intensité moyenne de GFP-HDAC6

compris entre 50 et 250.

3.6.6. Analyses statistiques

Pour l’analyse de comparaison du nombre de spots de PLA par cellule, les données

provenant d’au moins trois expériences indépendantes ont été analysées en utilisant le test

statistique Mann Whitney. Pour l’analyse statistique de (a) du nuage sous-cortical d’actine,

(b) des mitoses défectueuses, (c) des défauts d’arrondissement mitotique, les données

provenant d’au moins trois expériences indépendantes ont été analysées en utilisant le test

statistique Fischer. Le logiciel statistique Prism 6.0 (GraphPad Software) a été utilisé pour

effectuer les tests statistiques. Les valeurs de p<0,05 ont été considérées comme

significatives (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001; ****, p <0,0001).

145

4. Chapitre 4 : Lien fonctionnel entre l’activité autophagique du complexe chaperon

HSPB8-BAG3 et la régulation de structures à base d’actine pendant la division

cellulaire

Dans les chapitres 2 et 3 nos résultats suggèrent que le complexe chaperon HSPB8-BAG3

facilite, au cours de la division cellulaire, le remodelage du cytosquelette d’actine d’une

manière qui pourrait faire intervenir son rôle dans l’autophagie sélective, d’une part, et la

modulation de l’activité de la déacétylase HDAC6 notamment sur la cortactine, d’autre

part. En outre, il a été démontré qu’HDAC6 régule la fusion des autophagosomes avec les

lysosomes lors de l’autophagie sélective par un mécanisme qui implique la cortactine et la

polymérisation de l’actine (Lee et al. 2010). Il est donc possible que la régulation

d’HDAC6 par le complexe HSPB8-BAG3 contribue à moduler la dégradation des

protéines par un mécanisme d’autophagie sélective, lequel pourrait jouer un rôle clé dans

la régulation spatiotemporelle du remodelage du cytosquelette d’actine. Nous avons donc

voulu confirmer qu’il existe bien un lien fonctionnel entre la fonction autophagique du

complexe chaperon HSPB8-BAG3 et son activité sur le cytosquelette d’actine, et explorer

si ce lien implique la modulation de l’activité d’HDAC6.

Dans ce chapitre sont présentés des résultats préliminaires suggérant qu’au moins en partie

la fonction autophagique du complexe HSPB8-BAG3 est impliquée dans la régulation de

la dynamique d’actine et qu’une telle activité requiert la modulation de l’activité

déacétylase d’HDAC6.

Dans un premier temps, nous verrons des résultats complémentaires concernant l’influence

de l’inhibition du flux autophagique sur la modulation de la dynamique d’actine au cours

de la division cellulaire. Ensuite, nous analyserons l’impact de la déplétion d’HSPB8 sur

le flux autophagique et sur l’autophagie sélective lors de la cytokinèse. Finalement, nous

étudierons l’effet de l’inhibition d’HDAC6 sur la régulation du flux autophagique et du

désassemblage de l’AC dans des cellules déplétées en HSPB8 lors de la cytokinèse.

146

4.1. La déplétion d’ATG7 récapitule les défauts de remodelage de l’actine observés

suivant la déplétion de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1 lors de la division

cellulaire

Il a été montré que l’autophagie est toujours active à l’entrée des cellules en mitose bien

que la formation des autophagosomes soit réduite (Furuya et al. 2010; Li et al. 2016).

Cependant les fonctions assurées par la machinerie autophagique au cours de la division

cellulaire sont très peu connues. Il a été montré que le ciblage par p62/SQSTM1 de la

GTPase RhoA à la dégradation autophagique contribue à l’abscission des cellules filles et

au désassemblage de l’AC (Belaid et al. 2013). De plus, en mitose, l’adaptateur

autophagique participe au ciblage de la cycline A2 à la machinerie autophagique lors de

transition métaphase-anaphase (Loukil et al. 2014). Ainsi, ces études ont révélé certains

mécanismes dans lesquels l’autophagie sélective est requise pour la progression de la

division cellulaire. Or, le complexe chaperon HSPB8-BAG3 a été impliqué dans la

régulation de l’autophagie sélective dans les cellules musculaires et nous avons montré

qu’il est important pour la progression mitotique des cellules cancéreuses. Nous avons donc

émis l’hypothèse que la fonction mitotique du complexe HSPB8-BAG3 impliquerait sa

fonction régulatrice de l’autophagie sélective.

Dans ce sens, dans le chapitre 2, des résultats suggèrent que l’inhibition de l’activité

lysosomale ainsi que l’inhibition de la fusion des autophagosomes avec le lysosome

conduit à une accumulation anormale de F-actine au PI mimant la déplétion d’HSPB8 en

cytokinèse (Chapitre 2, Figure 2.6A). En outre, l’activation de l’autophagie non sélective

par traitement avec la rapamycine peut corriger ce défaut dans les cellules déplétées en

HSPB8 (Chapitre 2, Figure 2.6B). Ceci nous suggère que la modulation de la dynamique

du cytosquelette d’actine par le complexe chaperon HSPB8-BAG3 serait dépendante de sa

fonction dans le ciblage de protéines à la machinerie autophagique. Pour corroborer cette

hypothèse et renforcer nos résultats, nous avons décidé d’inhiber le flux autophagique de

façon plus spécifique en transfectant des cellules HeLa synchronisées par un double

blocage à la thymidine avec des siARN ciblant la protéine ATG7 impliquée dans la

formation des autophagosomes (Suzuki et al. 2001; Kim et al. 1999).

147

Il a été montré que des MEF (« mouse embryonic fibroblasts ») KO pour ATG5 ainsi que

des cellules pulmonaires cancéreuses déplétées d’ATG7 ou de p62/SQSTM1 présentent

une sur-activation de RhoA qui se traduit par une polymérisation excessive de la F-actine

(Belaid et al. 2013). Pour confirmer l’efficacité de nos siARN contre ATG7 nous avons

choisi d’évaluer si la déplétion d’ATG7 conduit aux mêmes phénotypes de réorganisation

du cytosquelette d’actine dans les cellules HeLa. Pour cela, nous avons transfecté nos

cellules sur une période de 24 h ou 48 h avec deux siARN ciblant ATG7 et réalisé un

marquage de la F-actine endogène à l’aide de la phalloïdine. Que ce soit 48 h ou 24 h après

la transfection des siARN, où les niveaux d’expression d’ATG7 sont réduits à moins de 25

% et 50 % respectivement (Figure 4.1A), nos observations ont été les mêmes. Nous avons

vu que les cellules transfectées avec le siCtl présentent des structures corticales et ventrales

fines de F-actine semblables aux cellules non transfectées, alors que les cellules déplétées

en ATG7 arborent des câbles épais et denses de F-actine au cortex et à la face ventrale

(Figure 4.1B). Ce résultat montre donc que la déplétion d’ATG7 s’accompagne d’un

enrichissement de F-actine au cortex et à la face ventrale des cellules comme cela a été

observé dans les MEF KO pour ATG5 (Belaid et al. 2013). Ceci nous permet donc de

confirmer l’efficacité des siARN ciblant ATG7 utilisés après 24 h ou 48 h de déplétion.

148

Figure 4.1: La déplétion d’ATG7 se traduit par un réarrangement du cytosquelette d’actine en interphase (A) Immunobuvardage de type « Western » d’extraits protéiques de cellules HeLa-RFP-H2B qui ont été transfectées avec des siARN spécifiques contre ATG7 (siATG7 #1 et siATG7 #2) pendant 24 h ou 48 h. La déplétion a été estimée à 50 % et plus de 75 % après 24 h et 48 h de transfection respectivement par le dépôt de quantités croissantes d’extraits protéiques contrôles (siCtl). L’analyse par immunobuvardage a été effectuée avec un anticorps anti-ATG7; GAPDH : contrôle de dépôt. (B) Images d’une coupe confocale de la face ventrale de cellules HeLa-RFP-H2B asynchrones déplétées en ATG7 pour une période de 24 h montrant un enrichissement ventral et cortical de F-actine; les flèches indiquent la position où ont été réalisées les coupes pour le zoom x2 présenté dans les encadrés; l’ADN et la F-actine ont été marqués avec le Hoechst et la phalloïdine-488 respectivement; échelle, 30 µm. Par la suite, nous avons testé si la déplétion d’ATG7 provoque un ralentissement de la

progression mitotique comme nous avons pu l’observé dans des cellules déplétées en

BAG3 ou en HSPB8 (Annexe 1, Figure 2E). Nous avons donc quantifié l’index mitotique

des cellules HeLa synchronisées par un double blocage à la thymidine, préalablement

149

transfectées avec des siARN dirigés contre ATG7 pour une période de 48 h. Dans ce

contexte, plus de 70 % des cellules contrôles sont en division cellulaire (mitose et

cytokinèse) tandis que cette proportion est drastiquement réduite suite à la transfection du

siATG7 #1; dans ces conditions, plus de 90 % des cellules sont en interphase (Figure 4.2A).

En revanche, les cellules transfectées avec le siATG7 #2 présentent les mêmes proportions

de cellules en division cellulaire que les cellules contrôles (Figure 4.2A). Nous avons

également constaté que ~20 % des cellules contrôles sont en mitose (prométaphase-

métaphase) après 8 h 30 de relâche tandis que ~30 % des cellules déplétées avec le siATG7

#2 sont dans cette phase (Figure 4.2B). Ces observations montrent que le siATG7 #2

n’interfère pas avec l’entrée et peu avec la progression des cellules en mitose,

contrairement au siATG7 #1. Une telle différence entre les deux siARN ciblant ATG7

pourrait dépendre d’une différence d’efficacité des siARN dans la déplétion d’ATG7 ou

d’un ciblage non spécifique (« off target ») conduisant à des phénotypes différents. Par

ailleurs, après 24 h de déplétion, lorsque 50 % des niveaux protéiques d’ATG7 sont réduits

(Figure 4.1A), aucun ralentissement de la progression des cellules dans les différents stades

de la division cellulaire n’a pu être observé avec les deux différents siARN ciblant ATG7

(Figure 4.2C). Ces résultats indiquent donc que la forte déplétion d’ATG7 (75 % de

déplétion) peut conduire soit à un fort ralentissement des cellules dans le cycle cellulaire,

soit à un léger ralentissement des cellules en mitose. Tandis qu’une plus faible déplétion

d’ATG7 (50 % de déplétion) ne semble pas affecter la progression des cellules mitotiques.

Figure 4.2: Effet de la déplétion d’ATG7 sur la progression mitotique des cellules HeLa. (A) Le graphique représente la proportion de cellules HeLa-RFP-H2B en interphase et en division cellulaire (mitose + cytokinèse) après la déplétion d’ATG7 avec deux siARN

150

différents (siATG7 #1 et siATG7 #2) sur 48 h et après une relâche de 8 h 30 suite à un double blocage à la thymidine; les résultats représentent la moyenne de deux expériences indépendantes +/- SEM où 33 à 573 cellules ont été analysées. (B) Histogramme du pourcentage de cellules HeLa-RFP-H2B dans les différentes phases mitotiques; les cellules ont été transfectées avec le siCtl ou le siATG7 #2 sur une période de 48 h et synchronisées par un double blocage à la thymidine en mitose; les résultats représentent la moyenne de deux expériences indépendantes +/- SEM où 29 à 424 cellules ont été quantifiées. (C) Graphique montrant le pourcentage de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées par un double blocage à la thymidine dans les différentes phases mitotiques suite à une relâche de 8 h 30 et 24 h après la transfection d’un siARN contrôle (siCtl) ou de siARN ciblant ATG7 (siATG7 #1 et siATG7 #2); les résultats représentent la moyenne de trois expériences indépendantes +/- SEM où 38 à 642 cellules ont été analysées. Aucune différence significative n’a été calculée entre la condition siCtl et les conditions siATG7 quelque soit la phase de la division cellulaire analysée par le test statistique Fisher.

Nous avons observé que la déplétion d’HSPB8, comme la déplétion de BAG3 ou de

p62/SQSTM1, interfère avec l’arrondissement mitotique des cellules en métaphase

suggérant que le complexe protéique faciliterait le remodelage du réseau cortical d’actine

et de myosine II (Annexe 1, Figure 7A, Chapitre 3, Figure 3.2E et F). Nous avons donc

testé si la déplétion d’ATG7 pouvait récapituler ce phénotype. Pour cela, nous avons

synchronisé des cellules HeLa en mitose et les avons déplétées pour une période de 24 h

avec les siARN ciblant ATG7. Nous avons observé que ~10 % des cellules contrôles en

métaphase démontrent un défaut d’arrondissement mitotique (Figure 4.3). De façon

intéressante, la déplétion d’ATG7, quelque soit le siARN utilisé, induit un doublement de

la proportion de cellules présentant ce phénotype anormal comme nous avons pu l’observer

suite à la déplétion de BAG3 ou d’HSPB8 (Figure 4.3). Par conséquent, la déplétion

d’ATG7 semble interférer avec l’arrondissement des cellules en métaphase suggérant que

la dégradation autophagique est importante pour le remodelage du cytosquelette d’actine

qui dirige l’arrondissement mitotique.

151

Figure 4.3 : La déplétion d’ATG7 conduit à l’accumulation de cellules partiellement arrondies en métaphase Images confocales de HeLa-RFP-H2B synchronisées en métaphase 24 h après la transfection d’un siARN contrôle (siCtl) ou ciblant ATG7 (siATG7 #2) présentant une géométrie mitotique normale, ou anormale, respectivement ; un anticorps anti-a-tubuline a été utilisé pour marquer le fuseau mitotique, l’ADN et la F-actine ont été marqués avec le Hoechst et la phalloïdine-488 respectivement ; échelle, 10 µm. Le graphique représente le pourcentage de cellules partiellement rondes en métaphase suite à la transfection sur 24 h des siCtl, siATG7 #1 ou siATG7 #2 ; moyenne de deux expériences indépendantes +/-SEM où au moins 189 cellules ont été analysées. Finalement, nous avons testé si la déplétion d’ATG7 récapitule les phénotypes observés

suivant la déplétion d’HSPB8 en cytokinèse. En effet, dans le chapitre 2, nos résultats

montrent que la déplétion d’HSPB8 se caractérise par une accumulation anormale de F-

actine au PI qui provoque une augmentation significative des défauts de cytokinèse (i.e. bi-

et multi-nucléation; Chapitre 2, Figure 2.2E et 2.3D). Pour tester notre hypothèse, nous

avons synchronisé des cellules HeLa en cytokinèse et les avons déplétées sur 24 h en

ATG7. Nos résultats montrent que ~23 % des cellules transfectées avec le siCtl présentent

une accumulation anormale de F-actine au PI, comparativement à 40 à 45 % pour les

cellules déplétées en ATG7 (Figure 4.4). Ce résultat indique que la déplétion d’ATG7

s’accompagne d’une accumulation anormale de F-actine au PI et suggère que le flux

autophagique est impliqué dans le désassemblage de l’AC en cytokinèse.

152

Figure 4.4: La déplétion d’ATG7 augmente la proportion de cellules présentant une accumulation anormale de F-actine au PI Images confocales de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en cytokinèse et transfectées avec des siARN spécifiques à ATG7 montrant une accumulation anormale de F-actine au PI (flèches) dont le zoom x4 est dans les boîtes juxtaposées. Le PI a été marqué à l’aide d’un anticorps anti-Aurora B et la F-actine avec la phalloïdine-488 ; échelle, 10 µm. L’histogramme présente le pourcentage de cellules arborant une accumulation anormale de F-actine au PI en cytokinèse. Les données représentent la moyenne de quatre expériences indépendantes +/- SEM où au moins 521 cellules ont été analysées. Le test statistique Fisher a été employé et compare les deux siATG7 avec le siCtl.

En résumé, nos résultats indiquent que la déplétion d’ATG7, en mitose ou en cytokinèse,

récapitule les défauts de remodelage du cytosquelette d’actine observés suivant la déplétion

de BAG3, d’HSPB8 ou de p62/SQSTM1. Ceci suggère un lien potentiel entre le

remodelage mitotique de l’actine et le processus d’autophagie sélective modulé par le

complexe HSPB8-BAG3, en association avec l’adaptateur autophagique p62/SQSTM1.

Nous avons vu que la déplétion d’ATG7 provoque un ralentissement plus ou moins

important des cellules en mitose ou dans le cycle cellulaire suivant les niveaux de déplétion

de la protéine et les siARN utilisés. Ceci est en accord avec la littérature où il a été montré

153

que la déplétion d’ATG7 dans des cellules MCF7 conduit à un ralentissement des cellules

en mitose (Loukil et al. 2014). Il est à noter que seul le siATG7 #1 provoque un important

ralentissement des cellules dans le cycle cellulaire après 48 h de déplétion. Ceci pourrait

indiquer une variation de la pénétrance du phénotype associé à la déplétion d’ATG7. Ce

fort ralentissement pourrait également suggérer que ce phénotype est indépendant de la

déplétion d’ATG7 et lié à un « off-target » du siARN. Pour confirmer ou non ce résultat il

nous faudra réaliser d’autres expériences avec de nouvelles séquences de siARN dirigés

contre ATG7. Par ailleurs, en utilisant des siARN ciblant d’autres protéines ATG

impliquées dans des stades plus tardifs du flux autophagique nous pourrons appuyer nos

résultats et confirmer l’implication de l’autophagie dans la progression mitotique.

Nos résultats suggèrent que la déplétion d’ATG7 interfère avec l’arrondissement normal

des cellules en métaphase ainsi que le démantèlement de l’AC en cytokinèse, tout comme

nous avons pu le voir suivant la déplétion de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1 (Annexe 1,

Figure 7A; Chapitre 2 Figure 2.3D; Chapitre 3, Figure 3.2E et F). Ce résultat renforce ceux

présentés dans le chapitre 2 et notre hypothèse d’une inhibition du flux autophagique en

réponse à la déplétion de l’une de ces trois protéines.

Par ailleurs, ces observations sont en accord avec celles de Belaid et al. montrant

qu’interférer avec le flux autophagique provoque une accumulation de F-actine au PI

inhibant la progression de la cytokinèse (Belaid et al. 2013). Il est à noter que

l’arrondissement des cellules en métaphase ainsi que l’assemblage et la contraction de l’AC

sont deux mécanismes impliquant la régulation fine spatiotemporelle de la GTPase RhoA

(Maddox et Burridge 2003; Matthews et al. 2012; Rosa et al. 2015; Cheffings, Burroughs,

et Balasubramanian 2016). Or, il a été montré que RhoA sous sa forme active est ciblée à

la dégradation autophagique par l’adaptateur autophagique et partenaire du complexe

chaperon : p62/SQSTM1 (Belaid et al. 2013; Fuchs et al. 2015; Gamerdinger et al. 2011).

Ceci nous suggère que le complexe chaperon HSPB8-BAG3 pourrait faciliter le ciblage de

RhoA-GTP par p62/SQSTM1 à la machinerie autophagique permettant le contrôle fin de

son activation durant la division cellulaire. Pour confirmer cette hypothèse, nous pourrions

réaliser des expériences de déplétion de BAG3 ou d’HSPB8 et analyser l’effet d’une telle

154

déplétion sur la stabilité de RhoA-GTP par « pull-down » à partir d’extraits de cellules

synchronisées en mitose ou en cytokinèse. Par ailleurs, le domaine WW de BAG3 a été

impliqué dans sa fonction de régulation de l’autophagie sélective (Merabova et al. 2015;

Arndt et al. 2010; Ulbricht, Arndt, et Höhfeld 2013). Nous pourrions étudier l’impact de

l’expression d’un mutant de délétion du domaine WW de BAG3 sur la stabilité de RhoA-

GTP par « pull-down » également. Nous pourrions aussi analyser l’effet de l’expression

d’un tel mutant sur les défauts de remodelage de l’actine observés au cours de la division

cellulaire suite à la déplétion de BAG3. De plus, il serait intéressant de vérifier que la

déplétion d’ATG7 ou d’autres protéines ATG s’accompagne d’une accumulation de RhoA-

GTP au PI comme cela a été montré dans la littérature (Belaid et al. 2013). Nous pourrions

également examiner si la déplétion d’HSPB8 ou de BAG3 se caractérise aussi par

l’accumulation de RhoA-GTP au PI à l’aide d’un anticorps spécifique (Selva et Egea 2011;

Winitthana, Lawanprasert, et Chanvorachote 2014). Un tel résultat permettrait de corréler

l’implication de l’autophagie sélective dans le phénotype d’accumulation de F-actine au PI

dans les cellules déplétées en HSPB8 et appuierait l’hypothèse d’un lien fonctionnel entre

la fonction autophagique du complexe HSPB8-BAG3 et son activité sur le cytosquelette

d’actine.

Finalement, l’arrondissement des cellules en métaphase requiert l’activation du complexe

ERM qui assure la distribution correcte de la tension corticale (Roubinet et al. 2011; Kunda

et al. 2008). Or, une étude de l’interactome de BAG3 a montré que l’ezrine est un partenaire

du co-chaperon en condition basale (Chen et al. 2013). Il est donc possible que le complexe

chaperon HSPB8-BAG3 module l’activité du complexe ERM en mitose via le ciblage de

l’ezrine à la machinerie autophagique ce qui assurerait le renouvellement de la protéine.

Pour confirmer cette hypothèse, nous pourrions réaliser des expériences de déplétion de

BAG3 ou d’HSPB8 et analyser l’effet d’une telle déplétion sur la stabilité de l’ezrine par

immunobuvardage de type « Western ». Par ailleurs, nous pourrions effectuer des

expériences de FRAP « Fluorescence Recovery After Photobleaching » en utilisant la

protéine ezrine étiquetée GFP dans des cellules déplétées en BAG3 ou en HSPB8 et

synchronisées en mitose. Une augmentation du temps de recouvrement de la fluorescence

155

au lieu de photoblanchiment suggèrera que les protéines du complexe chaperon sont

impliqués dans le renouvellement de l’ezrine.

4.2. La déplétion d’HSPB8 interfère avec le flux autophagique dans les cellules en

cytokinèse

4.2.1. La déplétion d’HSPB8 cause une augmentation de l’intensité et du volume

des vésicules LC3

Nos résultats suggèrent que les phénotypes de réorganisation anormale du cytosquelette

d’actine observés suite à la déplétion d’une des protéines du complexe chaperon HSPB8-

BAG3 sont liés un défaut dans le ciblage de protéines à la dégradation autophagique. Afin

de valider cette hypothèse, nous avons analysé l’effet de la déplétion d’HSPB8 sur le

marqueur typique de l’autophagie : LC3. En effet, celui-ci s’insère dans la membrane des

autophagosomes et sa dégradation est le reflet de l’efficacité du flux autophagique. Ainsi

la comparaison du nombre de vésicules LC3 par immunofluorescence avant et après

l’inhibition du flux autophagique à l’aide de drogues permet de déterminer l’état

d’activation du flux autophagique (Klionsky et al. 2016).

Pour ce faire, nous avons réalisé des immunofluorescences de LC3 dans des cellules HeLa

synchronisées en cytokinèse et déplétées en HSPB8. Nos quantifications ont montré qu’en

condition basale la déplétion d’HSPB8 conduit à une réduction significative du nombre de

vésicules LC3 en comparaison à la condition contrôle suggérant que la déplétion d’HSPB8

pourrait influencer la biogenèse des autophagosomes et/ou leur dégradation (Figure 4.5A).

Afin de déterminer l’impact sur le flux autophagique en cytokinèse, nous avons traité les

cellules HeLa synchronisées en cytokinèse et déplétées en HSPB8 durant 1 h avec des

inhibiteurs de l’activité lysosomale (Pep+E64d) ou un inhibiteur de la fusion des

autophagosomes avec le lysosome (BafA). Pour les cellules contrôles, quelque soit la

drogue utilisée nous avons observé une augmentation d’au minimum 1,5 fois du nombre

d’autophagosomes par cellule permettant d’appuyer la présence d’un flux autophagique

dans ces conditions (Figure 4.5A). Une augmentation de ~2,3 fois du nombre

156

d’autophagosomes est également observable dans les cellules déplétées en HSPB8 suite au

traitement avec les différents inhibiteurs, ce qui suggère un flux autophagique robuste dans

ces cellules (Figure 4.5A). Nous avons aussi quantifié le nombre d’autophagosomes suite

à l’activation de l’autophagie par un traitement d’une heure à la rapamycine (Figure 4.5A).

Dans les cellules contrôles, une réduction du nombre d’autophagosomes est observable en

réponse à la rapamycine, ce qui est consistent avec une augmentation de flux autophagique

(~2,3 fois; Figure 4.5A). Le traitement avec la rapamycine induit une réduction de ~1,5

fois du nombre d’autophagosomes dans les cellules transfectées avec le siHSPB8 #3

suggérant que l’activation du flux autophagique a été efficace dans ces conditions, bien

que réduite (Figure 4.5A). Ainsi, la quantification du nombre d’autophagosomes révèle que

le flux autophagique est actif dans les cellules en cytokinèse comme cela a été démontré

dans des études précédentes (Belaid et al. 2013; Li et al. 2016). En outre, nos observations

suggèrent qu’un flux autophagique est maintenu dans les cellules déplétées en HSPB8.

Ceci contraste avec les données de la littérature indiquant que le chaperon activerait le flux

autophagique (Carra et al. 2008; Hamouda et al. 2014; Li et al. 2017; Crippa, Sau, et al.

2010). Néanmoins, la réduction du nombre d’autophagosomes en condition basale ou suite

aux traitements dans les cellules déplétées en HSPB8 en comparaison aux cellules

contrôles (Figure 4.5A) suggère que des étapes du flux autophagique (i.e. initiation ou

maturation) pourraient être affectées suivant la déplétion d’HSPB8 (Klionsky et al. 2016).

Dans ce sens, nous avons observé que l’intensité moyenne et le volume moyen des

autophagosomes sont significativement plus élevés dans les cellules déplétées en HSPB8

que dans les cellules transfectées avec le siCtl en condition basale (Figure 4.5B et C). Ceci

suggère que la déplétion en HSPB8 conduit à un enrichissement de la protéine LC3 dans

les vésicules autophagiques et à une augmentation de leur volume. Suite aux traitements

avec des inhibiteurs du flux autophagique, nous avons observé une augmentation d’au

minimum 2 fois de l’intensité et de ~1,2 fois du volume des autophagosomes dans les

celules contrôles (Figure 4.5B et C). Ces observations suggèrent donc qu’inhiber le flux

autophagique dans les cellules contrôles induit une augmentation l’intensité et du volume

des vésicules autophagiques ce qui est en accord avec la littérature (Tumbarello et al. 2012;

Klionsky et al. 2016). Il est intéressant de noter que l’intensité moyenne des

157

autophagosomes suite à l’inhibition du flux autophagique dans les cellules contrôles se

rapproche de celle observée en condition basale dans les cellules déplétées en HSPB8.

Cette observation suggère que l’augmentation de l’intensité des autophagosomes observée

suite à la déplétion d’HSPB8 pourrait être liée à une réduction ou une inefficacité du flux

autophagique. Dans les cellules déplétées en HSPB8, l’inhibition du flux autophagique

conduit à une augmenation plus mesurée de l’intensité moyenne des vésciules LC3 (BafA :

~1,2 fois; Pep+E64d : ~1,3 fois) suggérant que le flux autophagique n’est pas inhibé mais

pourrait être moins efficace suivant la déplétion d’HSPB8 (Figure 4.5B). En revanche, nous

avons observé que le traitement à la BafA conduit à une augmentation de ~1,5 fois du

volume des vésicules LC3 tandis que le traitement à la Pepstatine et E64d affecte peu leur

volume (Figure 4.5C). Ceci indique qu’inhiber la fusion des autophagosomes avec le

lysosome accentu le phénotype provoqué par la déplétion d’HSPB8 sur le volume des

vésicules LC3 alors que l’inhibition de l’activité des enzymes lysosomales non. Cette

observation suggère qu’HSPB8 pourrait agir sur la même voie que la BafA et donc pourrait

faciliter l’étape de fusion des autophagosomes avec le lysosome comme cela a été proposé

(Li et al. 2017; Kwok et al. 2011). Alternativement, la déplétion d’HSPB8 pourrait agir sur

la maturation des autophagolysosomes. En effet, une augmentation du volume pourrait

traduire une perturbation de la maturation des autophagolysosomes comme cela a été

observé suivant la déplétion de Rab7 dans les cellules de mammifères (Kuchitsu et al.

2018).

En conclusion, nos résultats préliminaires suggèrent que la déplétion d’HSPB8 interfère

avec l’activité de la machinerie autophagique dans les cellules en cytokinèse, mais ne nous

permettent pas de déterminer à quelle étape du flux autophagique elle interviendrait. Les

résultats présentés suggèrent que le chaperon pourrait faciliter la biogénèse des

autophagosomes et/ou la maturation des autophagosomes et/ou des autophagolysosomes

(Klionsky et al. 2016; Kuchitsu et al. 2018). Il est intéressant de noter que le complexe

Arp2/3 est proposé pour être central dans les processus de formation, de maturation et de

fusion des autophagosomes avec le lysosome (Monastyrska et al. 2008; Kast et Dominguez

2015; Mi et al. 2015; Höhfeld 2016; Zientara-Rytter et Subramani 2016b; Coutts et La

Thangue 2016; Lee et al. 2010). En effet, la polymérisation d’actine branchée induite par

158

Arp2/3 serait nécessaire pour le trafic intracellulaire de membranes contenant ATG9

(phagophores), pour la courbure membranaire lors de l’étape d’initiation, le contrôle du

volume des autophagosomes, la motilité des autophagosomes et leur fusion avec le

lysosome. Les résultats présentés aux chapitres 2 et 3 suggèrent que le complexe chaperon

HSPB8-BAG3 limiterait l’activité d’Arp2/3 en mitose et en cytokinèse. La perturbation de

l’organisation des vésicules LC3 observées suivant la déplétion d’HSPB8 pourrait donc

être une conséquence de la dérégulation de l’activité d’Arp2/3. Par ce mécanisme le

complexe pourrait faciliter la dégradation autophagique de protéines endommagées lors de

l’assemblage/désassemblage des structures du cytosquelette d’actine pendant la division

cellulaire, comme cela a été observé dans le muscle squelettique (Arndt et al. 2010;

Ulbricht et al. 2013).

Il nous faudra vérifier nos résultats en répétant nos expériences. En outre, afin de

déterminer si une ou plusieurs étapes du flux autophagique sont affectées par la dépltion

d’HSPB8, il sera essentiel d’effectuer des immunofluorescences de marqueurs de

phagophores comme ATG9, d’autophagosomes immatures comme ATG16 et

d’autophagolysosomes matures comme LAMP-1 (Klionsky et al. 2016; Kuninori Suzuki

et al. 2007; Kuchitsu et al. 2018). Ceci est essentiel afin de déterminer la nature des

vésicules autophagiques présentant une augmentation de volume et d’intensité LC3, i.e.

autophagosomes (positifs pour ATG16) versus autophagolysosomes (positifs pour LAMP-

1). De plus, nous pourrions tirer avantage de l’outil LC3-clover-rubby pour déterminer si

le flux autophagique est perturbé dans les cellules déplétées en HSPB8. En effet, cet outil

permet in situ de suivre le flux autophagique en suivant la localisation de LC3. Le capteur

en tandem clover (vert) et rubby (rouge) permet de déterminer si LC3 est localisée dans un

autophagosome ou dans un autolysosome en raison de l’instabilité de clover à un pH faible

tel que le pH du lysosome (Klionsky et al. 2016). LC3-clover-rubby pourrait nous

permettre de déterminer de façon si la fusion des autophagosomes avec le lysosome peut

être réduite en réponse à la déplétion d’HSPB8 comme cela a été proposé dans la littérature

(Kwok et al. 2011; Li et al. 2017).

159

Figure 4.5: La déplétion d’HSPB8 interfère avec le flux autophagique en cytokinèse. (A) Des cellules HeLa-RFP-H2B ont été synchronisées en cytokinèse et déplétées sur 48 h en HSPB8. Les images confocales montrent la distribution des autophagosmes après 1 h de traitement avec 10 µg/ml de pepstatine et 10 µg/ml de E64d, ou 200 nM de BafA, ou 150 nM de rapamycine, ou le contrôle DMSO. Les microtubules ont été marqués avec un anticorps anti-a-tubuline et les autophagosomes avec un anticorps anti-LC3 ; échelle, 10 µm. Le graphique représente le nombre d’autophagosomes par cellule quantifié pour

160

chacune des conditions indiquées ; représentatif d’une à deux expériences +/- SEM où au moins 21 cellules ont été analysées. L’analyse statistique compare la condition siCtl à la condition siHSPB8 pour le traitement indiqué par le test Mann Whitney. (B) Représentation graphique de l’intensité moyenne des autophagosomes par cellule suite à la transfection de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en cytokinèse du siCtl sur 48 h et traitées durant 1 h avec 10 µg/ml de pepstatine et 10 µg/ml de E64d ou 200 nM de BafA ; représentatif d’une à deux expériences +/- SEM où au moins 21 cellules ont été analysées. L’analyse statistique compare la condition siCtl à la condition siHSPB8 pour le traitement indiqué par le test Mann Whitney. (C) Représentation graphique de la distribution du volume moyen et du nombre d’autophagosomes par cellule suite à la transfection sur 48 h de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en cytokinèse des siCtl ou siHSPB8 #3 ; représentatif d’une à deux expériences +/- SEM où au moins 21 cellules ont été analysées. L’analyse statistique compare la condition siCtl à la condition siHSPB8 pour le traitement indiqué par le test Mann Whitney.

4.2.2. La déplétion d’HSPB8 est associée avec une accumulation de protéines

poly-ubiquitinées sur K63 dans les cellules en cytokinèse

Il est connu que l’autophagie sélective implique généralement l’ubiquitination des substrats

sur K63 (Tan et al. 2008; Huang et al. 2013; Clough et al. 2016; McKeon et al. 2015; Xu

et al., 2009). p62/SQSTM1 qui forme un complexe avec HSPB8 et BAG3 dans les cellules

en mitose (Annexe 1, Figure 6D; Chapitre 3, Figure 3.3C), se lie préférentiellement aux

substrats portant cette modification (Wooten et al. 2008). Nous avons donc analysé l’effet

de la déplétion d’HSPB8 sur les protéines poly-ubiquitinées sur K63.

Pour cela, nous avons réalisé des immunofluorescences de l’ubiquitine K63 dans des

cellules HeLa synchronisées en cytokinèse et déplétées en HSPB8. Nos résultats montrent

qu’en condition basale, dans les cellules contrôles, les protéines poly-ubiquitinées sur K63

forment de petits agrégats (ci-après identifiés sous le nom d’agrégats K63) compris entre

0,2 et 0,4 µm3 dispersés dans la cellule et dont le nombre moyen est de 100 par cellule

(Figure 4.6A et C). Après inhibition de la fusion des autophagosomes avec le lysosome par

un traitement avec la BafA, une augmentation du volume (entre 0,3 et 0,5 µm3) et du

nombre (~200 par cellule) de ces agrégats est observable (Figure 4.6A et C). De façon

remarquable, la déplétion d’HSPB8 en condition basale s’accompagne d’un doublement

du nombre d’agrégats K63 par cellule en comparaison aux cellules contrôles montrant une

accumulation de protéines poly-ubiquitinées sur K63 dans ces conditions (Figure 4.6B et

161

C). De plus, il n’est pas rare d’observer de gros agrégats K63 qui font augmenter

légèrement le volume moyen de ceux-ci (~0,3 µm3; Figure 4.6C et D). Ceci suggère qu’en

l’absence d’HSPB8, les protéines ubiquitinées sur K63 s’accumulent et seraient prises en

charge moins efficacement. Suite au traitement avec la BafA, nous avons observé que le

volume moyen des agrégats K63 augmente de façon moins drastique dans les cellules

déplétées en HSPB8 que dans les cellules transfectées avec le siCtl (1,09 fois contre 1,2

fois; Figure 4.6D), corroborant ainsi l’effet observé précédemment sur les vésicules LC3.

Suite au traitement avec la BafA, nous avons observé que le volume moyen des agrégats

K63 augmente de façon moins drastique dans les cellules déplétées en HSPB8 que dans les

cellules transfectées avec le siCtl (1,09 fois contre 1,2 fois; Figure 4.6D). Il semble donc

que le traitement avec la BafA ait un effet plus restreint dans les cellules déplétées en

HSPB8 en comparaison aux cellules contrôles. Il est intéressant de noter que les résultats

obtenus suite à l’inhibition de l’autophagie dans les cellules contrôles sont proches de ceux

obtenus en condition basale dans les cellules déplétées en HSPB8 en termes de volume et

de nombre d’agrégats K63 (Figure 4.6A et B). Ces observations suggèrent que la déplétion

d’HSPB8 est mimée par un traitement avec la BafA et suggèrent donc qu’une telle

déplétion inhibe la fusion des autophagosomes avec le lysosome ou la maturation des

autophagolysosomes. De façon intéressante, nous avons aussi noté que le nombre

d’agrégats K63 est réduit en réponse au traitement avec la BafA dans les cellules déplétées

en HSPB8 à la différence des cellules contrôles et nos quantifications indiquent qu’il s’agit

du nombre de petits agrégats K63 dont le volume est inférieur à 0,3 µm3 qui est réduit

(Figure 4.6E).

Nos résultats suggèrent donc que l’inhibition du flux autophagique induit une accumulation

d’agrégats K63 en cytokinèse. Ce résultat est concordant avec ce qui a été observé dans la

littérature où l’inhibition du flux autophagique conduit à une agrégation des protéines poly-

ubiquitinées et suggère que l’autophagie sélective est active dans ces conditions (Hara et

al. 2006; Riley et al. 2010; Komatsu et al. 2006; Lee et al. 2011). L’ensemble de nos

résultats suggèrent qu’en condition basale, dans les cellules déplétées en HSPB8,

l’autophagie sélective est moins efficace ce qui va dans le sens de ce qui a été proposé par

les travaux de l’équipe du Dr Höhfeld dans le muscle squelettique (Ulbricht, Arndt, et

162

Höhfeld 2013; Arndt et al. 2010). En outre, il est connu que les chaperons de la famille

HSPB sont importants pour contrôler l’agrégation protéique au cours d’un stress

protéotoxique (Haslbeck et Vierling 2015). L’inactivation de cette fonction se caractérise

par la formation de gros agrégats protéiques poly-ubiquitinés toxiques pour la cellule.

Ainsi, la disparition des petits agrégats K63 au profit d’agrégats plus volumineux suivant

la déplétion d’HSPB8 est en accord avec la fonction chaperon de la protéine (Carra et al.

2005). Aussi, nos résultats tendent à indiquer qu’en réponse à la déplétion d’HSPB8 en

cytokinèse il y a une réduction de l’efficacité de l’autophagie sélective.

Il nous faudra répéter ces expériences afin d’appuyer nos résultats. Par ailleurs,

l’autophagie sélective implique des adaptateurs autophagiques comme p62/SQSTM1 qui

est un partenaire important du complexe chaperon HSPB8-BAG3 dans les cellules en

mitose (Fuchs et al. 2015). Il est connu que l’oligomérisation de p62/SQSTM1 est

essentielle à l’agrégation des protéines ubiquitinées et à leur ciblage à la machinerie

autophagique (Matsumoto et al. 2011; Wurzer et al. 2015). Ainsi interférer avec

l’oligomérisation de l’adaptateur autophagique réduirait l’agrégation et l’élimination des

protéines ubiquitinées sur K63 par la machinerie autophagique, tout comme nous l’avons

observé suite à la déplétion en HSPB8 en cytokinèse. Afin de comprendre l’impact

d’HSPB8, il sera donc important d’analyser l’effet de sa déplétion sur la distribution et

l’organisation de p62/SQSTM1 en cytokinèse. Aussi, la FLN est la seule cible connue du

complexe chaperon HSPB8-BAG3 au cours de l’autophagie sélective (Ulbricht, Arndt, et

Höhfeld 2013; Arndt et al. 2010). Il serait intéressant de suivre la dégradation autophagique

de la FLN, grâce à une construction FLN-clover-ruby, en réponse à la déplétion d’HSPB8

en cytokinèse (Klionsky et al. 2016).

163

164

Figure 4.6: Les cellules déplétées en HSPB8 présentent une accumulation d’agrégats K63. (A) Représentation graphique de la distribution des agrégats K63 en fonction de leur volume moyen et de leur nombre par cellule suite à la transfection de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en cytokinèse avec le siCtl et traitées avec la BafA (200 nM) ou avec le contrôle DMSO ; les résultats sont représentatifs d’une expérience où 33 cellules pour la condition DMSO et 39 cellules pour la condition BafA ont été analysées. (B) Représentation graphique de la distribution des agrégats K63 en fonction de leur volume moyen et de leur nombre par cellule suite à la transfection de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en cytokinèse avec le siCtl ou le siHSPB8 #3 ; les résultats sont représentatifs d’une expérience où 33 et 23 cellules ont été analysées pour les conditions siCtl et siHSPB8 #3 respectivement. (C) Des cellules HeLa-RFP-H2B ont été synchronisées en cytokinèse et traitées durant la dernière heure de relâche avec 200 nM de BafA suite à la déplétion sur 48 h d’HSPB8 puis une immunofluorescence de l’ubiquitine K63 a été effectuée. Les images confocales représentent le marquage typique des protéines poly-ubiquitinées sur K63 dans des cellules contrôles ou déplétées en HSPB8 traitées avec la BafA ou avec le contrôle DMSO. Les flèches jaunes indiquent les petits agrégats K63 et les flèches rouges ceux de plus gros volume. Les microtubules et les protéines poly-ubiquitinées sur K63 ont été marquées avec des anticorps anti-a-tubuline et anti-ubiquitine K63 respectivement ; échelle, 10 µm. (D) Graphique montrant le volume moyen par cellule des agrégats K63 après 1 h de traitement avec la BafA ou le contrôle DMSO de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en cytokinèse 48 h après la déplétion d’HSPB8 avec un siARN spécifique ; médiane représentative d’une expérience. (E) Graphique représentant le nombre d’agrégats K63 dont le volume est inférieur à 0,3 µm3 par cellule après 1 h de traitement avec la BafA ou le contrôle DMSO de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en cytokinèse 48 h après la déplétion d’HSPB8 avec un siARN spécifique ; médiane représentative d’une expérience.

4.3. L’inhibition d’HDAC6 normalise l’intensité et le volume des autophagosomes

ainsi que l’accumulation de F-actine au PI dans les cellules déplétées en HSPB8

Dans le chapitre 3, nous avons montré que le complexe HSPB8-BAG3 avec p62/SQSTM1

facilite le remodelage du cytosquelette d’actine en partie en limitant l’activité de la

déacétylase HDAC6. Or, HDAC6 a été impliquée dans trois fonctions importantes: (i) elle

régule la migration cellulaire en contrôlant la dynamique des cytosquelettes d’actine et de

microtubules à travers la déacétylation de la cortactine et de l’a-tubuline, respectivement;

(ii) elle régule l’autophagie sélective en contrôlant le transport des protéines poly-

ubiquitinées le long des microtubules à travers le ciblage de celles-ci à la protéine motrice

dynéine et, (iii) en contrôlant la fusion des autophagosomes avec le lysosome via la

régulation de la dynamique d’actine à l’autophagosome dépendante de la cortactine (Lee

et al. 2010; Kawaguchi et al. 2003; Zhang et al. 2007; Tran et al. 2007; Zuo et al. 2012;

165

Kaluza et al. 2011). Aussi, l’activité du nucléateur Arp2/3, dont l’activité serait limitée par

le complexe chaperon lors de la division cellulaire de façon dépendante d’HDAC6-

cortactine (chapitres 2 et 3), serait centrale pour la régulation de multiples étapes du flux

autophagique dont le trafic intracellulaire de membranes contenant ATG9 (phagophores),

la courbure membranaire lors de l’étape d’initiation, le contrôle du volume des

autophagosomes, la motilité des autophagosomes et leur fusion avec le lysosome (Zientara-

Rytter et Subramani 2016b; Mi et al. 2015; Kast et al. 2015; Kast et Dominguez 2015;

Aguilera, Berón, et Colombo 2012; Monastyrska et al. 2008; Höhfeld 2016). En outre, une

étude suggère qu’Arp2/3 pourrait participer à la neutralisation du lysosome en régulant le

recyclage de la V-ATPase, suggérant que le nucléateur pourrait également moduler la

maturation des autophagolysosomes (Carnell et al. 2011). Ainsi, nous avons émis

l’hypothèse que l’effet du complexe chaperon HSPB8-BAG3 sur le flux autophagique des

cellules en cytokinèse pourrait être dû en partie à la régulation de l’activité d’HDAC6.

Afin de répondre à notre hypothèse, nous avons traité des cellules HeLa synchronisées en

cytokinèse et déplétées en HSPB8 avec la tubacine (40 µM), un inhibiteur spécifique

d’HDAC6, durant 1 h et avons réalisé des immunofluroscences de LC3 (Figure 4.7A).

Comme nous l’avons observé précédemment, l’intensité moyenne des autophagosomes

dans les cellules déplétées en HSPB8 est plus élevée que dans les cellules contrôles en

condition basale (Figure 4.7A, DMSO). Dans les conditions expérimentales employées, le

traitement avec la tubacine provoque une augmentation de ~1,5 fois de l’intensité moyenne

des autophagosomes, suggérant ainsi que la drogue induit une réduction du flux

autophagique dans les cellules contrôles (Figure 4.7A, tubacine). De plus, dans la condition

contrôle (DMSO) le volume des autophagosomes est compris entre 0,5 et 1 µm3, alors

qu’après le traitement avec la tubacine il est compris entre 0,6 et 1,4 µm3. L’inhibition

d’HDAC6 se caractérise donc par l’augmentation du volume des vésicules LC3 dans les

cellules contrôles comme le fait un traitement avec la BafA (Figure 4.7B). Ce résultat est

concordant avec l’implication d’HDAC6 dans la fusion des autophagosomes avec le

lysosome qui a été démontrée par Lee et al. 2010. À l’inverse, le traitement avec la tubacine

conduit à une réduction de ~1,6 fois de l’intensité moyenne des autophagosomes dans les

cellules déplétées en HSPB8 (passage de 5400 à 3550; Figure 4.7A). Aussi, la proportion

166

des autophagosomes dont le volume est compris entre 0,5 et 1 µm3 (volumes de la condition

siCtl DMSO) est augmentée dans les cellules déplétées en HSPB8, tout comme le nombre

d’autophagosomes par cellule en réponse à la tubacine (Figure 4.7C). Ces résultats

indiquent que l’inhibition d’HDAC6 conduit à une réduction de l’intensité moyenne des

autophagosomes dans les cellules déplétées en HSPB8 comme le fait un traitement des

cellules à la rapamycine (Figure 4.5A). Le traitement avec la tubacine semble également

provoquer une réduction du volume moyen des autophagosomes tout en augmentant leur

nombre dans les cellules déplétées en HSPB8 (Figure 4.7C).

Ainsi, ces résultats nous suggèrent que l’inhibition de l’activité d’HDAC6 améliore le flux

autophagique dans les cellules déplétées en HSPB8, alors qu’elle le réduirait dans les

cellules contrôles. Par ailleurs, nos résultats suggèrent que le traitement avec la tubacine

des cellules contrôles, comme le traitement avec la BafA, pourrait mimer l’augmentation

du volume et de l’intensité des autophagosomes observées dans les cellules déplétées en

HSPB8. Ce résultat suggère qu’une réduction de l’efficacité du flux autophagique dans les

cellules déplétées en HSPB8 pourrait être reliée à une dérégulation d’HDAC6 dans les

cellules en cytokinèse, à l’instar de la dérégulation de HDAC6 pendant la mitose (Chapitre

3). Ces résultats ne sont pas sans rappeler l’effet de la déplétion de p62/SQSTM1 rapporté

par Yan et al. 2013, est associée avec une sur-activation d’HDAC6 et à une accumulation

anormale de F-actine dans les cellules cancéreuses (Belaid et al. 2013). Ceci indique

qu’HSPB8-BAG3, par interaction avec l’adaptateur autophagique, pourrait moduler la

fusion des autophagosomes avec le lysosome dépendante de la déacétylase en régulant son

activité au cours de la division cellulaire.

Il sera important de vérifier ces observations en répétant l’expérience. De plus, pour

confirmer la modulation par HSPB8 de l’étape de fusion dépendante d’HDAC6 et de

l’activation subséquente de la cortactine, nous pourrions réaliser un essai de restauration

du flux autophagique, dans des cellules déplétées en HSPB8, en sur-exprimant un mutant

acétyl-mimétique de cortactine. L’utilisation de l’outil LC3-clover-rubby nous permettra

de déterminer de façon claire si la fusion des autophagosomes peut être restaurée dans ces

conditions. Par ailleurs, bien que nous n’ayons pas observé d’anomalies dans la distribution

167

des agrégats K63 au sein du cytoplasme, nous ne pouvons pas exclure que le blocage partiel

du flux autophagique observé dans les cellules déplétées en HSPB8 implique également

une inhibition de la fonction autophagique d’HDAC6 dans le transport de protéines poly-

ubiquitinées agrégées. Pour répondre à cette question nous pourrions réaliser le même type

d’expérience avec la ciliobrevine D, un inhibiteur de la dynéine, ou un mutant d’HDAC6

abolissant sa liaison à la dynéine (Firestone et al. 2012; Roossien, Miller, et Gallo 2015).

Ceci nous permettrait de déterminer si interférer avec le transport des agrégats de protéines

poly-ubiquitinées dépendant de la dynéine et/ou d’HDAC6 influerait sur le flux

autophagique comme le fait la déplétion d’HSPB8.

Il semble que la capacité à moduler la dynamique du cytosquelette d’actine du complexe

chaperon HSPB8-BAG3 soit liée à son activité autophagique. Comme l’inhibition

d’HDAC6 semble restaurer le flux autophagique dans les cellules déplétées en HSPB8,

nous nous sommes demandés si une telle inhibition pouvait également corriger

l’accumulation anormale de F-actine associée à la déplétion d’HSPB8 en cytokinèse.

Pour ce faire, nous avons effectué nos comptes à partir des mêmes expériences réalisées

pour la restauration de l’arrondissement des cellules en métaphase et dont le protocole est

schématisé dans la figure 4.7 D (Chapitre 3, Figure 3.2E et F). Nous avons choisi ces

conditions afin de ne pas interférer avec la progression des cellules contrôles dans le cycle

cellulaire en utilisant une faible dose de tubacine (5 µM), comme nous l’avons montré dans

le chapitre 3. De plus, l’utilisation de ces conditions permettra de déterminer si la tubacine

peut corriger deux phénotypes différents associés à la désorganisation du cytosquelette

d’actine en réponse à la déplétion d’HSPB8. Ainsi, pour ~16 % et ~17 % des cellules

tranfectées avec le siCtl nous avons observé une accumulation anormale de F-actine au PI

en présence de DMSO et de tubacine respectivement (Figure 4.7D). Ceci indique que la

dose faible de tubacine utilisée n’affecte pas l’étape de désassemblage de l’anneau d’actine

en cytokinèse dans les cellules contrôles. De façon intéressante, une réduction de ~1,4 fois

et de ~1,9 fois de la proportion de cellules présentant ces défauts a été observée suite au

traitement avec la tubacine dans les cellules transfectées avec le siHSPB8 #3 et le siHSPB8

#1 respectivement (Figure 4.7D). Par conséquent, tout comme nous l’avons vu pour la

168

proportion de cellules présentant un défaut d’arrondissement en métaphase, le traitement

avec de faibles doses de tubacine permet de réduire le pourcentage de cellules présentant

une accumulation de F-actine au PI en cytokinèse dans les cellules déplétées en HSPB8.

Ce résultat nous indique que l’inhibition d’HDAC6 corrige les phénotypes associés à une

désorganisation du cytosquelette d’actine qui sont observés suite à la déplétion d’HSPB8

en mitose et en cytokinèse. Ceci suggère donc que la régulation de la dynamique d’actine

en cytokinèse par le complexe chaperon HSPB8-BAG3 implique la modulation de

l’activité d’HDAC6.

L’ensemble de ces résultats tend à suggérer que la modulation de l’activité d’HDAC6 par

le complexe chaperon HSPB8-BAG3 est importante pour ses fonctions de régulation du

flux autophagique et de la dynamique de l’actine. Nos résultats appuient donc un lien

fonctionnel entre la fonction autophagique du complexe HSPB8-BAG3 et son activité sur

le cytosquelette d’actine, et un tel lien semble impliquer la modulation de l’activité

d’HDAC6 par le complexe.

Toutefois, nos résultats ne nous permettent pas d’exclure un effet direct d’HDAC6 sur la

dynamique d’actine au PI indépendamment de sa fonction autophagique. En effet, les

résultats obtenus dans le chapitre 2 suggèrent fortement que le phénotype d’accumulation

de F-actine à l’AC suite à la déplétion d’HSPB8 est la conséquence d’une activation

anormale d’Arp2/3 au PI. Comme HDAC6 active la cortactine qui elle-même active le

complexe Arp2/3, il est envisageable que l’activation anormale d’Arp2/3 au PI qui est

observée dans les cellules déplétées en HSPB8 soit une conséquence de l’activation

anormale d’HDAC6. L’utilisation d’un mutant de liaison d’HDAC6 aux protéines poly-

ubiquitinées qui abolie sa fonction autophagique sans affecter son activité déacétylase

pourrait nous permettre de répondre à cette question (Kawaguchi et al. 2003).

169

Figure 4.7 : L’inhibition de l’activité d’HDAC6 restaure un flux autophagique normal et normalise la quantité de F-actine au PI dans les cellules déplétées en HSPB8. (A) Des cellules HeLa-RFP-H2B ont été synchronisées en cytokinèse et déplétées sur 48 h en HSPB8. Les images confocales montrent la distribution des autophagosmes après 1 h de traitement avec 40 µM de tubacine ou le contrôle DMSO. Les microtubules ont été

170

marqués avec un anticorps anti-a-tubuline et les autophagosomes avec un anticorps anti-LC3, échelle, 10 µm. Schéma représentatif du protocole expérimental employé pour l’expérience. Graphique représentant l’intensité moyenne des autophagosomes par cellule quantifiée pour chacune des conditions de traitement et de siARN transfectés ; médiane représentative d’une expérience où au moins 26 cellules ont été analysées. (B) Représentation graphique de la distribution du volume moyen et du nombre des autophagosomes par cellule suite à la transfection sur 48 h de cellules HeLa-RFP-H2B en cytokinèse avec le siCtl et traitées durant 1 h avec 40 µM de tubacine ou le contrôle DMSO ; représentatif d’une expérience où 30 et 26 cellules ont été analysées pour les conditions DMSO et tubacine respectivement. (C) Représentation graphique de la distribution du volume moyen et du nombre des autophagosomes par cellule suite à la transfection sur 48 h de cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en cytokinèse avec le siHSPB8 #3 et traitées 1 h avec 40 µM de tubacine ou le contrôle DMSO ; représentatif d’une expérience où 30 et 35 cellules ont été analysées dans les conditions DMSO et tubacine respectivement. (D) Des cellules HeLa-RFP-H2B synchronisées en cytokinèse ont été transfectées avec le siHSPB8 #3 sur 48 h et traitées durant la seconde relâche de 8 h avec 5 µM de tubacine. Les images confocales montrent une restauration de l’accumulation de F-actine au PI (indiqué par les flèches et zoomé x2 dans les boîtes juxtaposées) présentée par les cellules déplétées en HSPB8 suite à un traitement avec la tubacine. Le PI et l’actine ont été marqués respectivement à l’aide d’un anticorps anti-Aurora B et de la phalloïdine-488 ; échelle, 10 µm. Schéma du protocole expérimental employé pour cette expérience. L’histogramme représente le pourcentage de cellules avec une accumulation anormale de F-actine au PI suite à la déplétion ou non d’HSPB8 et au traitement des cellules sur 8 h avec 5 µM de tubacine ou le contrôle DMSO ; représentatif d’une expérience où au moins 110 cellules ont été analysées.

4.4. Matériel et méthode

4.4.1. Culture cellulaire, synchronisation, traitements et transfection de siARN

Des cellules HeLa-RFP-H2B, ont été maintenues dans un milieu a-MEM (« a-minimal

essential medium ») supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et dans une atmosphère

humide à 5 % CO2 et à 37°C. Les cellules ont été synchronisées par la technique de double

blocage à la thymidine et relâchées durant 8 h ou 8 h30 dans du milieu frais selon le

protocole employé dans Fuchs et al. 2015. Pour les expériences de déplétion, 50 nM de

siARN ont été transfectés en utilisant la méthode de transfection au calcium phosphate

(125 mM CaCl2, 140 mM NaCl, 25 mM HEPES, 0.75 mM Na2HPO4). L’efficacité des

siARN a été analysée 24 h ou 48 h plus tard par immunobuvardage de type « Western » ou

par immunofluorescence. Pour la mesure du flux autophagique les drogues suivantes ont

171

été ajoutées durant la dernière heure de relâche avant la fixation des cellules : pepstatine A

(10 µg/ml) et E64d (10 µg/ml), bafilomycine A1 (200 nM), rapamycine (150 nM) et

tubacine (40 µM). Pour la restauration de l’accumulation de F-actine au PI, la tubacine (5

µM) a été ajouté durant les 8 h de la seconde relâche avant la fixation des cellules. Les

séquences de siARN employés sont basées sur les séquences humaines des protéinés

ciblées et ont été obtenues par Thermo Fisher Scientific. Les séquences des brins sens sont

les suivant : siATG7 #1 : 5’-GGTCAAAGGACGGAAGATAATT -3’; siATG7 #2 : 5’-

CCAAGGACATTAAGGGTTATT -3’ ; siHSPB8 #1 : 5’-

CAGATAGGCTAGTGGTATT-3’ ; siHSPB8 #3 : 5’-

CAGAGGAGTTGATGGTGAATT-3’. La séquence cible du siCtl (si Allstars Negative

Control) provient de Qiagen et est la suivante : 5’-CAGGGTATCGACGATTACAAA-3’.

4.4.2. Anticorps et drogues

Les anticorps suivant ont été utilisés : l’anti-ATG7 (#2631) et l’anti-LC3 (#3868)

proviennent de Cell Signaling Technology ; l’anti-ubiquitine K63 (#05-1308) et l’anti-

GAPDH Clone 6C5 (Fitzgerald, #10R-G109a) sont de Millipore ; l’anti-Aurora B

(ab2254) provient d’Abcam ; l’anti-a-tubuline (T5168) est de Sigma-Aldricht ; la

phalloïdine Alexa-Fluor® 488 (A12379) est de Molecular Probes/Thermo Fisher. Le

Hoechst bisbenzimide H 33342 (B2261), la thymidine (T9250), la pepstatine A (P5318),

le E64D (E8640) et la bafilomycine A1 (B1793) proviennent de Sigma-Aldrich ; la

rapamycine (553210) est de Calbiochem ; et la tubacine (S2239) provient de Selleckchem.

4.4.3. Immunobuvardage de type « Western »

Les cellules ont été lysées dans un tampon SDS (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.3 % SDS,

10 % glycérol, 5% β-mercaptoéthanole, 0.05 % bleu de bromphénole, 1 mM

phénylméthylsulfonylfluoride) et des quantités équivalentes de protéines provenant des

lysats cellulaires totaux ont été séparés par électrophorèse SDS-PAGE de gels à 8 %

d’acrylamide puis transférés sur membranes de nitrocellulose. L’immunobuvardage a été

effectué selon le protocole décrit par Champagne et al., 2004. La concentration protéique

172

des échantillons a été déterminée à l’aide du kit « DC protein assay » (Laboratoires Bio-

Rad) et l’analyse densitométrique a été effectuée à partir d’images acquises avec l’appareil

FluorS MAX MultiImager contrôlé par le logiciel QuantityOne version 4.5.0 (Laboratoires

Bio-Rad).

4.4.4. Immunofluorescence, microscopie et analyses statistiques

Les cellules après avoir été doucement laver au PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4.3 mM

Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4) ont été fixées soit avec de la PFA 4 % (paraformaldéhyde)

dans du PBS durant 20 min à température pièce, soit dans du méthanol 100 % à -20°C.

L’ADN a été marqué à l’aide de l’agent perméable Hoechst (150 ng/ml). Les échantillons

ont été traités pour l’immunofluorescence selon le protocole décrit par Lavoie et al., 2000

et post-fixés durant 20 min à température pièce dans du PBS 3,7 % formaldéhyde. Les

phénotypes ont été analysés en routine par inspection visuelle et quantifiés de manière

aveugle aux conditions de traitement, en utilisant le microscope AxioObserver Z1 équipé

d’un objectif 60x/1.25NA et d’une caméra à dispositif couplé-chargé (CCD) Axiocam

MRm contrôlé par le logiciel Zen (Carl Zeiss). Les images en microscopie confocale ont

été effectuées avec le microscope PerkinElmer Life Science Ultraview Spinning Disk

Confocal équipé d’un objectif 60x/1.25NA, une caméra à dispositif couplé-chargé

EMCCD à -50 °C et contrôlé par le logiciel Volocity 6.01 (Quorum Technologies). Pour

quantifier les cellules en métaphase partiellement arrondie, nous nous sommes assurés que

les cellules prises en compte étaient en métaphase par inspection du fuseau mitotique

marqué par l’a-tubuline et de l’ADN marqué par le Hoechst et avons déterminé

l’arrondissement cellulaire à l’aide du marquage de la F-actine à la phalloïdine. Pour

quantifier l'accumulation anormale de F-actine au niveau du PI des cellules filles, nous

avons quantifié les cellules connectées par un PI coloré par Aurora B présentant un ADN

décondensé (télophase tardive) et des structures anormales de F-actine au PI marquées par

la phalloïdine. Pour quantifier l’intensité, le volume et le nombre d’agrégats de protéines

K63 ou des autophagosomes colorés par LC3, nous avons utilisé l’outil « find object » du

logiciel Volocity. Pour trouver les objets le seuil d’intensité a été calibré à partir de la

condition la plus intense pour chaque expérience et un seuil de volume minimal des objets

173

de 0,3 µm3 pour les autophagosomes et de 0,1 µm3 pour les agrégats K63 ont été calibrés.

Les logiciels Volocity et ImageJ 1.48v (National Institute of Health) ont été utilisés pour

le traitement des images avant de les recadrer pour souligner le point principal de l'image.

Le traitement des images a été limité à la soustraction du bruit de fond et au réglage des

luminosité et contraste.

Pour l’analyse statistique de (a) la distribution dans les phases mitotiques des cellules

déplétées en ATG7, (b) du pourcentage de cellules avec une accumulation anormale de F-

actine au PI après déplétion d’ATG7, les données provenant d’au moins trois expériences

indépendantes ont été analysées en utilisant le test statistique Fischer et le logiciel

statistique Prism 6.0 (GraphPad Software). Les valeurs de p<0,05 ont été considérées

comme significatives (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001; ****, p <0,0001).

174

5. Chapitre 5 : Discussion

L’objectif principal de mon doctorat était de déterminer si l’impact du complexe chaperon

HSPB8-BAG3 sur le remodelage des structures à base d’actine contribue à son effet sur la

progression mitotique des cellules cancéreuses d’une part, et d’investiguer les mécanismes

moléculaires impliqués, d’autre part. Les résultats obtenus suggèrent que le complexe

chaperon agit, en partie, en limitant la polymérisation de l’actine dépendante d’Arp2/3

et/ou en stimulant son renouvellement. En outre, les évidences laissent croire que l’action

du complexe pourrait relever de son activité modulatrice de la déacétylase HDAC6 et de

son action dans les processus de dégradation des protéines par autophagie sélective. Nous

discuterons de ces trois principaux résultats dans les sections suivantes.

5.1. HSPB8-BAG3 agit en limitant la polymérisation de l’actine et/ou en stimulant son

renouvellement pendant la division cellulaire

Nous avons vu que la déplétion d’HSPB8, de BAG3 ou de son partenaire p62/SQSTM1,

peut récapituler les mêmes phénotypes mitotiques associés avec une dérégulation du

remodelage des structures à base d’actine qui dirigent la division cellulaire (Fuchs et al.

2015; Champion, Linder, et Kutay 2017; Annexe 1). De plus, nos résultats indiquent que

la réduction des niveaux d’expression de BAG3 ou d’HSPB8 conduit à une augmentation

de la prévalence des cellules multi-nucléées, démontrant ainsi l’impact du complexe

chaperon dans la progression de la division cellulaire (Hayashi et Karlseder 2013; S

Pedersen et al. 2016; Chapitre 2). Nous avons observé qu’en limitant la polymérisation de

l’actine, notamment par de faibles doses de latrunculine A, il est possible de corriger ces

défauts de division cellulaire dans les cellules déplétées en HSPB8, lequel est requis pour

l’activité de BAG3 et le recrutement de p62/SQSTM1 lors de la mitose (Fuchs et al. 2015;

Annexe 1; Chapitre 2). Ces observations suggèrent qu’un complexe tertiaire formé

d’HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1, dont la formation est régulée par les signaux mitotiques,

pourrait faciliter la progression mitotique en contrôlant localement la dynamique d’actine.

Cette fonction chaperon pourrait permettre un désassemble/assemblage limité dans le

temps et l’espace des structures à base d’actine qui dirigent la division cellulaire. L’action

175

du complexe chaperon pourrait également favoriser le maintien de l’intégrité de telles

structures qui sont soumises à des forces mécaniques importantes en facilitant leur

renouvellement; c’est le cas notamment du cortex d’actomyosine qui supporte

l’arrondissement mitotique, des fibres de rétraction qui transmettent les forces mécaniques

au cortex pour favoriser l’orientation du fuseau mitotique, ainsi que de l’anneau contractile

d’actomyosine qui conduit la séparation des cellules filles lors de la cytokinèse. Bien que

le ou les mécanismes précis restent à déterminer, il nous est permis de spéculer sur des

pistes potentielles à explorer sur la base des résultats présentés dans cette thèse et de la

nouvelle littérature, qui seront discutés plus bas.

Sur la base de nos résultats, on peut prédire que des composantes et/ou régulateurs du

complexe Arp2/3 pourraient constituer de nouveaux « clients mitotiques » du complexe

chaperon. En effet, nous avons mis en évidence que l’inhibition du complexe Arp2/3 peut

restaurer les défauts associés à l’accumulation de structures d’actine ectopiques suivant la

déplétion de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1, incluant les défauts de cytokinèse,

l’arrondissement mitotique, et la dynamique du nuage sous-cortical d’actine qui influence

l’orientation du fuseau mitotique (Mitsushima et al. 2010; Chapitre 2; Chapitre 3). Ces

résultats suggèrent qu’HSPB8-BAG3 en association avec p62/SQSTM1 limiterait

l’activité spatiale du complexe Arp2/3 à l’entrée des cellules en mitose. Il a été montré

qu’un transfert de l’activité d’Arp2/3 en faveur de la formine mDia1 est requis pour

l’assemblage du cortex en mitose essentiel à l’arrondissement mitotique (Rosa et al. 2015).

D’autre part, il a été suggéré qu’Arp2/3 est essentiel à la régulation de la dynamique

d’actine au sein du nuage sous-cortical d’actine qui dirige le positionnement du fuseau

mitotique (Mitsushima et al. 2010; Théry et al. 2005), un résultat corroboré par nos travaux

(Chapitre 3). Ainsi, il est envisageable que dans ce contexte le complexe formé d’HSPB8,

BAG3 et p62/SQSTM1 faciliterait l’inhibition d’Arp2/3 en séquestrant des protéines clés

au cours de la division cellulaire. En conséquence, en ségrégant localement l’activité du

complexe Arp2/3, HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 faciliterait à la fois le transfert d’activité

des nucléateurs à l’entrée des cellules en mitose et la dynamique du nuage sous-cortical

d’actine en mitose. Une telle activité pourrait intervenir en cytokinèse pour limiter la

polymérisation d’actine branchée à l’anneau contractile d’actomyosine; à l’appui de ce

176

modèle, nous avons observé que la déplétion d’HSPB8 conduit à une accumulation

anormale d’Arp2/3 au pont intercellulaire lors de la cytokinèse tardive (Chapitre 2).

ArpC2 est un candidat intéressant comme cible potentielle de l’action inhibitrice d’HSPB8-

BAG3-p62/SQSTM1. ArpC2 est une sous-unité du complexe Arp2/3 essentielle à la

formation du complexe (Machesky et al. 1994; Winter, Choe, et Li 1999; Rotty et al. 2015).

Il a été démontré par spectrométrie de masse que la sous-unité ArpC2 du complexe Arp2/3

est un partenaire de BAG3 en conditions physiologiques (Chen et al. 2013). D’autre part,

la GTPase Rac1 pourrait également être ciblée par l’action inhibitrice du complexe

chaperon. Il a été démontré que la GTPase Rac1 est inactivée à l’entrée des cellules en

mitose et que la surexpression d’un mutant dominant positif de Rac1 interfère avec la

progression de la cytokinèse et conduit ainsi à un avortement de l’abscission (Bastos et al.

2012; Muris et al. 2002; Oceguera-Yanez et al. 2005). Rac1 serait régulée par le co-

chaperon BAG3 lors de la migration et de l’adhésion cellulaires dans le contexte de cellules

cancéreuses (Iwasaki et al. 2007; Hüfner et al. 2002; Chen et al. 2017). La séquestration de

Rac1 ou de ses régulateurs à l’entrée des cellules en mitose aurait pour conséquence de

favoriser l’échange d’activité des nucléateurs (Arp2/3 vers mDia1). Il serait donc

intéressant d’analyser la présence de foyers ArpC2 et/ou Rac1 dans les cellules mitotiques

et d’évaluer l’impact du complexe chaperon HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 sur la

distribution de tels foyers.

D’autre part, l’action régulatrice du complexe HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 pourrait

s’exercer au niveau de la GTPase RhoA. En effet, de récents travaux suggèrent que la

régulation spatiotemporelle de la GTPase RhoA lors de la division cellulaire pourrait

dépendre en partie de la formation de corpuscules contenant la GTPase ainsi que la cycline

A2 qui serait nécessaire à ce processus (Loukil et al. 2016). De tels foyers seraient en partie

dégradés par autophagie sélective via le recrutement de p62/SQSTM1 et LC3 ce qui

contribuerait à la transition métaphase-anaphase (Loukil et al. 2014). D’autre part, en

cytokinèse, il est suggéré que le ciblage sélectif de la forme active de RhoA par

p62/SQSTM1 à la dégradation par autophagie est essentiel pour limiter l’activité de la

GTPase au sillon de clivage (Belaid et al. 2013). Il est donc envisageable que le complexe

177

tertiaire HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 module des corpuscules contenant la GTPase RhoA,

qui ont été reliés à sa régulation fine. RhoA est une GTPase clé qui contrôle la mise en

place du cortex en mitose et la formation et la contraction de l’anneau contractile en

cytokinèse, dont l’activation excessive en mitose et cytokinèse est mimée par la déplétion

de BAG3, HSPB8 ou p62/SQSTM1 (Belaid et al. 2013; Marchesi et al. 2014; Maddox et

Burridge 2003; Liu et Weiner 2016; Chapitres 2 et 3). En outre, les travaux de Ke et al.

suggèrent qu’HSPB8 module l’activité de RhoA dans un contexte de stress cellulaire

provoqué par la fibrillation auriculaire (Ke et al. 2011). Il serait donc important d’analyser

une possible interaction fonctionnelle entre le complexe tertiaire mitotique HSPB8-BAG3-

p62/SQSTM1 et la GTPase RhoA.

En outre, la régulation spatiale de la dynamique de l’actine pourrait faire intervenir un

mécanisme impliquant l’activité du complexe tertiaire HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 sur la

séquestration des protéines. Des travaux récents obtenus au laboratoire ont montré

qu’HSPB8, en coopération avec BAG3, coordonne la séquestration de protéines nuisibles

lors de l’inhibition du protéasome, ce qui faciliterait leur transport à l’agrésome (Guilbert

et al. 2018). De plus, la séquestration locale du complexe TSC par BAG3 lors de la

contraction musculaire a été reliée à la régulation spatiotemporelle de l’activité de

mTORC1 (Kathage et al. 2016). En outre, l’activité protectrice de l’adaptateur

autophagique p62/SQSTM1 lors d’un stress protéotoxique se caractérise par son action sur

l’agrégation fonctionnelle des protéines nuisibles (Bjørkøy et al. 2005; Wooten et al. 2008;

Wurzer et al. 2015). Les protéines en voie de dénaturation sont ainsi séquestrées

rapidement dans des structures réversibles appelées corpuscules (« p62 bodies »), lesquels

sont organisés par l’oligomérisation de p62/SQSTM1. La formation de ces corpuscules par

p62/SQSTM1 a été associée à sa fonction signalétique où la séquestration de protéines clés

permet de reprogrammer et compartimenter des voies de signalisation dans la cellule

(Rantanen et al. 2013; Houslay et Christian 2010). Par exemple, la séquestration de la

phosphatase C1-Ten par p62/SQSTM1 permettrait son inactivation spécifique requise pour

la différenciation musculaire (Koh et al. 2014). p62/SQSTM1 active également la réponse

anti-oxydante dépendante de Nrf2 (« Nuclear Factor (Erythroid-Derived 2)-Like 2 ») en

178

séquestrant l’ubiquitine ligase Keap1 (« Kelch-like ECH-associated protein 1 ») (Komatsu

et al. 2010).

Ainsi, il est raisonnable d’envisager que dès l’entrée des cellules en mitose, la formation

de corpuscules orchestrée par l’oligomérisation de p62/SQSTM1 et régulée par le

complexe chaperon HSPB8-BAG3, pourrait créer une plateforme de séquestration

protéique. Ceci pourrait permettre la ségrégation de complexes de signalisation pour une

action locale, ou la séquestration de protéines endommagées par des cycles répétitifs

d’assemblage/désassemblage ou dont l’action doit être inhibée. Nos récents travaux

suggèrent qu’HSPB8 et BAG3 coopèrent pour promouvoir la phosphorylation de

p62/SQSTM1 sur des résidus spécifiques qui sont prédits comme essentiels pour son

oligomérisation et qui pourraient réguler des voies de signalisation intracellulaires

contrôlant l'état métabolique et oxydatif de la cellule (Guilbert et al. 2018). Nous avons

corrélé l’effet promoteur d’HSPB8-BAG3 sur la phosphorylation de p62/SQSTM1 à son

effet dans la séquestration de protéines poly-ubiquitinées, ainsi qu’à son effet régulateur

dans la séquestration de Keap1. Ainsi, à l’instar de son rôle dans le contrôle local de

l’activité de mTORC1 dans les cellules musculaires lisses, HSPB8-BAG3 semble contrôler

l’activation de Nrf2 et la réponse au stress oxydant dans les premières heures du stress

protéotoxique (Kathage et al. 2016; Guilbert et al. 2018). On peut donc penser qu’un

mécanisme similaire, impliquant la régulation de la phosphorylation de p62/SQSTM1 et

de son oligomérisation en mitose, pourrait intervenir. Dans ce sens, il est pertinent de noter

ici que p62/SQSTM1 est phosphorylée par Cdk1 à l’entrée des cellules en mitose et que

cette phosphorylation modulerait la progression mitotique (Linares et al. 2011). De façon

intéressante, nos résultats préliminaires suggèrent que la déplétion d’HSPB8 ou de BAG3

interfère avec la phosphorylation mitotique de p62/SQSTM1. De plus, l’existence de

corpuscules dynamiques dans les cellules en mitose, associés à la séquestration de protéines

mitotiques et au contrôle de l’activité de RhoA, a été mis en évidence récemment par Loukil

et al. (Loukil et al. 2016, 2014).

Sur la base de nos études récentes et de la littérature actuelle, il est envisageable que la

formation de corpuscules mitotiques par p62/SQSTM1 pourrait être facilitée par l’activité

179

chaperon d’HSPB8 qui aiderait à la reconnaissance des substrats mitotiques de

p62/SQSTM1. La fonction d’adaptateur autophagique de p62/SQSTM1 se caractérise par

la reconnaissance de protéines marquées par l’ubiquitine K63, grâce à son domaine UBA,

puis au déclenchement de leur agrégation par auto-oligomérisation à travers son domaine

PB1. Dans ce sens, nous avons observé l’existence de corpuscules dynamiques caractérisés

par la présence de p62/SQSTM1 dans les cellules mitotiques dont la formation serait

dépendante du complexe chaperon HSPB8-BAG3 puisque la déplétion d’HSPB8, BAG3

ou p62/SQSTM1 conduit à une réduction drastique du nombre de corpuscules

p62/SQSTM1 (Herman Lambert, résultats non publiés). Il sera intéressant d’analyser la

composition de ces structures, par purification d’affinité, puisqu’elles pourraient permettre

d’identifier plusieurs nouveaux clients du complexe chaperon.

Finalement, nos résultats suggèrent que la régulation fine de la dynamique d’atomyosine

ferait intervenir de nouveaux régulateurs mitotiques : soit la déacétylase HDAC6 et son

substrat prototype la cortactine.

5.2. Le complexe HSPB8-BAG3 facilite le remodelage des structures mitotiques à base

d’actine à travers la modulation d’HDAC6

Afin d’identifier des cibles potentielles de l’action du complexe chaperon HSPB8-BAG3-

p62/SQSTM1 dans le remodelage des structures à base d’actine, nous avons concentré nos

efforts à l’étude d’une structure d’actine mitotique suggérée pour dépendre de l’activité

dynamique d’Arp2/3 : le nuage sous-cortical d’actine dans les cellules en prométaphase-

métaphase (Mitsushima et al. 2010). C’est ainsi que nous avons émis l’hypothèse que la

déacétylase HDAC6, interagissant préférentiellement avec BAG3 en mitose et connue pour

réguler la dynamique du cytosquelette d’actine, pourrait être à l’origine de l’activité du

complexe HSPB8-BAG3 sur la dynamique d’actine (Fuchs et al. 2015; Kaluza et al. 2011;

Zhang et al. 2007; Kozyreva et al. 2014; Annexe 1).

Ainsi nous avons obtenu des résultats qui suggèrent que l’activité d’HDAC6 est régulée de

manière différentielle pendant la mitose et qu’un tel processus impliquerait le complexe

180

tertiaire mitotique HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 avec lequel HDAC6 s’associe de façon

dépendante d’HSPB8 (Fuchs et al. 2015; Annexe1; Chapitre 3). Cependant, les

mécanismes précis restent à déterminer. Nos travaux suggèrent que la cortactine pourrait

être une cible d’HDAC6 finement régulée en mitose (Uruno et al. 2001; Weaver et al. 2001;

Chapitre 3). En effet, nos résultats montrent que le « turnover » de l’acétylation de la

cortactine ainsi que son association avec HDAC6 sont réduites dans les cellules mitotiques,

comparativement aux cellules en croissance asynchrone. La déacétylation de la cortactine

est connue pour activer sa fonction activatrice de la polymérisation de l’actine branchée à

travers l’activation d’Arp2/3. Limiter l’activité d’HDAC6 sur la cortactine dans le temps

et l’espace pourrait ainsi contribuer au contrôle de la dynamique d’actine en mitose à

travers la régulation précise de la dynamique d’activation/inhibition d’Arp2/3. Ce

mécanisme moléculaire pourrait être requis pour contrôler la dynamique du nuage sous-

cortical d’actine en mitose et aider au transfert d’Arp2/3 en faveur de mDia1 à l’entrée des

cellules en mitose requis pour l’arrondissement mitotique (Mitsushima et al. 2010; Rosa et

al. 2015). Dans ce sens, nous avons vu que la surexpression d’un mutant non acétylable de

la cortactine interfère avec l’arrondissement mitotique (Chapitre 3).

En outre, la cortactine a été associée au contrôle du démantèlement des adhésions focales

via une dynamique d’association/dissociation avec la tyrosine kinase FAK (« Focal

Adhesion Kinase ») (Tomar et al. 2012). La phosphorylation sur tyrosine de la cortactine

qui stimule le désassemblage des adhésions focales, semble être un mécanisme qui

contribue à stimuler sa déacétylation connue pour être dépendante d’HDAC6 (Zhang et al.

2007; Meiler, Nieto-Pelegrín, et Martinez-Quiles 2012; Tomar et al. 2012). De plus, une

activité d’HDAC6 sur la cortactine a été caractérisée en G2/M où elle serait requise pour

le démantèlement du cil primaire, étape à laquelle se déroule le désassemblage des

adhésions focales requis pour l’arrondissement mitotique (Ran et al. 2015). Il est donc

envisageable qu’une régulation spatiotemporelle fine de la déacétylation de la cortactine

spécifiquement au niveau des adhésions focales par HDAC6 pourrait faciliter le

démantèlement des adhésions focales ce qui l’impliquerait dans le processus

d’arrondissement mitotique. Il serait donc important de préciser le lien fonctionnel entre

181

l’activité d’HDAC6 sur son substrat prototype la cortactine et la régulation des structures

à base d’actine en mitose.

La fonction mitotique d’HDAC6 pourrait également faire intervenir d’autres cibles

connues de la déacétylase qui modulent la dynamique du cytosquelette d’actine.

Notamment, la chaîne lourde de la MyoII, dont l’acétylation stimule la liaison à l’actine,

est une cible démontrée d’HDAC6 (Zhang et al. 2015). La MyoII joue un rôle central dans

la formation et le maintien de la rigidité du cortex requis pour l’arrondissement mitotique

et elle est nécessaire à la contraction de l’anneau contractile en cytokinèse (Mabuchi et

Okuno 1977; Straight et al. 2003; Ramanathan et al. 2015; Rosa et al. 2015). Une telle

fonction de MyoII en cytokinèse implique à la fois son activité motrice et sa capacité à

induire la dépolymérisation de la F-actine (Mendes Pinto et al. 2012). Ainsi en régulant

l’acétylation de la chaîne lourde de la MyoII et donc en réduisant son association à l’actine,

HDAC6 pourrait contrôler spécifiquement l’activité de la MyoII au cours de la division

cellulaire. En mitose, cette fonction aiderait à l’arrondissement mitotique et au maintien de

la rigidité corticale. En cytokinèse, la déacétylation de la chaîne lourde de la MyoII par

HDAC6 serait requise pour coordonner la contraction de l’anneau contractile et la

dépolymérisation simultanée de la F-actine. Il serait donc important de déterminer

l’acétylome d’HDAC6 en mitose afin d’identifier l’ensemble de ses cibles mitotiques et de

préciser leurs fonctions mitotiques.

En somme, la modulation de l’activité d’HDAC6 par le complexe chaperon HSPB8-

BAG3-p62/SQSTM1 facilite le remodelage des structures à base d’actine en mitose et en

cytokinèse. Le mécanisme moléculaire par lequel HDAC6 contrôle la dynamique d’actine

en mitose semble impliquer sa cible la cortactine. Il est évident que d’autres cibles

d’HDAC6 pourraient être également requises pour le remodelage de l’actine en mitose et

celles-ci restent à être identifiées. Outre sa fonction modulatrice de l’activité d’HDAC6,

les résultats obtenus dans le cadre des études montrées dans le chapitre 4 supportent un rôle

pour la fonction autophagique du complexe chaperon HSPB8-BAG3 dans la régulation du

remodelage de l’actine lors de la cytokinèse.

182

5.3. Implication potentielle de l’autophagie sélective dépendante d’HSPB8-BAG3

dans la progression de la division cellulaire

Le complexe chaperon HSPB8-BAG3 a été impliqué dans le contrôle du ciblage de

protéines agrégées, dénaturées ou poly-ubiquitinées à la machinerie autophagique dans le

contexte d’un stress protéotoxique (Carra et al. 2008; Gamerdinger et al. 2011, 2009;

Minoia et al. 2014; Xu et al. 2013). Dans le muscle, cette fonction du complexe chaperon

a été associée au contrôle de l’intégrité de la structure d’actine qui dirige la contraction

cellulaire : la myofibrille (Arndt et al. 2010; Ulbricht et al. 2013). La division cellulaire

implique des structures contractiles, soumises aux tensions mécaniques, qui sont

déstabilisées par la déplétion d’HSPB8 ou de BAG3 (Fuchs et al. 2015, Annexe 1; Chapitre

2). Nous avons supposé que la fonction dans l’autophagie sélective du complexe chaperon

est impliquée dans les processus de remodelage des structures contractiles qui dirigent la

division cellulaire. Nous avons montré que l’inhibition du flux autophagique mime les

phénotypes associés à la déplétion d’HSPB8 ou de BAG3 (i.e. inhibition de

l’arrondissement mitotique et du désassemblage de l’anneau contractile). À l’inverse, nos

résultats indiquent qu’activer le flux autophagique par un traitement avec la rapamycine

restaure le désassemblage de l’anneau contractile dans les cellules déplétées en HSPB8.

L’ensemble de ces résultats suggère que le ciblage sélectif de protéines à la machinerie

autophagique est une fonction du complexe HSPB8-BAG3 requise pour le remodelage du

cytosquelette d’actine au cours de la division cellulaire.

Les travaux de l’équipe du Dr Höfehld ont caractérisé une fonction importante du co-

chaperon BAG3 dans l’assemblage d’un complexe requis pour le ciblage de la filamine à

l’autophagie sélective (Arndt et al. 2010; Ulbricht et al. 2013). Cette fonction est

coordonnée avec une action du co-chaperon dans le renouvellement de la filamine

dénaturée par le stress mécanique, permettant ainsi de préserver l’intégrité de la protéine

au cours de la contraction de la cellule musculaire. En plus de proposer que ce mécanisme

moléculaire intervienne en réponse à tous types de tensions mécaniques, les auteurs ont

aussi suggéré que le chaperon HSPB8 est requis pour la reconnaissance spécifique de la

filamine dénaturée. Le mécanisme moléculaire de la CASA fait intervenir plusieurs

183

protéines clés, dont p62/SQSTM1 et HSC70, recrutées spécifiquement par BAG3. Comme

les fonctions mitotiques de BAG3 ne requièrent pas son association à HSC70, il est

envisageable qu’un mécanisme similaire au processus de CASA, mais distinct car

indépendant d’HSC70, soit impliquer dans le remodelage des structures à base d’actine

lors de la division cellulaire. D’autre part, il est possible que lors de la cytokinèse, HSC70

soit un partenaire important du complexe chaperon. En effet, l’architecture du complexe

pourrait être différente de celle observée en mitose, compte-tenu de l’état de

phosphorylation de BAG3 dont l’hyperphosphorylation est stimulée à l’entrée des cellules

en mitose, alors qu’elle est inhibée au début de la cytokinèse (Fuchs et al. 2015 ; Annexe1).

Reste à identifier les cibles de l’activité autophagique du complexe chaperon lors de la

division cellulaire.

La filamine pourrait être une cible potentielle du complexe HSPB8-BAG3 puisqu’une

fonction en mitose et en cytokinèse a été associée à la protéine de réticulation de l’actine.

En mitose, la filamine serait importante pour réticuler le cytosquelette d’actine de façon

dépendante de sa phosphorylation par CDK1 (Cukier, Li, et Lee 2007). En cytokinèse, une

fonction pour la filamine a été associée au recrutement de protéines requises pour la

machinerie de l’abscission (Mondal et al. 2012). Ainsi, en aidant au maintien de l’état natif

de la filamine, en induisant sa dégradation par autophagie sélective et sa synthèse

simultanée, le complexe HSPB8-BAG3-p62/SQSTM1 permettrait de maintenir l’intégrité

corticale en mitose via son activité de réticulation et le recrutement des protéines de

l’abscission en cytokinèse. Il serait intéressant de tirer avantage d’une construction

filamine-clover-rubby qui nous permettrait de suivre le ciblage de la protéine à la

machinerie autophagique et d’analyser l’influence du complexe chaperon HSPB8-BAG3

sur un tel processus au cours de la division cellulaire.

Telle que mentionnée dans la section précédente, Belaid et al. ont montré qu’en cytokinèse,

p62/SQSTM1 est impliquée dans le ciblage sélectif de la forme active de RhoA à la

machinerie autophagique en contrôlant l’agrégation de la GTPase (Belaid et al. 2013).

Interférer avec un tel processus conduit à une activation excessive de RhoA, à une

expansion de sa localisation et à une accumulation anormale de F-actine, qui seraient

184

responsables d’une instabilité génétique caractéristique d’un avortement de l’abscission.

De plus, HSPB8 modulerait négativement l’activité de RhoA dans un contexte de stress

cellulaire provoqué par la fibrillation auriculaire (Ke et al. 2011). Ainsi en aidant au ciblage

spécifique de la forme active de RhoA à l’autophagie sélective via son association à

p62/SQSTM1, le complexe chaperon HSPB8-BAG3 pourrait faciliter les processus de

remodelage de l’actine requis pour le désassemblage de l’anneau contractile en cytokinèse.

Il serait donc intéressant d’analyser l’implication du complexe HSPB8-BAG3 dans le

ciblage à la machinerie autophagique de RhoA-GTP en cytokinèse.

En outre, nos résultats préliminaires suggèrent que la déplétion d’HSPB8 interfère avec le

flux autophagique. Sur la base de l’ensemble de nos résultats, il est possible de suggérer

un modèle selon lequel la régulation d’HDAC6-cortactine puisse avoir un rôle dans la

modulation du flux autophagique. En effet, Lee et al. a montré que le cytosquelette d’actine

et la déacétylation de la cortactine par HDAC6 sont requis pour l’étape de fusion de

l’autophagosome avec le lysosome uniquement au cours des processus d’autophagie

sélective (Lee et al. 2010). De plus, les réseaux d’actine branchée régulés par Arp2/3, dont

l’activité semble être limitée par HSPB8-BAG3 au cours de la division cellulaire de façon

dépendante d’HDAC6 (chapitres 2 et 3), seraient au cœur de la régultation de multiples

étapes du flux autophagique (Monastyrska et al. 2008; Kast et Dominguez 2015; Kast et

al. 2015; Mi et al. 2015; Höhfeld 2016; Coutts et La Thangue 2016; Zientara-Rytter et

Subramani 2016b). Or, il semble que l’inhibition de l’activité d’HDAC6 améliore le flux

autophagique normal dans les cellules déplétées en HSPB8. Cela suggère que la

modulation de l’activité d’HDAC6 sur la cortactine par le complexe HSPB8-BAG3

pourrait facilter une ou plusieurs étapes du flux autophagique dépendantes de l’activité

d’Arp2/3. Il est intéressant de noter ici que p62/SQSTM1 régulerait négativement l’activité

déacétylase d’HDAC6 suggérant que l’adaptateur autophagique joue un rôle dans la

régulation de la fusion des autophagosomes avec le lysosome dépendante d’HDAC6 lors

du processus d’autophagie sélective (Yan et al. 2013). De récentes études suggèrent aussi

que le chaperon HSPB8 faciliterait la fusion des autophagosomes avec le lysosome à

travers un mécanisme moléculaire indéterminé (Li et al. 2017; Kwok et al. 2011).

Notamment, les travaux de Kwok et al. ont montré que la surexpression d’un mutant

185

d’HSPB8, le mutant K141E retrouvé chez des patients atteints de neuropathie motrice

héréditaire, interfère avec la livraison des autophagosomes au lysosome (Kwok et al. 2011).

Ainsi au cours de la division cellulaire HSPB8, en association avec BAG3 et p62/SQSTM1,

pourrait faciliter le flux autophagique en assistant l’étape de fusion. Un tel mécanisme

moléculaire pourrait impliquer la modulation de l’activité d’HDAC6 sur la cortactine

requise pour la fusion des autophagosomes avec le lysosome au cours du processus

d’autophagie sélective. Il sera intéressant de tester ce modèle par analyse de la distribution

de la construction LC3-clover-rubby en réponse à la déplétion d’HSPB8 ou de BAG3.

En résumé, les résultats présentés dans cette thèse suggèrent un modèle selon lequel le

complexe chaperon pourrait moduler le cytosquelette d’actine en facilitant deux étapes

distinctes du flux autophagique. Premièrement, il pourrait aider à la séquestration et au

ciblage sélectif de protéines mécanosensibles à la machinerie autophagique tel qu’il l’a été

proposé pour le processus de CASA. Deuxièmement, en modulant l’activité de la

déacétylase HDAC6 sur sa cible la cortactine, il pourrait faciliter l’étape de fusion des

autophagosomes avec le lysosome.

186

6. Conclusion

Les travaux présentés dans cette thèse ont mis en avant une fonction encore non appréciée

du complexe chaperon HSPB8-BAG3 dans la modulation de la dynamique des structures

à base d’actine qui dirigent la division cellulaire dans le contexte de cellules cancéreuses.

Tout d’abord, nous avons déterminé que la limitation de la dynamique d’actine par le

complexe HSPB8-BAG3 est un mécanisme par lequel le complexe chaperon aide à la

progression normale de la division cellulaire dans le contexte de cellules cancéreuses.

L’exploration des mécanismes moléculaires par lesquels le complexe HSPB8-BAG3 peut

moduler la dynamique d’actine a révélé deux modèles qui pourraient être interdépendants.

D’une part, nous avons vu que le complexe chaperon facilite la dynamique d’actine au sein

de structures qui dirigent la division cellulaire en modulant l’activité d’HDAC6. D’autre

part, le complexe chaperon HSPB8-BAG3, par le ciblage de protéines à la dégradation

autophagique et/ou en facilitant la fusion des autophagosomes avec le lysosome,

modulerait la transition dans l’organisation des structures d’actine au cours de la division

cellulaire.

L’ensemble de ces travaux appuient l’hypothèse que les chaperons de la famille des HSPB

contrôlent la dynamique de l’actine dans un contexte physiologique et qu’une telle fonction

pourrait favoriser la survie des cellules cancéreuses et l’expansion tumorale. Par ailleurs,

ces travaux ont mis en évidence la déacétylase HDAC6 comme un partenaire important du

complexe chaperon HSPB8-BAG3 dans ses fonctions régulatrices du cytosquelette

d’actine. HDAC6 pourrait donc être une potentielle cible thérapeutique pour des

pathologies impliquant une dérégulation du complexe chaperon. En conséquence, il serait

important de déterminer l’ensemble processus cellulaires dans lesquels HDAC6 et ses

cibles potentielles sont régulées par le complexe chaperon HSPB8-BAG3.

187

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•

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8. Annexes

8.1. Annexe 1

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8.2. Annexe 2

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8.3. Annexe 3

SMALL HEAT SHOCK PROTEINS

Fine-tuning of actin dynamics by the HSPB8-BAG3 chaperonecomplex facilitates cytokinesis and contributes to its impacton cell division

Alice Anaïs Varlet1,2 & Margit Fuchs1,2 & Carole Luthold1,2 &

Herman Lambert1,2 & Jacques Landry1,2,3 & Josée N. Lavoie1,2,3

Received: 16 January 2017 /Revised: 13 February 2017 /Accepted: 14 February 2017 /Published online: 8 March 2017# Cell Stress Society International 2017

Abstract The small heat shock protein HSPB8 and its co-chaperone BAG3 are proposed to regulate cytoskeletalproteostasis in response to mechanical signaling in musclecells. Here, we show that in dividing cells, the HSPB8-BAG3 complex is instrumental to the accurate disassemblyof the actin-based contractile ring during cytokinesis, a pro-cess required to allow abscission of daughter cells. Silencingof HSPB8 markedly decreased the mitotic levels of BAG3 inHeLa cells, supporting its crucial role in BAG3 mitotic func-tions. Cells depleted of HSPB8 were delayed in cytokinesis,remained connected via a disorganized intercellular bridge,and exhibited increased incidence of nuclear abnormalitiesthat result from failed cytokinesis (i.e., bi- and multi-nucle-ation). Such phenotypes were associated with abnormal accu-mulation of F-actin at the intercellular bridge of daughter cellsat telophase. Remarkably, the actin sequestering druglatrunculin A, like the inhibitor of branched actin polymeriza-tion CK666, normalized F-actin during cytokinesis and re-stored proper cell division in HSPB8-depleted cells, implicat-ing deregulated actin dynamics as a cause of abscission fail-ure. Moreover, this HSPB8-dependent phenotype could becorrected by rapamycin, an autophagy-promoting drug,

whereas it was mimicked by drugs impairing lysosomal func-tion. Together, the results further support a role for theHSPB8-BAG3 chaperone complex in quality control ofactin-based structure dynamics that are put under high tension,notably during cell cytokinesis. They expand a so-far under-appreciated connection between selective autophagy and cel-lular morphodynamics that guide cell division.

Keywords Cytokinesis . BAG3 .HSPB8 .Actin . Autophagy

Introduction

Fine-tuned protein quality control (PQC) systems are governedby molecular chaperones of the heat shock protein (HSP) fam-ily. Chaperones of the small HSP family (HSPB) form aneclectic family of proteins, which differ in their expressionprofiles and biochemical properties (Bakthisaran et al. 2015).Nonetheless, they are proposed to act mainly as ATPase-independent holdase or unfoldase by virtue of their dynamicquaternary structure, to segregate damaged proteins and pre-vent their irreversible aggregation (Finka et al. 2016; Haslbeckand Vierling 2015). In addition to their cytoprotective functionunder proteotoxic stress conditions, they appear to be instru-mental to the normal functioning of complex proteinous struc-tures of the cytoskeleton during biological processes relying onacute cellular remodeling (Guilbert et al. 2015). For instance, aphosphorylation-regulated function of HSPB1 has been report-ed, which may regulate actin polymerization and cancer cellmigration (During et al. 2007; Kostenko and Moens 2009;Lavoie et al. 1993). Furthermore, HSPB8 has been involvedin the recognition of damaged filamin, an actin-binding pro-tein, during muscle cell contraction and its segregation fordegradation by selective autophagy (Ulbricht et al. 2013).The later mechanism is proposed to maintain muscle fiber

Electronic supplementary material The online version of this article(doi:10.1007/s12192-017-0780-2) contains supplementary material,which is available to authorized users.

* Josée N. Lavoiejosee.lavoie@crchudequebec.ulaval.ca

1 Centre de recherche sur le cancer de l Université Laval,Québec, Canada

2 Oncology, Centre de recherche du CHU deQuébec-Université Laval,Québec G1R 3S3, Canada

3 Département de Biologie Moléculaire, Biochimie Médicale etPathologie Université Laval, Québec G1V OA6, Canada

Cell Stress and Chaperones (2017) 22:553–567DOI 10.1007/s12192-017-0780-2

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integrity by promoting clearance of actin-binding proteins un-dergoing partial misfolding in response to mechanical strain.Expectedly, several HSPB chaperones are up-regulated in can-cer cells where they could contribute to the fitness of actin-based structures that support the tumor phenotype. Thus, byenabling targeted protein storage, recycling, or degradation,HSPB proteins would play important roles in cytoskeletalPQC, to maintain the integrity of cytoskeletal structures duringstress, as well as to facilitate cellular morphodynamics thatguide cell division and differentiation. In line with this concept,we have recently uncovered a novel role for HSPB8 in mitoticcell remodeling (Fuchs et al. 2015).

In spite of their known implications in human diseases,such as cancer, the mechanisms underlying the contributionof HSPB proteins to cytoskeletal dynamics/proteostasis arepoorly understood. In that regard, the co-chaperone and scaf-fold protein BCL2-associated athanogene 3 (BAG3) is ofparticular interest. BAG3 can associate with several HSPBproteins but show a preferred association with and regulatethe stability of HSPB8 (Carra et al. 2008; Fuchs et al. 2010;Taipale et al. 2014). In the context of cancer cells, BAG3 isviewed as a molecular scaffold owing to its interactions withsignaling proteins and several regulators of actin dynamicsand its implication in key biological processes, including ap-optosis, development, cell motility, and cell division (Behl2016; Rosati et al. 2011). Yet, the significance of distinctchaperone partners for BAG3 functions in intracellular signal-ing has remained unexplored. BAG3 also acts as a co-chaperone for HSC70/HSP70 chaperone system and modu-lates its function in proteasomal degradation, aggrephagy, andsignaling (Chen et al. 2013; Colvin et al. 2014; Gamerdingeret al. 2009; Gamerdinger et al. 2011; Minoia et al. 2014).Accumulating evidence suggests that BAG3 serves to bridgeimportant components of the chaperone network (Rauch et al.2017). Nonetheless, BAG3 may function without recruitingHSPB8 in aggrephagy (Minoia et al. 2014). In contrast, itsinteraction with HSPB8 seems to be instrumental in typifyingBAG3 functions in cytoskeletal remodeling. This is supportedby our recent findings that BAG3 regulates remodeling of themitotic actin-based structures that guide spindle orientation ina manner that requires binding to HSPB8, but not to HSC70/HSP70 (Fuchs et al. 2015). Because the same mitotic pheno-type can be recapitulated by depletion of HSPB8, BAG3, orthe autophagic receptor p62/SQSTM1, which shows en-hancedmitotic association with BAG3, we have proposed thatthey act within a so-far unrecognized cytoskeletal PQC mech-anism during mitosis. Evidence suggests that targeted cyto-skeletal protein degradation can provide a mechanism to limitsignaling pathways in time and space during mitotic cell re-modeling (Belaid et al. 2013; Werner et al. 2013). Little isknown, however, on the mechanism of quality control autoph-agy that provides Bbuilt in^ selectivity for components of cy-toskeletal remodeling pathways. Whether the HSPB8-BAG3

chaperone complex may contribute for such mechanism dur-ing mitosis remains to be demonstrated.

Here, we investigate the impact of HSPB8 in cytoskeletalPQC during cytokinesis, a process that is orchestrated byhighly organized actin-based structures that are put under hightensile forces. We show that HSPB8 regulates BAG3 levelsduring mitosis and the accurate dynamics of the cytokineticactin ring, via a mechanism that may involve effects onbranched actin nucleation and autophagy signaling.Importantly, strong evidence is provided that first linkHSPB8 function in cytoskeletal PQC to its modulation ofmitotic cell division in cancer cells.

Material and methods

Cell culture, synchronization, drug treatments, and siRNAexperiments

Parental HeLa cells, HeLa-GFP-H2B cells (gift fromLaurence Pelletier), and HeLa-RFP-H2B cells (gift fromSabine Elowe) (Klebig et al. 2009) were maintained in α-minimal essential medium supplemented with 10% fetal bo-vine serum. All cell lines were grown in a humidified atmo-sphere with 5% CO2 at 37 °C. Cells were synchronized by adouble thymidine block and were released for 8 to 10 h infresh medium, as described previously (Fuchs et al. 2015).For knockdown experiments, HeLa cells were transfectedwith 25 to 50 nM siRNA duplexes in calcium-phosphatetransfection buffer (125 mM MgCl2, 140 mM NaCl, 25 mMHEPES, 0.75 mM Na2HPO4) overnight. Analyses were per-formed 48 to 88 h later byWestern blot, immunofluorescence,or live cell imaging. For cell cycle analyses of the impact ofHSPB8-specific siRNAs on BAG3 protein levels, HeLa cellswere synchronized in G2/M or M-phase by a 16-h treatmentwith the selective CDK1 inhibitor (RO3306, 8 μM) or withnocodazole (400 ng/ml), respectively, and mitotic cells wererecovered by a mitotic shake-off, as described before (Fuchset al. 2015). Cells were lysed by 3 cycles of freezing/thawingin 4 volumes of lysis buffer (20 mM TRIS-HCl pH 7.6,150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% IGEPAL, 1 mMNaVO4, 10 mM NaF, 40 mM β-glycerophosphate, 1XComplete [Roche], 1 mM DTT), centrifuged at 15,000g for15 min, and the supernatants were processed for Western blotanalyses. The following drugs were added to cells that havebeen synchronized in mitosis with a double thymidine block,during the last hour of the second release period before cellfixation as followed: latrunculin A, 20 nM; CK666, 40 μM;rapamycin, 150 nM; E-64D and pepstatin A, 10 μg/ml;bafilomycin A1, 200 nM. For multi-nucleation assays, unsyn-chronized HeLa-GFP-H2B cells were grown in the presenceof 1 nM latrunculin A for 48 h before cell fixation. The siRNAduplexes were based on human sequences and were purchased

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from Qiagen (HPP grade siRNA) or Thermo Fisher Scientific(standard A4 grade). Sequences of the sense strands are asfollows: siBAG3 #1: CGAAGAGTATTTGACCAAA-3′;

siBAG3 #2: 5′-GCAAAGAGGTGGATTCTAA-3′;siHSPB8 #1: 5′-CAGATAGGCTAGTGGTATT-3′;siHSPB8 #2: 5′-GCAGTGAATGCAAGGGTTATT-3′;siHSPB8 #3: 5′-CAGAGGAGTTGATGGTGAATT-3′.si AllStars Negative Control, target sequence: 5′-CAGG

GTATCGACGATTACAAA-3′.

Transfection, infection, adenovirus, and vectors

HeLa cells were seeded on fibronectin-coated dishes and weresynchronized by the double thymidine block method. Duringthe second release period, cells were transfected with GFP-Arp3 (human Arp3 in pEGFP-N1 vector, gift fromDr John A.Cooper, ST Louis, USA) (Welch et al. 1997) usingLipofectamine 2000 at the ratio Lipo/DNA of 2:1 and follow-ing the manufacturer’s instructions (Invitrogen) for a 10-hperiod before cell fixation. To follow the dynamics of actin,cells were seeded on fibronectin-coated glass dishes (MatTekCorp.) and synchronized by the double thymidine block meth-od. Adenofection was performed during the first thymidineblock using Ad-LifeAct-TagGFP2 (60121, IBIDI) at a multi-plicity of infection (MOI) of 1 plaque-forming units per cell(pfu/cell), BacMam 2.0 reagents at 4 pfu/cell in α-MEM-mi-nus, and siRNAs in calcium-phosphate transfection buffer,using the method described in Fuchs et al. (2016). Sixteenhours after adenofection, cells were washed 3 times withHEPES (6.7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES,pH 7.3) and were released in fresh medium for 8 h beforeadding back 2 mM thymidine.

Antibodies and chemicals

The following antibodies were used forWestern blot analyses:rabbit anti-BAG3 LP11 was raised against full length recom-binant human BAG3 fused with glutathione S transferase(LP11) (Fuchs et al. 2015), rabbit anti-HSPB8 against a C-terminal peptide (NELPQDSQEVTCT) (Carra et al. 2008);anti-Vinculin (V9131) was from Sigma-Aldrich; anti-Arp3(ab49671) was from Abcam; anti-Calreticulin (#612136)was from BD Biosciences; and anti-GAPDH Clone 6C5(Fitzgerald, #10R-G109a) was from Millipore. Secondary an-tibodies (anti-mouse-HRP 115-035-146 and anti-rabbit-HRP111-055-003) were from Jackson ImmunoResearch. The fol-lowing antibodies were used for immunofluorescence: anti-Aurora B (ab2254) was from Abcam; Alexa-Fluor® 488Phalloidin (A12379) and Texas Red®-X Phalloidin (T-7471)were fromMolecular Probes/Thermo Fisher. Goat-anti-rabbit-594 (A11037) was from Molecular Probes. HoechstBisbenzimide H 33342 (B2261), thymidine (T9250), fibro-nectin (F1141-5 mg), RO-3306 (SML0569), E-64D

(E8640), pepstatin A (P5318), bafilomycin A1 (B1793), andCK666 (SML0006) were from Sigma-Aldrich; latrunculin A(428021-100UG) was from Calbiochem.

Immunofluorescence and live-cell imaging

Cells were gently washed once with LUFTIG (0.2 M sucrose,35 mMPipes, pH 7.4, 5 mMEGTA, 5 mMMgSO4) and fixedwith 3.7% formaldehyde in LUFTIG or 4% PFA in PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mMKH2PO4) for 20 min at room temperature. DNAwas stainedwith cell permeable Hoechst (150 ng/ml). Specimens wereprocessed for immunofluorescence as described (Lavoieet al. 2000) and were post-fixed with 3.7% formaldehyde inPBS for 20 min at room temperature. Phenotypes were mon-itored routinely by at least two independent investigators byvisual inspection of fixed specimens and were scored in amanner blind to treatment, using an AxioObserver Z1 systemusing a 60 × 1.25NA objective and a charged-coupled device(CCD) camera AxiocamMRm controlled by the Zen software(Carl Zeiss). Confocal microscopy in live cells and fixed sam-ples was performed with a PerkinElmer Life ScienceUltraview Spinning Disk Confocal microscope, equippedwith a 40 × 0.75NA objective, an EMCCD cooled charge-coupled camera at −50 °C (Hamamatsu Photonics K.K), anddriven by the Volocity software version 6.01. The system wasequipped with a humidified/5% CO2/thermoregulated cham-ber. Bi- and multi-nucleation was scored as the number ofcells presenting 2 or >2 nuclei per cell; single cells were de-lineated by staining of the cortex with F-actin. To quantifyabnormal F-actin accumulation at the intercellular bridge ofdaughter cells, we scored the number of daughter cells con-nected by a bridge labeled by Aurora B staining that hadcompletely de-condensed DNA (late telophase) and abnormalF-actin structures at the bridge.

Long-term live-cell imaging was performed using a NikonTE-2000 inverted microscope equipped with CO2/thermo-regulated chamber with a 40 × 0.6 NA objective. Images werecaptured as 16-bit TIFF files with a photometrix Collsnap FXcooled CCD camera (−30 °C) (Rooper Scientific, Tuscon AZ)driven by the Metaview software version 4.5 (UniversalImaging Corp., Downington, PA). Images were acquired at90 s intervals for a 48-h period or at 10 min intervals for a72-h period, starting at 40 h after siRNAs transfection.Phenotypes associated with cytokinesis were estimated by vi-sual inspection of time sequences. Spreading of daughter cellsand disappearance of the intercellular bridge were evaluatedby monitoring the time spent between closure of the actin ringand cell spreading and/or disappearance of the dense midbodyring, respectively. Defects in daughter cell spreading wereconsidered as follows: (1) prolonged cortex blebbing, (2) un-coordinated spreading of daughter cells, and (3) no spreading.To quantify the number of cells that re-entered mitosis

HSPB8 regulates F-actin dynamics during cytokinesis 555

316

synchronously, we determined that cells are derived from thesame mother cell by visual inspection of time sequences; cellswere considered synchronized if they entered mitosis at thesame time point or separated by less than 2 time points. Actinring (AR) thickness and width were expressed as the meanintensities from F-actin staining and were evaluated by delin-eating AR manually on confocal slices determined as the cen-ter of the cell, using the Volocity software version 6.0(Quorum Technologies); cells were considered only afterAR closure and DNA de-condensation. To quantify GFP-Arp3 recruitment, AR and daughter cells were delineatedmanually using F-actin staining as the reference for cell shapeusing the same software. The mean fluorescence intensities ofGFP-Arp3 at AR and in the cytoplasm were measured fromconfocal image stacks acquired at 0.5 μm z-steps andexpressed as a ratio of AR over cytoplasm. The Volocity soft-ware version 6.0 (Quorum Technologies) and ImageJ 1.48v(National Institute of Health) were used for processing entireimages before cropping to emphasize the main point of theimage. Processing was limited to background subtraction andbrightness/contrast adjustment.

Western blotting

Cells were lysed in SDS sample buffer (62.5 mM Tris-HCl,pH 6.8, 2.3% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol,0.05% bromphenol blue, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluo-ride); equal amounts of protein from whole cell lysates wereseparated by SDS-PAGE on 10% acrylamide gels and trans-ferred onto nitrocellulose membranes. Immunoblotting wasperformed as described (Champagne et al. 2004). Protein con-centrations were determined with DC protein assay reagent,and densitometric analyses were performed from FluorSMAX MultiImager-captured images using the QuantityOnesoftware version 4.5.0 (Bio-Rad Laboratories).

Statistical analyses

For experiments examining (a) the time spent for daughter cellsspreading or (b) AR thickness/width, the mean values from in-dividual cells from at least three independent experiments wereanalyzed using the Mann-Whitney test, which is a non-parametric test that compares two unpaired groups of ordinalor numerical variables. For experiments examining the propor-tions of cells with (a) cell spreading defects, (b) ICB defects, (c)persistent connections, (d) synchronized daughter cell mitosis,(e) nuclear abnormalities, and (f) abnormal F-actin accumulationat the ICB, data from individual experiments were analyzedusing the Fisher’s exact test, which is used for small sample sizeswith nominal/categorical variables. Statistical calculations wereperformed using Prism 6.0 (GraphPad Software) statistical soft-ware. p values <0.05 considered significant (*p < 0.05;**p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001).

Results

Silencing of HSPB8 or BAG3 perturbs abscissionof daughter cells

We sought to characterize the function of HSPB8-BAG3chaperone complex in the extreme cell morphodynamicchanges that guide cytokinesis. To that end, unsynchro-nized HeLa-GFP-H2B were treated with control small in-terfering RNA (siRNA), or HSPB8- or BAG3-specificsiRNAs that achieved >75% depletion of the protein inthese cells, and were imaged for a period of 72 h startingat 40 h after transfection of siRNAs (Fig. 1a). In agree-ment with our previous findings, cells depleted of HSPB8or BAG3 eventually progressed through anaphase, butexhibited higher incidence of defects during cytokinesis(Fuchs et al. 2015). Such defects were associated with twomajor phenotypes: delayed cell spreading at telophase anddelayed abscission of daughter cells. HSPB8-depletedcells showed a ∼1.3-fold increase in the mean time re-quired to achieve spreading (35 min; siHSPB8) relativeto control cells (26 min; siCtl) (Fig. 1b, c), frequentlyassociated with prolonged cortex blebbing (Fig. 1b,siBAG3 490′; supplemental movies S1–S3). This pheno-type was observed in 24 to 30% of HSPB8- or BAG3-depleted cells, respectively, as compared to 12% of thecontrol cell population (Fig. 1c). The data are consistentwith previous work involving BAG3 in modulation of celladhesion, a function that may engage its association withHSPB8 at mitotic exit (Iwasaki et al. 2007; Iwasaki et al.2010; Kassis et al. 2006).

Most remarkably, depletion of HSPB8 or BAG3 wasassociated with increased occurrence of abnormally thickand long intercellular bridges (ICB) connecting nascentdaughter cells, which persisted for longer periods of time(Fig. 1d, arrowheads; Fig. 1e; supplemental movies S4–S6).Indeed, BAG3-depleted cells showed a ∼1.7-fold increasein the mean time required for ICB disappearance relative tocontrol cells (Fig. 1e). Moreover, a larger proportion ofHSPB8-depleted cells remained connected by an ICB com-prising a typical midbody ring (Fig. 2a, red arrowhead andinset) and even re-entered mitosis synchronously (Fig. 2b,c). These phenotypes are typical of cells that fail abscissionand were also observed in BAG3-depleted cells (not shown)(Belaid et al. 2013; Schiel et al. 2012). In further support, asignificant proportion of cells transfected with two distinctHSPB8-specific siRNA sequences exhibited bi-nucleation,a defect that arises upon cytokinetic failure and collapsingback into a single bi-nucleated cell, which may be due toimpairment of abscission (Fig. 2d, e). Together, these ob-servations suggest that HSPB8, in complex with BAG3,facilitates some late steps during cytokinesis that controlthe abscission of daughter cells.

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Fig. 1 Depletion of HSPB8 or BAG3 perturbs daughter cells spreadingand ICB disappearance during cytokinesis. a Representative Western blotof HeLa-GFP-H2B cells lysed in SDS-sample buffer, showing theefficiency of HSPB8 and BAG3 depletion after transfection withHSPB8- and BAG3-specific siRNAs. Depletion was estimated at >75%by loading increasing amounts of control extracts (siCtl). Western blotanalysis was performed with anti-HSPB8 and anti-BAG3 antibodies;GAPDH: loading control. b Unsynchronized HeLa-GFP-H2B cellswere depleted of HSPB8 or BAG3 using the indicated siRNAs andwere imaged starting 40 h post-transfection for 72 h at 10-min intervals.First row of panels: representative time sequence of a control cellshowing normal daughter cells spreading; second and third rows ofpanels: representative time sequences of HSPB8- or BAG3-depletedcells showing delayed spreading. Scale bar, 10 μm. c On the left: graphshowing the average time of daughter cells spreading for control (siCtl)versus HSPB8-depleted cells (siHSPB8). Data are the means ± SE fromthree independent experiments; the Mann-Whitney’s test was performed

relative to control ****p < 0.0001. On the right: graph depicting thepercentage of cells with abnormal daughter cells spreading in HSPB8-(siB8) or BAG3-depleted cells (siBAG3) compared to control cells(siCtl), means ± SE from two or three independent experiments.*p < 0.05 compares siHSPB8 #3 to siCtl by the Fischer exact test. dRepresentative time-sequences of HeLa-GFP-H2B cells transfectedwith the indicated siRNAs and imaged for 72 h starting at 40 h aftertransfection. Enlarged views of the boxed regions emphasize thestructure of the ICB, which is abnormally long and/or thick in cellsdepleted of HSPB8 or BAG3, as designated by the white and redarrows, respectively; time sequences are in min; bars, 10 μm. e Graphsdepicting the percentages of cells with abnormal ICB (on the left) or thetime spent between early telophase and disappearance of the ICB (on theright); the data are the means ± SE of two to three independentexperiments as indicated. **p < 0.01 and ****p < 0.0001 comparesiHSPB8 to siCtl by the Fisher exact test

HSPB8 regulates F-actin dynamics during cytokinesis 557

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Knockdown of HSPB8 causes abnormal F-actinaccumulation at the intercellular bridge of daughter cells

Having shown that silencing of either BAG3 or HSPB8 causessimilar cytokinetic defects, and considering that HSPB8 levelsdepend on BAG3 (Fig. 1a) (Carra et al. 2008), subsequentanalyses were performed in HSPB8-depleted cells. Besides,we found that depletion of HSPB8 reduced BAG3 levels by∼50 to 75% in soluble fractions recovered from cells arrested atthe G2/M border and at the M-phase, respectively, withoutaffecting BAG3 levels seen in the insoluble fractions (Fig. 2f,G2/M andM). In mitotic cells, BAG3was mainly detected as a

supershifted, hyperphophorylated protein band on SDS-PAGEas previously shown (Fig. 2f, red arrow) (Fuchs et al. 2015).This was contrasting with themodest reduction of BAG3 levelsseen upon silencing of HSPB8 in asynchronous cells (~30%),as shown before (Fig. 2f, AS) (Carra et al. 2008). Together withour previous findings that HSPB8 facilitates BAG3 phosphor-ylation and localization at mitotic entry (Fuchs et al. 2015),these results suggest that cell mitosis offers a unique model touncover the HSPB8-dependent functions of BAG3.

Based on our previous work linking BAG3-HSPB8 to theremodeling of actin-based structures at mitotic entry (Fuchset al. 2015), we then sought to determine the impact of

Fig. 2 Silencing of HSPB8 interferes with cytokinetic abscission andmarkedly decreases the mitotic levels of BAG3. a UnsynchronizedHeLa-GFP-H2B cells transfected with various HSPB8-specific siRNAsequences were imaged for 72 h at 10-min intervals. The redarrowhead designates a persistent ICB connecting sister cellsthat comprises a dense midbody (emphasized in the enlarged view); bar10 μm. The graph shows the percentage of cells remaining connectedby an ICB; means ± SE. *p < 0.05 compares siHSPB8 #3 to siCtl by theFisher exact test. b Time sequences showing sister cells entering mitosissynchronously (red arrowheads); bar 20 μm; P prophase,M metaphase,T telophase. c Graph depicting the percentages of cells undergoingsynchronous mitosis; means ± SE. ***p < 0.001 compares siHSPB8 #3to siCtl by the Fisher exact test. d Representative Western blot of HeLa-GFP-H2B cells that have been lysed in SDS-sample buffer extracts,

showing the efficiency of HSPB8 depletion, 88 h after transfection ofthe indicated siRNA sequences; calreticulin: loading control. bConfocal image of HeLa-GFP-H2B cells transfected with HSPB8-specific siRNAs, showing multi-nucleation; F-actin was stained withTexas-Red-Phalloidin; bar 30 μm. The graph shows the incidence ofbi- and multi-nucleation; means ± SE from three independentexperiments. ****p < 0.0001 compares siHSPB8 #2 to siCtl, and**p < 0.01 compares siHSPB8 #3 to siCtl by the Fisher exact test. fRepresentative Western blot of HeLa cell extracts isolated fromunsynchronized cells (As), or cells that have been synchronized at theG2/M border (G2/M), or M-phase (M), after transfection with HSPB8-specific siRNA or control siRNA (siCtl) for 88 h, showing the levels ofBAG3, HSPB8, and GAPDH (loading control). Cells have been lysed by3 cycles of freezing/thawing in 4 volumes of 0.1% IGEPAL lysis buffer

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HSPB8 on actin dynamics during cytokinesis. In animalcells, cytokinesis begins with the assembly and contractionof an actomyosin ring that leads to the formation of an in-tercellular bridge (von Dassow and Bement 2005). Finalcleavage and fusion of this intercellular bridge require thin-ning of the ICB (secondary ingression) that critically relieson actin depolymerization within the ICB (Schiel et al.2013; Schiel et al. 2012). We hypothesized that the chaper-one complex might assist in accurate assembly and/or dis-assembly of actin-based cytokinetic structures.

To test this idea, we took advantage of LifeAct-GFP—aprobe that binds to F-actin (Riedl et al. 2008), to visualizethe dynamics of actin at the actomyosin ring by spinningconfocal microscopy. HeLa-RFP-H2B cells wereadenofected with recombinant adenovirus driving the ex-pression of LifeAct-GFP together with control or HSPB8-specific siRNAs, and then synchronized by a double thy-midine block using a protocol developed for knockdown-rescue experiments (Fig. 3a) (Fuchs et al. 2016). Live-cellimaging revealed that assembly and constriction of the ac-tomyosin ring were not significantly perturbed by depletionof HSPB8 (Fig. 3c). Nonetheless, in HSPB8-depleted cells,the AR appeared abnormally enriched in F-actin. This wasrevealed by an increase of AR thickness at telophase(Fig. 3c, supplemental movies S7–S8). Remarkably, higherproportions of HSPB8-depleted cells (∼43 ± 2.5%;43 ± 4.2%; 58 ± 2.5%) displayed abnormal F-actin accu-mulation at the ICB marked by Aurora B (Murata-Horiet al. 2002)—a mitotic kinase that relocates to the ICB attelophase, as compared to cells transfected with controlsiRNAs (∼24 ± 1.3%). Such disorganized actin structurespersisted after cell spreading and DNA de-condensationand were observed using three different HSPB8-specificsiRNA sequences in depletion experiments (Fig. 3b, c).The data suggest that HSPB8-BAG3 chaperone complexfacilitates accurate AR dynamics to enable timely abscis-sion of daughter cells.

Down-modulation of actin dynamics can normalizeF-actin accumulation at the intercellular bridgeand correct cytokinetic defects caused by depletionof HSPB8

Abnormal accumulation of F-actin at the ICB suggestedthat HSPB8 depletion could perturb actin dynamics, i.e.,polymerization-depolymerization. To obtain evidence fora causal relationship, we used the actin drug latrunculin A(LatA), which inhibits actin dynamics by sequestering G-actin, hence limiting the actin pool available for F-actinassembly (Coue et al. 1987; Morton et al. 2000). Cells weretreated with a low concentration (20 nM) during the lasthour of the release period before cell fixation (Fig. 4a).Under these conditions, the organization of F-actin in

control cells was not noticeably affected. Significantly,such treatment inhibited F-actin accumulation at the ICBin HSPB8-depleted cells, bringing it in line with cellstransfected with control siRNAs (Fig. 4b, c). The resultssuggest that HSPB8-depleted cells have deregulated actinpolymerization at the ICB that can be normalized by limit-ing the pool of G-actin.

We then took advantage of the hypersensibility ofHSPB8-depleted cells to LatA to examine the cause-effectrelationship between deregulated actin dynamics and cyto-kinetic failure, by measuring the occurrence of bi- andmulti-nucleation. We determined that incubation of HeLa-GFP-H2B cells in the presence of 1 nM LatA for a 48-hperiod of time modestly affected cell division and in-creased the incidence of nuclear abnormalities by ∼1.8-fold(Fig. 4d, siCtl LatA). However, this treatment reduced theincidence of bi- and multi-nucleation in HSPB8-depletedcells to a level comparable to the one observed in cellstransfected with control siRNAs (Fg. 4d, siB8 LatA).Thus, the data suggest that perturbation of actin dynamicsupon depletion of HSPB8 contributes to its impact on celldivision.

Inhibition of Arp2/3 complex can normalize F-actinat the ICB in HSPB8-depleted cells

Accurate assembly and disassembly of the cortical AR duringcytokinesis are proposed to rely on the combined action of twoF-actin nucleators, the formin diaphanous (Dia) and theArp2/3 complex, and require dynamic actin turnover at theequatorial AR (Bovellan et al. 2014; Murthy and Wadsworth2005). We noted that the BAG3 interactome from HeLa cellscontains proteins that could link BAG3 to Arp2/3 complex,notably ArpC2, a component of Arp2/3 complex, andELMO1, which provides a connection with upstream regula-tors (Chen et al. 2013). To explore a potential relationship withthe Arp2/3 complex, we first analyzed its subcellular distribu-tion during cytokinesis. Small amounts of a fluorescent probe,GFP-Arp3, were expressed in HeLa cells for a short period oftime after silencing HSPB8 to avoid perturbing actin dynam-ics. The subcellular distribution of GFP-Arp3was analyzed byconfocal microscopy after cell fixation (Fig. 5a, experimentalscheme; Fig. 5b). Cells transfected with control siRNAs un-dergoing cytokinesis exhibited a rather diffuse localization ofArp3-GFPwith no significant enrichment at the ICB (Fig. 5c).This was revealed by quantification of the GFP fluorescenceintensity ratio of ICB over cytoplasm (Fig. 5, ∼0.89). Inmarked contrast, in cells transfected with HSPB8-specificsiRNAs, GFP-Arp3 accumulated at the ICB and co-distributed with aberrant F-actin structures, as revealed by a∼1.6-fold increase in the ICB/cytoplasmic GFP fluorescenceintensity ratio (Fig. 5c, arrowhead).

HSPB8 regulates F-actin dynamics during cytokinesis 559

320

We then sought to acutely perturb Arp2/3 activity ascells entered cytokinesis and monitor the impact on ICB-associated aberrant F-actin. To that end, HSPB8-depletedcells that have been synchronized in late mitosis were in-cubated in the presence of the selective Arp2/3 inhibitorCK666 (Nolen et al. 2009) or with the vehicle only, duringthe last hour of the release period from the thymidine-block. Using this protocol, inhibition of the Arp2/3

complex did not impact cytokinesis in cells treated withcontrol siRNAs, consistent with recent findings (Bovellanet al. 2014; Rosa et al. 2015). Nonetheless, such treatmentinhibited the occurrence of abnormal F-actin at the ICB inHSPB8-depleted cells (Fig. 5d). These data suggest that bylimiting Arp2/3-mediated actin polymerization, an accuratebalance between actin assembly and turnover at the ICBcan be restored in HSPB8-depleted cells.

Fig. 3 Silencing of HSPB8 causes abnormal F-actin accumulation at theICB. a Schematic of the protocol used for adenofection of HeLa-RFP-H2B cells with Ad-LifeAct-GFP together with HSPB8-specific siRNAs.b Western blot of HeLa-RFP-H2B cell extracts prepared in SDS-samplebuffer showing the efficiency of HSPB8 depletion 48 h after transfectionof the indicated HSPB8-specific siRNAs; depletion was estimated at>75% by loading increasing amounts of control extracts (1/4, ½, 1,siCtl); vinculin: loading control. c Live-cell imaging was performed fora 2-h period at 5-min intervals by spinning disk confocal microscopy.Representative time sequences show F-actin organization at the actinring (pointed by white arrowheads) in cells transfected with controlsiRNAs (siCtl) compared to cells transfected with HSPB8-specficsiRNAs; bar, 10 μm. Quantification of the actin ring thickness over

width; means ± SE from three independent experiments. The Mann-Whitney’s test was performed relative to siCtl; ****p < 0.0001. dConfocal images of HeLa-RFP-H2B cells that have been synchronizedin mitosis after transfection with HSPB8-specific siRNAs, showingabnormal F-actin accumulation stained by Alexa-488-phalloidin at theICB (green) marked by immunostaining of Aurora B (red). Whitearrowheads designate enlarged viewed that emphasize actinorganization at the bridge of daughter cells; bar, 10 μm. The graphshows the percentages of cells with abnormal F-actin accumulation atthe ICB in late cytokinesis, means ± SE from three independentexperiments. ****p < 0.0001 compares HSPB8-specific siRNAs tosiCtl by the Fischer exact test

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Drugs that affect lysosomal function recapitulatethe HSPB8-dependent phenotype, whereas inductionof autophagy signaling can restore the F-actin defectscaused by depletion of HSPB8

A specialized role for a multichaperone complex organizedby BAG3 has been proposed in the clearance of damaged

proteins undergoing partial misfolding in response to me-chanical strain during skeletal muscle contraction (Arndtet al. 2010; Ulbricht et al. 2013). Given that the actin-based AR is also put under high tensile forces during cyto-kinesis, we hypothesized that HSPB8-BAG3 could be mo-bilized to facilitate the autophagic clearance of componentsof actin-based cytokinetic structures.

Fig. 4 Down-modulation of actin dynamics can rescue phenotypes causedby depletion of HSPB8. a Schematic of the protocol used to modulate actindynamic in HeLa-RFP-H2B cells synchronized in late mitosis that havebeen transfected with HSPB8-specific or control siRNAs. bRepresentativeconfocal images of fixed HSPB8-depleted HeLa-RFP-H2B cells, showingnormalized F-actin at the ICB (emphasized in enlarged views pointed bywhite arrowheads), after treatment with latrunculin A (LatA, 20 nM);immunostaining of Autora B (red) was performed to detect ICB and F-actin was stained with Alexa-488-phalloidin (green). Bar, 10 μm. c Thegraph depicts the percentages of cells with abnormal F-actin accumulation

at the ICB; means ± SE from four independent experiments.****p < 0.0001 compares siHSPB8 #3 treated with the vehicle (DMSO)to siCtl ± DMSO by the Fisher exact test; n.s.: non-significant comparessiHSPB8 #3 + LatA to siCtl ± LatA. d Unsynchronized HeLa-GFP-H2Bthat have been transfectedwithHSPB8-specific or control siRNAs (siB8 vssiCtl) were grown in the presence of 1 nM LatA for 48 h and thepercentages of nuclear abnormalities were scored; means ± SE from threeindependent experiments. ****p < 0.0001 compares siHSPB8 #2 treatedwith the vehicle (DMSO) to siCtl ± DMSO by the Fisher exact test; n.s.:non-significant difference between siHSPB8 #3 + LatA and siCtl ± LatA

HSPB8 regulates F-actin dynamics during cytokinesis 561

322

To explore this idea, we used two distinct experimentalapproaches. We first asked whether impairing lysosomal func-tion could interfere with AR dynamics. HeLa cells that havebeen synchronized in mitosis by a double thymidine blockwere incubated in the presence of drugs that are commonlyused to disrupt the autophagic flux; these include bafilomycin

A (BafA), which inhibits V-ATPases and blocksautophagosome-lysosome fusion, or pepstatin A and E64D,two inhibitors of lysosomal proteases (Klionsky et al. 2016).The drugs were added during the last hour of the release pe-riod before cell fixation, and cells in late cytokinesis weredetected by immunostaining of the ICB using anti-Aurora B

Fig. 5 Co-distribution of abnormal F-actin and Arp2/3, and restorationof F-actin organization at the ICB in HSPB8-depleted cells uponinhibition of Arp2/3 complex. a Schematic of the protocol used tovisualize Arp2/3 localization in Hela-RFP-H2B cells duringcytokinesis. b Western blot of HeLa-RFP-H2B cell extracts prepared inSDS-sample buffer showing the levels of transfected GFP-Arp3 andendogenous Arp3; calreticulin levels are shown as loading control. cRepresentative confocal images of HSPB8-depleted HeLa-RFP-H2Bcells, showing accumulation of GFP-Arp3 together with F-actin;staining of Aurora B (purple) was performed to localize ICBs that areemphasized in enlarged views designated by white arrowheads; bar,10 μm. Quantification of the fluorescence intensity ratios of GFP-Arp3is shown on the right graph, means ± SE of at least 98 cells from four

independent experiments. The Mann-Whitney’s test was performedrelative to control; ****p < 0.0001. d Confocal images showingsynchronized HeLa-RFP-H2B cells depleted of HSPB8 treated with thevehicle only (DMSO) or with a selective Arp 2/3 inhibitor (CK666,40 μM) 1 h before cell fixation. F-actin organization at the ICB(phalloidin staining: green, Aurora B staining: red) is emphasized in theenlarged views designated by white arrowheads; bar, 10 μm. Aschematic of the protocol used is shown below. The graph depicts thepercentages of cells with abnormal F-actin accumulation at the ICB;means ± SE from two or four independent experiments; n.s.: non-significant difference between siHSPB8 #3 + CK666 versussiCtl ± CK666 by the Fisher exact test

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323

antibody. Analysis of F-actin distribution revealed that a largerproportion of cells treated with the drugs accumulated aber-rant actin structures at the ICB that persist after cell spreadingand DNA de-condensation relative to cells treated with thevehicle only (∼1.8-fold increase; Fig. 6a). Thus, the data sug-gest that inhibition of vacuolar acidification or lysosomal en-zymes, like depletion of HSPB8, can recapitulate similar de-fects in actin dynamics at the ICB.

As a second approach, we submitted HSPB8-depletedcells that have been synchronized in late mitosis to a 1-hincubation period with rapamycin—a drug that inhibitsmTORC1 and stimulates autophagy signaling (Crespo andHall 2002). Remarkably, such treatment corrected F-actinaccumulation at the ICB and brought the proportions ofHSPB8-depleted cells bearing F-actin defects in line withcel ls transfected with control s iRNAs (Fig. 6b) .Collectively, our results suggest that defects in the dynam-ics of the actin-based AR caused by depletion of HSPB8may result, at least in part, from its function in the segrega-tion of cytoskeletal protein clients to selective autophagy.

Discussion

BAG3, in association with its chaperone partners, has beenlinked to the selection of damaged proteins for autophagic deg-radation during proteotoxic stress and muscle cell contraction(Minoia et al. 2014; Ulbricht et al. 2013).While BAG3 controlsthe stability of HSPB8, it may also function without HSPB8during stress, questioning the exact role of HSPB8 in the re-ported functions of BAG3 (our unpublished data) (Ganassiet al. 2016; Minoia et al. 2014). Recently, we uncovered anHSPB8-dependent function of BAG3 in a basic and fundamen-tal activity of cancer cells: mitosis, in the remodeling of actin-based structures that guide spindle dynamics (Fuchs et al.2015). In the current study, we present further evidence thatin response to mitotic signaling, HSPB8 and BAG3 act togeth-er to modulate actin dynamics during cytokinesis and facilitateabscission of daughter cells. Depletion of HSPB8 or BAG3caused levels of cytokinetic defects, notably multi-nucleation,that compare favorably with those reported in the literatureupon silencing of p62/SQSTM1 or key effectors of cytokinesis,using similar approaches based on analyses of hypomorphicphenotypes (5 to 25% of multi-nucleated cells on average)(Belaid et al. 2013; Ma and Chircop 2012; Schiel et al. 2012).This suggests that the HSPB8-BAG3 complex plays a signifi-cant role in the context of HeLa cells. Because drugs that se-lectively perturb actin polymerization can correct the multi-nucleation phenotype caused by depletion of HSPB8, whichalso depletes the mitotic forms of BAG3, we suggest that anHSPB8-BAG3 complex promotes accurate cell division main-ly by limiting actin polymerization and/or promoting actin turn-over. Whether such process may involve HSPB8-BAG3

function in autophagic sequestration is suggested by some re-sults presented here and is further discussed below.

Our finding that HSPB8 maintains BAG3 levels mainlyduring M-phase suggests that it may serve to stabilize partic-ular conformations of BAG3 induced by mitotic phosphory-lation. This could promote interactions between BAG3 andclient proteins that would connect the chaperone complex toactin-based structures, perhaps, via BAG3 Pro-rich motifs,which we have identified as crucial determinants of BAG3mitotic activity in previous work (Fuchs et al. 2015). BAG3was reported to interact with several proteins that could mod-ulate actin assembly or promote actin turnover, for instanceCapZ—an actin-capping protein that prevents filamentgrowth (Cooper and Schafer 2000; Hishiya et al. 2010;Pollard and Cooper 2009), or non muscle myosin II—themolecular motor that generates forces for constriction of theactin-based AR (Hong et al. 2016; Maupin and Pollard 1986;Schiel et al. 2013). It has been shown that actin at the AR ishighly dynamic and myosin II was involved in the dynamicturnover of actin during cytokinesis (Murthy and Wadsworth2005). Given that BAG3 can interact with a plethora of po-tential client proteins in HeLa cells (Chen et al. 2013), itsmitotic activity likely involves complex interactions with cli-ent proteins that could be regulated in time and space byHSPB8 and multisite phosphorylation of BAG3.

The results presented here provide important mechanisticclue by showing that silencing of HSPB8 causes accumulationof branched actin at the ICB. Assembly of branched actinnetworks is mediated by the actin nucleator complex Arp2/3that appeared to accumulate at the ICB of HSPB8-depletedcells (Goley and Welch 2006). Furthermore, inhibition ofArp2/3 using CK666 can prevent abnormal F-actin accumu-lation at the ICB in these cells, suggesting that HSPB8-BAG3act by limiting Arp2/3 activity. It has been proposed that aswitch from Arp2/3 to diaphanous-mediated actin nucleationis required to drive assembly of a rigid actin cortex in meta-phase cells (Rosa et al. 2015). Too much Arp2/3-mediatedactin polymerization may also lead to cytokinesis failure(Chircop 2014). Indeed, deregulation of the antagonism be-tween the Rho GTPases Rho and Rac, which is believed tocontrol AR dynamics during cytokinesis, leads to defectivecytokinesis and aberrant distribution of F-actin (D Avinoet al. 2004). We have shown that depletion of HSPB8 orBAG3 interferes with cell rounding and assembly of a me-chanically rigid actin cortex at mitotic entry, in addition to itsperturbing effect during cytokinesis (Fuchs et al. 2015). Basedon the overall data, it can be argued that failure to accuratelylimit the activity of Arp2/3 upon depletion of HSPB8 orBAG3 contributes to defects in mitotic cortical rigidity, spin-dle positioning, and cytokinesis, leading to impaired cell divi-sion and multi-nucleation.

Our findings also suggest that a phosphorylation-activatedfunction of HSPB8-BAG3 would promote actin turnover

HSPB8 regulates F-actin dynamics during cytokinesis 563

324

rather than enhancing actin polymerization, as it is the case forHSPB1 (During et al. 2007; Lavoie et al. 1995). Such functionwould be in line with the proposed role of HSPB8-BAG3within a pathway induced by mechanical cues for the clear-ance of cytoskeletal protein in the muscle sarcomere—theactin contractile unit of myofibrils (Ulbricht and Hohfeld2013). This pathway could be mobilized in dividing cells bymitotic signaling, via BAG3 phosphorylation, to facilitate ac-curate turnover of non-muscle contractile structures that aresubmitted to high tensile forces. It has been hypothesized thatthe organization of actin and myosin II in the cytokinetic ARis similar to that seen in muscle sarcomere; recent evidence

supports a sliding filament-based purse string contractionmechanism for AR constriction (Fenix et al. 2016; Pollardand Wu 2010). Although it has been established that the ARneeds to be disassembled to allow for the final abscission ofdaughter cells, the mechanisms remain poorly understood. Arole for selective autophagy has been proposed, in the localizedinactivation of RhoA involving the autophagic receptor p62/SQSTM1 (Belaid et al. 2014;Mizuno 2013; Piekny et al. 2005;Theriot 1997). In further support of a role for autophagy, weobserved here that treatment of cells with commonly used in-hibitory drugs recapitulated abnormal accumulation of F-actinat the ICB, similar to the phenotype caused by depletion of

Fig. 6 Inhibition of lysosomal function mimics, whereas autophagicsignaling can correct the cytokinetic defect in F-actin caused bydepletion of HSPB8. a, b Representative confocal images of HeLa-RFP-H2B cells unstransfected (a) or transfected with HSPB8-specificsiRNA (siB8, b) that have been synchronized in late mitosis and treatedwith the indicated compounds for a 1-h period before cell fixation;bafilomycin A1 (BafA, 200 nM), pepstatin A and E-64D (Pep + E64D,10 μg/mL), rapamycin (150 nM). F-actin was stained with phalloidin

(green), and immunostaining of Aurora B was performed to detect theICB (red). F-actin organization at the ICB is emphasized in the enlargedviews designated by white arrowheads; bars 10 μm. The percentages ofcells exhibiting abnormal F-actin accumulation at the ICB are shown onthe right graphs; means ± SE from three independent experiments.****p < 0.0001, compare BafA or Pepstatin + E64D to DMSO, orsiB8 + DMSO to siCtl by the Fisher exact test; n.s.: non-significantdifference by comparing siB8 + rapamycin to siCtl ± rapamycin

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325

HSPB8. Recently, we have shown that HSPB8, BAG3, andp62/SQSTM1 form a mitotic complex and that depletion ofany of the proteins resulted in the same phenotypes in earlymitosis (Fuchs et al. 2015). Here, we provide further evidencefor a connection between the activity of HSPB8-BAG3 duringcytokinesis and autophagy signaling by showing that treatmentof HSPB8-depleted cells with rapamycin could prevent F-actinaccumulation. This is in line with recent work suggesting thatBAG3 modulates the spatial activity of mTORC1—the targetof rapamycin and a key regulator of autophagy signaling, inaddition to its direct interaction with the selective autophagicmachinery via p62/SQSTM1 (Gamerdinger et al. 2011;Kathage et al. 2017). Overall, though the exact mechanismwhereby HSPB8 and BAG3 promote disassembly of cytoki-netic actin structures remains to be established, we think thatwe can reasonably speculate that the chaperone complex couldact in the autophagic sequestration of proteins that regulateassembly of actin networks, a function that would be modulat-ed by BAG3 mitotic phosphorylation.

In conclusion, the present study further supports a special-ized role for HSPB chaperones as members of a quality controlnetwork that would assist in the assembly and disassembly ofmacromolecular complexes controlling the dynamic architec-ture of actin during various mechanical processes, includingcell-shape changes that guide mitosis in cancer cells (Guilbertet al. 2015). Deciphering the mitotic interactome of BAG3 andthe molecular impact of BAG3 multisite phosphorylation iscrucial to our understanding of HSPB8-BAG3 function in actindynamics and is the object of our current work. Given thatHSPB8 and BAG3 are expressed in a wide variety of cancercell types, their activity in cell division may sustain tumor ex-pansion (Rosati et al. 2011). Thus, uncovering their mode ofaction is of great interest for the development of targeted ther-apeutic approaches to inhibit the HSPB8-dependent function ofBAG3 and further enhance mitotic stress in cancer cells.

Acknowledgements We are grateful to Sabine Elowe (CentreHospitalier de l’Université Laval, Quebec, Canada), John A. Cooper(Dept of Biochemistry and Molecular Biophysics WashingtonUniversity, St Louis, USA), and Laurence Pelletier (the Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Toronto, Canada) for providing criticalreagents. We thank Carl St-Pierre and Anne Loranger (Centre derecherche sur le cancer de l’Université Laval, HDQ) for their assistancein microscopic analyses. This work was supported by the CanadianInstitutes of Health Research Grant No 7088.

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