T,C.

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLiMLERİ ENSTİTÜSÜ

SIÇANDA SEREBRAL ve HEPATİK DOKULARIN OKSİDE GLUTATYON ve TOTAL GLUTATYON DÜZEYLERİNİN ÖLÇÜMÜ

ve OKSİDATİF STRES İNDÜKLEYEN AJANLARIN GLUTATYON SİSTEMİNE ETKİLERİ

fARMASÖTİK TOKSİKOLOJİ PROGRAM~

BİLİM UZMANLIĞI TEZİ

Ecz. AYLİN GÜRBAV.

ANKARA - 1993

T.C

JL\CETTEPE Ü:ıf.İVERStTESt

SA(~LIK 13lU:,ıLJ~Rİ ?NSTİTiiS[i

STÇ.\:~ı)_.\ SE~i:3RAL ve HE?ATİK D0:(ULA~I:i DK3İ:)S GLU'l'•\'I'YO>!

ve TOL\L GLU l'ı\TYON DÜZEYLERİ'.'/İ.\/ ÖLÇti>!'..:

ve

OKSİDATİF STRES İNJ/)K!,EYE.1./ ,\JA:JLAR[:1 ,~LITTATY0'-1 sisn:..,:İNS ETKİLERİ

FAW-1ASÖTİK TO~S [KOLOJİ PR.OCRı\~11

BİL 1>1 ll7,'.'L\N"LTĞ1 rr:z L

!•:cz.AYLİ:J GÜl{:"UY

A\/KARA - 1993

Prof,!lr.İııci (lzer

Jüri Üyesi

BİLİM UZMANLIĞI TEZ SA YUNMA JÜRİSİ

Jüri Bnşkanı ve

Tez IJanış:nnnı

Doç.Dr,Gi_in 1 ıl Şahin

J;iri i_iyesi.

t Ç i ~ D E K t L E R

CI},U;j Vf> Aı-Uı.Ç ....••..........••..•••..•••..•...••..••••••.•••••

I. GENEL BJLGİUJ~ ......................................•.......

1. 1. CLUTATYO~ ..........................................•......

l. L l. Bulunu.'::;u ve Biyolojik Örn:~Tlli ...............••.••••.••••••

I. l.Z. Yap1sı ve KL,nya,,cıl ÜJ:clliklcrL ve 13unlara İ1işkirı

Biyoloj~k Etkil0ri

l. 1. 3. GS'.I !lo1ıcostaz t .•........................................

l. L3.1. CS\I Sentezi vec Hetalıo] ü:n;:-ısı ......................... .

L l. J. l . L c;s'.I tın lliicresc1 Kul l cııı lITTJ •••••••••••••••••••••••••••

[.1.J.1.2. CSH'ın K;1tahohzma:;ı ............................... .

1.1.3.1.'3. GS'.i'1n T3:şın:11,ısı ..............................•.....

l.1.3. LI,. CSll Rerioks 1kın~üsii ............................ - . · .. ·

I.1.ı._ GSll'ın Dağılımı ........................................ .

I.1..5. GSH'ın j.1levleri ....................................... .

L l. ':ı. 1. GSH I ın Radikal lcrle j ndiiklerıcn liiicrcsel lbc:~c1rın

Dctoksifikasyonundaki Rolü ........................... .

1.1.5.1.1. Oksidatif Stres ve Serbest Radikal Reaksiyonları ... .

LL.'1.1.2. GSl! VC' Serbest Radi!caller .......................... .

I. L r.;. 1. 2. 1. GSil' ı rı Peroksit Rrıd ikal l eri Ur:- Re3.ksiyonları .... .

l.l.5.1.2.2. C'.;:i'ııı ~'.ariikal Toplayıcı Etkileri ................ .

I. 1. ')_ 1. 2. 3. Proteinlerin :;iilf idril Gru1ıL:ırının Korunması ..... .

1.1.5.1.2.4. es:~ ve rn~A Onarımı

I. L 5.1. 2. 5. İskcmi-Reperfii:-::yon Hasarında CSH ................. .

l.1.5.1.2.6. Kimyasal >beldelerle ve Radyasyonla indüklenen

Oksidan Hasar

1. l. 5 .1. 2. 6 .1. GSH ve esse Sent.cz Hızlan ve Hücresel GSI!' ın

Tiiket il nıesi

I.1.5.1.2.6.2. GS;I'ın Konjugasyon Reaksiyonları ile Tüketilmesi.

I.l.5.1.2.6.3. GSH'ın Biyoaktivasyon Yapıcı Etkisi ............ .

Sayfa No

l

3

3

J

4

' _}

6

g

9

9

11

11

l3

lh

14

17

1c,

20

21

21

22

23

23

2';

25

I.1.5.1.2.6.4. Radyasyonla İmlı.iklenen DNA Hasarı ve GSH......... 25

I. 1. 5. l. 2. 7. L ipid l'eroksitlasyon . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

1.1.5.1.2.8. Yaşlanma, Dcjeneratif Hastalıklar ve GSa •..••...•. 27

I. 1.6. Biyolojik Örneklerde GS'.{ ve GSSG'nin Ölçümü ve Glutatyon

Redoks Durumunun Saptan:ıEısı • . . • . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . 28

I. 1. 6. l. Biyolojik Orneklcrin Hazırlanması . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

I. l.6.2. GSH ve/veya GSSG'nin Tayin Yöntemleri . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

I.2. E Vitamini 32

I.2. ı. Kimyasal Yaµıs, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

1.2.2. E Vitaminin İşlevleri . .. ..•. .•. . .. .• . .. . .. .. . .. .. . . .. ... 33

I.2.3. E Vitamininin, Sc, C Vitamirıi ve GSH ile İlişkisi .. ... . . 34

1.3. Allopurinol . . . • . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3G

I.3.1. Kimyasal Yapısı ve Biyolojik Etkileri .. .. . . . . . .. .. .. .. . 36

I.3.1.1. Ksantin Oksi_daz ve Al lopurinollc İnhibisyon.... .• . .. . .. 36

1.4. r:ndosulfan ....................•.............. , . . . . . . . . . . . . 33

I.4. l. Kimyasal Yapısı ve Özellikleri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

I.4.1.1. Endosulfanın Metabolizması 39

I.4.1.2. Toksik Özellikleri ve Etki Mekanizması ............•... JY

I. 5. Sipro f 1 oksazin . • . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . /~O

l.5.1. Kimyasal Yapıs1. ve F_iziksel Özellikleri . .... . .. .. .•.. ... 40

I.5,2. Hiyoyararlanım ve Farmakokinetik Özellikleri ... . . . . .. .. . Lı2

I.5.3. CPR'nin Tok.sik Et.kileri ... .. . .. . .. . . .. ..... .... . . . . .. ... 42

II. DE'.rnYSEL KIS f.:-1

II. l. Kullanılan Kiıııyı-ısa l 'la(\deler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . /~4

II.2. Kullanılan Araçlar ve Gt~reçler . • . . . . . . . .. . . . . .. • . . . . . . . . . 45

II.3. Kulla.nılan Çözelti ve Reaktifler , .. ,. ............•. , . , . . . 46

II.4. Deneysel İşle:nler ve Yiinteınler . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. L~8

II.4.1. Kullanı.lan Deney !!ayvanları, Deney Grupları ve Deney

Düzeni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

II.4.1.1. Kullanılan Hayv.::ınlar ...................••. , .... ,, .. .. 48

II.4. 1.2. Deney Grupları. ............•...•..................... , 48

II.4. 1.2. l. Endosıılfan (E:ıJDO) Grupları . . . . • . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . 48

II.4.1.2.2. Siprofloksazin (CPR) Grupları .. . . .. . . . .. . . . . . . .. .. . L,g

II.4.1.2.2. l. Tekrarlanan Dozda CPR. Uygulanan Grup . . . . . . . . . . . . . 43

11.4.1.2.2.2. Tek Doz CPR Uygulanan Gruplar ...... .............. 49

Il.lf.1.2.2.3, "CPR + E Vitamini" Uygulanan Grup .. . .. . . . .. .. . . .. 49

11.4.1.2.2.4. "CPR + Allopurinol" Uygulanan Grup •. ....... .. .. .. 49

II.l•.1.2.3. Kontrol Grupları . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . 49

II.4.2. Doku Örneklerinin Hazırlanması .. . . . .. . .. .• .. .. . . .. .. . . . 1ı9

II.4.2.1. GSH'ın NE._\f ile !-la.skelennıesi ve NE>! Fazlasının

Ekstraksiyonla Uzaklaştırıbı::ı.sı ('IE'.-1 Rea'.<siyonu)

II.4.3. Total Glutatyon (Total GSH) ve GSSG'nin Erızirn3tik Diingi.i

50

Yöntemi ile Ölçülmesi . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . 51

n.4.3.1. Kinetik Tayin Koşullan ve Uygulanışı . . . . .. .. . .. . . . . . SJ

II. 4. 4. İstatistiksel Değerlendirme . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . 53

II1. BULGULAR

III.l. Kullanılan Enzimatik Döngü ve Yönteminin Validasyonuna

İlişkin Bulgular . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . • . . • . . • . . . . . . . . . . 54

III. 1.1. Standart GSH ve GSSG ile Yapılan Eıızirnatik Ölçümler . . . 54

III. l. 1. 1. GSSG Standartları ile Elde Edilen Standart Eğriler 54

III. 1. 1. 2. Farklı Enzirı:ı (GR) Konsantrasyonları ile Çizilen

Standart Eğriler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SCı

f.II.1.2. Sıçnn Reyin ve Karaci;';er Homojenatları ile Yapılan

Enzimatik Tayinler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

JII.1.3. Yöntemin Do3rulu;}u - Verim Deneyleri ......... , . .. .. ..• 5ı,:J

III.1.3.1. NE..\l Reaksiyonunun Do~ruluğ:u - Verimi . . . . . . .• . .. .. . .. 59

HI. l.3.1.l. Dokusuz Ortamda StaıHlart GSSG ile l-11'.'.'.·{ Reaksiyonu

Ver imi . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

III.1.3.1.2. Dokusuz Ort.ımda Standart GSSG ve GSH ile NE1

Reaksiyonu Verimi . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . 61

II (. l. 3. 1. 3. Sıçan Bey in Dokusu Homojenatı nd.a 'tS'1 Rertksi yonu

Verimi ... , ................•...... , ... , .. , . , . • . . . . . 62

1(1, 1.3. 1./L S.1.çan Karaci:~cr Dokusu Hoınojenatında ~m;,f Reaksiyonu

Verimi ......... , .•... , ........ , .• , ... , ... , ...... , . 63

III.1.3.2. S1.çan Beyin Dokusunda Total GSH ve GSSG Tayin

Yönteminin Verimi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . 63

III.1.3.3. Sıçan Karacif~er Dokusunda Total GSH ve GSSG Tayin

Yönteminin Verimi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

IH. 1. 4. Yöntemin Kesinliği - Tekrarlanabilirli[;i . . . . . . • . . . . . . . 65

Ill.1.5. Yöntem.in Duyarlılığ1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111. 2. S1.çan Beyin ve Karaci'.~er Dokularında Ölçüler1 Total GSH ve

GSSG Diizl~ylcri ve HesapLrnan Glutatyon Redoks

67

Güstergelcri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

Til.2.1. Kontrol Grulıu !!ayvanlarda Ölçülen Glutatyon Düzeyleri ve

Hcsaplannn Glutatyon Redoks Göstergeleri . . . . . . . . . . . . . . 67

III. 2. 2. Pozitif Kontrol Olarak Kullanılan Ccı4 Uygulanmış Sıçanlarda Ölçülen Glutatyon Düzeyleri ve Glutatyon

Redoks Göstergeleri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

III.2.3. Endosülfon Uygulanan Sıçanlarda Ölçülen Glutatyon

Diizeyleri ve Glııtatyon Redoks Göstergeleri 70

III.2.4. CPR Uygulanan Sıçanlarda Ölçülen Glutatyon Düzeyleri ve

Glutatyon Redoks Göstergeleri .. ....................... 72

111. 2. L,. 1.. CPR Grııplan nın Kontrol Grubu ile Kıyaslanması

(Student t-Testi Sonuçları) .. ....................... 72

IJI.2.Lı.2. CPR Gruplarının .Birbirleriyle Kıyaslanması (Studen

t-Tesli Sonuçları.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1¾

JTJ.z.ı~.3. CPR 1.50 + E Vitarnini Uygulanan Grup (Studcnt t-Testi

Sonuç} arı) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

11J.2.lı. 1ı, CP}: 150 + A.llo;ıurinol UyguL:rn;ın Grup (Student t-Te;-,li

Sonuçları) ....... , . , . , .... , . , , .................. , . . 7.5

TV. 'J'Al{TlŞ'.1A

IV.1. Yiınte:nin i"şlerliği ve Güvenirli:;i , .................. ,.,. 76

lV.2. Kont.rol Grupları ..... ....... ...... ........ ............ .. 78

IV.3. Endosul farı Uygul:ı:ııası ile Gözlenr-n Sonuçlar ...... , . .. . . . 78

IV./ı. CPi{ Uy;_:;ul:ım:ıst j]c GJzlencn Sonuç1ar .................... 80

TV.4.1. C!'R'ııı lkyin Gl.uuıtyon Sistemine Etkileri . . . . . . . . . . . . . 81

lV.4.2. CPR'rn Kc>rnci],-r Glntntyo, Sistcainc f.tLcilcri ......... s:ı

Tablo 1

Tablo 2

Tablo 3

Tablo 4

Tablo 5

Tablo 6

Tablo 7

Tablo 8

Tablo 9

TABLO LİSTESİ

DT:~[) Varlı·~ınch Enzi:natik Dönc;li Yünte:niyle Glutatyoıı

T;ıyini için ;\ull:ıınb.tı ~in~tL:: T::ıyin Ortarnıcıın

Sayfa No

Bil~:oi':li • . . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • . . • . • • • • • . • 5.!.

En;ci.'7:-ıtik i-ie:1'.<siyon Hızınırı Do;,;;-ı C.-ı;;1TTJlı.~t GSS,~ 3tan-

ılnrtları il~ St3nd7.rt E~ri ÇiziıJi ........ ..........•. 56

dartJ.arı .i.Le Elde t:Jilen Kinetik Ölç,1:!l Soııuçlnrı.... •. .17

Valid:.ısyonu-I. i:ıokusuz OrtaEı:Lı Gss;,:; Verimi ve GSSG

St:::ırnbrt Eğri.si Çizimi

GSSC J':1yj11 YcintJc;Jinin >lr'.\!-GS'.1 Reoksiyont.! B.:ıs::ıciıu.~ının

60

VulitLısyoııu-11. Do:.zu:~u;,: ı)rtcncja G.·)d ve G3SG Vcri:;ıi •. . ôl

cssı__; Vcrüıi-Sı<;Lırı ilcyin Jo:(U !!oınojc:1atında Veri_,, •• • 62

Tol,ıi-C:~;! ve CS'.),::; T:ıyi_n Yöntc:~inLn ~o·.~rulu~u CSl ve::

GSS(; Ekkııcıı Sıç:rn f3cyin Doku Cir:ıeld,~ri_ııde V2ri:1

Tablo 10: Sıçan Kuraci,~cr ve !leyin Do1<u l 3nndrt Total-GS!l

ve GSSG T:ıyi.11.lcrinjn Tc\rnrlnn:ıbi.lirli'ti ............. (/)

Tablo 11: ı<ontrol Gruplanfl'l:J 1)1ı;ıilf':1 GJututyoıı Düzeyleri ve

Clııtatyon Rcdo!<':> Cöstergeleri

Tablo 12: ccı 4 (.1 :wdk:;, ip) lJy";uJ.an,rn Sıç.arılard:_ı Br-,yln vt' Kara­

cir;er Dokus:.ınr\a Glııl:ılyoıı !hi;,;cylcri v,~ (;lul:ıtyon ifr:do'...:s

(i9

Gösterge lcr i . , .................. , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7:)

Tablo 13: bıdosıılL:ııı ('ı \;liıı, i;;) \;y:-:;ul:ııı:ııı Sıç;ın.Lc1rdil Ö(cyiıı ve

Kac-ıcl __ ,;er DoKıısurıdr_ı GLııt:ılyon Düzeyleri ve Redok;-;

Göstergeleri •.••....••..••.......•.....•.•••..•••..... 71

Tablo 14: Siprofloks:ı,,;in (Cl-'i{) Uyı;ulan,ııı Sıç.anLırda Bı:yiıı ve

Knrnci;1cr Dokusunda C:.lutatyoıı Düzeyleri ve Xcdoks

Göster~eleci . • . . • . . . . • . • . • . . • . . • . . . . . . . . . . . • . • . • . • . • . 73

Şl'1CİL LİSTtSİ

Sayfa No

Şekil 1 : G1 utatyorıun Kimyasal ve Konformasyonel Ycı.pısı • • • • • • • • 4

Şekil 2 Glut3tyoıı Scntı.:;:i ve >lctaboliz:nası .......•.......... 7

Şekil 3 l~lut,1tyon Redoks iJöngiisü ..•..........•....•......... l2

Şekil 4 Serbest Oksijen Radikali Olu~turan Bazı. '·!ekanizmaLır

ve G1 utalyon Sj stc:ni.rı.in Antioksidan Etkisi . . . . . . . . . . Hl

Şekil 5 JYl'Nı'\ 1 nin GSJI ile Hecı.ksiyonu .•••••••••••••••••.•••... JU

Şekil 6 ı:x-, f3-, ~ - ve ~ -tolrnferoliin Ki,nyasal Yapısı 33

Şekil 7 Allopurinol.'un Kiıny3sa1 Y3pısı ..................... .

Şekil 8 r~ndosul fan ve ı\na >letaboliti Endo:-;iilfan Slilfal ..•.• 38

Şekil 9 Slprofloksazirı ve Bilinen >lctabolitlcrinin Kimyasal

Y:.1pı lcırı • .\: Ht=:lÜ/. T:ım :nlan;namtş Ar..:ıiir:in ••.•. , •.. , • • • lfl

Şekil 10: Kör, GSSl; vr! GS!I 2°)t:ımbrtL:ırın;_ı ait Kinetik Real-<siyon 55

Profilleri

Şekil 11: Doku hrnekleri ile Elde Edilen Kinetik Reaksiyon Pro- 53

filleri

KA Y:lAKLAR . ' .................................................. .

ÖZEJ' ..........................................................

SUMXA1{Y ..•....•••...•...•••........•••...••..••.•.••••••..••.•

GİRİŞ ve AH.AÇ

o1ar::ık, ksenobiyotiklere temasla

o 1 u~~,ın cksojt·n prooksirJ~rnlar ve mi tokondrü11 elektron trasportu, y2ygın

fa;_;nsit 3ktiv3s\u-ırıu vry::ı r)took';iclasyonLı olu.;c:rn cnrlojcn prooksidanlar

ile karş1. k3.rş1 va,hr. Ore;:rni:c:1ı,c1 bu oksid::ıtif tehi itlere kar:::;ı, enzimatik

ve ncıneıızi_rn:ıtik <1rrtioksida.nL:ırı il'=' kar'.c;J koyar. Prook:~idan fcıkLSrlerle

antioksidan kaµ::ısite arasınrtaki hassas denge, genelde prooksidan ~uçlere

do•~ruJur ve lıu nedenle de eırQ_ani::'.:ıu s;jrck1i oL:ırcık 111Jksir_btif Stres"

tchrliti i 1 e taraftan oks i clo-red iiksi von

reaıc~ivoıı1,ırı, lıiic: re fon l:si ycınl Jrı niinclcn tıÜ\'ii'z önc:;ıe salıipdir ve

hiicrescl hasctrda a nonıı:o 1 e le1~ tron t r3 ns feri sıizkonusnrlur. Ilticrenin lıu

tip lıa,~::ır,cı k'1r~ı keırıın:-:1wcanıl~ı çe.c:;it1i \ıiy,Jlojjk ;ıı,_:,!c1:üzm:-::lar rol alır.

l:!unLırın lı;:ı,şlı cıl arı cı ll ü•.'•,ii yiıksek e lekL ron transport yolak} cırı,

r3dika1 topl:cıyıcıL1r, detoksi\:asyrın en:"ir:ıleri ve omırım sistcm1eridir.

Glutatyon (CSH) bu me;urnizmaların ço:~uncL:ı merke1i bjr rol oynzır ve

hiicn'scl GS'i I ın t 1 ıkenmesi oksül3ti f hasarı artırır. t! -glııt::ımi lsistein­

glisin yapı,;ınıla tıir tripeptit olan CS!l, canlı hücrelerin ço0,urrnn aııa

~~erbcst L iyeıJ bi leşi,:_;irlir, llijc re içi konsc1n tra:c:;vonu ni slıeten ytiksekt i r

(0,5 - 10 m>lı v,, ,lo,~rurbn ya ,ia ılo1avl1 olarak protein ve lf'lı\ c;l'ntcz:i,

tran:sport enzimi. cık ti vitesi, meta hol i_;:rr.a ve hıicrcnin korunııı;::ısı gilı:i

bir ,;ok önc~ıli lıiyoloiik proc::esd[' önemli rol c,br,

ol d 11 Q u an l :1 :;i ı l ;ı n

1~ vi t;11ııini_nc

C~~'l'ın, lı:icn'nin ,ınti(ıks1rbtif s,ıvunmcısına katkısı,

gi_in.ıek; glut:H yon (GSll-Px) bir

f'l .. ~k:ınizma ile~ lipit pcroksidasyon ürünlerini toplamak; di sülf j d lcri

tiyo1-disiH fiti

t iyol-disiilfirl duru•'lunurı

mekanizması

korunmasını

ile redükleyip,

S3ğl.::ımak;

proteinlerin

hasarın

o mırı bıası nda esansiy!' 1 bile şen rölü oynamak başt<1 o bıak ~ize re Ç<'c,i tl i

yolcıkLı.rla olur. Bu olaylc1rın sonunda GSH oks idasyona ıı[~rar ve oksj de

g l uta t yon veya gl uta tyon d isül f id ( GSSG) mey da na gelir. Do l;ıyı sı y la

-2-

oksidatif stres varlığı dokunun GS!-1 ve GSSG düzeylerini değiştirir.

GSH' ın hücresel işlevler inde tıu tiyo 1/ d j siılf id dengesinin sürdürülmesi

önemlidir. :lormaldc hucrenjn GSSG içerigi GS!1 1 a kıyasla çok düşük

dıjzeylcrde siırdurulur ve hucre içi g1utatyonun indirgenmiş ha1dc idamesi

g 1 u t ,1. t y o n r ul ü k t 3 z c il;~ i :n i ve

ı\rıcı.k NA!ıl';J hirçok biyosc>ntcz ve dc·toksifik3syon pro,,esi için g•:-'reklidir

ve içeriğinin sJrnrlı ol:n:1:--;ı CSd SSC uranınırı her ko,-,,ulda yuk~;ek rlüzcyde

sıirrliiriil rrıesı rıi engel 1 Pr.

Tü:;ı bn rıed,0 rılerlc, CJL~,--;id:ıtif stresin vc1rlı:~ırnn gôst'-'I'ılr:ıl~si ve

oks it!at if st n•,; dc,t'ccsi n ı n s3ptanmas1 rıclJ, hücresrl GS'l/GSSG or::ını veya

f:ırk l ı şekillerde jfad[' ed1l,~:1ilen '\~lut3tyorı Redoks }nde~si",

bir gc)stcrge o1,ır:J;( kcıbu1 cd11;;ıcktc:Lir. Di2er t;:_ıraftan tok:-;ik etkilerini

metabo L ik 3k ti vasvonu t _-ık i hen göst,~n•[ı, i l:1ç l:ır dahi 1 endüstriyel ve

çevresı' 1

ra[lJ ka 11 er

Çl'\;i t1 i ki;ı1v,ıs:-ıl maddeler in aktif meta bol itler inin, serbest

olahildi;~i sa pLı ;ı,nı ş t ı r ve bu nedenle de toksik etki

mckanizm;ılarırıda serbest radikallerin ro 1 li büyük ilgi konusudur.

Bu çalış;;ı:ıda, yukarıdaki bılgilerden hareketle, oksid:ıtif stres

inJüklemesi oLısı klorlu hidrokarbon yapısında bir insektisit

"EndosuJ Lrn' 1 ı rı ve f 1 uorok i no lon gruhu bir antibiyotik "Siprof loks3zirı 11 i:1

sıçan beyin ve kc-ıraci!'.;cr dokularımL::ı gluLıtyo:-ı siste:nine etkilerjrıirı,

gluL1tvon redcıks in,lc-ksi cılı;\i::ıiı ilt~ ar~-ı~tırılr!1ası am3çLıncııstır.

I. GENEL BİLGİLER

1. 1. Glutatyon

I. l.l. Bulunuşu ve Biyolojik Önemi

Glutntyon (GSH) canlı sistemlerdeki en önemli protein ol:uayan tiyol

bile~iS:idir. Bitki, hayvan ve mikroorgani.z:naların hücre içi ortamında

ya.y;p.n olarak bulunur. İl:Z kl~7. 1:333 'de de Rey-P;:ıiJ hade tarnfından kcş-­

fedilmiş, önceleri elec.ıentcl kiikürtle (S) rc1aksiyona giren bir mad<l(~

olarak, d,1ha sonra sistcin içeren, dolayısıylcı S taşıyan bir organi'.z

bileşik ob1rak tanımlanın1-ş ve canlı hücrelerde yaygın oldutıu o bu

nedenle de i:incmli biyolo_jiK rolü olması gerektiği ileri st.iriJlıni.işt..i.ir

(1).

1921 'de l-lopkins (2), GSH 1 ı, glutamn.t ve sisteinden oluşan bir

dipcptit olarak U:ırıımlamJ_ş, dah8 sonra glisin içerdiğini de bulanık

GSil'ın tripcptit yapısı.nı aydınlatmıştır. Hopkins, ~ücrclerde "öncelikli

olar:ık .in<lcrgcırniş şekli" ile bulundu[;unu ileri sürdürıü GS!!'ın, sistein

için bir depo ve transporl formu oluşturduğunu ve sisteinin bu tripeptit

yapısı içinde melabolik yı.kı'.lldan korunduğunu ileri sürmüştür. Yüzyılır.

ba.şlarındc1 yapılan lıu yorumlar GS!l enzi:nolojisi Uzerimle yapılan daha

:,oıırnk i çalış:nalarda dor;rular.mıştır (3). Yine llopkins ve di~. ( !ı), G.SH' 1'1

enzimleri □ktif hnl,lc Lutnn bir redükleyici ajan işlevi gördü~ü:ıü daha

bu yı lL-ırda farketın.i.ş lerd ir. GSH' ın ilk sentezi de 1935 yılında i[a'Tlington

ve ,'·lea,i tnrafınd3n gcrçcklcşti.ril:ni~tir (5).

GSll'ı.n hücre fonksiyonlar:ındaki rolı..i son 30 yıldan bu yana yavas

bir lıızda gel işcrck nnl□ş1.1ınaya başlanmıştır, Bu konuda mevcut veriler

hücre biyoloji:ü ve biyokiı;ıyac;al toksikoloji ba!;>ta olmnk üzere çc;aitli

al..ınL.ıra yeni boyutlar ve ara.şttrmalara yeni bir iv;~c

knzandırmıştı._r.

-4-

GS!J, prot~in ve sentezi, amino asit transportu, çeşitli

cnzinlerde kofRktör

dahil birçok o:ıc:TJ i

((ı' 7). cırtıL:

1.1.2.

ro 1 ij, rıuc re m,~ tR bol i zm3s1 ve hjcrenin korunnası

bjyolojik olRvda do~,u~an ve dolaylı rol alır

oL:ır ;:ık bilin::ıcl:tedir ki hücreye

tı i 1 eşikler d e:ı

-5-

GSH' ın Şek.l 1 1 1 de ~ôrlilen bıı konforr:ıasyonel yapısı oldukça st:-ı.bildir

ve serbest CSll, enzime tıaSlı GSI-! ve GSrI-konjugatları Y -"?eklin:leki bu

yapıları ile birbirlerine beıız2rler (8).

Fonksiyorıel gruplar 2 karboksil grubu, 1 amine grubu ve l tiyol

ı;nıbudur. ;-Jolekülün kimyasal özelliklerinden sorumlu o]an 6rup tiyol

r,rubudur ve pKa değerleri 8.G - 9.2'<lir (9). Bu nedenle fizyolojik pil

ar a lı [; 1. mhı. tiyol grubu tiyoLı.t halinde bulunur ve kuvvetlL bir

ni.ikleofilclir (10). Tiyol grubunun btı özelli_~inin önemi büyüktür. Şöyle

ki.; serbest radikJ.llerle bir elektron reaksi.yonunn gire, ve tivil cr;s·) serbest raükalleri oluşlıırur. İki tiyol nı.dib.li di::ıcriz~ olup okside

glutatyonll (GSSG) oluşturur ((ı, 7, 11-13).

GSI! hücresel esansiyel bir redoks taı,ıpo:rn işlevi

Proteinlerin, peptitlcrin ve sistein molekültinün tiyol grup]an ile

tersinir olarak etkileş,neyc girebilir ve sonuçta proteinlerin ti yol

fonksiyonlannın redoks durumunu lıüyük ölçüde etkiler (11). Disülfid

bagla.rının proteinlerin konformasyonunda önemli yapısal unsurlar

olrııası nedeniyle, bu me!G,nizmalar çc.şitli enzimlerin aktivitesini regüle

etme yetene,ğinc sahiptir. Bu nedenle GSSG'ye yakınlarda "üçiinci ulak"

adı da veril~iştir (12).

I. ı. :3. GSH ltoı:ıeostazı

llücre içi tiyollerindcn en y3ygını olan GSH 1 .1.n, hıicre içi

konsantrasyonu nisbeterı yiikseh: olup genellikle 0.5-10 'rl'l dii;;:cyindedir

( lJ, 14). Ancak GSH kolaylı!da okside olup, disiilf id tlirevi, GSSG I ye

dörıii?ür. ,\yııı şekilde proteinlerle de karı.~ak disiilfidler ol11şnhilir.

ı\ııcak ann fonksiyonel şe-ki1 rectüklemni.7 şekil olan GSH'dı.r. !li.icre

içindeki. konsantrasyon farklı ko~ullarda değişir. Bu nedenle hiicre<leki

:;lut3tyon k:ınsaııtnısyonunun, d:ıhPı dof;ru olarak, "Glııtatyo:ı. Stc1tU;:/\1

veya "Glutatyon Redoks Statiis'\i -?eklinde ifade

siiri.ilı1ıekter!i r ( 5, 15, lô). Bu terimin, lripeptit i.:1

edilebilecc~i ileri

total hücresel kon-

santrasyonun ve hücre içindeki. :nuhtemel şekillcrinirı da2ılı::ıını ya da

oranlarını tanımladığı ifade e-dilmiştir (J 7). Nitekiı:ı g.lutatyone,ı redoks

-Cı-

statüsü (bu tezde buradan itibaren redoks statüsü tericUi yerine "redoks

duruınu 11 terimi kullanılmıştır) ve "total glutatyon (GSH + GSSG) üzerinde

yapılan çalışmalar, özellikle karaciğerde ksenobiyotiklerin, açlığın,

oksidatif stresin, hormonal dengenin, büyümenin ve gelişmenin önemli

etkileri olduğunu göstermiştir (18-21).

Önemli biyolojik fonksiyonları ve özellikle detoksifikasyondaki

önemli rolü nedeniyle GSH'ın sentezi, transportu, degredasyonu ve

homeostazı etkileyen çeşitli diğer faktörler çeşitli hücre tiplerinde

yoğun olarak çalı.şılmı.-ştır (1,3,6,7), GSH'ın hiicresel dengesi; sunuluş

hızı (sentez ve uptake) ve eliıni.nasyon hızı (konjugasyon ve hücresel

çıktı - Efflux ) tarafından tayin edilir (13),

I.1.3.1. GSH Sentezi ve Hetabolizması

GSH, tüm memeli hücrelerinde, hücrenin kendi aminoasit prekiir-

sörlerinden hareketle ATP I ye bağımlı

sentez edilir (1,3,5-7,13-22). Şekil

2 reaksiyonu içeren bir yalakla

2 1 de GSH'ın sentez, metabolizma

ve fonksiyonlarına ilişkin biyokimyasal reaksiyonlar özetlenmiştir (7).

Birinci reaksiyon b' -gluta;nilsistein sentetaz tarafından katalizlenen

bir re3ksiyondur. Birer molekül glutamat ve sis teinin bir izo-peptid

bağı ile bağlanmasıyla ~ -glutamilsistein meydana gelir. Sentezin ikinci

ve son basamağı, GSJ-l sentctaz tarafından katalizlenen ve glisin

ilavesiyle tripeptid oluşumunun tamamlandığı reaksiyondur.

Reaksiyon 1, GSH sentezi için hız kısıtlayıcı basarı:ıağı teşkil eder

ve enzimin 'd -glutamat bağlayıcı bölgelerinin GSH tarafından fecdback

ol:ırak (geri bildirim) k.oı□ petitif inhibisyonla regüle edilir (23),

t;SH'ın, ikinci reaksiyonu katalizleyen GS!-1 sentetaz enzimi üzerinde

böyle bir etkisi yoktur.

Diğer taraftan, GSH sentez hızı substrat varlığına da bağımlıdır.

Tateishi ve diğ. (24) sıçan karaciğerindeki sistein konsantrasyonunun

GSH lıiyosentezi için sınırlayıcı faktör olduğunu göstermişlerdir. Sistein

OK5!DA5YON-REDLiKSrYO/lN GSSG~

Y □LAGJ \"' '\

@ , 9

Redlık,,:~tz Transh1.drogenazıar p k 0d 1 ~

Deaksiribanükleotidle~ As kor bat --------.

ero sı az ar 1

Serbest s,

AA, Amino asitier: ),, ı~onjugat oıuşturnıals'. Lı:c::ere bS~ ile recı.ksiyonB. :;ır<2-n oii•.:.><;i:d.:.ır. 1.:J -r-gc•Jt2-.mdsistein :;entEtd.::;

(2) GSH sentetaz; u, T-g!utami!Lranspeptiaa;::; \4) dipeptı-­

rJa::::!ar: ısı T-gt,_ıtamilsıklot,:ansfE:'raz: tô) S-ı:ıkscprGıına::;

C/J GSH S-transferazlar; ((1) N-asetiltransferaz; (9) GSH pe­

roksiaaziar (S,;, ıçeren ve içermeyeni; ü!JJ gıutareaoKsin ve protein disülfit izomeraz gibi GSH tiyol transferazlar; (11J GSH ile seroest ı-adikailerin reaksiyonu; ı.12) glutatyon Oi­sUlfit (GSSGı redüktaz; (13) -r-Glu-(Sis),'nin transportu; (14) formaldehit. dQhidrogenaz, maieyıaktoasetat. izomeraz, glioksataz, prostag!andin endoperoksidaz izomerazlar, ve diki or oaif eni ı t r ıki or o.:ı tan (Dl)T)-denidrokl orına z vo. enzim ı er için bir koenzim olarak GSH fonksiyonları. Gliko!az reaksiyo­nunda, metilglioksaı ve GSH'un rea.ksiyonuyia nonenzimatik olarak hemimerkaptal ojuşur ve glioksalaz I tarafından S­lakr..ii-GSH'a dbnuştUrUlür, bu da glioksaıaz: ıi tara.tından ü­laktat ve GSH'a parçalanır. Formaldehit dehidrogenaz reaksi­yonunda, S · forınii GSH oluşur <.GSH ~ HCHO ~ NAL!' J ve iormat ile GSH'a hidroliz edilir.

için en önemli kaynağı protein ya da metionin şeklinde di.yetsel alım

olu.;ıturur. Açlığı takiben gözlenen he patik GSH deplesyonunda hepatik

sistein ve GS!l içeri11indeki de':;işikliklerin paralel olduğu saptanr.ıış,

GS!!'ın yeniden sentez hızının diyetsel sistein içeriği ile doğru orantılı

olduğu gösteril:niştir (25). En<lojen protein yıkımı, sis tein için önemli

bir kaynaktır. Ancak karaciğerin, sistationin yola_ğı ile nıetioninden

sistlc!in sentez etme kapasitesi vardır ve bu yolak karaciğerin, ana

si.stein temin yolunu teşkil eder (26).

O halde GSH sentc%i, normalde, GSH'ın feedback inhibisyon yapıcı

etkisi ve sistein preki.irsör:.inün bulunabilirliği ile regüle edilerı bir

olaydır. Anc,ık GS!l'ın normal konsatrasyonunun 10 kezden fazla ölçüde

değişikliğe uğraya b.il:nesi nedeniyle, başka faktörlerin de etkili

olabileceği bil<liril:niştir ( 13). Nitekim son çalışmalar, ATP ı nin de

GS!! sentezini sınırlay abildiğini ve bunun özellikle sistein

konsantrasyonunun düşük olduğu hallerde önemli olduğuau göstermiştir

(27). S.ista tion.i.n yoL1ğındaki S-adenozilmetionin sentetazın ATP I ye olan

K:;-ı' si_ yüksektir ve bu nedenle sisteinden senteze kıyasla I metioninden

GSH sentezi ATP azalmasına karşı daha duyarlıdır (13), Bu ise, hepatik

oksijenlenı:ı.ede nispeten (lüşük bir azalmc.nın bile GSH sentezini

sınırlaması anlamına gelir ve özellikle hipoksi~ koşullar için önemlidir,

I.1.3.1.l. GSH'ın !-focresel Kullanırıı

lliicrc içi GSH, GS!1 transhi<lrogenazlar (Reaksiyon 10) ve GSH

pcroks i.ctaz 1 ar (bSH - Px, Reaksiyon 9) dahil çeşitli enzi:ııler tarafından

kullanılır. Btı re.:ı~siyonlar sonucunda oluşan GSSG, GSSG redüktaz ile

GSWa indirgenir (Reaksiyon 12) ve bu reaksiyonda NADPH kullanılır.

Serbest radü.allerin oluşması da d3hi.l (Reaksiyon 13), bu reaksiyonlar

GS!-!' ın oksido-rediiksiyon ya lağıııı oluşturur.

GSI! 1 ın çeşi.tli S-sUbstitüe adduct'larına dönüşümü GSH-S-

transferazlar tarafından katalize edilir (Reaksiyon 7). GSH, lökötrien

A ve cistrojenler gibi endojen bileşiklerle konjugatlar oluşturur. GSH'ın

-9-

eksojen bileşiklerle konjugasronu .ise hem ilaç :netabolizması hem de

toksikoloji yöni..inden önemlidir. 11:-lerkapturik asit yalağın denilen bu

yolak ta, GS1-l I ın S-konjugatları, karşılık gelen

konjugatlarına dönüşürler. Bu i.irünler dipeptidaz ile

S-konjugatları verirler (Reaksiyon 4) ve bu ürünler

sistenilglisb

bölünüp sistcin

de daha sonra

asetillenip ı:ıerkapturik asitleri oluştururlar (Reaksiyon 8).

I.J.3.1.2. CSH 1 ın Katabolizması

GSH, hücre r.ıeınbranının dış yUzi..ine bağlı oları '3 -glutamil

transpeptidaz ve dipeptidazlar tnrafından katalizlenen reaksiyonlarla

(Reaksiyon 3 ve 4) ekstrasel lüler olarak yıkı_ 11lanır. Hücre içinde oluş3n GSI!, normrıl fizyolojik koşullarda r:ıc:nbrana bağlı btı enzimlere doğru

:ne:nbran içinden taşınır. Yine :ı.orm,:ll koşullarda az miktarda GSSG de

bu şekilde taşınır, anca!( intrascllüler GSSG dizeyi arttığında bu

dışarıya t·rnnsport işlemi d.e artar (7). GSll'ın S-substitüe konjug3 tları

için de aynı işlem söz konusudur. Transpeptidizasyon a;ninoasit varlıl5ında

ı:ıeydana gelir ve 'i:)' -glutarnil a'llinoasit.ler oluşur. En aktif a;,ıinoasit

akscptörü sistin' dir; <liğer nötral aminoasitler, özel.lüle r.ıetionin

ve glutaınin de aktif akscptörlerdir. Bu şekilde oluşan 'd -~lutar.ıil

aminoasitler hücre içine taşınır ve ~ -glutamil siklotranfcrazlarL.:ı

5-oksoproline ve ;<arşılık gelen aminoasitlere (Reaksiyon 5 ) dönlişürler.

5-oksoprolinler rle Al'P 1 ye ;)ağımlı olarak .S-o:.:soproli:ıaz tarafından

gltıta:nata dö;1üşti..irülürler (K.eaksiyon 6). O halde ,?ekil 2 1 de de g~rülen 11 8' -G.luta::ıil 11 döngüs:..i GSH 1 ın se:ı.tezi ve hıllanımı içindir. Ayrıca GS!l' ı:1 ve~ -glutar.ıil a:nino asitlerin transportunu (~a kapsar. Dolayısıyla GSH'ın

hücre chşına taşınr.ıası ve hücrenin dışarı verdiği siste.in ve di_ğer

ar.ıinoasit gruplarından tekrar yararlanması için bir yolai< oluştunır

(7).

I.l.3.1.3. GSt!'ın Taşınması

Normal koşullarda h:.icrelerden ve do!<ulardan ekstraseliiler ala:ı.a

ve plazmaya önemli bir miktarda GSH akımı vardır. Bunun hücre me:ııbranının

tiyol gruplarının, D(-tokoferol gilıi diğer ıncmbran bileşiklerinin devamını

sağlamak suretiyle oksidatif ve diğer tip hasarlara karşı kor•,ı:ııaya

yönelik olduğu anlaşılr.ıaktarhr,

Hücre içinde milimolar konsantrasyonda bulunan GSH, türler arası

ve tiir içi bireysel de.Sfişken.likler göstermekle birlikte plaz:nada

mikromolar konsantrasyonda bulunur (22). Transpeptida7, inhibitörleri

kullanıldığında plaz:na GSH ve idrarla atılan GSH artar (28), Bu bulgular

b1-glutar:ı.il transpcptidazın fizyolojik rolün:in GSH ve türevleri ile

metabolitlerinin r.ıetaboliz:nası ve tranportu olduğunu gösterir.

taraftan GSH sentezi inhibe edildiğinde, hücre içi GSH !<0:-ısantrasyonu

azalır, çünkü hücre dışına GSH ihracı devam etmektedir.

Böbrekler, fibroblastlar ve lenfoit hücreler de ekstraselüler ortama

GSH verirler, ancak plaz:na GS!l' ının hemen tamamı karaciğerden gelir.

Karaciğer GSll' ın en öne;nli sentez yeridir, hem en çok kullanıldığı,

hem de biiyi.ik miktarda ekstraselüler alana verildig-i organdır (7 13 • • 22). Karaciğerin GSH salgılaması, çoğu sinuzoidal kısımdan olmak üzere

safra kanaliküllerinden de olur, taşıyıcı aracılı bir transport

mckaniz,nasına dayanır ve GSSG ve GSH-S konjugatları için de aynıdır

(29). Ba?.ı doku ve hücrelerin kendi hücresel GSH sentezlerini, plazmadan

GSH uptake ederek destekleme sistemleri vardır (13). Bu hücrelerin

hangileri oldu~u tam olaraK bilinmemekle birlikte yeni araştır~alar

renal proksir.ıal tübül, alveolar tip II, retinal pigment epiteli, ince

barsak endositleri gibi birçok epitelyel hücreden GS'.! uptake 1 i olUuğunıı

göstermiştir (30-32). GSH'a ba{;ı:nlı detoksifikasyonda aktif olan ve

oksidatif hasar ve malign tranfornıasyonlara duyarlı olan bu epite1yel

hi.icrelerin, endojen GSa sentezini suplemante etmek üzere plazma GSWnı

kullanma kapasitesine sahip olduğu anlaşılmaktadır. Genellikle yüksek

transpeptidaz aktivitesine sahi;ı olan böbrek gibi organlar plaz:na GSH'ını

kullanırlar (6,33),

-11.-

I.1.3.1.4. GSH Redoks Döngüsü

GSH hon.ıeostazının diğer bir yönü "tiyol/ disülfid" dengesinin

idame sidir ve indirgenmiş GSH ile onun okside şekli olan GSSG, hücrenin

ana "tiyol redoks siste:ni"ni oluşturur, Bu sistem tarafından regüle

edilen redoks durumu hücrenin canlılığı için büyük öneme sahiptir. GSSG,

GSH'dan kimyasal oksidasyonlar ve GSH peroksidaz ile katalizlenen

detoksikasyon reaksiyonları sonucu meydana gelir. :iormal fizyolojik

koşullarda hücrenin GSSG içeriği GSH 1 a kıyasla çok düşüi<. düzeylerde

sürdürülür. Diğer bir ifade ile, fizyolojik aralıkta hücrenin nGSH

statüsi/' çok büyük ölçüde indirgenmiş haldedir ve bu halin idar:1esi,

Şekil 3 1 de görüldügü gibi, GS!I-peroksidaz ve redüktaz sistemi ile ı'iADP+ /

çifti tarafından sağlanır ( 34, 35). NADPH redoks

katalizlenen bir reaksiyonla GSSG'ye oksitlenir ve

GSH-peroksidazla

GSSG N.-\DPH'nın

bulunabilirliğine bağlı olarak NADPH' ya bağıanlı GSSG redüktazla GSH 1 a

redüklenir. Ancak NADPil birçok biyosentez ve detoksifikasyon prosesi

için gereklidir ve içeriğinin sınırlı olması GSH/GSSG oranının, her

koşulda yüksek düzeyde sürdürülebilmesini engeller (5,13). ¾ADPH'nın

ana kaynağını glukozun pentoz fosfat yolağının ilk kade:nesinde okside

edilmesi teşkil eder. Pentoz fosfat şantı aktivitesindeki değişiklikler

NADPll düzeyini, dolayısıyla da GSH/GSSG oranını değiştirir.

Sıçan he;:ı::ıtositlerinde tioasetamidle bu şantın stimüle edilmesiyle,

GSH/GSSG

tarafto.n

oranının GSH

kscnobiyotü

le:üne değiştiği gösterilmiştir ( 36). Diğer

veril'llesinden sonra oluşan yetersiz :ı/ADPH

rejcnerasyonu ile hi.icrcdc GSSG konsantrasyonu ve uptake I ı artar, çünk\.l

GSSG-rcdiiktaz enzimi GSH' ırı. oksidasyon hızı . ' ı.,_e başedemez hale gelir

ve sonuçta hücresel GSH havuzu tüketilir (5). Diğer taraftan, örneğin,

hipoksi halinde glikolizin artmasıyla glukoz ınü::tarı kısıtlanıp

mitokoıı.<lrial fonksiyon bozulduğundan NADPII azalır. Bu nedenle,

oksida:-ılara maruz kalan hipoksik hücrelerde GSSG' nin art;nası, GSH 1 1.n

azalması ve h:icrenin tersinmez hasara karşı duyarlığının artması NADPH

içeri~inin sınırlı olması ile ilişkilidir (36).

-12-

2H O

GSH - peroksidaz

2GSH GSSG

GSSG - redüktaz

+ 2NADP 2NADPH

i pentoz - fosfat - şantı

Şekil 3. Glutatyon Redoks - Döngüsü

Görüldüğü gibi organizmanın oksidatif has:ıra karşı korunmasında

GSH I dan bi yoyararlanımı, çeşitli faktörler etkilemektedir. Yukarıda

sözü edilen bu faktörler tekrar şu şekilde özetlenebilir:

i- GSH sentez hızı,

ii- Sentezde kullanılan prekürsörlerin yeterli di..ızeyde bulunuşu,

iii- GS!! 1 ı:-ı çıktı (efflux) hızı,

iv- GSH'ırı. kullanım hın.

O :ıalde hcr'."langi bir oksi<lan stres r.ıekanizmasında GSl-l'ın kritik

::lir faktör ya da y2.rd1::ıcı i)ir faktör olup ol:nadığını ve de GSH'ın

tersin::ıez hLicrc hasarına karşı koruyucu bir konsantrasyonda idame

ettirilip ettirilcmiyecc~ini, GSli'ın kullanım yalakları tayin etmektedir.

I.1.4. GSH 11n D3Qılıcı

ile:nen tü~ı ıne;ncli dokularında bulunduğu bildirilen GSH'ın çc.ş:itli

doku.lnrdaki dl!ze:ıleri forklıdı:-. Göz :ııcrceğinde 15 m.\J gibi yüksek

-13-

bir düzeyde bulunur; ana biyosentez yeri olan karaciğerde 5-10 rr~\l

konsantrasyondadır; diğer dokularda da 1-2 :n.'1 düzeyde b•Jlunur; ancak

GSH'ın, dokuların çoğunda bulunmakla birlikte, bu dokuların tü~

hücrelerinde bulunmadığı bildirilmiştir (37). Örneğin, beyindeki ortala:na

düzeyi 1 .2-5 m,\-1' dir(38), ancak histokimyasal çalışı:ıalar rıöronal stromada

bulunmadığını göstermi.7tir (14), Akciğerlerde interal veolar hücrelerde

bulunduğu, fakat alveolar hücrelerde olmadığı, böbrekte en zengin

bölgenin proksimal tübUl olduğu, göz merceğinde ise periferde yüksek

oranda biriktigi bildirilmektedir (39),

Hücre içi glutatyon norı:ıal olarak ~;99 oranında GSH halinde bulunur

(6). Bu oranın fare ve sıçarı plasmasında, sıçan safrasında ve insan

lenf hücrelerinde %90 olduğu bildirilmiştir (33,40-42). Normal koşullarda

insan eritrositlerindeki esse oranının %0,1 'den az olduğu gözlen'.Tliştir

(43).

I.1.5. GSrt'ın İşlevleri

GS!-1, I .1.1. 1 de de kısaca sözü edile.1, yaşamsal önemi büyük biyolojik

işlevlere sahip bir hücresel bileşendir. Proteinlerin sentezi (ve yıkımı)

için elzem ol.an redüktif proseslerde; DNA' nın deoksiribonükleotid

prekürsörlerinin oluşturul.nasında, dolayısıyla DN"A sentezinde; enzim-

lerin regülasyonunda; hücrelerin reaktif oksijen bileşenlerine ve serbest

radikallere karşı korunmasında rol alır, Ayrıca çeşitli enzimatik

reaksiyonlardn koenzim işlevi görür; ilaçlar dahil yaba:ıcı ki:nyasc1l

ı:ıaddelerin ve estrojenler, prostagladinlcr ve lökotrienler gibi endojen

bileşiklerin konju~asyonunda, dolayısıyla rnetaboliz::ıalarında rol alır

(1,5,7,13,18,22).

Diğer taraftan GSH'ın, I.1.3.1.3. 'de sözü edildiği şekilde, membrana

bağlı 'd - 2;1utamil transpeptidazlarla hücre dışına ve aynı :ııekaniz::ıayla

oluşan 'ı -gluta:-:ıil aminoasitlerle hücre içine taşın;;ıc:ısı, aminoasit

transportu için önemli bir mekaniz;nayı teşkil eder (33). Eu şekilde

hiicre dışına taşınan GSH, hücre membranını ve hücrenin yakın çevresini

Lçi:-ıe alan redüktif reaksiyonlarda da işlev görür ve plaz:naya dahil

olup diğer dokuların hücrelerine transfer edilir, Glutatyon sistein

içirı bir depo ve transport aracıdır (3!+).

I.1.5.1. GSH'ın Radikallerle İndüklenen Hücresel Hasarın Detoksifikasyo­

nun<laki Rolü

Güçlü bir nüklcofil olan GSH çeşitli d.etoksifikasyon reaksiyonlarına

katılır (3,13,18,34,35,37,44). Bu,üarın başlıcaları:

- UV ile veya ki:ııyasal proseslerle oluşa:ı. peroksitlerle reaksiyon,

- Radikallerle <loğ:rudan reaksiyo:1,

S-tiyillenmiş proteinlerin redüksiyonu,

- Diğer okside liri.inlerle reaksiyon1dur,

I.l.5.1.1. Oksidatif Stres ve Serbest Radikal Reaksiyonları

Oksidatif stres, organizmanın oksidanlara temasını artıran ve/veya

organizmanın antioksidan kapasitesini tehlikeye sokan durumları tarif

için kullanılan bir terimdir (45). Endojen veya eksojen kaynaklı

olabilir. Endo jen oksi<lan o luşurnu nor:nal aerobik metabolizmarıırı bir

parçasıdır. Ancak oksidanlar fazla miktarda oluştuklarında doku hasarına

sebep olurlar. Ayrıca doku hasarının kendisi de daha fazla oksidan

oluşnasına sebeb olarak hasarın ilerlemesini sağlar (46).

2;,,dojeıı oksidatif stres veya oksidatif hasar aerobik yaşamın bir

sonucudur ve organizma<laki hemen her hücre, çoğunlugu kendi o2 uptake

hızına b3glı olmak üzere, oksidatif <leği.şikliklere maruz kalır (47,

48). Endojen oKsidatif stresin ökaryotlar-da en çok oluştuğu yer

mitokondrilerdir. Oksijenin solunu::ı zinciri içindeki reaksiyonu ekseriya

tam değildir ve sonuçta toksik oksijen ara ürünleri meydana gelir

( !+9), '.'litokondrial o2

tiiketirninin 1;2' sinin ı-ı 2 o 2 olu.şturduğu hesap­

ları1:1ıştır (50). Biyolojik slsteanler :nitokondrial elektron transportuna

ilave olarak, yaygın fagosit aktivasyonu veya otooksidasyon sonucu

endojen olarak oluşan ve başta redoks döngüsü ilaçları ol:nak üzere

çeşitli ksenohiyoti;clere temastan kaynaklanan eksojen prooksidanlar

-15-

ile de karşı karşıyadır. Organizma oksidatif strese enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidanları ile karşı koyar. Glutatyon redoks

döngüsü, sÜperoksit dismutaz (SOD), katalaz ve E vitamini, oksidatif

strese karşı koyan ana hücresel savunma sistemleridir ve dogal antioksidanlar olarak da adlandırılırlar (51).

Serbest radikal tcri:ni, bir veya birden fazla eşlemııe,11iş elektron

içeren rnolekii1lere verilen addır. Serbest radikaller bu yapısal

Bzellikleri nedeniyle eşlenmemiş elektronlarını diğer bir moleküle

vere b i 1 en veya kendi el ek t r on la r ı nı e .ş lemek uzere başka bir mo lek ü 1 den

elektron çalan nc"aktif bileşiklerdir (46).

Hid roksü Rr1d ikal i ( "OH) bilinen en reaktif radikal mo1eki.il üdür.

İ y onizc radyasyona maruz kal an hücrede, suyun oksijen~ hidrojen kov alan

bağlarından birinin ayrılması ile "OH meydana gelir.

J I-0-H R,ıdyasyon

► ARA DÖNE!\1

► . .

H+OH (1)

·oıı, canlı hücrede lıemt~n her molekule saldırabilir ve serbest

rarlik,:11 reaksiyonlarının çogaltılmasına ( propagasyon) neden

olarak, örnegin DNA ile rcc1ksiyonla mutasyonlara ve zincir~ kırıkları,ıa

vr~ bunların sonucunda da on!(o Jcn ak ti vasyonuna ve karsinojeneze neden

olabilir (37).

Li pid pcroksidasvcınu da, "OH' ın stimulc et t igi bir serbest radikal

zinciri reaksiyonu sonucu meydana gelir. Özellikle memhran yakınında

oluşan "(~[. tercihan çok çifte baglı yag asitlerine saldırır:

-16-

H

1 . - C- + OH ►

- . - C- + H (2)

H +OH H.,O (3)

Görüldüğü gibi, "OH, 2 ve 3 numaralı reaksiyonlarla ortadan

kaldırılır, fakat membranda karbon merkezli bir radikal oluşmuştur.

Fizyolojik koşullarda bu radikal oksijenle birleşir ve sonuçta bir başka

radikal, peroksil radikali (ROO") meydana gelir:

- C - + O_, ----►► Peroksil radikali

(4)

01 uşan ROO ·, bitişiğindeki yağ asidi yan zinciri ile reaksiyona

girip hidrojen çeker ve sonuçta lipit hidroperoksit (LOOH) oluşturur:

. o,.,

1

- C' - +

H 1

- C - ►

0-ıH ı-

-C - + - C -Lipid Hid rupc-ro ksit

(5)

Bu son reaksiyonda meydana gelen karbon merkezli bir radikal, zincir

reaksiyonunun (Reaksiyon 4 ve 5) deva;nına sebep olur. Hiicre memhranında

meydana gelen ve burada kısaca ozetlenen reaksiyonlar, normalde hücre

ölümünün mutat sonucu olan, fakat inflamasyon, yaşlanma, kanser ve

ksenebiyotik toksisitesinde "sebep" de olabilen "Lipid Peroksidasyonu"

nun temel mekanizmasını teşkil eder (46,51).

-17-

SÜueroksit anyonu canlı organizmada endojen veya eksojen

kaynaklı olarak :neydana gelen bir oksijen radikalidir, Bir oksijen

molekülüne bir elektron ilavesiyle meydana gelen bu radikal (Reaksiyon

6), süperoksit dismutaz enzi:.,i t:::ırafından katalize edilen bir reaksiyonla

(Reaksiyo:1 7) uzuklaştırılır:

(6)

Siiperoksit Radikali

Superoksit Dismutaz H,02+ 0 2 (7)

Ancak :ııeydana gelen ıı2o 2 de !-tücre için toksikdir. Ör:ı.cğin, in vitro

koşullarda fazla miktarda Hı°2 ile inkübc edilen hücrelerde D;'jA hasarı,

· Ca+2 k +2 membran hasarı ve iı:..icrc içı onsantrasyo!'lu artması ile Ca • a

bağır.ılı proteoli tik enzim] erin akti vasyonu gözle:-ıITJiştir ( 46). Bu hasarda

eıı azında:1 kısmen sorumlu ajan, demir ve bakır iyonları r:ıevcudiyetinde

02-vc H 2o21 cıen meydana gelen, "OH'dir:

(8)

I. l. 5 .1. 2. GSH v2 Serhest Radikaller

Şe!<il ı.'dc serbest oksijc.ı radikali o]u,nuran bazı mekaniz;nalar

ve glutat:;on s:i ste~ıinin antioksid::ın eti<isi Ozetlenmiştir.

OKSİJEN1N REDÜKSİYONU: 0 2 + 4e-+ 4H:...2H20

K1Sfıv1İ OKSİJEN REDÜKSİYONU:

• 02'in süperoksi\ anyonuna redüksiyonu

• Süpcroksit anyonunun spontan veya SOD kiltallzörlügünde Jismu!asyoııu

• Fenton reaksiyonu

Lipid hidroptroksitler

211 o 1 2 •

1 +

~ + H -.. 0.5 il, o,+ 0.5 o, Vefd O, ..... ~ - .:.

~

n + I\ktal ______.,. tı.·1eta!n-l + O

t n-1 2

n i\.kta! + I 1, flı _...__ fVkıal + OH + Ol 1 -" ----

-----~--------- l)üşük rcaktivitcde hidroksi yağ u~itlcri

-------------► 21120 + O 2

2 REDOKTE CLUTATYON

,, OKSİDE

Heksoz monolosfot şantı

NADP

t'-______ G_L__,lr\TYON

◄--------------- NADPH

Şekil 4. Serbest oksijen radikali oluşturan bazı mekanizmalar ve glutatyon

sisteminin anti oksidan etkisi ( 15).

-19-

I.l,5.1.2.1. GSH'ın Peroksit Radikalleri ile Reaksiyonları

HidroperoKsitlerin (ROOl-i) GSH ile detuksifikasyonu aşağıdaki reaksi­

yonda görüldü~ü gibi yürür:

2C,SH + ROOH _ _.► GSSC, + ROH + HCO

Bu reaksiyon iki tip enzim tarafından katalize edilir:

i- Se'a b.:ı.ğıınl1 gluUıtyo:ı peroksidaz (GS:!-Px)

ii- Bazı GSrı - transferazL:ır

(])

Sclcnyu~a (Se) b:ığıı:ılı GSH-Px sitoplazmanın sulu fazında nito­

kondrial matriksdc ve kan plazr::asındo. bulunur (52,53). İkinci grup enzi:.ı

ise Se'a hc1ftıml1 (ie~ildir ve karnciğer, böbreı< ve ince barsakta yüksek

konsantrasyonda buluaan bazı GSH-transferazları kapsar (54).

GS!l-Px'lerin radikal hcısarına karşı koruyucu etkisi, peroksit

kons3ntrasyonunu aznltmak siiretiyle yürüyen dolaylı bir etkidir. Perok-

sitlcrin serbest radikal proseslerini genişletip büyi..ıtmeleri

(a~plifik;:ı.syon) nedeniyle bu etki öne:oılidir (51). Aşagıda ııserbest

raıl:i knl . " . prosesı nırı te:nel mekanizması basitle;,tiribıiş şekli ile

göriilı:ıcktcdir:

B~ı.~latına Evresi

('oğaltnıa

}::.vresi

Cicni~lctınc Hli\'Ülnıe l·,\TC.'ıl

RH + başlatıcı

ıt + o, ► Roo· ROCY+RH --ROOH + ff

(2)

-20-

Görü~düjii ,;ib.i nı<.i!znl. rec;;.;:sLyo!ı zinciri içinde ol.:ışc1.:ı her ı;crnl(sit

iJr yent bir lıa~lat7a evresi başln~ v2 olay ~i~ reaksiyon zinciri

şcdindc ıicv;:nı eder. Iştc pc-roksitleriıı (}WJ.) GStl':1 :::Ja~ı~ıJ-ı o1arak

indirgc:ü;:ı orta:ııdan uzak l c1ştırı lı;;ası bu pros2s1 önler ve böylece

serbest ra::lik,d rcctksiyoalarınırı kontrolünde kriti\ lıir rol oync1.r (5.J,

:\adikc:1 prost~~ılcr1;ıirı h:1sL1t1.l.;1ıasınn çeşitli ınek:::ı.ııiz;;1c1lc1.rııı lut:nsı

v:1rd1.r. Gunl.ırd:ın en Ö!ıe'T,lisi, l.l.5.1.1.'de <le söz:i ed:ildi.,~i şekilde,

bir yolla da

ile:- re:1Ksiyondar. lşte GS:! (~edl J'df'

]olnyısıyla cs:-ı r,:dikal proseslere k::ın,ı doL::ıyl.ı

işlev

r0,1.ktif

\;önncktcdir. Bu işlev, özelli:...le, b::,.şLıLna

oksijen b~l2şi~lcrinirı rol aldı~ı :-;ıdyasyon

iıasarı:ıC:a V(.' lü;wro!<sik h?csard,ı O:ıe::11.idir (1.1).

I.l.5.1.:? .. 2. GS!-l'uı '.bdikal Top.1.ayıcı r.:tkilcri

Ancak GSi!•1.n h:ic:-escl savıınm::ıda radikal zincirini

ilişklr: r\o.;rudaıı Lıir eö~sini:ı ünc:ııi çok net def;ildir (13). Çün'.-<:ü GS:l

g:ibi. tiyo1 !ıile.7i.kleri, ·o:ı vcy:ı '.<arboıı radik3Jlcri ile oksidcısyonda

nispeten suıbil ti.yil radi:<;1! leri. (es·) oluştururlar ve bu radikallerden

ikisi rc.ıks:iyon::ı giri;) çlisii1fit (GSSC) verir (57) •. .\vnca GS'le:- o:..:.sijen

ile re:1.{si von:ı st:l fur ;;croks~.t r:ııiLcıllcri--ı.:i. l o O (C" o w;1 ... ıırurı.1r .J::ı;.

Bu rcaiv,iyoıı"!.:ır:ıı koruyu:::.u o1;:ıayabilecc.F çünkü böy1~ radik:ıllerı :ı loksik

oLı!ı·ilecc,-;i. ve hasnr::ı kat.kı.d:ı bcılunab.ilc'ce~lC'ri ileri sJrüL;ektedir

(58),

IH~cr L..1rc1f'.::ırı GS'.l'ı:a lipid pcroksidas:10:ırbki r.1.dik;,J. rc3ksiyon

zi.nci.rlcri.ııi s,mLı,ı,l.ı.nı:ı konu'.iu, G.Si!'ın sulu ort::ımrl:ı. (si.tozoldC') bcılun-

:n:ısı ve '.J:..ı ıce:de:--ılc~ hi.icrc :ne7~ra:nnı:ı li;:ıiJ ort;ı;;ıına kolay ulcı$:n:-ıy;:ı_-

'.ıi ler:e(;i screkçesi.ylc c!c tartı.·;nlmaktachr (13). Dolayısıy ! :ı GS:J' 1 n

~ı2rhcst r:.ıd ika l lop i crnaria do~r~dan büyük 1Jir etK.islilin o 1 du~u korıusunurı,

-21-

taırmmem dışlanmamakla birlikte ta,:ı bir kabul gönıedigi ileri sürülmekte­

dir (13).

Anca;.;. yine de GSil, radikal topla~ada, dolaylı fakat kritik bir

role SRhi ptir. 3u ro} , radikal toplayıcı o<: -to'.rnferolC.en oluşan

krornanoksil radikalini redükleme özelliğinden ileri gelir. Membranlardaki

lipit peroksidasyo~un GSil'a bağı~lı Lir faktörle inhibe edildi@ine

ilişkin v12riler fazladır (59, 60) ve bu ir.'.übisyonun katalitik miktarda

CX.-to)rnferol1e şu sıra içinde yi..is':.idüğü ileri sürülmlişLür.

R'+ YİTE ► RH + YiT E' YİTE·+ GSH -vir E + GS 2GS' ► GSSG GSSG + NADPH-•►►2GSH + NADi'+

Dolayısıyla GSH, zincir kırıcı

(3)

hücresel antioksida~ olarak

tanı:nlanan E vitaminini rejenere ederek radikal to;ıla'r.a görevine iştirak

etmektedir (51).

I.1.5.1..2.3. Pro~cinlerin Sülfidril Gru~larının ~orunması

GSI!, sülfidril gruplarının ida~esini sa~layara~ proteinleri radikal

fnsara karşı korur. Kritik sülfidril gnıplanna sa!lip 240 1 d?.n L:,zla

protein '.)i li:ı.:neizteC:ir ve ::ıu kritik gnıpları:1 oizsidasyonu fonksiyon k:1.ybı

ile sonuçlanır (61). GSE, disiilfiı:!lerdcn sulfo;ıik asitlere kad:ır çeşitli

yapıl.D.r olLıştura.ı bu oksidasyon rec.1;..:siyonlarırn geriye çevirme yetene~ine

s:ıhiptir (62).

I.l.S.l.2.4. GSH ve D~A Onarı~ı

llS:J'ın r.:v!ya~yo:ıla veya oksidanlada indU;denen DNA hasarının

oııarıı:11:::Lı bilinme~·erı bir mekanizma .ile rol ald1gı, rııevcut verilerin,

[;Si!'ın si.i~i"iJril taşıyarı bjr on,1rırr. enzir;ıinin i-ıl.lcrescl düzeyini regi..ıle

ctti•;iııı ,!.i~tı:ıdjrcil!~ıi hildiril~iştir (63).

-22-

1 ı 5 l 2 .. -r ' • 0 f .. 'l d cs·ı ·-· ... ~. Ls;ze:ın-,,eper uzyoıı. asarın a . ı.

Keperflizyon iıas;ı.rı, isl.::e:nik do;.;.uıarırı, oi-:.sije:ılenmiş kanla

repertiizyonunu takiben gelişen, şok ve orgarı lransplantssyonları cbhiJ

l)irçok klinik duru11da sözlc:--ıen patofizyolojik bir prosestir (64). ÇoK

sayıda yayında, reoksijenasyo:--ıurı o!<sidan stres oluşturarak doku hnsarına

neden oldu.~u ileri sürülmü.','tÜr (64,65), Bu veriler rcpcrfüzyon hc1sarı:1G

karşı, koruyucu olarak antioksidc1:1 kullcı.:nı:n veya reperft.izyon esn::1s1r,da

oksida:ı ölçü:nU ile elde edilmekte:lir. Çok sayıda arnştır,naJcı s,m, katnlaz

veya allopurinollc koruyucu eti<i giizlen::ıiş, daha yeni ~:o. l ış:nalania

ise iskcrni-reperfüzyon '."ıasarına karşı <loi<.unun d:.ıyarlı lığ1:nn GS'.l redo'.,,:s

c\urwıu ile ilişkisi incelenmiştir (65-67). Doku GSll içerigi.nin, N-asetil

sistcin gibi ajc1nlarla artırıbnsı ile de koruyucu etki gözlendiği.

bj 1 d i_rııı i.şlir ( 68,69). fü:ız L ÇGlışrr.alar, SOD ve katalazın etkili o} madıgını

güsterirkerı, rmlikal bas.:ırının bazı koşul1.ardn bne·:11.i olduğu, anecık

her za:ııan hFJ.s;ır1 :ı kr ilik lı.i.r bi leşcni ohıadıgı göri.işiinij giindc;ne getir-

mektedir (70, 71). lier;ıekal.l;ır rncli\c:ıl toplayıcılar kullan.::ırai<. yapılan

bir çok c1r3ştınn;-ıda rcperL'.zyonun oksida'1. stres yaptığı gözlcn:niş ise

de lıu oL~y esn;ısınd:ı lir:cı~li ~i.'.<t:1:-da reakti.f oksijen bi.leşi·~;i oluşup

olu~:n:1dı(tı konusuncls çelişkili veriler vardır. Di.Jer taraftan recütif

oksijen bileşiklerinin yarı ö::ıi.irleri çok '.<ısa olduı;u iç.in do(trııdan

ö.lçü:nlcr.i giiçtür.

Su ne,lcnlcr!c oksidnn stresin izlen~csinde, dolaylı ~ir yöntem

0Lıı·c1k !--(lutfltyon rAdoks onanr.ı:ı. (GS!!/GSSG vcy;ı ':GSSG) ve GSSG çı:.ztısrnı:1

ti.lçüııii k u 11 :ın ı 1 ,ı;ı .';' t ı r (// ~· 72) , U'-<, 1 1., • konud;üi veriler

çclbkilidir. kCoy ve di.;;.'ni.n (64) böhre'-<te yaptıkları. ç:o.lış:nada

ve Sc i_Lc doyurulma hal.inde 5 dakik::ı.Lık rcperfozyonıbn sonra /~ GSSG 1 ni.n

0.(J'J'dcn l.66'ya çıktı~ı. Se eksik.lif;i. olan böbreklerde ise 0,79'cbn

3rıcak l .17'yc çı;<t1.\p ~özleıı:ni?tir.

Repcrfüzyo:ı olayının meıc::ıniz~.ası olarnk ileri surülcn di~cr bir

olasılık da rcaktif oksije:1 türevleriıde ö:ı.e:nl i '.)ir artışın obwr:ıası,

aııc:ık iskcınln.Lrı hüc.relcri oksidan strese kcırşı çok j3)1;:ı d·.1yc1rl1 hal<:!

getir~csidir (13). Pcıstc1.:1oksi'..z hücrc!.crh ::ıeta'Joli'.z kapi.lsitelcriııi_n

bo:(,ulwısı i]c; d:::ıha :::ı.z oksidcırı dctoksi.fi.kasyon·J ve o~sid:rn hasur on;ırı,n

yap::ıbi l,lik l eri. (27, 74) d i;duı.le .::ı.l1n:ır::::1k, lıu :ıı.icreler in ;wrnm] il'..!crc.icrc

kıyasla, oi<.s i.ıl:rn lard:rn do.ha ölçi..:de etkilendikleri, hc!.sar için

dramatik lıir oksidan oluşu:ııu artışına ihtiycıç ol:.ıadığı ileri sürülmliştLir

( l3).

l. L.5.l.2Jı. '.\imyasal :-bddclcrle ve Rady::ısyonL:ı İndüklcnc,ı (hsida;c i\3s:~r

T.L.5.1.2.G.l. GSll ve CSSG Sentez '.!ı7-ları ve Hı.icrcscl GSH Tiikctilr.,csi

l.l,5.l.2'dc de lıcl irti ldiiti gibi GSl! oksidan '."lascıra

peroks:i t lcr i. (i-i2

D2

, lipit ve fosfol.ipi t hi dropcrok~;it ler) redüklcyc-rı

ve orga;--ıik r;ı:iik,ıllt~rin Lopl:1nması:1da kro;aanoksi1 radika~ini indükleyerek

koruyucu i.;:lt~v (;Ori.ır. Bu işlevleri:ı yerine getirilmesini sıc1.ırlay1.cı

te!'lc 1. faktör GS:! + GSSG havuzunun ida;nesi:iir. i{aracif~erde GSSG I nin

rcdi:icsi yo,ııı için gerekli :ncıksi~ıu:-:ı '.\A.Dllll sc1ğL::ı::ı::ı. hızı S nmol/ıng protein/

dakika'dır. Dol::ı.yı.sıyl:-1 c~cr GS~ ojsi('.asyon hızı 10 mıol/rr,g µrotei:1 1 i

n\>c:ırsa GSi! fıızla oksi.~e olur. lhger taraftan kilraciJerde nor;:ıal Ol.

tıikcti;!; '11.zı 20 nı.101/m~; protein/daki;.:.a'dır. I3u redijksiyon için ı;erckli

Nı\1WH' nın tcıni~ı hı7,ını a.sşan ko.<şullarda, nor:na l c lektron c1kışında öne:nl i.

bir :<:esiaıti v0 oksi_icn kullanır:nnda biiyük bir de.~i.şik1ik neydan3

~clcc~ktir (l'.\).

aıwk:rnizınası v::ırclır ve oLıy, en azıııd:ın kıs~en, hllcrcscl GSSG '.<:onsan­

trasyonuna \ı:1,~lıdır. 0.SSG :{ons,rntrasyonu, C:cıh.:ı önce de değinildiqi gibi,

nor::ıal<lc ço'.z (Eç,Ukti..ir ancak oksicbn b:ir yjklcme ile artar. Karacifierı\c

GSSC çı'.{tı hızı 0.7 aF:ıol/~-~ protcin/dakika'dır. GS'!'ın sentez cdil:s,cdi.:~i

vursayılırs;:ı, lm çıktı hızı ile lı:icre GSl!'ı l saatten ci3lıc1 ;:ız siir,; iç.inde

ti..ike::ilciı.ilir.

Di.f~r)r t::ırnftcın ~arc,ci.'-\eri.n 0Sil :-;eııtez hızı .aıaksi:nwn oL:ır::ık 0.5

n;nol /:·q, protcin/,la~ika'clır aonıal koşullarda O.l n:nol/::ı0 '

dr:ıkik.:ı hl7:ımb GS;! plaz~ı.::ıy'1 ve safrava doğrucbn s3.lıveriLir. K:n:ıci.;;er

pJa7,::ı::ı.d:1n c;s:ı vey,_1 GSSG u;ıtake ct:-:ıcz. Dol:=>.yıs1.yLı hiicre:ıin GSH'ı

yenile~esi yetene1i, oksid~n stres altında SÜ7le:ıen GSSG çıktı ~1.~1.ndan

da:vı. azdır ve bu da GSll '.<:dybı ile sonuçLrnır (13).

O halde GS~ kullanım hızının, yapım hızını aşlıRı, boşk::ı. bir ifajc

l!e prooksi.dacı koşul LırLı 2rı.tio;-:sidcın sisteI'.ller arasıfüh;<i de:ıgı:!nin

bo%ul<luğu

tüketilir.

strcsdc hücresel. GS'.! redoks duLErt'J bozc:L:r ve GSH

Bazı ilaçlar ,lc1iü! birçok toks:ik :::ı.j:rn tmzi:ıı:,ti.k veya 11011 enziı:..ati..:-:

olarak bir-elektron redüksiyonu yoluyb rc>doks dcirı->üsüne cC gir-erler. 3u

oksijenle reaksiyona gire'::ıilen ve si.iperoksit anyo:1 olıışu:nu başl.:ı­

~erlıest :-3dikal.~er ol::nk '...!zere, rcaktif ara ürüıılerln

olıışf'lc.ısıno yol açar (47). P.edoi<s döngı.isürıc giren ksenobiyotiklerin en

tipik cirne;.;i, scmiki:ıorı SC!rlıcst redikaller i_ o lu;:tu:-ö:-! kino:ı] ::ırdır.

rndi.knl lcr:i. kuvvetli njanl::ırdır, '.!lolekülcr

oksijenle '.n7,la reaksiyona girip o2

.- ol•":şturur, Bu rc.:ıksj yo:-ıl:ır sc:nikinon

tiikctil:m'ksi.zi.:1 dcva:n eder, dolayısıyla hLicrescl has3ra yol açan bir

rcrloks döngiisi.ıiH' ~;irilir (7.5).

I.l . .".i.l.2.6.2. GS!l'ı_r~ fonjuc;asyon '.\eaks"i.yo:ıları ile Tüketilmesi

l!ıicrc.'nin o:{~İ.:!cın i:;ı.s.-_1rc1 1<::ırşı claycrnıklılı:";ı:n :Jiiyi_ik iilç'.i:ic c1rtırc:.:1

d i .-.~er lı i.r Lık~ör, c;s;ı 1 1-ıı L:.onj,ıgasyon reaksiyonl:1n. i 1 e tii.ketil::ıesidir.

Hetioks ksenobi.yotiKlcr dahil, çcşitii

cle'.<lrof.ilik bil.f'şikl,~r GS1! ile kov:-ı1an ti.octcr adCuct'br o::.u.7t'..lrurl:1r

( l.3, 33). Jtı rc3ksiyo:1 l :1r ge,ıcll ikle GSH S-trnnsf.ernz 1 arla !cıtc:.l ize cdi 1 ir

vrı yüksek hızda oluşu~ GSH ~eplcsyonu yaparlar (7S). O halde h~cresel

(~Sil havu7,ıımın iwy'.ıı Çi~şitli :nc;rnniz;naLul;ı olıır vc iJU Juru:n, toksi!<

han~i spesifjlc rs~ksivoııların öne~1i old~~ıı konusunun

cıyduı L:ıtıl.:n.:ısırıı ~ıic,:leşt ~r ir.

GS!l sentez inbibitörU butionin s:..ilfoicsi:r.in (;3SO) k:ılL:ı:n::_:ır2k

iıijcresel (Si dc;:ılesyonu (GS:-1 < ~; 5) sağl:rnclı~::.nda redoi<s :1ktif sitoto!csi.\:

ilnç.1c1r oLın :dri:l'Tlbinin ve bleo:ııisini:-ı. sitotoksi.~ etkilerinin artı.'','-,

GSH ~,cııle-::i indükley.ici ok.sotiazoli<lin-.!ı-kc1rboksilat (OTZ) kullaııılara:,

GS!l yiikseltiJinde ise (GS!l) Z 200) sitotoksis.itcnb üalendiği güsteril­

:ni.~tir (77). Car::ıichnel ve diğ, (73)'nin r.ıaksi:mı:!l dctoksifikasyon iç:in

he:ı, GS;f' u1 heı:ı de GS!l S-Lrarıs(erazJ arın ö~1emini gösteren çalı-7:nalo.n.,

ise olrlukçcı ilginç ve Oııernlidir, 3u ç::ıl.1.9malarda let.:ıl doz siklofosfamid

uy~;u1mıcın icc 1 :ıiricilcrc, bu doz,:ian 5 gün önce aynı ilacın '.:lir "tı:=.şlntıcı

doz,ıu uyg·JlandJ~ı.rnL:t, GSH ve GSil S-transforaz <liizeyleri:lirı i.ine::ıli ölçi.ıde

art':ı;~·t ve <le let:ıl etkinic1 ö:1lendi2,i gösterilmiştir. Bu i(oruy'-lCU

ctki;-ıi.n, lıaşlatJ.cı dozdan önce BSO veril~ıı,ıoi. ile kalktı:~ı ve bu geriye

di:i.ıiişi..:n GS!l deplesyonu ile (kontrolün %47 1 si) ilişkili olduğu, ç.'jnkii

GS!l S-tnınsfer2z düzeylerinin apı ;rnldı(;ı Ueri si.!ri.i11ıiiştiir.

I.] • j. l.. 2. 6. J. GS:l I ın Biyoakti vasyon Yapıcı Etkisi

GSJ!'ın ilaç.ların inaktivasyonunda ve ki~yasal hasarın deto!Zsi fikas­

yonunda rol al::ıast çok sayıda veri ile de desteklenen qcncl bir bul~udur.

Ancak GSI!'Fı bazı. ilaçbrın toksik üriinlere c1ktivasyonuns da neden

oldu~unu gösteren çalışmalar bulu:-ımaktadır (79), Orne~in, neokarzi.ıo­

statin (:'ICS) i:l sitotoksü:. etkisi için hücresel GSil ile redüksiyon

gerekir (80). BSO ile mua:;1ele edilerek, GSll düzeyi kontrolün ~;s 1 inin

altına dj;;Liri.ılen .1~ci;1r~r fibroblast lüicrclcrinde, :-lCS sitotob,is.i.te:-ı.i.n

ünlendi~.:.; L:ıkat 3;<ci~cr kanser hlicrelcrinJc !Y..ı koruyucu ctki:a.fr, ön'"c1li

:~österiiT'.1.iştir (öl). Ih bulgubr b!1ser :,iicre!.cri:lin scl.clctif

olı:ır:.ık yo~ cdiLncsi yöcıündcn öne::ıli bulguL:ı.r obr:1:c değerlcndiril­

:ncklcd i r.

J • l . 5. 1. 2. 6. 4. Ra:l yasyonla !nd iiklencn J~A Hasarı v~ GSil

l{adyc1syoıı, iyonizcısyorı yoluyb. JNA 'da doqru.:b.:ı Sl"rbest radik;:ıller

oluşturar:cık veya rn.dyoJiti.K Un.inleri aracılığı. ile D;,iA hasarı y::ı.par.

GSi!' ın serbest rndü.allcr i çc.-şi tl i yollarla dctoksifiyc c,lcbilm,si

ncdeni.yle raJyo:luyarlık ü:~erinde de cine:nli rolü olalı:i l('.'CCi'i hi;ıuv,zi

çe.7i'::li ç:ıl1ş.:L1lcula i.rıcc-1.('m:i~ti.r (82,:J3). Gs;ı tleplesyon~ınu:: duyarlı:;ı

c1rtı:rd1_~ı, eksojen '::.iyol ilavesiniıı koruyııcu oldıı~',ı gösteri.Lni..';;t.i.r.

,\nccık bu kocı;_ı:la çc.l i.şi<:.ili son:ıçlar l'.a vardır (77). S;__ı ncdccle GS'.l 1u1

ancak bazı ko~;ullarda ki.:ny.:ıszıl :ncı<ldclerle veya radyasyonla ol:..ışan oksid3n

T.1.5._:_.2. 7. Lip.irl Pero:zsidcısyonu

hucrc öl.iiı~,ürıiiıı ::ıutal soııucu olaa µatofi1:yolojiK bir porscstir. Ancık

inf L::ır~:ı.syoıı, y;ı:;;la:n~, l,;_;:ııı.scr ve k.scno;ıiyotik tok sisi tcs i.:--ıc b2..,1lı doi'-n

lıas3rırıda "sebep11 de o L:ıbilece:~i düşi.iniilmektc<lir. LP esnasıııdc1

·nc:nbrarH!aki çoklu doy,nu.ş yrı:~ asitleri, il" çıkarılı:,as1, rearranj:ncı:1 ve

-,:o:talL:ı,:t Das3::ıakLırını içeren bir serbest radikdl me~;:ıniz:nası ile

perokside cdi 1 i r. Bu c;;erl.ıcst r:ıJik.al re3:(si.yonları:ıııı a.~ıplifiyc cdile­

b.il:.ıesi. de o'.-<sid:ıtif has3rıJa LP 1 yi çok önemli bjr kon:.ıı:u getirir. Aync3

LP i.ie toks i:<. iiriinler ve (S! 1 a b3g1□lı detoksifikasyon

sistcmlcr:i nin bozu !ı:ıası rl:ı önc"1 taşı:na;zta<lır (5], 55,.56).

GS!!' ın LP I yr~ lu1rş1. ko:-nyl!cu.lu[;u i. lk kez :SkCay ( 84) taofıııdun,

!Jl.r s1.ço.n ;ni.krozoı:ı:11 LP s:isteıni.ne ay,n ar:.da GSil ve dinlizc cdil:niş sıçan

s:..ıpern:1taın ilavesi i.lc gôstcribıiştir. Bciyle bir siste:.ıe

iLwe LP I n.i.:1 b3şlamcısı için olan Ti • 1 gcc 1:c:ıc

7.~t:n.~rn.1' 1 ııı.n uz:ıdı!}ı sı)zlcn::ıis, etkinin :ni~roz2;nl~r1.rı ıs1.tı1rr.:ısı vcva

Lripsi.n ile ·,ı,.::ımc:1(•::;i ile k:ıl,'.,;_tı-~',ı, doL:ı.yısıyl;ı L?'yec kurş-ı_ korunıcu

(_;qı i1 bir :ni.krozoır.al protcirıi;ı rol cı.Lhğ1. :ileri

si.:r·jl::ıiiştür Bu,ıurı gösteriJ.::ıiş ( 3))'

cL1iıa sonra fos~ol ipid '.ıi.clroperoksi.t üzerinde GSif-Px aleti.vitesi gösteren

bir sitosoli:< protein izole cdilı:ıi7 ve cr;.;.inin 1rnna ba:~lı oldu;}u ileri

suriil~ü5ttir (SG,½7).

l·!cCay ve dig. (SS) il.c Gi.lıson ve :ıq. (60) ise, GS:J'3 b:ı;~ı:nlı

si.tozoli.k di•~er bir proteinin de koruyucıı rolü olrh:gun;1 bulr:ıusL::ır ve

ctici:ıin LP'nin "lfaşL-ıtılı:ıa f'.'.vreslnin" inhi.:ıc cdiltrıcsinc daycıJ.ı Lır:,:ı

\ . ,.ı.ı.r ı~ek3.nizı~a

gözlc::ı.i.7] erdir.

ile olduJu, GSH-Px akt.ivitcsine da y anı~aJ ı;;: J. rı ı

Ycıkın y1-llan!,1 y:ıpıla:1 çalışmalar ise GSH 1 ın ;:ıi~rozmıal LP'ye kar;-;ı_

koruyucu etkl.sinin, biiyiik ölçüde Vitanin E' ye bağımlı olduğunu

göstcr::ı.i..-;;ti.r (85) I.l.5,l.2.2'de dcği:1iHi<;j i.:z12re, Vit::ı;nin E'lkn radik:ıJ.

top L1m:ı esrrnsında olc1-?a;1 raılikaller, b.i.r Ll(l ik;-ı.l rcdıikta7. ile

katalizlenen reaksiyonla GSI-1 k;ıllanılar:1'.( reje.ıere edilir (S(1). Bu

radikul rcdt.iktnz, esonsiycl bir tiyol gcu'.n içerir ve hu :;r~ıbun

'-;"-etilı:ı:üei~ıid vh alkiLleyiö ajanlarla alkiLısyonu cnzi:ni inaktlV(!

eder (39). Allilal:ZoHin he;:ıatotoksi"- met:ı!Joi.ı.t.:iti oları akrolci.nin benzer

bir eLki. ile, (;Sl{'a bn:~ı:nlı LP'ye kar;n savun:,ıayı inhibe etti~i ileri

siirülrr.l!ştür (90). O lrnlde GS'.!, LP'yi a?.alt::ı.ada hem doğrudan he.Ti c!t,

ılolaylı işlev 3cir~cktedir.

I.l.5.l.2.8. faşlaıı:no., Dejenentif l--lostalıkL:ı.r ve G'.'ıii

Ya-?Lınr;ı;ı fonsiyonel :upositenin 223.lmasından ve h:ısta1ıkL:,.rc:ı. ve

kscnobiyoti.klcri:ı. toksik et:<ileri:ıe kar,;,ı duyarlıQın art;;ıası.ndarı. sorumlu

de{;i:;;ke:ı likierirı i le!r lcyic i .<şe\zi lde birik:nesi olarak. Lrnırnlarıa;J i 1 ir.

YaşL:rnmarn:1 serbest r:ıdikaller ve/veya serbest r:ıdikı:ıllcrin sebep ol.du.½cı

hrısar ürünlerinin lıi.rik::ıcsi ile c;1.eydan:ı geldi~i.w ili;;:<in hir teo:i,

soıı yı 1.brcia :ı:.:ylik ilJi ko:rnsu olmuştur (91). Antioksi.d:::;:-ı s;1vuı1::ıc1

ynqlılıklr:ı ;.;c:ıe! ~ikl.c 3z3l::ı:ı;:t.1riır ve bu azal:::;ay;, G5'."! ve GS;'.'a Oa~ı:nlı

aktivitclcr de dniıildir (l)'.2). Lipit peroksit düzeylerinin de aym şck-i.1.(le

::ırttı,;ı giistcrilr:'.iştir (93). Ancak GS:--!. ve pre'.{lirsöderinin ve perok­

sitlerin y:1~>L-ı.:rnnrnn sebebi ya da so~ucu olduğu konusu d;ıha ileri

:ıraşt 1 r::ıa Lar:ı gerek'..ıinim göster:nekteciir.

~özde \.:atanıkt olu.7u:ııu, GS:l'1.:ı oi(sidatif hasara

;cırşı koruyucu rolüne özgül bir örnek te7kil ede:-. G:iz ~crceğinin GS·l

kons:1ntrasyom: yiiksckt ir ve bu red:ıkleyici ort_--1,:ııcı ido.::ıesinir. :.:-.cı.t:ırat,'.t

oluşumunu gecii<:ti.rebil.ece~_i., GSl! kay';nnın ise katara~tın nedeni oldu[;u

deneyse1 ol3rn:< ela 8Österil:ni.ştjr (94,95).

\'a.';,la ilişkili ve GS~l'ın oksidatif clc<;işikliklere kcın;,ı koruyucu

roli!n~in oldı.: 11u di:ler bir hasLılık Parki;;so'ldur. Parkinso;1, do;,a~ıinerjik

nigrostrüıtcll nöron ;.;_aybı ve dop3'nÜı t'.lr:1overi nrtış1- ile kar:ılçtcrizl!

bir hGstalıktır, Dopaminin ::ıonoa::ıin oksidaz i k oksic\atif

rtea~inGsyoı1und2 ~202 olu~ur ve hastalıJın etiyolojisinde ~u ~ücrcsel

oksid:ın1-n varattı"ı . " oksülatif stresin rol oyırn.yaJi leccği ileri.

s\irillndştür (96). lJ,1ha örıce de değinildiği gdJi n2o

2 katalazla veyn

CS'.f-Px ile dctoksifiye edilir. CS:-1-Px'in :-ı 2 o 2 ile reaksiyonu ile CSSG

konsantrasyonu artar. .'\i telci:n dopa:ninerjik sinaptik vczü:i.illcrdc

depolanr:ıay1 bozan bir ilaç., rezcrpin, veriJ.erek, dopcı::ıirı •;•,:r:-ıoverinin

artt1.rı1cl.ı_;:;ı hayvaaıL:ırda dc::ı:ııi;-ıe mctabolit oluşu:nu ile birlikte, beyin

GSSG d\izeyl.eri.ıde ;;go'den fazla artı.eş ~ü.den~ıiştir (95). O halde c;:=:-,;ı,

c:ıdoj(-)n oksi(\c er!ilebilir bileşiklerin turnovcrirıin artrn::ısınn b2.ğlı

oksidatif hascırn :<ar.;,ı, cksojeıı ~imyo.sal maddeler için taın.:nLınana benzer

şcki l de koruyucu işlev giin1c:cteıiir.

t.l .<ı. Biyolojik Örneklerde GSti ve GSSG 1 nin Ölçii:ni..i ve Glut::ıtyon ;-!erioks

Duru."lıınun Sn;:ıuı.nmas1.

1hyo.loj ik önc:ni o lan çok sayıda olayda rol alr.ıaları nedeniyle,

dokulardaki sülfi(lril vep tiyol (SH) ve r!isü.lfid (SS) gruplarının

ölç.ül'Jıesine i l.işlzin yönten; anı~tırmal;:ırı, biyokimyns31 yönte::ıler içinC.e

belki de en yüksek sayıda o1.Jnlarc.iır. SS [;ruplarırnn tayini ;jnccleri

r\öni_işt.ür:::c ycintc;:ıleriylc yo;nlr.nş; cinin sonra ss ::::•,ıplnrı.nııı 1'1,ıores.ıns siiııdüf.'ne ôzelliğinden yrır,ırl:rnıLırı yünte'lllcr,

dıi.<;,'i~ pil ı da disiil.Ci('. de;i.;ıi::ıine katıl;na es::ı.sına dayanan yönte:nler ve

j)Olaroı;rafi:< yc:intc:ııl.cr geliştirilmiştir. Ayrıcı:ı oksidatif ve rerlüktif

açı1r:ıa vey::ı ti.yol./dis·ilfi<l (!el;i:;;i:'.1.i ile açıl8.c1 ycintc:nleri gibi indirekt

ölçiir:ı yöntemleri. de kulLnıl:nıştır. Si-1 gruplarının tayini. ıse, Sl! 1 ııı

rediik !.ev i.ci özell.iğinr~ dayalı genel yörıte::ılerle,

öz,~l \jklerine dayalı yö:",tc>::ılerle vey2 GS;i'c'.a ol.dugu

bile";,ikleri için özgiil yöntemlerle yapılagd::ıi.';Jtir (97).

s:1 1 ın

bclirl i ti yol

Yönte;n ne olursa olsun ilk basa:nak, GSH gibi protein olmayan

tiyollcrin, protcı:ı tiyollerindcn ı:ıvrıbıosıdı.r. Su c1rınçL:ı ::ıetafosforik

asit, 5-sulfosalisilik asit, trikloroasetik asit, pe~klorik asit, pikrik

Hsit gibi protein çciktUrUcUleri k~llanılır (97-100).

1.1.6. l. i.liyolojik Örııeklc~rj.:1 ibzı.rLınrn::ı.sı

GS!'. kolA.ylıkla nonenziır:atik olarak oksitlenir. Ayrıca i -gluti1mil

transpeptid:;1z i.çi:-ı iyi bir substrat oldu}und:Jn biyolojik Orneklerin

hız 18. asi tlcııd iri l:nesi gerekir. Döy1 ece GS!I' ın GSSG' ye ve knrışı!:

dislil:itlcrc oksilbsyonu ö11Je:1ir ve aynca 'ı; -~btamil !:ranspeptidaz

(GGT) iııa:<.ti.vc c,lLlir (g3). Bu nedenle yüksek Jjzeyde GC/l''ye sG.hip

böbrc:(, fh1nkrc~ıs ı-;ibi do~u.L:ırı.11 ~~ok hızlı bomojenize edilr:ıesi gerekir.

Karaci:;r:r, beyin, diilak ve \;ılp gibi d □ l<.iılarda transpepti.dc1z düzeyi

çok dı.i~üktür, bu ııedenle -20°C 1 de 10-20 saat bekletilmeleri ~ü::ıkünclür

(98).

Dokular111 ho~ojenizasyon~ yukarıda sözj e1ilen asitlerden biri ile

/2 5-20' lik (a/h) ho'.'.lojenat hazırlayacak şekilde ynpılır. Doku :10mojenat­

ları 9000x g 'de santrifü_jc edilip kullanılıncaya kadar 0° -f+ °C' de sak L:rnır.

t:,°C'(iC bir gcu~ bt~klct,:ıc ile total GSH düzeyindeki azahıanırı r..iniır.al

ol::ıc1.sJ.na kc1rşıl1.k hızlı c1.nı,1.iz örwribıektedir (98-100).

I. l.6.2. GS!! ve/veya GSSG 1 nin 'I':-ı.yin Yöntemleri

iliyoloji.k clokul:..ırda Gs:; ::.ayinleri enzic::c1.::.ik veya lci.::ıynsnl ölçii;.1

yôııtcmlcri il.c y::ıpılcıbi.lir. l.935'.lerde tanı::ı1_:ı_nan eıızi.r:ıatik "gli.o~sc:ılaz"

yôntcr:ıindc :nctil •::;lioks<1li11, L:ı~tilc aside dönüşii::ıiinü GS!l'a ba:Jır:":lı olJ.rJ.I(

katali.ze eden gli.o\s:11:ız ccızi::ıi:lin re8.ksiyoıı lıı?.1. 8lçülır,!.iş; 1950 1 ]12rC.c

ta:ıımJ..,na:1 Ki::ıy;:ı.sal '':\J lokso.n" yi.intcrr::i.ndc GS'.!'ın ;ı'.-l 7' Je alloks.:ınl:ı

rcai<.s.iyorı jri.ini.i:ıiin absorbansı 305 n:n'de spektrofotocrıetrik olac:1k sapta.1-

mı.ş; lY(>O'L:ı.rd,ı ta:1ı::1Lınc111 siilfori:< asit yünte:nindc, Gs:-ı 1 1n H?S04 'b.

ısıU.1m:,s1rn tnki:-Jen 265 n.m'de vcr:!igi. ahsorbans ölçülmüş, ayrıcı

iyodoınetrik titrasyon, nitcoprositle> reaksiyon yönte'llleri kull:ınılmıştır

(97,tCJJ,l.0'.'.). Ancak lw~cr. de kullanıbc1kt:1 oJ._qn g]io!<.salaz yönte<Di (99)

dışın;i:J, bu yi:intcınlcrin ôz:;;ill<.igti ve duy:::ı.rhğı düşıi 1ztür ve stdece total

GS!I t:-ıyi:ıi iç indir.

JO-

Ellm,-ın tar::ıfından 1CJ5d 1 dc sentezlcncıı ve tiyol dc.2. r c,J ks iyonlar J.

ilı, yiiksck kromujenü: tiircv1cr vcrc:ı hi.r aro:1c1tik rlisi.:lfid bilc,7 i:";.i,

ti yol hi l C"~iklPrinin ve r'.o1,:ccyısıyLı GSl! 1 ın t2yiııiııc biiviik ö 1',:i•rk koJ ,,.vlık

;;r·t:irmic,;Liı- (1Cıl,1D3,l:J/+). DT:-1(', sud;ı kolay ç,i,:i.:nür, Ljyo11erle rr.>ak:;jyonu

kolaydır, bir ır:olckiil tiyolc karşılık 2 molekül 3-k-:3.rboksi

lı-n i tro lıen:ccııt io 1 ~ı t (T:··-ı;,.) anyon!J ı:ıcydana ~:eli r.

s-QHO, • GS- ~ s--Q-HO,

coo­TNB

• Gi-S-S--Q-HO, coo-

coo coo

s--Ö-oo, DTMB

Şekil 5 DTNB' nin GSH ile reaksiyonu.

F.u t_i_yok i!ıoıı t:ırcvini n :nolar c:c~Linksivon katsayısı çok y;i~c:::;c~:l:i r

(E.,_,~12

t:1yirıi

1'31i00) ( ]{)/,, 105). bıı yöntc>::ı yakın zar'laıılar:1 kadar tcıt::ıl GSr[

iç in k ıı Ll anı lan ki :n yasal yön t e::ı ol'lm',; tur. Ell~ıarı

yöntcr:ıi,öLçiim !ı; 0 c:ııirıi .,:·;ı\tı,ıa'z i.izen~ yapılan çeşitli modifikasvonlarla

d:ı uygı1lzınr:n'.-;tır ( lO(ı).

l (JfıCı 1 cL, -,,c l i.';t i relik] eri c;sıı 'lil o-fL, 1;,] (J ehi [

yönte:'ı~eri, ,:\;ılu sorı:-a cs:ı Vı." esse T nin !ıir} ikt2 Uıvüıi için gel i::.tirj 1-

1~ i :~. U- ı- ( Hl:3) • Eu v,;:,ıı t c:,ıd e C '~SC , al k;ı 1 i o r t:a:;ıda DPT i 1 c verdi·~: i f l ,_ıoros :ıns

ii:>.er i nde,1 Lıy i ıı e:l ili rk,''.l, c::=::-ı, '.·1-el i ı~aleimicl (:ü:>ı) ile aJki l lenerc·k

Y,.in teı,ı i rı karş-ın OFA 'n1n pri mc' r a:ıı i_ :ı le r le

renks i yomı nedc:1 i y le ( 6' ey;) ,::;ssc; r rı iıı yüksek Ü lç.(.il 'Tlf:Si.rW neden o 1::a:.ısı

lı i r dezav,ınLıjdır.

lbJ1 ve l,ehninger'i:1 (.109) tan1.:;ılndı,";ı en7-ima:ik yönt2~.:dc, :;.~S0

.\AU!'li ile olcı.n ve :sl'Jt2tyon redJktazla ka!:.alizlenen re,üsiyon'.a Olçıiliir.

:SiADPH' ın bu rcnksiyon la stokiyo:;ıetrik dö:1ü.•;;l.bü, ya 340-400 n~ı' de spe'.(tro­

foto;;ıctrL( oLıra:, ya ı.la 366 nm eksitasyon ve 4\JD-300 nr.ı emisyon dal:;a

boylarında fluorimetrik olarak iL.lenir. iblen :,ullanıJan

yönte~lerdendir (6,99,1LO).

~ -glut3wi l. tr,1ns;ıe;ıLifaz (GGT) aktivitcsinJeki degi,;,ikliklcr GSH

r:ıctaiıoliz:'.1asındab de·.~işi_Klcr.in duyarlı bir göstercF'Sit:ir (11.:_). Genel-

1.ikle hep.::ı.tok.:ırsinojenler GCT'yi kuvvetle indüklcrler (112) ve çe!;;itli

~scnobiyotiklcri:ı 1 • • • ' .. ursınoJenıK etki.leri:ıi;; scıptanr::asında

histoki:1ıyasc1l olarak tcsbitinin etkin bir yö:-ı.~_em oldu;~u bilt.lir::.cktdir.

(5,113). Jqer tarnftnn L- 'd -glcıtaınil-p-nitro nnilinir1. Sl:bstrat olarak

kull.:H:ı.ldıi;ı \r.ısit ve dcı·/arJı bir c;;T tcl.yin yörı.te;r,i de seli,';i::iril::ıi;;tir

( 106) .

CSI! S-transfcra;:1:-.rının ""ıı'cster~ B.lot" tckni:;i ile vey:ı basit

kolorimetri~ yöntcı:ılcrle

konjııgnsyon rcaksiyonlo.rını

kullanıl::ı,;.kto.dır (19).

tayini de ksenobiyotiklerle indüklenen

ve bu yolla GS'.! tü~ethıini ölçı,.ek için

Stoki yo::ı~tri'.z reaksiyonlar içeren yöntcr.ılcre e:z oliıra~ çok dakı.

yüksek cluyarl1r;1. oLrn cıızüntik dön,;üyöntc•nlf'ri (rccycil:1z ass3y) de

gel i,•;;t_i_ril:ni<_;tir. 3ı.: yöntc::ılerCc Ell:nan reaktifi i1c yapılnn a::;:ılitik

tilçiimlerin, SH !;ruplar1-na duyarlı ve Ö?.gül ol:",aması dez2.vantaj1-, orta;.13

GSSG 1 ye çok y\iksc~:-:: öz;;üllii~ göstere;ı gLıtatyon rcJLiktJ..o: (GX) enzi.!;ıi_

i L::ıvı's i ile ortada;ı k.:ıldırılmc1ktadır. Oı;ens ve Be lehe,' 1 rı ( 114) bir

;;ıikro:netod o lar;ü gel işlird i.~ l eri DT;;-3-GR enzi::12.tik dcingii yönte',)i_, daha

sonra Tietzc (115) tc±rnfından '.:lüyük. ölçüde modifiye edilmiştir. Glutat­

yonuıı oksi,;c ve rcdi.ikte .şekillerinin birlikte tnyin edildi~i bu kinetik

y0ntF-·:ırle GSl-1 V(:y:ı GSSG ilr:' G:{'nin katA.litiK ;nihar3-arı, DT'.\B'nı:-ı :-iAiJP:l

ile: sl.lrekJi red~:"siyonurı3 neden oLı: ve olay aşağıdaki rec1ksiyon:!_o,r-:ı.

ı:ırire yürjr:

-32-

ııonenzı maıı k 2GSH + DTNB ---------GSSG + 2TNB GSSCi + NADPH + H'-(_-,S_S_G_, P_.c_d_uk_ıa:_. 7

-· -----►~2GSH + NADP+

NADPH + 1-f + DTNB CiSH .·· fiSSCi -~---__,►.., 2TNB + NADP" c;:::::;c_; Redükt:ll

Kullarııldıgı her laboratuvarda az ya da çok modifiye edilen bu

yöntem halen en çok kullanılan enzimatik yöntem özelliğine sahiptir

(98, lDO, 110,llô,117).

En,:imat ik döngi.i vo:-ıtemi orta:ndaki GS'.i • ın NE>! ( gg, 105,110, 117-122)

veva 2-vinilpi ridin ile (28,40,41) :nas'ı<-elerıri:Csi ile GSSG için de özgül

\ıale getirilebilmektedir. Dolayısıyla, I.1.6,l'de genel olarak

değinildigi tarzda hazırlanan örneklere doğrudan enzimatik ölçüm

uygulanarak total GSH; NE.~l veya 2-vinilpiridinle muaJıeleden sonra uygu­

lanarak ise GSSG tayinleri yapılabilmektedir.

GSll ve GSSG tayinlerinde kağıt ve kolon kromatografileri dahil

çeşitli kromatografik yönte~ler de kullanılmıştır (6,98,118). Ancak

llPLC yöntc:nlcri dışındakilerin en büyük dezavantajı yavaş oluşlarıdır.

GSH ve GSSC ı nın scparasyonu ve duyarlı tayinlerine ilişkin çeşitli HPLC

yöntemleri geliştirilmiştir: 2-Virıilpiridin ile türevle;neyi takiben

iyon-de;_~ işi,ıı kromatografisi ve ninhidrin ile tayin; Kosower'in

ınonobror.ıoııiınan reaktifi ile turev1c:;ıe ve zıt faz HPLC ile fluorimetrik

tayi ;ı :,,ibi ÇC'}itli türcvle:::e işle::ılerinin ve clcktrokirr.yasal ölçümler

de claiıil ÇC'.;itli dctek tör~ 1 erin kullanıldı~ı HPLC u ygularmıaları

bulun::ıakt.:ı.dır (t'ı,93,123-125).

1.2. 1,, Vitar:ıi:-ıi

J .2.1. r:imyas:ıl Ya;n:,ı

E vi tzı;ıı ini ilk kez 1922 vılırıda, sıçarnLı fötal ölü:ıüi ve rezorps iyonu

üııle:ııc yf"tene:~iıw s;:ı.iıip, yaj,b:1 r,:ozunen bir diyetsel faktör olarak

t;ıııı~);,ıırıı\;tır (126) Bu gi.iıı lıu tcri11, nitel olarak a<-tokoferol akv;_vitesi

-33-

gösteren, toko ve tokotrienol türevi en az sekiz adet, yağda çözünen

bileşiğin genel adıdır ( 51). Her biri 6-kromanol türevi olan bu

bileşiklerden, çeşit1i türlerde en çok bulunanı ve tür:ı tokoferol

bileşiklerini:-ı en patent olanı c< -tokoferol I dür. Şekil 6 1 da bazı

tokoferollerin genel kimyasal yapıları görülmektedir.

R, CH,

R, o CH,

CH,

HO

R,

B:lEŞıK R, R, ıı,

CX - tokoferol CH 3 CH 3 CH,

fl- tok of er ol CH, H CH,

)!- 1okoferoi H CH3 CH3

s- tokolero: H H CH 3

Şekıl 6 oc-;~-1 ½- ve b-tokoferolün kimyasaı yapısı.

I,2.2. E Vitaminin İşlevleri

E cksikli:';inde hayvanlarda kas distrofisi,

distrofi, ki.stik fibrozis, kolestatik karaciğer sendro:nu gibi çeşitli

bozukluklar ve biyokimyasal de~işiklikler meydana gelir; ancalc E

vi:::amini;ıi:1 bu lezyonlara karşı Koruyucu e:::.Kisinin kesin :::ekc1nizr;ıaları

henuz t.:ı..ıı ol:ırnk bilb.mc:ncktedir (51).Diğer taraftan o(-tokoferoHin,

ser~cst ra,li~allerlc başlatıla~ peroksid □ tif doku hasarına jarşı hücresel

savun:nc1ıl3 pr1.l':ıcr iı:i r rob olC\..'.~u i<abul edi l.1ır~Kte ve hücresel ac:.tioksi<lacı

snv·.1:1:na sistenleri:1in bir ana Cli leş eni_ olarak adL:ı:1dır::!.l73ktadı::

(51,127). ;.; vlt:1:üni y,1ğJa çi5zünfc:l bir bil.~şik olarak bi.iyük ö1çüdc hücre

mer:ılırarn:-ıd:::ı. yer 3l1.r (128) ve bu özelli~i ile serbest radi 1cal toplayıcı

r;ıekarıizma.Lıra \c1t1-lr:ıas1. özelliği uyu:;ılu:lur. Hücresel i.7lcvi i(ısaca şi)yi_e

özetlenebilir:

Peroksit Lıdika1 lerini to;:ılayarak nLincir kırıcın antioksiC.:ı:--ı

görevi gôrlir ve hiicrc serr.br3n"!...cınnın lipid pcroksiCGsyonu i~e !-::1sarı::1-

önler ('ıl ,S.'ı,l'..'.7).

:!c0 :ı,'.ır~ın sla'Ji 1 lz:1syorıu ve :r,e:noran enzicrılerirıin mo,llil.ısyoııcın:.b

rol a1ır (12'.-l).

S vit;-ımini eksikli:~i oL:rn tav.?arılarJa hepalik ksaı:tin oksidazın

de rıovo sentezinin :ırttı:~1-. bu :ıedenle E vit::ı.:nllıini:ı protein sentezinde

roli.i oblıi lccc)\i ve eksikliğinin süperoksit raiik3li oluşu:ntııı·J

artırabilcceji ileri siirıil:nekte<lir (]29).

!1.i'.<rozo::ınl_ cnzir:ı :.ıktivitesirıi rleQLştirerek kseno':::ıiyotL<lcri:ı

r.ıeu1bo1i7.rnc1s1ıı1. r:ıodii.1c eder (130).

Proslıı~lıınr\inlcriıı ve lipd peroksidasyon ü::-iinlerinin

o1w,;ım:ı:ıu :ıto(!ti'.e e:lerck i::ı:n\in cevalıı ve h;.icresel i;nmüniteyi reg:ile eder

( 1 :ı ı ) .

I.2.3. E. Vitar:ıinl:"li:ı, Sc, C Vita::ıini ve GS!l ile İli-?kisi

!•: vil:ınaL,lin, cizcllikle Sc ve C vit:-nini (i-l.skorbik ;:;sit) gilıi bcsi:ı

ii::ı,eler i fmı:c;iyonel i1 i_şki_si vc1rdır. K.1.s dejerıerasyon::, sıç.:ın('.a

k::ır3ci;~cr nekrozu ,;ihi E vita:nirıi yctersizligi i1c ilişkili. s<:mj.'tor:ılar,

d Lyc;tsc1 S ·ı d ·1· 1 ·1·1· S ·1 '·· 1 •·ı· (13') .e ı c c t ı\;,(ı~Hır ve e verı ere;< on~ene □ ı .tr _. Ayrıca

F, vit::ırıini,ılıı antioksidan fonksiyonları ve organiz.ni1nııı '...: vit3;;;i_rıi

ihtly:ıcı ile C vit;:ı:-;;i.ıi nrasın:::!.a do ':::ıir ili.'~ki vc,rĞır (133,134). Ya.kın

yıl.l.:.ırdn Y3!nl.:1n çal.ışııalarda, E vital!i.ni, Se ve C vit:ıı~;jni acısınclal-çi

fonKsiyonel ilişkiyi aydınlatabilccc:.:. önemli veriler eLie cdilıoişlir.

'.lidro;ıeroksitlc>rin indirgen~esindc rol cbn GSii-Px ve fosfoli.pit

'.üdropcroks.i.t GSi!-Px enzimleri Se'a ba;;lıdır. Bu nedenle :le Se, hjcrc.ıin

E V i t:;,::1i;1i ihtiyac1.n1 azalt..ır (:37,135). Dii_;er L.ıraftn:1 csıı,

I. l.). 1.. 2. 2 'ele suzu eJildigi :--;ib.~, E vita::ıiniııin n:jcw2Lcısyo-ı-c1:,fa ro 1.

alır ve GSH'ın i!1 vitro ko7ullarcla li;ıi<l peroksiCasyona ka:şı kon.::yuc.'.J

etkisinin E viLı~ininc b.::ı:\ı.;nlı ol<luJcı :;özlen;;:iştir. Ei>.ınun '.ıir enzi::ı

vcy;ı Cl\7. İ.:ll sister:ıi. :ıracılı:;ı ile, örne,~b, c;s:-ı 1 a ba~;1-ı:ıl.1., ısıya

dayanıksız ";:,i.r 18.Ktür(irı veva faktörlerin aracılığı ile ola\Jileccğinc

ilişki:-ı veriler bulunmakta<lır (136,137).

b~ vic1:-.:i:li ile C vito.:1ıi.ni ilişkisi ise olc!,.:kç:1 komplelcstir. Suda

çôziinr>:-ı hücresel bir antioksidc:ın olan C vita:1rini, tiyol gruplarını indir­

genıni.ş lı:~1.dc tuun kapasitesi.ne sahiptir ve hunu bir ço1< redo1<s

reaksiyonuna girerek ve si.nglct oisi.jeni ve serbest radikalleri topla-

yc1.r :ık :np::ır (1.3tı, 13,S), Ayrım i-: vit:ı.::.irıbin 3ntioks.id3n üzellii-:.lcrini.n

re_icnc.'r:ıc;yonııııd:ı. rol alır. O( -tokofl~ro l, nıdikallerle reaksiyon:ı gir.ii­

:~.i.rn!e kro:nano!(si.:. radikali ol.u-;;ur (P,K.z I. 1...3.1.2.2.) ve taleben, doic:.ıLır­

d,1ki eıı ri,ı:.•nıl i tc>rsi.:a 1:ıez o~sid::ısvon ıirüwi olan c<. -tokofecil. !cinoııa

diirni.'~'iı· ( lJ'.J). ı\s'..;.ortıik .ı.5i(i.i.;ı, E vitı::ıinini, tersin;;ı02 tobforil. kinon

kaıı1.tl;ır :ıııl,11ncı;(Lı.dır, ;ınc:ck bu vl'ri.lcr in vitro çalış::nlarl:ı. elde

crliL::ıhli.r (~40-\.'.d',,in vivo çalış;naLnla elde edile:-: veriler ise, l:er­

nc!zit,1:Jr iı.v.1 t·Jrlcrde ::ı::ırjjn:ı.1 vit311in C e'.csikliJi ile, akci,1cr ve

kar::ı.ci.,-;cr clo'-rnl:.ırında E vjtaa.ıini.nin azalıiı~~ını ::;öst(>riyor ise de, hcn'.iz

yeterli dc'~.i 1.ıl ir ( 11/ı).

C vitcı::ıin:inin ve c·;;ı'ın, rejerıere e<lici et:cilerü,e ~arşılık,

düz c.• y le r i. n i :1 ida~ıesi çeşitli .ııetabolik yolaklarla sa·JLanır. C vitn-

mininin rcjcncnısyon 1"1 c;.Sil'a ba~ı:rılı bir dehdro:ıskorbat recli.iktaz ve

-3G-

bir ;-lA9!1-serüdelıidro-ask.orbat redt..iktaz ile saQlanır (145,146). GS:ı

düzeyleri ise' GS'.l sentet:,z ve GSH rediiktazla regüle edilir. Anca!( gerek

GSH gerekse C vitacoininin suda çözünür olmas, ve öirincil olarak sitozol

de bu1 unmaları, bunG karşı] ık E vitami:1i:ün yagda çözün:ir ol::ıas1 ve

birincil olarcJ.k biyo'.ne::ı:Jra:-ıda bulun!:lası rejcncrasyon Konusunu tartı~'.Jal1.

tutm:.ı.klcı (147) ve daha L:ı.zla incelen:ııesi gerektiği anlaşıl:.;aktadır.

1.J. Allo?uriııol

T .3.1. Kir:;y,ısal L!nısı ve Biyoloji:( Etkileri

Alloµu"inol Şedl 7' de görüle:1 yapıya sahip hipoksantin analogu

bir bileşiktir ve alt,;_ol<lc çözünürlüğü azdır, alkali hi(!roksi.tlerde

çözünür. Oral alımı takibe:1 a:)sorpsiyo;1u hızlıdır ve plazma ?ik

diizcyleri:112 JU-60 dakik3d;:ı ulaşır. Plazrr.a yarılanma ö,:ırü 2-3 saatdir.

Ana :netcılıoliti o}an oksipurinolün yarılanma o:ııru ise H3-3J saatC.ir

(_148). Her iı<isi detür.ı vücut sıvılarına dağılırlar, anca/( beyindeki

konsaııtrnsyonları diQ0r dokuların 1/3'ü kadardır ve plazma proteinlerine

ha~lan~azlar (146).

h

I.1.1.1. Kscıııtin Oksitlnz ve AlloııurinolJe İnhibisyon

Al1o;ıuri:ıol duştik ~ozlnr~a ko::ıııc~itif, yiiksek dozlarda nonl{o:ııpctitif

ol~ır31: ks:ınti:--. oksi.ı!::ı:c (:W) e:ızi::ı'.n~ irı 1 ıi.lıe eder; XO ile :~elaboli:.:::ıası

sonucu ol~~;ııı o~sipuri;ıol ise enzimiıı nonko~petitif inhibitcirüdJr.

~37-

Güçlü bir "OH toplayıcısı olduğu bildirile:ı (149) ve klinikte

hi;:ıerürise:n.i tedavisinde bllanılan allopurinoll!:1 biyolojik ve foma­

kolojik etkilerinden, maddenin kendisi kadar, oksipurinol aıet:aboliti

de soru:nladur (148,149).

XJ, bakterilerden insanlara kadar çeşitli tLlrlerin do~ıılarında

bulunur, ancak h:icre f:i.zyo1ojisirdeki rolü ta:a olarak bilin.:ıermcktedir

(150). Biliııcn işlevlerinde~ biri pürin metabolizması ile ilgilidir

ve p'.irin bazLır·ırn h;ıoksantin ve ksantin :.izerinden ü:-i:< asirie

(!önu~tUrür. IJi~er taraftan X0'1n hücrede s~puroksit radikali oluş~asında

.:ıııa bir fakt:ör olduğu ve XO aracılı;;ı ile olu.';'cın sertıesl rac!ikallerin

iskeırıi-reperfüzyo:. hasarı ve !ü;ıeroksik a:(ciğcr h3.sarı gibi patofiz-

yolojik olaylard::ı rol oy:ıadığı bildirilmiştir (67,150-154). Enzimin,

oksülaz (XO) ve dc!ıidrogenaz (XJD) oJrr.ak iizere, iki şekliP.in olCuğu,

XO'nun aşi'.lğıda gcisteriler: reaksiyonlardan 1. ve 2, 'yi XOD'nin ise 3, 'yü

katalizleJiği bildiril~ektedir (lSO):

.. - + Ksantin + 20r 1120---- t·rik Asit+ 202+ 2H (1)

Ksantın-+ C)ı+ H,O --ı►► Crik Asit+ H2o

2 (2)

Ksantın + :'iAD + Hfl2--Crık Asit+ NADH + H (3)

A1 Copuri:ıoli.in, hi;ıok.s3nt i~ıden Ksant:i.n olı.:şu:ıı·..: b3Sa:'.1aQı:u inhi':le

ol:.ışu:n:_:nu inhibe ettiği (149,151) ve o2

• ile

ba7l:ü1 la:: sr>rtıE'.Sl rad.ka1 reaKsiyon zincirin.'.'.e oluşan ·o:-ı 1 1 temizleC:iği

lıildiril~ı::.ş:.ir (Ul). ·o:ı toplo~adaki etkinliğinin mcı.einitol ve dimctil­

s'.ilfok!;it (;)\1.SO) ile kıynsLın::ı'.l:ilece'.< kadnr y>.iksek (109 M-1 , s- 1 ) oldu1:ı, anuık ol<sipurino1 için bu dc[;erin 4 ki:1t fazla oldu~u; ayrıca oksipu­

rinol 'ü,ı, niyel.o:,croicsi:la;,, ile oluşan hipoklcirciz asit iç.in de toplayıcı

nılii oLLı:'.,ı :ıiLliril.:ıc'....::tcıiir (14'}).

-38-

Allopurinolün serebral iskemi-reperfüzyon hasarında koruyucu etkili

old ugu ( 1'S2, 153), etanol ile karaci~erdc i nduklenen lipid peroksidasyonu

ve GSH azal ;nasını öne;nli ölçüde azalttığı (154,155), iske:ııik sıç an ince

barsa~ında glutatyon redoks durumunu düzelttigi ve lipid peroksidasyonunu

azal ttıgı göstcriLrıiştir ( 156).

I.!,. Lıdosıılfa:ı

I.4.1. Ki~yas2l Yapısı ve Özellikleri

Erıclosııl fan ve-ya T!ıiodarı (1,4,5,6,7,7-hc:.-:zakloro-5-norborniıı-2,3

,liınetil siklik sıılfit), siklodie:1 grubu bir organoklor1u irısektisittir.

Çok sayı ıL, uy l' s ı ,ıı n kul 1 a ıı ını ı nı n y asa:-C 1 andı Q ı y ,ı da sınır la rı dırı 1 d ı g ı

klorlu hidrokarbon grubu irıscktisitlcrin, kullanı:nı devanı eden birkaç

L:ınesi rıch~ıı lıi r idi r ve iJl:Zf':nizde en çok kul LrnıLm 10 irısekt isi t içinde

yer alJr (157).

E rıdosurf oı

c, C!EB=CHıO--...,_ ,,;; O ı cı -~ 1/

C! o; 0.,,-~0 2

cı

Endosufan SÜifat

F.ııdosu l Lrn ve A:ı:'l >1et3bo l iti Endosiilfan Sul:at

SC),:, kokulu k:ıhvc n_'n;;i k ri sta lcrı bir k.::ı tı o lan e:ıdosu lLrn iki ( 0< ve Ş)

stereoizon,,rin karı.~,11:11:lır ve teknik '.;'eklinde lX_ izo:ncri daha yüksek

orand:ı :,ıu\unur (cx: ~ or.::,nı 2;l'dir). Sud;:ı çozun:;ıcz, orga;1ik çözücü

ve yag1arJ;ı çuz;ınur; ::\ııı J '}ı;~ındacı etkilccrncz. Alkali ortar:ıcl3 yavaş

bir hidrol:iz]'._' dio1 ve SD/c hidrolize olur (158).

l. 4. 1. 1. Endosulfa.n' ın >let,ıboliz~:3sı

Bi.tkilcrde !:ıöcclderde, ve r.:c.';lelilerde ya;nlan çcılı.ş::ı.:ılar gcr~k

0(-, :_;erekse p- izor.ıerirıin cndosülfan sülfatc1 (Biz Şcki_l 7) ,~•Jaüştii.~li

ve bu metabolik k'.ı;zurt oksüL::ısyonunun ~ıetiooklor ve e~ıdosiilLın dışında

ditcr orranoklorlu insektisitlertlc gciriil~crti~i bildiril~iştir (159).

Anc3k lrn su l foksirL1syoıı yola~ı endosüLfc1n i~in bi~ detoksikasyon

rnekarüz:n:.ıs1 ık:\ i l.d ir ve böceklerde endos'Jlfan kadar sülf.3.t mctobo li ti

ele toksikti,. Ei1dostilfarı :netA.boliz:nasınGa böceklerde toK.sik ol::ı;ıycııı

alkol ve; eter ;:ıct3!Jo.l:i:._;_cri de olu~ur, cx-,1ıetcılıolitiıı, p'd,r, :.ia:ıcı hu:Jı

::ıetalrnlizc ol,h(;u ve bunıı'1 CokuLı.cdcı ~-izomerirıin birLbn2siııe ııcr!cn

oldugu hi1diri.1'nc>;.tdir (159).

Di,1er t=ırnft~ın GSi! S-traııfernz.lac nrncılıgıncla GSI! ik korıju~asyonurı

endosi..ilf:111 içi.n bir detoksikasyo:1 yoL:ı·}ı oJduğu; endosdL111a s~:re;<.Ji

tc;:ıas eden lıciceklerJe ve O'.~urgasızlard3. GS:! S-tranfec.:ı.z ve GS'! indük­

siyonu giizlE-~ndi~i ve bunun inscktisite !rnr';,ı rezist:ıns gcli%ıesinde

temel bir rot oyncıdı~ı bildiril~iştir (160-163).

I.1+.1.2. Toksi.k Öz(~llikleri ve .Stk:i. '.'!eK:rnizması

Tck'1.ik <;,E~,<lirıi:ı SJ.çc1:1]0.rtb oral LD_) <le,Jr~ri. 80-llO ~n/,u,'dır, cilt )l ,. co '°

yolu il.e L!)Sll (tcıv.'7nndcı) dr~:~;cri isC' 359 "1g/;q olar::ık vcrihıe!<tcdir (158).

~:ndosii l :·:u:1.n b i yol oj i.:z ve tcksik ö:~e l.l ikl2ri \oıııısu:ırbki veril er c;o;ı

derece s.1.n1rlıd~r. Y:ı.yı:1l:-1n)::ı klorlusü:Lodicrıl.cr genel '.ıir grup o.L::ır:ık

0!1.n::n~tır. Aldrirı, dieldri:ı,

tiyel.('r.iııin dt~ lıulundu<;u b:ı ;ırubu:1, bil.inen e,ı tok.sik ve çevresel

kalıcılı:tı oln:1 µcstisltl~r arns~ııda olduJu

Cil Ll(~ll de kobyl ıki,1 2.bsorbe edilirler,

bildiril;Je~teGir ( L:J9).

dol::ıyısıyL:ı :le·::

inscktisiti' 1, hem de "sistc;:ıik i,ısektisit" oL:ı.ra:< .:ıJla:ıdırılırlar. Düşii'<

dozl::ıra kroni,~ u:::ı:ıs].a SS.Srni.n duyus31 V('. motor bil.e:fenlf'ri;ı.i içino

aL:ın nöroto:-::s:isitr~ye sebep olurL:ır. Gene1likle 2-::3 sa:ıt gecik:ncylc

.:ıkut etkileri de ö;ıcc aktivite d2;ırcsyonıı, sonnı.

hi.pcrcksi.tabilite, tremorlnr ve konvJlsif nöbet1cr şeklinde geliş~e

-40-

g~istcrtr (l'i)). DiÇ;2r taraftan erdosülfa:1 d:-ı da1li: sıçar,larcia ter:ı::ojcni.k

ve cı:1bri.yotoi<si. k etki pot3:1siyelleri oldtıC;u, tekr:n1:-rnan

dokulc1nla birikti:deri, b:ı.-,;ta karaci~er oü13k i..ızere orc;aaı bJy,J:ncsi:-ıc

neden l)ldu~brı '.J Lldiril:ni..~,tir ( 164- Hi6).

Jlüce~ Lcrde tle iı ipereksi t:1syo:: ve sinir J enle tekrar lcınan dcşc1.r jlar

şekli nele :ıifrofizyolo j.i'.< <:;i.izle::ıler yapıl:nışl ır ( 16 7). Siklodienlcrin

rıiitotoksik ctld nek3:ıi.z:naları UDT gibi oq:ınoklorlu insei<tisitlcri:1

c:ıi<sinc, perifer:icn ziyade 11er:c:~zi sinir siste:nini içine a'.:_ır V(' \:irn_nısal

yil;nları gibi ct:cilcri de pikrotoksine benzer (1".)7,168), Pi . .zroto'.csin

bir sinir olup SSS 1 dcki 75 -cı:ninr))ütiri\ ' ' \ ,, \) \ \.J.' _);

antagonistdi.r (l'ı9,l67). GA:3.-\ nciron"l.ann l<lorür :..:;ıtai<e'ini. i_n('.'.ciclc:.'c:1

bir nöı-:otr::ıı-:sı:ütcrdir. rliyo;:ıkti.vi.tcniıı pikrotoksi:ı veva siklodic:ı insc:{­

tisitlcr t'.1rc1fırıdaoı b1okc cıliL";",esi :1iiro:ıl2rEı a:ıca'c ,ns;~l'll re:,olc1rize

cdi1rx•lerı ve irnnlro1 t:c!ilr:ıeycn bir eksit::ısyon ;13li içinGe k:11:ıı::ıla~J.a.a

"\+ -,+ '[' ' 1 nedc:ıı oluc. Ayrıca siklodicnlcr ı\: , .\ -A ıaz ı:1 patent in!libitö~l.cric i_r,

Lık:ıt d.:ı.'."ıa d2. iincmLi.si k:1lsiyu.:ıun r.ıe·:ıbranlarda:ı tr;Jnsportu için elzen

olan

hiicr(' i_ç i

.,,., +2 - -\TP·ız' ı • •.:, • • C "

scrlH>st Cn +:2

inhibe ederler (l59,lfı7,168). Bu

ı:ı artışına ve so:-:uçta ko':l.7u

iııhi'.ıisyo,:

ncironlarda

<lc~ulıırizasyu:ılnr ile s=i:nulus~n tüm SSS'de yayıl~as1:ı3 sebep olıır.

!'.ıı do s :1 1. Lırn ıı OT, ~ı r g :1 sız 1 a rd rı 1 ipict :neta :JOl iz11cısın ı dc:1 icştirı.li,:ji

( 16 l), s1ç.111 Lır,!:_ı ;nr':..:ıran li;ı:i.d ;ı:-ofilini

:wlc'slrol, fo:~f:ıLidl 1 iuJl i.ıı orcını:n artırr!ı:";ı (L69) IJilc!.irilnJ.~,

,:ıi!zro:~orrıcıl V\c s.Lto~ol. cıızi:rc indüksiyonu y:ıµıcı et:dleri konusunrla i.se

I..l.J.. Ki:ııy:ıs:ıl Ya:nsı ve Fizi'<sel Özellikleri

Siprot lolcc.::ızi.:1 ( 1-siklo;,rop i. l-6-fluoro-1, 4-diiıidro-4-okso-

7-( 1-;>i:ıcraziııil- )-b,ıo l o,,-1-k:-ıriıoksi l..ik asit), prototi;:ı.i 30 yıl ö;ıce

gc.li.ştirilcn ııa.lir~i.ksik asi: ola:ı ki;ıo1.on grubu :ın~ibiyotiderin '::ıü

-41-

üyesidir. Doku penetrasyonlarının çok iyi olduğu ve mevcut a:ıtibiyotik­

lcrin rezista:ı olduğu pekçok gra'n pozitif ve negatif bakteriye karşı

yi.ikse;( aktivjtc göstcrdi;i ileri sürülen (173-176) kinolin karboksilik

asit ycJ;,1-s111(bi<.i b:ı antibiyotiklerin fluo!"lu bir türe\'i olan C?X'ı:--ı

kimyas:.ı! yapısı (::ı:ı.a :netaboJitlcri ile ::Jirliktc) Şekil 8'de görı..il-

mcktcdiı-.

o

/ -/LOCOOH HOJS-N IJ- 'V "N _,,

'----' 6

Siprofloksazin

Sulfosıprofloksazıc (M2) Formılsiprof!oksazin (M4)

Dese~iiensıprotloKsazin (M1)

Şekı! 9 Sıprofloksazın ve bılınerı r:ıetabolıtier:nın kimyasal yapı:arı X Henüz tanımlanmamış araürt.in

Cl'i-!'1:ı :ı!:.-ı :lc';crlcri tl ve .S,S'Cir, hiclroklor\.lr veya L-<..<tat tuzları

h.1li:1,!c.' çOzünı.irL.i;;ü 36 sulu

I .5.2. ili.yoyaL:rlanıı-cı ve f?3r:•ı:-ı~okiııetii< Özellikleri

CPR'ı:ı :1bsor;ıslyorı'.l '.lı:>:tıdn. Gö:ıülliılcr:ie .i._Q,J-1.JOQ rn;;'.'..-ık ord

dozL1r1.nı tc:ı:ci.ben pik scrw~ı c!iizeylerine 1-2 snat(le uLı.~-ı lır, l()(J '.'.1'.~' lık

iv dozu ile ul::ışılan serum düzeyleri onıl dozl:::ı l saatte ulaşılan

dii7.cyler ile ay:ıı:lır ( l.rJO :;ıg için :J ::ıg/L) ve tablet !:icidir.Jc

uy;_rnb.r:ıaltırı da dahil, ort:ıLı~ıa lıiy:.ıy:ır,H"L.ı.:nının ,-, 75 - :; S5 arasında

oldu:;La bildi.riJ:ni:_:;ti.r (173-177). Serum için yarılarıaı3 O:nrü (t117 ) 3 s::ı::ıt

civarı.ndaCı.r, d:c(;ılım ;ıac:~ıi 18:31 ve total vücut klerensi 42 L/sa3t olanı~

hesapla:ı;:ıı~.;tır (17)). 7'j() :n::; oral do;:u L:!kiDen seru~. k.o:ıs2.ntr3syon:.ı

6 p;-:,/,ı:l, i,ar.ıci~t'r doku ko,ısar1tr:1syon'J ise 12,7 fl';,,/:-:ıl o.br::ı!\. ölç.tihit,;'tiir

(l73-178).

ı\nU lınktı:'riyeJ e'::kisi ::.Li:~. kino::!.on gruJunda olduJ·.ı gibi. lıa:üeriyel

ginızcn (D,',f.'\ topoi.zornenız 11) inhilıisyo:ıu suretiyle ln.'-<terisidal etkidir

(l74). CPR gend.lildc '.\iivc;11i. lı"!.r anti.Lıiyo':ik oL:lra~ tanımlanır (103).

Fnz Il ve lfl. rlcinc:1i.,Hl-2 yer ,ılnae 8861. v;Ü 1 :ının dc<_4crlcrdiri1"Jcsi

lınst:1l:1rın '."::1.U':..ı:ırl:-ı, y:ırıd3;-ı L1:-:bsı g:ıstroi:ıtcstinal, metnboli.k \'e

niltrisyonel !ıoz:ıkluk!ar □ 17::ık '.!zere zıt (3dvers) etki gLlzlen:li~ini ortaya

koy:ı:ı.-;<tı;r

ctki.lc:-ri

Llıı

ö:wı1ldi.r.

ki.no:o:ıLırı.rı :ırı t.:. tıi \'()t i:dcrci::ıı :":ır'clı

or:1:ıJ nchı.

o.i.cırak, kıs::ı

sss birlikte

l'. 11 etki.J,,r ;..;onri:zyon, ;,.ılusircasyo;-ı, :::ı:ıksiye::c, aji.t::ısyon ve epi.lcpsi

bcn7.cri 'w:ıvjlsi.f ıı:J:ıeL.lcri ,u~.s:,r ve ya.',;lılarda rli:ıYw sı'( oiarnk

~i_i7.]r_•1H!i. 1,ı. '.ıl_i_ri.i.r:ihiştir (B4,.lSCı). \ite:cim C?:\'ııin Kulla:11,;:ıda olan

prcııJrııtl:ırııı~rı prospc~tıis;iııdc de ya5lı hast3l3rin, cizclliklc de mevcut

lıO;.'.L]!(LJkl_ırı. o!:ıııl:ıcda, iirncjirı l'pile~~i..'<. hastal::ırda ve/vcy:J.

ol:rnLurh d i:~k;:_ı_tle kıı l 1 :ıın lr:nsı cincri lı:ıcizted i.r. Ancak bu niirotoksik

et:( i pot 311s i_ ye lin.i rı tc:.ıc .lindc'.<i mei(anizrr.J.L:ı.r bilin::ıc11cktedir, y::ıpı -

-43-

aktivitc ç3lışmaları fluoroki:10lorıların GABA reseptör a·,t • ' agor:ıstleri

ile bc:ızcr bir y::ıpıya sahip olduğunu ve epileptojenik potensleri ile

spes:ifik GA:H n'sc;ı::ürlerine baglanmala:ı arasında bir ilişki oldugunu gös ter~ı:i ş, c;:ıj ~cpto jenik etkilerinin muh tec:-ıele:ı

bagLı.:1an ve GAL\..\ reseptcir antagonisti gibi etki

7

yapılara ba~lı olJugu ileri sürül~üştür (185,187-199).

nu:nara]ı pozisyona

eden GABA-bcnzeri

Di_;;cr taraftan C?lt ':ıin kısa s'.1:eli uygulamadc1, glukoz ve oKsi_jen

rnctc::ıbolin;~ısı.nı ctkilcr:ı'2z\en, beyin kan 2.\ı:r,ın<la öner:'.li ölçüde dii~üşc

,.·ol aç.tı:.',' r.•,i:.istcrilmi.."",,tir (ltJü) 'ı1inrow ve c!iti (191) ise c:)K' · · . • • • o· , n::_rı ırıtr,ı-

krnni.aJ basınç artışına scjcp oldu~unu göstermişlerdir. Du etkiler

sercbral iske~i tnblosu ortaya çıkar~a~ yorıüııJcn cine:~li olara~ JU~ü:ıü­

lcbilir.

C!)K 1 ırı tcofilirıi:. klcrans:ın:ı azalt:ııcık suretiyle klinik öne.:,i bi..iy·j!<

bir ctki1c~~c potansiyeli o2ju~u, kafeinle ve nonsteroidal antjinfla~~­

tııvrır ilnçlarla clkiloş~clerin de cine~li SSS etkileri oldugu bildirilDis­

tir (lSS, 1Sl1).

II. DENEYSEL KISIM

II. l. Kull anı L:rn Kimyasal ~laddeler

5,5'-ctitiyobis-(2-nitrobenzoik asit),

E.ll'Tian :\ecıktifi

Al lopu"inol

~-:,.l_ikotinn::ıid ndenin dinükleotid fosL1t,

rcdiikte fonı (P-~ADPH), tetra sodyum tuzu

D.ic~ileter

;~ vita!r.L:ıi (d-.-Tocofcrol)

l::'.ndosülfarı

EU.lendüı..'11i.r1 tetra asetik asit-disodyu'll

GJut3tyon Redüktaz (III.Tip, Gakers Yeast)

Hidroklorik asit

Kilrbontetraklorür

(!etnfosforik asit

~hsırôzi.i yngı

N-C'Li lına lei:ııid

Okside glutatyon

Rcdiıktc glut:ıtyon

Si. ;ıro f ıo;.;:s:ızi n

:-;ody:ı~ riihidrojeıı fos:'at

'.;ıı,lvıırı lıidroksit

So:lyu:J knrhoksi~ctil selüloz

('.-!erek)

(Sig:cıa)

(Sigma)

('.'lerck)

(Sigın::ı)

(Bayer)

(:·!erek)

(Sig:,,a)

(:--1erü)

(:-icrck)

(':erek)

(:-::0.ııili)

(Sig'.Tla)

(Sigma)

(Sig:na)

(Bayer)

(:·lerck)

(.'1crck)

(Acıselsan)

( ., ' ) :.erc,c

-45-

Il. 2. Kullanıl arı Araç ve Gereçler

~ikruµipet - 20, 100, 200,

Vida kapaklı cam tüp - 10

Epcndorf tiip - 4 X 1 CC -

Po1istirc>n tiip - 10 X 1..5

pil test bf\ıdı - pH (3-6)

İntrag;ıstrik sonda

Giyotin

pil ıııetrc

Vortcks ~ . .. , ,eKanıK

Tsıtıcı

Karıştı r-ıcı

1000

X 1.3

konik

cm

Kuvnrz spektro.foto:netre küveti

Derin

Derin

Etiiv

sogı..ıtncu (- 20°c) o

dorıdurucu (- 40 C)

l!omojeniz;ıtör, teflon başlıklı

!bs.s.ıs TPr,ızi

S:ıntriLi_j

S:ı.ıtciftij

Spcktrofotometrc

pl'lik (Cilsor1)

(Pyrex-U.S.A.)

(Sigma)

cm

(Sig'.na)

(Sigr:13)

(:ııEL p!l 890)

(ileidolph Reax 2000)

(Ika%'!.g RH)

(Ter:ıal)

(llellma)

(AEG - 1350 S)

(Revco)

(Dcdeoğlu)

(Thomas Sci.)

(Mettler il 54)

( i!erneus L:1 bol uge)

(:leraeus Biofuge)

(Shimaclz:.: 0V-VJS

Recordi;-ıg Spectrophotomcter

\;V- 160 A)

II.3. Kullanılan Çözelti ve Rcaktifler

O.Ji-1 Sodyum Fosfat/0.00'1 M EDTA Tam onu H 7.5 (Fosfat/EDTA Ta~ onu) l':ı. 60 g :,l":ı.ll 2PO 4 ve 1 • 86 g

tuzu (EDTA-Na 2 ) 950 ml distile

etilendiamin tetraasetı· k a~ı· t •iı· s ı - "' -, oc yum

suda çözülür, 5:-1 Na OH i la vesi i ı e pH

7. 5 'a ay;_ırlanı r ve su ile 1000 ml' ye tamamlanır. Çözelti buzdolabında

2 ay dayanıklıdır.

Mctafosforik Asit Çözeltisi

!'letafosforik asidin, (HP03 )n, distile sudaki %5 1 lik çözeltisidir.

'~-etilmalcimid (NEM) Çözeltisi (40TTL.._f)

Fosfat/EDTA ta!Tlponu içinde, her deney gunu, taze olarak hazırlanır,

S,S'-ditivobis-(2-nitrobenz:oik asit) (DTNB), (S rı\1)

Fosfat/ l~DTA tamponu iç inde, istenen hacimde hazır laıı.ı r. Çozel ti,

-2ü°C'dc, ışıktan. korunarak saklandığın.da 1 ay dayanıklıdır.

ölr,: i_im

[3,-Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat, Redüklenmiş Şekil,

(FLNADPII), (4 m:1)

Fosfat/ EDTA tamponu içinde, her deney gunu taze olarak hazırlanır.

Glut;:ıtvorı Redüktaz (0.5 İU/ml)

Fosfat/EDTA ta,nponu içinde, 0.5 İÜ/25 ~ıl konsantrasyonda (enzimatik

ort.:1ını n.Jaki nihai konsatrasyonu O. 5 İÜ/rnl olacak şekilde) her

deney giinii taze oLnak hazırlanır.

Okside Glutatyon (GSSG) Stok Çözeltisi (2;n_\1}

Fos fa t/EDTA tamponu iç inde ,~özülerck hazırlanır. Çöz el ti O ila

-S°C' de 2. 5 ay d.cı.yanıklııl ır. Her deney gLinü y,.~niden çizilen standart

eğri için 2 5-1200 n g/ lOOp l konsan t rasyo ndaki dil üs yanlar• bu stok

çcizelticlcn hareketle, tampon çcizelti ile seyreltilerek hazırlanır.

Rediikte Glutatyon (GSr-J.) Stok Çözeltisi (7 r:ı.;--1)

'.-!ctafosforik asit çözeltisi içinde çözülere~ hazırlanır. Çüzclti

O · ı c0 c' l 2 d . l d ı a -_ı ( e ay ayanı:-c ı ır.

İntr;:ı.peritoncal (ip) Siprofloksazin (CPR) ı_;ygulama Çcizeltisi (100

ve 150 ~ıg/kg)

Sıçalllara 100 veya 150 mg/kg dozda, ı:-o;ılam 1 :cıl haci:n içinde, ip

yolr!an uygulanmak üzere hazırlanan, CPR'ın seru:n fizyoloji;,;_ içindeki

çözcltisLdir. l;ygulamc1dan hc::ıcn önce hazırlanır ve ışıktn:ı korıınur.

İntraıı:ıstrik (ig) Siprofloksazin (CPR) Uvgulama Çözeltisi (500

mg/kg)

S1-çanlarn 500 r:ıg/i<g dozda, topla:n l ml !-ıacirn içinde ig yoldan

uygulanmak üzere lw.zırl cın3n, CPR' ın cw, S' lik karboksimeti 1.sel ü1oz sodyum

(C!-1:C-'.'Ja) içindeki süs;,ansiyonudur. :;ygula:nactan he,;ıcn önce hazırlanır

ve ı~ıktan korunur. %0.)'lik OlC-:fa bir gün önceden, distile su içinde

hazırl3nır.

ig, E Vila:nini Cvgulc1a:ın Çözeltisi (40 ve 100 ;ng/kg)

Sıçan lanı 40 veya 1"0 /k . d v rr.g g ooz a, toplar:ı 1 ml hacim içinde, ig

oh:ırak uygulanaccıK .•;cKildc iıazırlanan, d..-tokoierol 1ün mısırözi.i yaJı

içindı:-id çözcltisiıiir. Taze olarak hazırlanır ve ışıktan korunur.

ip, Allopurinol llveula~a Çözeltisi (40 ~g/kg)

S1-çanl:ıra Lın ~ı~/kr, rlozrld, to;:ılam 1 r:ı.~ hacLn içinde ip olarak

uyr,ııları:ıcak

çözeltisidi.r.

hnzırlansrı, allopurinol 1ün 0.1~ NaOll içindeki

ig, F:ırlos:ılfan l.lvguLı::ı;:.ı Çözeltisi (10 ve 15 :ng/kg)

Sıçanl.nra 10 Vr:'ya toplam 1 ml hacü, içinde,

olarak uy hu L1 n,K<1!< .. şeki ldc :-laLırlarıo.n, endosulfa:-ı' J_n mısırcizi.i

içimlcki çözelı:isidir. Uyg,.ıla::ı,ıclan önce '.1azırlanır ve ışık.t;:ın korunur.

-43-

II.4. Deneysel İşlemler ve YOntemler

II.4.1. Kullcrnıları Deney Hayvanları, Deney Grupları ve Deney Düzeni

II.4.1.1. Kullcınılan Hayvanlar

ilu çalı~>mada llaccttcpc

ratuvarı' ndan scıgL:ınan 1.50-200 g

kullanıl:nıştır. Hayvanl3rın 1

::niversitesi, Jeney Hayvanları Labo­

ağırlıJınc\8 erkek 1üstar-Alhino sıçanlar

hafta öncede;ı laboratuvar ko.;ıullarınc1.

uyumları s/lt;laıımış, yc:;ı ve su tüketimleri çalışma sürcsjnce sınır­

lanıııamı şt ı.r.

i"luhtcmcl di.iirııal varyasyonların en aza indiril:nesi için, hayvanlara

ilaç ya da ta~ıyı.cı uygulaması, sabah 9.00-10.00 arasında yap-dmş ve

hayv:rnların dekapitasyonLırı en geç saat 11.00'de tamaı~larrnı.?tır.

Hayvanlara veril.en ilaç ya da taşıyıcı hacmi, kullanılan Li.im

uygula:r.a yolları için 1 ml 'dir.

II.4.1.2. Dcııcy Grupları

II.t~.1.2.ı. Endosulfan (E:'DO) Grupları

Bu gr•,ıplar·daki !ıayv:ı:ılar"a, 5 gün s:..ireyle,

dozd3 e:ıdosulf:ın :nısırözii yağında çözülerr>k ve tg

yardım1yl □) ııygulanmıştır. Son dozdan 24 sonra

dekapite cdilerelc öldürülm:..iştilr.

II.4.1,2.2. Siprofloksazin (CPR) Grupları

II.4.1.2.2.1. Tekrarlanan Dozda CPR Uygulaııaa Grup

lO veya 15 r:ıg/kg/gün

olara~ (gastrik sonda

hayvanlar giyotinle

Au grup iıayv3nlara, 5 gün süreyle, 500 ::ıg/kg/.~iin dozda cp;;:, :W,S 1 lik

01C .içind(~ hazırlan::ı.n bir süspansiyon şeklinde ig olarak uygulan:ııı_ştır.

Son dozdan 2 saat sonra hayvanlar dekapite edil:uiştir.

11.4. l.2.2.2. Tel< Doz C;;'i\ Uygulanan Gruplar

Bu gruplardaki hayvanlara, 100 veya 150 mg/i<.g dozdcı CPR, seru,:-ı

fizyolojik içindeki çözeltisi halinde, ip olarak uyg:.ıl;:mmJ_9 ve hc1yva:ılar

2 saat sonra dek;:ı.pite erlibıiştir.

II.4.1.2.2.3. 1'CPK + E Vita:ııüıi 1 ' üygu1arıan Grur

Bu gruptaki. kıyvan1arcı, mısırözii yağırıda çöziil:nü.,_; E vita:ııin.i, J

gcın süreyle, 100 rıııı./kg Joz,Jcı, 4. g\in 40 mg/kg dozda ig olarak uygula;1mı.ş,

son uy~ula:ıı;cıd:rı L) ;hkikcı. sonra 150 mghg, ip, CPR uygul.sann hayva:-ı­

lar 2 saat so:-ırcı dekapite edil:ııişti.r.

Il.4.1.2.2.4. 1'CP~ + ı\11opurinol' 1 Uygulanan Grup

Bu gr:ıptüki. '.1ayvanlar,;. 0.1 N NaOH'de çözülere'.'{ hazırlarıcı.:1 Allo­

purinol, !.;() mg/kg Jozd3, ip olarak uygulanmıştır. 15 dakika sonra lY)

mg/kg, ip, CPK, verilen bu hayv,:ınlar, 2 saat sonra dekapitc edibıiştir.

11.4.1.2.3. Kontrııl Grupları

Bu :~ruptaki hcıyvcı.:ılara, ilaç gruplarının uygu1a:ıdığı hacir:ı, yol

v~ doz Lı:x1 uy:_1,un ol an,i-.: çöziicii uygula::ıası yapıl mı Jtır. Ayrıca l:n:-dk'.:;,

ip, CC1 1 uy.'-iul.1ııa;ı bir g:-u;ı iıayvacı, 4

mı;,;tır.

II.l~.2. Doku cirnt''ı<lerinin ıiazırLın;:ıası

;wzi.tif kontrol olarak kul1cı.nı1-

Giyoti.nl.c clc~i.!pi.tasyonu tai<iben l •. "ı-2 J;,,kik:-ı içinde ç1.'.co.rıla:1

kaıacj [;er ve do:.Cu1:Jrı(beyin sapı dahil tilm serehral

çal ı_ş:n3 s\ircsincc bu;,: iç.inde vey:ı. o0 r: s1.ccı.kl1.kt:1 tutul'.:lu-<;,tur. Jo:.:.ıı:ar::ı

uygulanan işler:ılcr 2~:ı..~;1.d:1:<i sır:ı iç.inr!e ve hızlı o1:1r.cı.k y::1µıl:ı11,;;:..1r:

1- Serun fi;,.yolo_jik i(,:jne daldırılarak çalknlnni:.n organlar t:ırt.ıldı.

-50-

2- Beyin hor:ıojenatı hazırlanırken bir yarı küre kullanıldı ve teflon

başlıklı bir hornojenizatör kullanılarak metafosforik asit çözeltisi

içinde, %20 1 lik bir hornojenat, hazırlandı, Karaciğer doku homo j.,..natı,

%10 konsantrasyonda, aynı şekilde hazırlandı.

3- llazırl3nan hornojenatlar 10000 rp::ı 1 de (...A.,9000x g) 10 dakika

santrifiijc edildi.

4- Ayrılan 9lJOO X g supernatanın bir kısmı ertesi gün "Total

Glutatyon 11 (GSH + GSSG) tayini için kullanılmak üzere 20°C'de saklandı.

Diğer k1sını, GSSG tayini içi:1 :ıazırlanmak üzere NE.'1 ile maskele;;ıc ve

ekstraksiyon işle:nine tabi tutuldu.

II.lı.2.1. GSE'ın NE.11 ile Maskelenr:ıesi ve ~E.'1 Fazlasının Ekstraksiyonla

llzaklaştırıl;nası (NP! Reaksiyonu)

9000x;; supernatanda bu1unan GSH'ın, NEM reaktifi ile alkile edilip

maskelenı:ıcsi ve böylece otooksidasyonunun önlen:ııesi için uygulanan bir

reaksiyon ve r~kstrnksiyon basa,nağı olup, şu sıra ile uygulanrr:ıştır:

1- 0.5 ml, 9000xg supernatan üzerine 0,5 ml, 40 m;\J NE.'1 çözeltisi

eklend:i ve 1 d.::ıkika süreyle vortekslendi.

2- Çö7.e1:inin pil'sı, 50 pl trieta:10laııin (TEA) eklenerek pH G'ya

ayar!11ndı. :',,ı i:,;1..cJı csna:-;1nc\a yerel olarak pii değişi::ı:i.r..i önlemek amacıyla

tüpler l1~zlıı ve çok iyi karı~tırıldı.

3- Çcizcltiler 20-22°C'de 1 saat stireyle inkUbasyona bırakıldı.

4- ~b süre sonun,);-ı, Nl·'.\1 fazlasının or:.amdan uzakla~lırılması için

1 ml'lik etilcLcr porsiyonları ile 10 kez ekstraksiyo~ yapıldı.

5-- [ter art1klnnnın uz::ıklaştırılması iı,:in, içinden ]-1.5 dakika

siircy le ::ızot ;~azı geçi r:i .1 c:-ı sulu fazlar, ertesi gün oku:ı;,1ak üzere

-S.l-

II.4.3. 'fotal Glutatyon (Total GS!l) ve GSSG'nin Enzimc1ti.k Döngü Yöntc:ni

ile Ölçi.ilmesi

Bu çalışmada karaciğer ve beyin dokularınc!a Total GS:l ve GSSG

Ölçümleri Tietze (116) tarafından tanımlanan ve Hazelton (100) tara-

fından modifiye edilen enzi:nstik döngü yöntemi i 1 e yapı lmı.ştır. Ölçülen

total (okside + redükte) glutatyon değerlerinden GSSG (okside glutatyon)

degerleri çıkarılarak dokuların redükte gJutatyoıı (GSH) düzeyleri

hesap}anmıştır. Ayrıca dokuların GSH ve GSSG miktarlarınısı oranlarını,

dolayısıyLı. redoks duru:nunu ifade edebilecek 3 parametre; R8do]zs Or3rıı,

GSSG Yüzdesi ve !{edoks İndeksi hesaplanmıştır. l3u para::,ctrcler gf'rçekte

birbirinden çok farklı ı.leğildir. Fakat literntünle "GSH Redoks i)uru:;ıu"

farklı şekillerde

lanmıştır:

ifade edilebildiği için üç farklı şekilde hesap-

Redoks Oranı GSil/GSSG

GSSG GSSG Yüzrlesi ""' -==~- x

Redoks İndeksi""'

GS!-1. + GSSG

GSH + GSSG

100 x GSSG

100

i~u kinetik yönte:n, DTNı3'nin GSH veya GSSG ve glutatyon rediiktazl::ı

kata lizlenen bir rc::ıksiyon la, NADP!l taraf-1.nd.arr si.irc;(l i. indirc3e:1mesi

esasına daysrnr. Reaksiyo;1 hızı glutatyon konsantrasyon:.ın3 bağımlıd1.r.

Bu nedenle reaksiyon kineti[ıinin 412 n::ı 1 de spektrofoto::",ctrik oLırak

izlenmesi süretiyle, ortamdaki GSH + GSSG (Total Glutatyoıı) veya GSSG

(GSH 1 ın NE,'1 ile mclskelen;;ıesini takiben) ;niktarı bulunur.

II. 4. 3. 1. Kinetik Tay in Koşulları ve Uygulanışı

Total GSll'ın ve GSSG'rün, DT:JB varlığı.nda enzimatik dö'.ı~ü yöntemi.y}e

tayini için kullanılan kinetik tayin ortar.n.nın bileşenleri Tablo l' rlc

görülmektedir.

Tablo l. DTNB Varlıgında Enzimatik Döngü Yöntemiyle Glutatyon Tayini

için Kullanılan Kinetik Tavin Ortamının Bileşimi

l m1'1ik Deney

Stok r,:özelti Eklenen Ortamındaki

B:i le.7en f:ons.:ıntrasyonu !fa cim ( p1) Miktar

DT:m 5 m.\1 100 0.5 rmnol

NADPH 4 !TL '1 50 0.2 m:ııo 1

GR 2İÜ/ml 25 0.5 iU

Örnt'k 25-100

Fosfat/EDTA O. lm/ 5 ITL"'f 800-725 O .1 rmnol/5 prno1

Uyg,.· 1 1 1 ~::ı şu sırayla yapılmıştır:

l~ GSSG tayinl"'rinde, beyin ya da karaciger QOOOx.g supernatanlarına

doğrudan NEM rea~:siyonu uygulanmış ve takiben 100 pl örnek hacmi ile

kinetik ölçüm yapılmıştır.

2 Total CS 1! t::ıvini için kullanılan 9000 x g supcrnJtanları,

içerdikleri ;n,~tafosforik ;ısidin sc>yreltilrnesi ve Ufgıın konsantr;:ısyon

aralı ;ı;ıd;J ki net ık ölç ürnün yapıla bi Lnesi iç in kinetik ölçiımJen hemen

önce Fosfat /EDTA t ampomı ile seyrel t ilmiştir.

Beyin dokusu QQU;J><R supcrnat:rnlar için sevreltme 1/4, karaciğer

dokusu nd;cı ise 1 oranında yapılmıştır. 13u seyreltmeyi takiben kinetik

tayin ortamına eklenen örnek hacmi 25 pl'Jir.

3- Kinetik ölçümün yürütüleceği spektrofotometre küvetine, sırasıyla

Fosfat /EDTA tamponu, DTNS, örnek ve NADPi-1 konulmuş, küvet a 1 t üst

edilerek karıştırıldıktan sonra 25-26°C'de 2 dakika süreyle dengelenmeye

bırakılr:ııştır.

-:i3-

4- Enzimatik dcingi.i reaksiyonu, ortama glutatyon redi.iktaz (GR)

enziminin iLwesiy le başlatılmış ve reaksiyonun kineti_gi_ 412 n:n' de 3

dakika si.ireyle izlenmiştir.

5- Spektrofotometrenin kinetik modu ile çalışıldıJında, aletin

30 saniye aralıklarla ö.lçti.iğü absorbans farkları (Lı.A) 'odan hareket.le,

30-180 saniyeler arasındaki 2 dakikalık sürede ölçülen ortalama reaksiyon

hızı, 1::,. A41 / dakika 0,A/ dk), olarak hesaplanmıştır.

6- ller ölçüm günü doku örnegi ilave edilmemiş ölçi.i~ ortamında ıı . enz:ım

körü 11 olarak iki ölçüm yapılmış, bu değerler örneklerle elde edilen

bA/dk de~erlerinden kör deger olarak düşülmüştür.

7- Her deney günü, deney orta~ındaki ~onsrtntrasyonları 25-1200

rıg/ml olacak şekilde i lavc eclilen GSSG standartları ile ölçiim

yapılmıştır. Elde cd ilen D A/ dk değerleri bu konsantrasyonla rn ka r.şı

gr afi ge geçi ri lcrek elde edilen standart eğril er ( ve eğri denklemleri)

doku homojenatlarındaki, Total GS!-1 ve GSSG konsantrasyonlarının, GSH

eşdeğeri c insind c n, 11 pmo 1 / g doku II olar ak hesaplanması için kul lanı 1-

mış tır. TUm çalışma siiresince ölçümler en az 2 kinetik ölçürn ile yapılıp

ortalama 6 A 'hır üzerinrl.eıı hesaplamalar yapılmıştır.

II.4.4. İstatistiksel Degerlerıdir~e

Verilerin ista ti s t ikse 1 olarak d eger 1 endir ilme si ndc :'1 IC:.0STA paket

programı kullanılarak Tek Yönlü Varyans (ANOVA) ve Student t Testi

uygulanmış,

saptanmıştır.

standart e~riler Doğrusal Regresyon Analizi yapılarak

III. BULGULAR

III.l.Kullanılan Enzirnatik Dcingü Ycinteminin Validasyonuna İlişkin Bulgu­

lar

III.1.1. Standart GSH ve GSSG ile Yapılan Enzimatik Ölçümler

II.4.3.1.'de anlatıldı~ı şekilde, cirnek veya standart içermeyen

ortamda yapılan lıir kor deneyle (enzim kcirü) elde edilen kinetik rcak-

siyon profili, Şekil lO'nun A p3nelinde g0rülmektc<lir. B panelinde

30 ng/rnl GSSG stambrdı, C panel inde 801) ng/ınl GSSG su.ndartı, D

panelinde ise B~J ng/ml GSH standartı ile elde edilen kinetik reaksiyon

profilleri veri lmi'?tir. Her bir panelı1c, 6 A/dk oL::ır;:ık hesap la.nan reak­

siyon hızları da grirülmektedir.

Şekilden de görü ld ıi~ı.i gibi, enzi:;1atü. dongü yönteminde standart

olarak GSH yJ dJ. GSSG kul lanıl3bilmektedir. Ancak bu ça.lışmada CSSG

kul Lınıını tercih cdilmişt ir.

III .1.1. l. esse; Standartları ile Elde Edi.1 en Standart Eğriler

Deneyler in \ıa';'L:tn,c;ıcında, kinetik ölçüm ort3mındaki GSSG konsan­

tr:-1.syonu 25-1200 ng l olac,ıx şekilde, 8 farklı konsantrcısyonda GSSG

standardı ile cnzimatik ölçü~ yapılmıştır. Elde ertilen 6 A/dk değerleri

ile GSSG konsantrasyonları arasındaki ili~ki, verilere dogrusal regresyon

analizi uygulanarak bulunmuştur. Böylece kinetik reaksiyonun hızının

GSSG korısan trasyona ba:~ıııılıgı gösterilmiştir. Tablo 2 ı de 2 ayrı deney

gününrle 5-8 farklı konsantrasyonda GSSG standardı ile elde edilen veriler

ve nkonsantrasyon-rcaksiyon standart denklemleri görülmek-

tedir.

+0.14A

A

- -

l<OR

+0.20A

0.020 _A/OlV.)

B r_/_., r"

/ / 30 ng GSSG

,.,/ 6 A/dk=0.0275

6. A d \" = O . O 1 J 5 +0.09A ·ı--ı::'------------_,_-------<,__ ___ ___,

SEC + 0. 1 O A ,.__. ____ / ___ _,__ ___ __,_ ____ ___,_ ___ ----ı

SEC 200.0

+1.60A

13 • 2.0 O (fVDlV,)

0.0

C

50.0(SEC/O]U.> 200.0

1 4 ı, 2 ._~_!Hl - 70. 043fll

800 ng GSSG 6A/dk.== 0.4J00

+1 .&0A

0.200 (A/OIU.)

o.o

-D

50.0<SEC.'DIU.)

L:fl2. C•IIM

+ 0 • 0 0 A ı--------------•- 5 E c 0.0 50.0<SEC/OIU.) 200.0

i 4 1 2 • O !Hl - 0 • 0 4 2 A) 1 0.0 50.0(SEC/DIU.)

! 412.üt-lM

Ş k ·ı 10 L'"" ,,,,,-,., Gsıı S \ \ · .,. ·ı "' 1 · P r-·11 · e ı : .,or ,.,;):)',, ve ,. . t;ını nrt .arın;ı :n.t ı, ınct.ı < t,c.:ı csı.yon . ro --,. crı

ıL 2 Q 8 tıl

SEC 2üO.ü

-ü .04314)

1 V, ı.,.,

1

-)n-

Tablo 2: Enzii,ıatik Reaksiyon HLzl!l]ıl Do7.a I-t:ı:}ı:nlılı:_;ı - c;ssc; Stanrbrt1an

ile Standart Egri Çizi~i

Ölç ü:n Cfr t:ım ındak i

GSSG Konsantrasyonu

(ng/ml)

o

25

'iO

100

:mn

300

sun 1200

Ölçiilen

D, A412idk ~

0.0085

O .1)195

O.D315

0.05Lı0

li.UlJJS

o. 12()5

o. 2065

O. T\2 5

ıJ.5055

Deney Günti [ y= -0.000153 + 0.000410 x (r=0.0407)

Deney Günü II y= Cl. Cl01):L1 + 0.000341 x (r=O.l)qq::_ı)

rp Son UÇ-1 3 r j ki şc r ölç iiınün orta ld~ası dır ...

Ölçülen ~

D Ac'ıl2/dk -,-

O.UlS:2

O.ı1MlU

O. 1.ı.lSU

!-'.u sonuçLır enzimati \.;_ ,löngü reaksiyorıımun 25-12UU w;/ml konsan­

tcısyon :1r:ı] ı;~ındc:ı lineer oldur:unu gösterr.ıc::ktetl ir.

lll.l.1.2. Farklı En;ı;i:rı (GR) Konsantrasyonları ile Çizilen SLrn.:Lwt

fa;riler

Enzim körü deJerini düşürüp, duyarlılıRı arttır~ak üzere, II.4.3.1 1

de verilen deney ortamındaki enzim konsantrasyonu, 0.5 İÜ/;nl' den O. 25

İÜ/ml'ye indirerek kinetik cilçüm yapıl~ıştır. Tablo 3'de ü.25 iU/ınl

-57

Gf/ ile y3p1lan bir dizi kinetik ölçü:nQ alt veriler ve 21,ic edilen

standart c>·~ri d,2n~:le:ııi ver~ilmekte,lir. Bu koşııld3 d::ı reaksiyonun vi_ırııdü,,ii,

G:3SG kons::ın t r~asvorıu ile kinetik reaksiyonun hızı arDsınJ~ yüksek

korcL:ısyonlu bir Llc,~rusal ilişki bulunri.u;_;u 5 orıil:neitc:ciir. Aııc3k bu

ç3l1şırıada, özellikle düşük konsantrasyorüarLla daha güve:1li çalışabilmek

için O.'i i0/m1 'lik cnzi.m kons3ntrasyonu kulL:ını'1lı tercih edılmişlir.

Tablo 3: D. ~5 Ei/r;ıl Konsaııtrasvonda Enzi·n ( 1~R) ve G:3S(~ St:rndart.1arı

ile Elde Edilen ;;irıetik Ölçüm Sonuçları

Olçüm OrtamıIHla~:i

G~SG Konsantr~syonu

( n~/ml)

o 30

50

100

300

500

Ölçüleıı

l::, Aı 1'7/d~: '+ ~

O.UUSJ

0.0103

o.oı_ıG

U.IJl'.'.l

O • l Ci(JCJ

y= - o.o:ıu4 + 0. 1.JsJClllU x (ı'"'ıJ.LJ(FJ~ı

f11.l.2. Sı,;an (-\eyirı ve Karaci_~er Ho~ıojervıtbrı ile YapıLrn inzir:ı::ıti:Z

T::ıy iıı Ler·

II.4.2. 'de anlatıldJ.f;ı şekilde hazırLrnarı sıçan beyin ve k;:ıraci:;er

cloku örnekleri ne, l I. 4. 3. l. 'de an1atıldığı şekilde uygulanan enzimatik

ôlçum yciııtemi ile elde edilen kinetik reaksiyon profilleri Şekil ll'de

gcirülmektedir. Beyin dokusunda Total GSH tayinine ilişkin n~a'.<siyon

+l .60{1

·11.40ı"ı

.,. [l • O O A

A

'::, n . i.i ,: :0; F C / D I 1,,1 • )

["" -\-! 2. üt!l'I-- -0. Ü-~ 3(i] re·----------....

0.0 5 ,:ı . O ( S r:: C / n. I U • )

,- ·i 1 2 • ü ti M 1. ........ .

0.020 ( ~·ı / fJ I l) •

+0.1üA

+ü .. 55A

Ü. t [l ij < n / r, I t) • )

·t-13. 1 5 (t

i

!9 i

f _../-i· ..r"~

! .,r,F'

1 r

1 1

.,----·! .,-,-· .... ~.,. :

-~ j ' 1

1 ! l 1

~_.,..,_,,.,/- 12 . 4 O n m ol/ g ·ı İ-------ı---------<------ , ______ ,

(l - rı :5 Cı • O ( S E ı": ., n ı 1.1 • ) ? .:, l) ~ Ô ı_

4 12. ütj r·ı_ -_ı:ı. o,-ı.::::n!

f

.1

1

·! 1

1 v°l (L 1

-S9-

kinetif?,i profili A paııelinck, GSSG tayiııLne ilişkin kinetik profil B

pnncliııdc verilmiştir. C panelinde karaciğer dokusıında Total GSl\ t;ıyininc

ilişkin kinetik profil, D panelinde ise GSSG tayin.ine ilişbn kinetik

profil görülmekte(lir. Ölçülen reaksiyon hızL::ırı ve hes3pl3mı.n Total

GSII veya GSSG konsantrasyonları da panellerde verilmiştir.

111. l.3. Yöntemin Doğruluğu-Verim Deneyleri

Kullanılan enziııı:1ti!< yönteminin dogruluğu, bilinen miktarda

stand;ırt GS!l ve/vcy3 GSS(: ilave edilen Joku örnekleriyle ve dokusuz

nrta,cıda yapılan ver.im (gcrj cl(\e etme) ça.lı';nıaları i1c ir<lcleıı~ıişlir.

Bu çalışmalar;

Zı) Doku ho~ıojenatlarının hazırlanmasından lıcışlayarak Tot:J.l ı;s:ı

ve GSSG tayi.ninc i li.şkin tiirı reaksiyon haso.maklarını k::ıpsayacak .','ekilde,

b) Dojrudan :J~:-'1 reaksiyonu basama~ından başlayarak sadece GSSG

tayin bc1s;::ı:n3:~ını kc1psayac:1.k şekilde yapılmıştır.

III. 1. 3. l. NE:--1 Reaksiyonunun Doğrulu:'.;u-Verimi

IJI.1.3.1.1. Dokusuz Ort-1md?ı Stcındart GSSG ile NE!l Reaksiyonu Veri~i

II. 4. 2. l 'ıle taınmlanccı;ı :fü:-1 rcaks iyonu, dokusnz orLı:ncl::ı, do:~rud;1.ı.

GSSG standartları ile yürütiılerek yöate:nin, GSSG tayini i..ç.in kritik

olan bu biJ.saın0(p_nırı validasyo:rn yapılmıştır.

Kinetik ölçü:n ortamındc1ki rıihai ko:ısantrasyonları. 25, SO, 100,

veya 200 ng/;;ıl olacak şekilde GSSG standartı ilave edi.lere\{ yapılan

verim deneyinin sonuçları. Tablo 4'dc gönil::ıcktc<lir.

Tablo 4: GSSG Tayin Yönte:ninin

V3} icl3syc,nu -1. Dokusuz Drcıın,l3 G'.3SG Vcrüıi VC' cs:~c St:m,brl

E-:~r i,~;i ı,'.i z: i:ııi

Reaksiyon Ort~mına

Ek 1 ,·nen GSSG

(ng/100 pl)

lUO

2()1)

ı't' r• ,---, ._;ı,._-,,._;ıl.J

(n5/l(J0 pl)

2iı.07

h10. 25

CS;:;G Ver iı:ıi

FJ2 .3

ıuo.)

9q . 6 t- 2. :i ( X + S: l)

Cl;riildü,~ü ~ibi 4 Lı.rklı CSSG koıısaııtr.ısyonu ile de:: c, lOiJ',: yakın

verim ,·lde cı:li.lı;ıi~tir ve ortaLı:na verrnı c, Y9.fı + :'.5 oLır:ık h2sap­

Lınıııı:;;t 1_ r.

Hu d,·ney ::;uniicı,le kul] aıııLrn sL:rn,hrt e:~rının (kinetik ö] çii•11 ortaı,ı1 wı

doı;rudan iLtv,' e,iilen J,ı, ıno, 300, BO•l, 12U1J n cıl ',:ons:1.;,tr:ısyuııLı.rcb

GSSt_; :i. l L' ç i. z i_ l,:•n) denk l e,n i a:::<!:~ Hb ı:;iirii Lıw k t ['11 i r:

y = - u. noouo 5 + u. OıJU/ı 99 x ( r=fJ. 9'ı9'ı9)

NS>l reaksiyonu uygulanmış GSSG standartları ile ~lde edilen

"rec1k c; :i. yon

verilmiştir:

hızı-konsantrasyon" ilişkisinin denkle:ni

-61-

Bıı sonuçlar (_;:::;sl; Lıvini için uygulanan ;'/f-'.\J rc3ksiyoımnun, etileter­

le 10 kez yapılan ekstraksiyon aş3ması d::ı lLıhil, u;,:un işlC':n1erin,·

kar.'Şı 1 ık ver imirı taın o ldu-;::unu g;~istermist ir.

III.1.3.1.2.

Vcri:ııi

II.4.2.l'de tanımlanan :lEil reaksiyoı1uııu:1 dokusu::: orta,ııcL:ık i CS::',;:;

verimi, GS!l v:c1rlıgınd;ı irdelc-nmiştir. Kinetik o]çiıııı orta'.Tl1n(h 'i!)) ng/nıl

GSH il,~ hirli\_tc SU veyc1 250 n:c:/nıl GSSG tıulunacal: ~;ckilde GSSG stanıianh_

ilave edilerek yapıl3ıı verü1 Jcneyinin sonuçları T::ıb]o S'dc ;;orıiLrıc,!c­

tcdir.

Tablo 5: GSSG Tayin Yönteminin Nr:'.·1-GSH r:eaksi yonu B,,sc1m:qının V,, lidasvonu -

II. Dokusu::: Drt3mda GSH ve GSSG Veri:ni

Reaksiyon Ortomın~

i~k lcnen St ,ıııd:ırr J 3r

( n ,v' l 011 11 l )

GSI! ( °>OU)

GSSG (250)

GSSG (50)

csıı (SUıJ) + GSSG (250)

GSH (500) + GSSG (SU)

(n;;/100 pl)

u 224.]2

53.0S

::151. UıJ

M.60

GSSG Vcri~,i

{)7.6

ıu4.4

89.2

98. 4 _+_ J. 54 (X ±_ SH)

Bu sonuçlar, ortamdaki GSH r ın NE:1 ile maskelenip uzaklaş-

tırıldı~ını, dolayısıyla okside olup GSSG tayinini bozmadıgını gdster­

miştir.

IIT .1. 3. 1. 3. Sıçan Beyin Dokusu Horııojerıatında t{F>l Reaksiyonu Verimi

ITI.1.3.1.l'dc an1atıl:rn ve dokusuz DrLırT1da yapılcın NC>1 reaksiyonu

vcrir.-.i çalışması, II.4.2. 'de anlatıldııı şekilde hazırlanan beyin

doku su ')ODCı x;:; süper-ırn uın lar-ı kullanJ_ la rak tel: r.3 r lan:n 1? t, r. Sı:muçlar

Tablo 6'da görülmektedir

Verimi - Sıçan Bcvin Doku Homojenatında Veıim

Beyi rı-9ı)rJQx':!,

Superna.tana

Eklenen GSSC_;

( rı ,,:; / 1 OCJ \1 l )

Ü

25

J 1), 1

c'ılçiilcrı GSS•:;

(n::-;/ınc:ı pl)

20.07 / 7 1 1 ,ı I • -' ı

. ~ '). IJ /. y'.J

GSSG \'crüi

lıl8. 4

iU,ı, ı

93.5

-63-

III. 1. 3. l .4. Sıçan Karaciğer Dokusu Ho'Ilojen2tında 1-iC·l Reaksiyonu Verimi

IIT.1.3.1.1. 'de an la t ı la;1 ve dokusuz orta~da )'3pılan NE'·l

reaksiyonu verimi çalışması II.4.2' de anlatıldığı şekil de hazırlanan

karaciğer dokusu 9000 X g süpernat anları kul Lrnı 1 ar 2k t e~:r ar 1 anmıştır.

Sonuçlar Tablo 7'dc gJriilmektedir:

Tablo 7

KC ~ 9000:-..g

Sııpcrnatana

Eklcrıeıı GSSG

(ng/100 [ıl)

o

50

100

200

GSSG Tayin Yönte:;ıiıün :lE'i-GSi-! R•::-aksiyonu Bas:::ını:-ı~ırıda GSSG

Verimi - Sıçan Kcıraciğer Doku H::ı;noj t:>natı nda Verim

Ölçülen GSSG

(ng/100 pl)

20G.51

232 .. 57

258.53

30.:'ı.62

411.Cll

GSSC; Verüıi

W4.2

104.0

9S.l

J 02. 3

T1I .ı.:~.2. Sıç;ın Reyin Dokusund.1 Total G.S:! ve c:s::;G Tav in Yônte'Tlinin

Veriirıi

Beyin doku urnekleri:1e homojenizasyondan he:r.e:ı ö,ıce GSH ve GSSG

stanr!artbrı i.la.ve eoil:üş, II.4.2. ve II.4.J1de anlatıldı.ğı şekilde

1.1\"\:u.l:ınarı h;:ızırL:ıına i~lcc,lcri ve enzi:.·,:nik dongd yönte:;;i i~e Tot3l

csıı Vl~ GSSG tayinleri y;ıpı_lıp. gerek csıı. gere~se GSSG için verim

hcs::;ıLın,;nşt:ır. Sonuçl:ır, L:ıblo S'dc göri.ilnıektc-:!ir.

Lıblo t); foLıl~GSl-1 V(' cs:::;t'_; 'Lıvin Yönteminin

ı•:!denr:rı Sıçan L',eyin Doku Örnekl erinrJe Vc:crüı

\loı:ın j e 11 izas vo 11

o r tam1 n:1 ek I enen

Standart

o

GSll (CJ.3254)+

CSSG (U.0163)

Ölçülen Ölçiilcn

Total GSH Total GS:!

lıJ. 5

2. 1 () 1D3.l

(Tüı.ı dc:~er ler GSll eşdeğeri cinsinden veri lmişt Lr ve sonuçlar 2 dency'i 11

orta larııas ııl ır).

ll l. l. J. 3. Sıçan Karaci:;;er Dokusunda Total CS'l vıc:: G:;r,;; 'fay in Y::intc:ünin

Veri:11i

Touıl c;sıı v,~ l;ssc tayiıılr·ri yapılıµ, :_~erek (~SH, gcrı•kc-:C esse içiıı

ver iı:ı lHJs;ıpLrnrrıı:-7 tır. Sonu,;:Lıx, Tablo 9 1 d8. gcirulrneUe:ii r.

Tablo 9 Total-G:S!l ve GSSG Tayiıı Yönte:n_i_nin ll,):::;nı1 ·J::;u-GSl\ !·'.klencn

Sıç~n Karaci~er Doku Urneklerinde Verim.

1 kı,,10 jeıı i z:ıs yon

tJrt:1,ıı ı na Ek 1,'n en

GS:!

Cıımol /:1, ,loku)

o

1. :~':ı

6.50

o 0.44

01 ı:.~Li len

'fota 1-G'.~il

t'ı. J\~

t,ı •. ':L'.

12.(lıJ

6.17

6.G2

10. 9CJ

Toul CS!l

ıcıs. ':, ]()0.2

lıJ/. 3

107 .5

C::iSG

11:::'.2

l scı .O

ı ıl. ı

2öl.J

25(ı. 2

2'>7. 4

(Tiim dc•~crler GSI! eşde;~eri cirısindcıı veriLııi.<,sLir)

1fl.l.!ı. Yiintcıninin Kesinli·~i-Td:r,uL,nltıiltrl i

GSSG

LıJ[I. 6

q9_4

9:3. O

:;urı y:ıpıLıu iiçcr ulz;ü:nJ,, '.~un jç_i_ v:ıryc:ı,-:;yonun belir]r:-n:;ıcsi ve birinci

h:ı;'.1 r l =ı ,Ll!ı c rlcsi_ tek Lir {) lç ıJ l ın·.'S i sureti y l,J

Tablo lO'da gt',r(iL;ıekLedir. Bu de:,e;erlcnriir~ıı::- 1-lc ilk ?,cın h::ızJrLrnarı

cirnrklcrin ertesi o un "

oku:1:1lıilirliı;i de ırde!F>ı1'l1i';,'tir.

-66-

Tablo 10: Sıçan Karaci:=;cr ve Beyin Dokularında Total-GSH ve GSSG

Tayinlerinin Tekrarlanabilirli~i

Karaci[;er - 1 Karaci0er - ·; Beyin - l Beyin - ·) ~

* ** ~

** * *>~ * ~~

T T ~~

T-GSH GSSG T-GSH GSSG T-GSH GSSG T-GSH GSSG

6.63 164.5 8.14 132.6 1. 62 10.3 1. 76 8.8

I.Gün a 6.30 150.4 7.83 145.3 1.55 11.3 1.87 9.2

6.51 169.0 7.90 138.6 1.66 11.0 1. 90 10.5

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

X 6.65 161. 3 7 .96 133.8 1.61 10.9 1.84 9.5

s o.ıs 9.7 0.16 6.4 0.06 0.5 0.07 0.9

- - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Güniçi ev 0.02 0.06 0.02 0.05 0.03 0.05 0.04 0.09

6.79 169.5 8.30 143.6 1.64 13.9 1.80 10.3

II.Gün b 6.64 176.1 7.88 139.7 1.67 12.l 1.86 9.0

6.86 163.4 7.91 136.5 1. 58 10.5 1. 78 9.5

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

X 6. 76 169.7 8.03 139.lJ 1.63 p ') ~-~ 1.81 9.6

s o. 11 6.4 ıJ. 23 3.6 0.05 1. 7 0.04 0.7

- - - - - - - - - - - - - - - - - -r7-- T - T ,_,,Jnl<,,l ev 0.02 0.04 0.03 0.03 0.03 0.13 0.02 0.07

III. Gün X 6. 71 165.5 8.00 139.4 1. 62 11. 6 1. 83 9.6

s ü.O8 5.9 o.as 0.8 O.Ol 0.9 0.02 0.1

- - - - - - - - - - ~ - - - - - - ~ ~ - - - -

Gürıarası C" ' O.Ol 0.04 O.Ol O.Ol O.Ol 0.03 O.Ol O.Ol

µmol/g doku, GSH eşdegeri a Dekapitasyon, hazırla~a ve ölçü~

aynı gLln yapıldı

** n~ol/g doku, GS~ ri h d il~ ikinci giln yapıldı

Ill.1.5. Yöııtc:ııin Dııycırlılığı

lJ I. 1. 2' ıic anlatıldıL~ı şekilde çizilen standart e:';riler, en7-hati k

reaksiyonun 25-1200 n,,Jı;ıl GSSG konsantrasyon ara1ı,~1,1dd lineer oldujuııu

göstermektedir. Bu bö Lihıde Yeri len Tablo 2' elen de ;;örülecc.~i üzere,

25 ng/ınl konsantrasyonda ölçülen 6 A/dk dejeri, kör de;~erinin iki

katından faz 1 ad :ı r. Ruc:ıdan hareketle, yönt011 duyarlı] ıjırnn rır,/r:ıl

oldu;;u kabul edilebilir. Arıcak deneyler, bu konsantrasyonun üzerinde

ölçii:ıı yapı l3c3k şekilde dilüsyonlar yapılar:ık veya örrıek hacmi

artırılnrak yapı.l.m1-_<;;t1-r. :{ullan:ılan 1/4 - ]/8'1ik diltisyonlarııı ve 2S

J.SO pl 'li;ç örnek h,,ci:nleriııiıı sonuçlarırnıı tekrarlanabili.rl i.ı}ini

III .2. Sıçan Beyin ve Karaciğer iJokularında Olçülen T,)tal C:Sfl Vt: GSS'.;

Dtizeyleri ve Hesaplanan Glutatyon Re<loks Gösterg0leri

11[ .2.1,Kontrol Grubu Hayvanlarda Olçülen Glutatyoıı Düzeyleri ve

Hesaplanan Gluc:ı.tyon Redoks Göster6eleri.

Bu ç,ü 1-ş:nada ilaç uy;3ulamalan, tek doz vera tekrar.l.:ı.nan dozL,.;

şeklinde, 2 ayrı uygııl,ırn3 rotuyla (ig ve i.p) ve 3 farklı çözücü kull.anı­

larak yapı1·:ııştır. Ç.:ılı';ima.nın b:ı,,dc1ngıc1.nda bu ferklı uvguLı~ıaLırın

her biri için ayrı kontrol :::,ruplan. diizenlen·üş ve sonıı',:ta:

]~ lliçhir uygula:n3 y;:ıp1 l:na:nış sıçanlanb (;:bzal Düz.ey Grubu),

2- ip, serum fizyolojik verilip 2 saat sonra dekapi..:::c edilen

s1-çaıılarda (Tuzlu Su - Kontrol Gru'Ju)

3- 'S gii:1 süre> ile ig, C'.'1C ııygnlaıııp son uygııLı:nad.:ı·ı 2 s:ı:ıt ."iOnra

dckcıpitc edilen sıçcınLırda (C-JC - Kontrol Gnıbu),

1+- .3 gün sureyle, ig, :rnsırüz;·;i yagı uygulanıp son UY'.iula"'lad.:ı.n 21.

saA.t sonra clek3pite edil0n sıç.anL:ırcLı (>fısır Yagı - ~on~ro1 Grııbtı),

Total. GSil ve GSSG değerleri ülçü1liµ redoks

!1(~S'Jpl.1n:n1şt1r. ilc~r gruptan J. hayv~-rnla y3pıLrn <lcm~ylcriıı sonuçL.ırJ.

'l'3hlo 11 '!le gôrıil:r.c'ctcd Lr.

Bu veri 1.cr Studcnt t-testi ile an3liz edildi~inde gluLıtyon redo:""s

~C)stergelerinin farklı ol:naJı~ı gözlcnr'.liştir. ;'")u ru~denlc ç;ıl1_.ş;nan111

uı.nıaınııd.J kontrol grubu de_']crlcri olar.,k Tuzlu su, C·IC Vl.:! :11sır Ya\_:ı

kontrol gruplcırının (n=(ı) ort.:ılamaları (ki :ııı ortala:na değerler de b.:ız:.ıl

rlejer lcrden farklı rle_'Jilclir) kullanılmıştır.

111.2.2. Po7.İ.tif :Zontrol Olarak Kullanıb·ı ccı 4 Uygulanr:ıı,,; S1.ç::ııılarJQ

~ilçülen Glutatyon Düzeyleri ve Glutatyo:1 Redoks Göst.'.~r•";deri

Oksi dzıti f yap1.cı özelli.Ç;i.ne ve

göstergelerini tle;;iştirdiğiııc ilişkin çok sayıda ya yırı bu Luna.ı

lnı çJ.1 ı.c;,madcı pozitif kon trol olara!<. kullanılmştır.

rE"(loks

cc1. 1 , -,

Ta\ılo l2'Jc 1 ms/kg, ip ccı 1, uygulanan iki sıçando elde edilen

sonuç.1;::ır vcril:niştir

Gi..irüld(i,~ii ~ibi ccı4 ile karacigerde öne'!ll:i ölçüde GSil t:.ikcn:ncsi,

(;SsG yükselmesi, dolayısıyb ~1.utatyon redoks durumunr1a öııcr~li bir dc:~i­

şikLik elde edi.bıekt.edir. beyinde de öne::ıli ölçüde GS1! di.i;.;;ne:ü .soz konu­

sudur.

' . l J

1

l l l

z )­w ~

ıY. w 0 ..... u er iL er

-69-

Taıııo 11: kontrol 6ruplaı-ında Oiçülen 6lutatyorı w;,eyl~rı ve 6lutatyon Redo~s G.:ister';leien

n = 2

tİdca ı cr·up Tuz iu S,ylco.ıtrol

ı'ıuı,;L bSW .

&Sil i GSSb

ıZ 5S5& ı

/hi"i.l, ın.:ıe~.sı / lüT;L 6Sn• .

1 ]b~Sö 11 ~

'

lfıS!I / GSSb· I

p;,c,~. ~llJ<'f' o;; \

ı. /S ~ IJ. Ül

7.6::: 1.2

t.&5 ± ü.u4 l.74 ± lı.02

0.44 ± ı).08

7. •. 37 ! v. 41

7.3B .! 0.26 l 6 .. 64 ±: (ı.to

5o.3ı ± 4. 19 ~~.fı4 ± 9.&3

i.LS' !: l:.'27

• µmo 1/ y d0t u ı GSı-1 e ?.:!eqer· i •• :ımoı/9 dmu, 65H esue,~~rı

1.fı4 ! IJ.!(1

1. 62 ± ı). 10

?. 49 : 0, 45 l

ö.13 ± (,.2:

ı. S l ± •1. ı 3

n = ;,

Hı~ır Ya~1-r;ootrol kootrol iırn;ııan

Dr t;ıJ ~.ı.ı.s:

i(ı.(ı ± 1). i5

U:8 ± fı.Or

0.4B±O.(ıl 1), 44 ! 0. I)~.

?.09 ± 0.1)6 2,32±!).iı

7.3B ! fJ.ô9

nu.'i ± 12.s

55. 'i'3 ! 3.0?

-70-

Tablo 12. CCI 1 (1 mg/kg, ip) Uygulanan Sıçanlarda Beyin ve Karaciger q

Parametre

* Total GSH

** GSSG

* GSH

GSH / GSSG

% GSSG

Red. İndeksi

Dokusunda

Göstergeleri

Glutatyon Duzeyleri

BEYİN

1.41 .±. 0.06

9.10 ± 1.20

1.40 + 0.06

144.54 + 2.82

0.69 ± 0.02

1.07 ± 0.45

ve Glutatyon

KARACİĞER

5.21 ± 0.23

441.30 ± 18.80

4. 77 ±_ 0.25

10.85 ±. 1.02

8.51 ±_ 0.73

0.12 _±_ O.Ol

(Tüm değerler Ortalama.±. Standart Hata olarak verilmiştir) * pmol/g doku, GSH eşdeğeri

** nmol/g doku, GSH eşdeğeri

Redoks

III.2.3. Endosülfan Uygulanan Sıçanlarda Ölçülen Glutatvon Düzeyleri

ve Glutatyon Redoks Göstergeleri

II.4.1.2.1 'de 31ılatılan protokole uygun olarak, iki farklı dozda

endosülfan uygulanan sıçanlarda ölçülen Total GSH ve GSSG düzeyleriyle

hesaplanan glutatyon redoks göstergeleri Tablo 13 1 de görülmektedir.

Gerek tek yönlü varyans, gerekse stude~t t-testi ile yapılan

istatistiksel analiz sonuçları, endosulfanın beyinde, her iki dozla

da, GSl! düzeylerini değiştirmediğini, buna karşılık GSSG düzeylerini

oncr:ıli ölçüde artırdı nı (10 mg/kg ile p(U.02, 15 ile p < O. 002),

GSI\ redoks durumunu ise (her üç şekilde yapılan hesaplamayla da görüldüğü

;izerc) öne:nli ölçüde (p < O.Ol) d rd ini ter.11ektedir.

[{ı!nJ

z -).--J

;:-l_JJ •Iı

(( w (:1 +-1

u (:1 G:'. (1 "

-71-

TA~LU 1~: Endasul!an tS g~nıiQl b•guia~an Sıçaniarda Be~in ~e (~racıger

Dokr1sunı:l2. Gbt,1tyorı üüzeyi1c1ri ve Redoks Gôsteı·oeler·i

ENI:~) /ıg l i ·~ WD1J15gı ig f':._n.ıtei;re l<on t ı-o 1 10m,:ı /kg /g 15mg/kg/g

(n=6) {rı=5i {n-=4)

' a \ TOTAL ı35~· 1.88 + o.ı)? 1. 81 + O.Ol t. 89 ± o. (ıB 1

1 ı3SS9" 8.4 + 0.7 11. 4 + [. 4c 13.2 ± ı. l C - -.

' IGS~ 1.8-a ± D.07 1.80 + o. 11 l, 8-9 .ı. {;, 1)8

\ ! -

1 i

16, 1)7c) jG.SH ! 63SG 230.66 + 17.54 15{). 20 + 11. {i(r<= 146.28 + -

; l ., .. GSSG o. 44 ± 0.0.3 1).68 ± l),(ç"' C·. 71 ± ı;. :)8'= ' ı ' \Red. !n,jeksi ! '/ T? !. 0.17 l,5! ± (J.11" 1.47 .ı. ü. 15" ...... -.J ....

l !

' ssff ı TUTı'\L .' .. xı + 0 .. 3-~ "/.86 ! lJ.T-5 8 •. ~,6 ± Ü. li'"

' 1

ı.:.:5Sl1' 132.6 ... o ' 164.1;' + 1' • C 168.2 ± 'i,!_/ ı.-..ı ..,, l

·'··!_', a + o. 2< i. ;ı; .. 0.71 8. t9 ± (c. t/" 11..J._,/'!· ,' .. ·~·~) -C

iG~H G~-SG :5. ~." 1>: 4~t18 ± 2.41" :l.8, ;9 i L • ± i.64 '-~ -

' ii', 6~.SG 1.78 .ı. 0.08 'i -!'";• ,. o. i:::" 2, ü? ± (·.%" ........ ...__

ıc ,-1 : d 1c~ ·: !' e.., .. n e :.,,ı ı (ı.57 + o. ı):3 C'.48 ± o .. 02c ı). 5,) .). o. (tl C

(Tüm deçerlEr Od.üam.:ı ± Standart H.a.tJ. oian~: verilmi5tir)

a µmol/g doku 1 GSH eşdeQeri b nmol/g doku 1 6SH eşdegerı

ANOVA

r

0.232

6.179

0.2ıl.8

9.912

5·. oi:J(ı

10.1~-9

5J~;)

S,588

4.8~5

~-' j ı:0

ıl. zc, ......... ,

5.470

"!:ontl'Ol 1~1'Ul.ıundarı ıJnemli ölçüde (o 0.05) fi:d.11 (Student t-T~stil

testi

r·

ı).796

0.014

ı). 784

ı:. (ıl)3

ü,(<f>4

O. üC•-3

üJ,:i,S

(J ~ (ı1 i3

ü. o:;1r

0. l 12

(i, (•7i

o. 11),)

-72-

Karaciğerde elde edilen sonuçlardan sadece GSSG düzeyleri, tek

yönlü var yans analizinde önemli ( p <.O. 05) bulunmuştur. Student t-testi

uygulandığında ise, GSH düzeylerinin 10 mg/kg doz ile kontrolden farksız

olduğu, 15 mg/kg dozla ise önemli (p < 0.02) ölçüde yüksek oldugu

gözlenmiştir. GSSG düzeyleri 10 mg/kg ile p < O. 05, 15 mg/kg dozda ise

p < O.Ol düzeyinde yüksek bulunurken, 10 mg/kg ile GSH redoks durumunda

önemli ( p < O. 02 - p ( O. 05) değişiklik göz lenmiş, fakat 15 mg /kg ile

gözlenen farklar önemsiz bulunmuştur.

III. 2. 4. CPR Uygulanan Sıçanlarda Ölçül en Gl uta t yon Düzeyleri ve

Glutatyon Redoks Göstergeleri

II.4.l.2.2'de anlatılan protokole uygun olarak, iki farklı uygulama

yolu, iki farklı doz CPR uygulanan sıçanlarda ölçülen Total GSH ve GSSG

düzeyleri ve hesaplanan glutatyon redoks göstergeleri Tablo 14'de

görülmektedir. Aynı tablo' da CPR + E vitamini ve CPR + Allopurino 1

uygulanan sıçanlarda ölçülen glutatyon düzeyleri ve hesaplanan glutatyon

redoks göstergeleri de görülmektedir.

CPR uygulaması ile bevinde elde edilen sonuçlardan, tek yönlü

varyans analizinde gruplar arası farkın önemli (p( 0.05) olduğu parametre

GSSG degerleridir. Karaciğer sonuçları analize edildiğinde ise grup­

lararası farkların ti.im parametreler için en az p (O. 002 düzeyinde önemli

olduğu bulun~uştur.

II I. 2. 4. 1. CPR Gruplarının Kon trol Grubu ile Kıyaslanması ( St uden t t­

Tcs ti Sonuçları)

100 !llg/kg, ip, CPR ile beyinde elde edilen degerler kontrollerden

farklı değildir. Karacigerde ise önemli ölçi.ide ( p ( 0.001) GSH azalması

gözlenmiş, fakat GSSG düzeyleri de önemli (p ( O.Ol) ölçüde düşük

ölçülmüş, dolayısıyla GSl-1 redoks durumu önemli ölçüde değişmemiştir.

DOKU

z H )-

lı.J aı

[f lu 0 H

u <I it: <I ~

TA8lü l 4; Sıı:ırnf lok samı (CF'R) U:,,qu i anan 5 ,çan l aro'a Bey ın ·,ıe Karac i •~er uokusund a G I uta t yon Düz eyleri ve Redoh Gös te ı·ge !eri

1 1

Pard8lefre 1 Kontrol

1

CPR, ıp ı 1 l)Omg/1.g Cf'R1 l p ı 150m1~/ kg 1

{ncc6) (n=4) (rı=4) 1

TOTAL 6SH'" l. 88 ! (), 1)1 1 J.79 ± 0.11 ::.O'ı' ± ı), 13 1 1

1 1 GSSGtı 8.4 ± Ü. 7 9 ' ±. u 12, 4 ± 1), 6< ' , !

GSH'" 1 l,t;S ± 0.07 ! J.78 ± o. ı ı 2.,)8 ± 0.13 1 1

i i

GSH / GSSG 23(•. 66 ±. 17. 54 I l 99. 07 .. 18.58 168.00 ± 5,92° -\

'J. GSSG 1

1).,l4 ± (1.(,3 1 0.5~ ± 0.06 0.60 ± 0,1)2"

Reci, lnı:Msi 2.32 ± 0.17 ı !,99±0.18 1.69 ± 0.06"

1

l TOTAL GSH" 7.38 ± IJ. 33 4,63 ± (),58e 5.68 ± 0.43• 1

GSS•3" l : 132.6 ± 9.3 ,ı 94. 7 ± .;:, , • 120.6 ± 9.6

GSH• 1,

7,:/J ± 0.3[ \ 4, 51 :t o. 58" 5.55 ± 0.42"

GSH / GSSG 55.93 ± 3.02 1 47,47 ± 4.60 46.23 ± l. 71 • '

% GSSG 1.78 !:. 1),08 ) 2.12 :!: 0.19 2.13 ± o. 1)8<

jRed, tndek,; i 0.57 ± O.ı)3 1 o. 49 ± ·o Jı5 ) 0.48 ± 0.02• 1 1

(Tüııı de~eder Ort.la.m1 :!: St:ırıo'ad Hata oial'ak vedlmiı;tid

'" ~mol/g öolu, ı;Sll ~;,de~en "nmol/g dolu, GSH e?,jeQer:

5 tuden t t · T es". 1 sonuç lan na Ç;tire: c ı::on tro ! g ,·1Jbı.ın dan öneııı l i ölçüde ( p { ı), 0.S} f aı-U ı ı.ı CPR- 1 'S•) ıJı-ubund an önı:ıııli ti 1 ç(.ı:l e ip {. ı). ı)5) hd: l ı • CF'fH l)i) g rutıund an örıeııı l ı ö 1 çuııe { ıı ~ ü. (ı~ l fark l ı.

CPR-150 + t CFR-!50 + CFR, ig 1500mg/kg AtlOVA E V ı tam in l

1 Allapudnol 5 g,jn

(n:.4) \

(n=4l (n='5l F

' 1 1. 93 ± 0.06 1.92±0.!l 1.92±0.07 ı L 101 'ı 1

9.9 ±: ı). 4" lü.5 :!: 1:ı, 4c' <.1 14.5 ± 3. 1)" 2,889

l.9'.2 ± 0.06 1. 91 ± O. 1 l ı. 91) ± o, 07 i.üBO

193. 54 :!: 4, 76" 182.24 ± 6, 49c 152, 56 ± 34. 5'5" 2,478

0.51 ± ı), Ol" 0,55 ± 0.02" ! o. 78 ±. O. l 9" 2 .. 323

1.96±0.05 1. 54 .t O. 07< 1.54 ± 0.35< 2.483

1

4.97 ± 1),61 C ) 5. 70 ± o, 08"-1

ı 5,99 ± ı)..35c,• 5.999

96.1 ± [ 1, 9< iü3.9 ± 3.5• 165.8 ± 5. !"•"·· 10.241

4.87 ± o. 60• 1

5.59 ± 0.()8" 5.82 ± 0.35" ,1

6.355 '

50.97 ± o. 71" 5U)9 ± 2cı 3:~ 35.26 ± 2. 54c,cı,. \ 6.767

[. 94 ± O.OZ" 1.83 ± i),1)8d l 2.80 :!: Ü, 2ı)e, "• • 9. 185

(J,52 ± o.oıd O. 55 ± O.(ı~" 0.37 ± O~G3~t~,. 6.577 '

1 1

\

1

,1

testi 1 1

1

F ( 1 1

0.391 1 1

1

0.041) ı (ı, 401 (

1

ı:,. 067 ı

(1, 1)81

1 o. 066 1

! 1

1. 5:dı)-" )

5.6:do-ıı

ı. ı~ıo-" '

7. 7:dı:,-• ıl ,'

1.2:;10-•

9.0:d(ı-•

,'

1 -.ı w 1

-74-

150 '.Tl'.;;/kg, ip, CPR ile, beyinde GSH

düzeyleri öne:r:li (p( 0,002) ölçüde yükse:<.

da önemli ölçüde de~işmiştir (GSII/GSSG

d:.izeyleri c'.eğiş:nezken, CSSG

ölçülr:ı.üş, GS;-I rcdo!cs cluru:n'..ı

için p ( 0.02, GSSG içüı

p< 0,01). Karnci~erde ise, GSi-l düzeylerinde yine önemli (p( 0,01) bir

azalma gözlen::ıiş, fakat GSSG düzeyleri. 100 .:-ıg/kg doza kıyasla yUksel::ıeklc

birlikte fark öne:nli bulun'.llrrmıştır. GSH redoks Juru::ıu ise önc,nli

(p ( 0,02 p < O .05) ölçüde değişmiştir, 5 gün süreyle tekr3rlan, 500

mg/kg/,c;ün, ig, CPR ile beyin GSH 1 ı de:ıişmet:ıiş, GSSC düzeyleri ,":5':i'c

varan bir 3.rtışl::ı önemli (p ( 0.05) bulun::ıu:;;, GS:-I redoks duru:~unda c'.a

p( 0.05 dUzeyirnie lıir far!<- ~özlenmiştir. '.(araciğerde ise tli~er CP;:t uy~~n­

la:ııalarına benzer şe!cilde, GSH düzeyir1de öneı7li (p < 1J.'Jl) :1ir c1z:ü,n:=:

gözlen:niş; GSSG düzeyleri artmış (p<0.02), dobyısıyl::ı. reı.loks chrumun­

da p < 0.001 düzeyinde farklılık saptanmıştır.

III.2.4.2. CPR Gruplarının :hrbirleriyle Kıyasbnm3sı (Stuıient t-Tesü

SonuçLlrı)

100 ve 150 ::ı;;;/kg, ip, CPR uy~ulamaLı.rının sonuçları kıyaslandığında,

gerek beyinde gerekse karncqerde ye6ane önc:nli (p ( 0.05) farkın GSSG

düzeylerinde olduğu görüb-ıektedir. 5 3un süreli, 500 rng/kg/;:ün, ig,

CPR' ın beyin sonuçları diğer CP:<: uygula:nalarından fark gösterme:niştir.

Karacigerde ise GSSG düzeyleri, 100 :ng/kg CPR I dan p < 0,001 düzeyinde,

150 r:ı~/k~ CPl{'dcn p( O.Ol Jiizeybde farHa yü'.<.se'.<. bulunur:<.en GS:ı redoks

göstcr;;clcri de öne:cıli (p(ü.01 - p<0,05) ölı,:i.ide farklı bulunmu.7tur,

111.2.4.3. CPıl JS·J + E Vitami;li iJygubnan Grup (Studcnt t-Testi

Sonuçbrı)

150 rng/kg CPR ile birlikte E vita:nini uygulanan ~rupta beyin GSi1

düzeyleri de~i.';;:nezken GSSG düzeylerinde önemli (p ( ü.D1) l.ıir azal;ns

;:ıözlen.:ıi.<;,, GSH redo'.<s göstergeleri de öne:ııli (;ı< O.Ol) ölçüde farklı

bulunmuştur. Bu de1erlerin hiçbirinin kontrol grubundan öne:;-ıli Oir farkı

yoktur.

-75-

150 mg/kg CPR uygulanan grupla kıyaslamada karaciğer GSH ve GSSG

düzeyleri arasındaki fark önemsiz olmakla birlikte GSH redoks durumunun

değiştiği, örne!'.",in % GSSG' nin p < O. 05 düzeyinde foemli bir farkla azal­

dığı saptanmıştır. E vitamini grubu kontrolle kıyaslandığında GS:-1. ve

GSSG düzeyleri önemli (p ( 0,01 ve p ( 0,05) ölçüde düşük bulurı~uş fakat

redoks durumunda bir fark gözlenmemiştir.

III,2,4.4. CPR 150 + Allopurinol Uygulanan Grup (Student t-Testi Sonuç­

ları)

150 mg/kg CPR ile birlikte Allopurinol uygulanan grupta beyin GSSG

düzeyleri önemli (p < 0.02) ölçüde düşmüş, diğer değerlerde öne:nli bir

fark bulunmamıştır. Bu grup kontrol grubu ile kıyaslandığında GSSG düzey­

lerinin önemli (p ( 0,02) ölçüde yüksek, GS!-l. redoks duru:ııu da önemli

(p< 0.02 - p < 0.05) ölçüde farklı bulunmuştur.

150 rng/kg CPJ{ uygulanan grupla kıyaslamada karaciğer GSH ve GSSG

düzeylerinde öne:nli bir fark gözlenmezken GSH redoks duru:nundaki farklar

önemli bulunmuştur. Örneğin % GSSG değeri p( 0.02 düzeyinde önemli bir

azalma göstermektedir. Allopurinol grubu kontrolle kıyaslandığında,

GSH ve GSSG düzeylerinin önemli ölçüde (p < 0.002 ve p ( 0.05) düşük

oldugu, GSH redoks durumunun ise farklı olmadığı gözlenmiştir.

-76-

IV. TARTIŞMA

IV. 1. Yöntemin İşlerliği ve Güvenirliği

Oksid8tif strese karşı hücresel antioksidan savtın~13nın ana

bileşenlerinden ola:1 ve hücrede esansiycl lıir redoks taı:ıponu işlevi

gören GSH.' ın tiyol/ disülfid dengesinin sürdürülmesi, bu tiyol redoks

siste'.llinin işlerliği için zorunludur.Bu den~e oksidatif stres1c ve

elektrofilik bileşiklere temasla bozulduğundan, oksidatif strese temasın

göstergesi olarak GS:-1. redoks duru::ıunu:1 ölçülmesi son yıllardc.1 oldukça

büyük ilgi konusudur (5,6,ll,38,40,75,98-125).

Bu çalış:nada uygulanan enzimatik döngü yöntemi, b'-!

geliştirilen ve iki aşamalı bir ölçümle hücresel total GS!l'ı (GSH +

GSSG) ve GSSG değerlerini veren ve bu değerlerden hareketle GS!1'ın ve

GSH redoks göstergelerinin hesaplanmasına olanak sağlayan bir yönter.ıclir

(100,115).

Çalış:nanın başlangıcında (Bulgular kısmında ayrıntılı olarak

anlatıldığı şekilde) yöntem kurulmuş ve validasyonu yapılmıştır.

Kullanılan bu enzimatik dönrıü o yöntemi,esas itibariyle Tietzt:' (115)

tarnfından tc1nımlanan ve Hazelton (110) tarafından ı:ıodifiye edilen şe1<1.i

ile uy gul3n:nı şt ı r, Ar..c3k örne;.;.ıerinin hazırlanışından ki:-.etik

ölç'J;;ı_lere kadnr 1--ıcr kade:7ıe kritik oldu~undan, yö,.tc;;ı_in ,io.t;rullı 1c,k2.sinlik

ve duyarlı;;ını ctkile:nl'.:! obsılığı olan tü:n faktörler kor.trol altına

alınnaya çalışılarak işle'.nler stan<lardizc ve opti:nize edilmiştir.

Şekil lO'da göri..ıl<lü~;; gi':ıi, Standart GSSG (veya GS!!) il2 ynpılan

tay inler, reaksiyon hızının, ölçü:nUn yapıldını 25 1200 n1hl 'lik

konsantrasyon aralığında lineer oldugunu ge)ster:~) .. "'tir.Tablo 2'cl!? de

gdri.ildü2ü gibi bu do.1rusallık tekrarlanrt 1Jilir ob3:-<1a birlikte, her

dlçü~ gi..ınünde yeni standart e~ri ile çalı~~~ gcre~i varrtır.

-77-

Doku örnekleri ile çalışıldı;1ında elde edilen kinetik ' . re::ı,~sıyon

profilleri ölçü:nlerin güve:-ıirliğini göstermekte olup en az 2. 5 d.akü::a

süreyle lineer bir kinetik gözlenr:ıiştir (Şekil 11).

GSSG

Yöntemin doğruluğu, öncelikle (III.1.3. 'de anlatıldığı şekilde)

tayin.imle kritik olan N&\1 basamagı için gerek do:Zulu gere'.<se

dokusuz ortamdcı irdelenmiştir. Doğrudan GSSG standartları ile yapılan

;cinetik ölçümler.le çizilen standart eOri D

ile, dokusuz ortamda

reaksiyonuna tabi tutulduktaıı sonra yapılan kinetik ölçü:nlerle çizilen

standart eğrilerin aynı oluşu bu basa;ııağın rnüke:nmel yürüdüı;ünü

göstermiştir (3kz. Tablo 4).

Oysa Nl01'ın ,GR'ı inhibe edici etkisi nedeniyle reaksiyon orta:nından

uzaklaştırılmasının 1<r itik olduğu bildirilmekte, za'.'.ları alıcı ve güç

bir işlem oldu;_;u ileri sürülerek eleştirilmektedir (28 40 41) CE>!'ın ' ' .. uzaklaştırılması için Sephadex G-10 kolonları, pH' ya b::ı:~lı olarak

katyonik veya anyonik r0çineler veya SepPak kartuşlarının kullanılması

önerilı:üştir, ancak bu işlemlerinde örnek konsantrasyonunu düşürme

dezavantajı bulunnaktadır (98,99,121).

Trieti la'.11.in ilavesi ile pH 6' da yapılan NE-! reaksiyonunun hem GSil' ın

etkin şekilde alkillenip maskelen:nesini sağladı31, hem de uygulanan

eter ekstraksiyonu ile NE:·1' i et!<in şekilde uzaklaştırrlığı Tablo 4 ve

5 1 deki sonuçlardan anlaşıl:naktadır, Tablo 6 ve 7 'de görüldü_:;li gibi, beyin

ve karacqer doku Orneklcri ile çalışıldığında elde edilen -~;SSG veri:n_i

/2 100 civarındadır.

Dekapitasyonu takiben inzla çıkarıhın organların homoje;1iz3syonıından

hemen önce il3vc edilen GS!-l ve/v~ya GSSG standartlarıyla yapılan

ölçü!cllerle yöntemin ti.i:n veriminin tam olduSu,vcrim yüzdesinin

konsantrasyonla da de·F-;ı:nedigi gözlenmiştir.

YöntBmin te!<rar lana:Ji lir liğinin yüksekli~i, he;n gün içi, hem

gi.inlcrarası ölçü::ılerin varyasyon katsayılarının (CV) düşük oluşu ile

-78-

saptanmıştır. Tablo l0 1 da görülen sonuçlara göre bir gi..in (iekapitasyon

ve hazırla;n3. yapılıp, ertesi gün l<inetik ölç•j::ılcri:ı. yapıLc:ıası :nü::ıküa

olmaktadır. 0okular bekleti Lneden hazırlanmış ve ölçü;nlerin ~; 95 1 i ertesi

6Ün yapılmıştır. Sadece birkaç deneyde aynı gün ya;n lrnıştır,

Yönter.ıin duyarlılıJı 25 ng/:nl GSSG'ye kadar ölçülmüş olmada

birlikte,ölçü:nler bu konsantrasyonun üzerinde

dilüsyonl.ar ve örnek haci:nleri kullanılarak yaµıLnıştır.ÇalışıLı.n 1/4

- 1/8 'lik di.LüsyonL::ırın 25 - 1.50 pl 1 lü örnek haci:nlerinin te!<.rarl3-

nabilir liği de:~iştirrnediği de belirlenmiştir.

Sonuç olarak, doğrulugu,kesinliJi,duyarlı~ı kesin olarak saptan:Jn

bir yönte:n kurulup hem GSH, hem de GSSG düzeyleri güveali bir yönte:.ıle

sıçan beyin ve :rnraciğer dokularınd::ı ölçül:ııüştiir.

IV. 2 . Kontrol Grup lan.

Uygular:ıaların çeşitliliji nedeniyle çok sayıda kontrol grubu ile

çalış:na durumund::ı 1<:.alındıJından, III. 2. 1. 'de anlatılan uy2ul3~a ile

her gruptan ikişer hayvan ile elde edilen sonuçlar birbirleri ve b3z,--ı l

düzeylerle karşılaştırılmış ve sonuçta fark gözlcr1medijindc•1 6 h.:ıyvanlı:<

bir karışık :<ontrol grubu kullanıL;uştır,

hc;ıatotok.sisitesi ve li~id :J(~roksidasyo,ıu y:i!ncı etkisi

iyi bilirH~n bir nja:1 01Ju:1unda:1 pozitif :<o:1trol oLırcü ,lC=:1enr.lişt.ir

(192,193),24 saat aç bırn\nlan sıçanlarda uygulamada,, 21~ s.3at sonr-o.

yapılan ölçii:nde öne:nli (Hçjde ;; GSSG artı.~1- ve G:::i·--l reı.bks duru~ıu

değişikliği gözlen'.11iştir.

IV .3. :~ndosulfan Uygulaması ile Gözlenen Sonuçlar

İnsektisitler, yay6ır-t kullanı:nları ve özellii<.le or:_ıanoklorlu obnl:1-

rının uzun süreli kalıcılıkLuı nedeniyle öne~li çevresel kirlenr:ıc etken­

leridir. Klorlu hidrokarbon türevi i:-ısektisitlerin biyolojik :ne:nbranlar]:ı

-79-

etkileştikleri, meınbran aicışkanlı gırıı bozu;ı, transport fonksiyon 1.arını

etkiledikleri bilb!:ıektedir (194). Aldrinin, endrinin, hekzaklorosik la

hegzarı (Lindan) 1 ın lipid peroksidasyonu yaptıkları, GSH deplesyonuna

sebep oldukları göster iLniştir (55,195,198).

Endosulfana ilişkin yayınları11 iııcelenınesi, aynı ülkede:-ı yapı lan

ve he;nen hemen aynı dergilerde yayınlanan az sayıda çalışmayla s1.nırlı

olduJunu ve sonuçların kendi içlerinde de ve birbirleriyle de uyu,.ılu

ol:nadı:~ını göstermektedir (160,161,164,171). Ülkemizde kullanılan çok

az sayıdaki klorlohidrokarbornian biri olan ve halen en çok kullanılan

10 insektisitden birini teşkil eden endosulfan yuirnrıdaki bilgilerden

hareketle seçi bıiştir.

Seçilen uygula:.ıa dozları (10 mg/:cg ve 15 :ng/kg) • LD50

de·~eri 110

mg/kg alındıJında (153), % 10 ve% 15 LD50

•ye karşılık gelmektedir.

Beyinde gözlenen değerler GSH I ın her iki dozla da değişmediÇ~ini,

ancak GSSG yüzdesinin önemli (p ( 0.001) ölçüde arttıi4ını gcister:nektedir.

Ancak muhtemelen uygulanan dozlar arasındaki far!<.ın fazla ol:nar:ıası

nedeniyle, her iki dozla elde edilen değerler arasında Oner.ıli bir forl<

buluııma;nıştır. ;(araciger somıçları ise, 10 mg/kg ile deJil ama 15 mg/kg

ile GSI! düzeylerinde önemli (p < 0.02) bir artma gözlenirken GSSG

yüzdesinde önemli bir artış ve dolayısıyla GS:--l redoks oranında öner.ıli

bir azal:.ıa gö?.lenmiştir.

Bu duru:ndrı cndosulfanın, beyin dokusunda daha önemli ölçüde olr:ıak

üzere, incelenen her iki dokuda da GSSG yüzdesini artırdı~ı, GSH redoks

duru:nunu etkiledig:i anlaşılmaktadır. ı\nca\c. crıdosulfanın metabolizmasıyla

ilgili olara1<., aktif sülfat konjugntlarına ve GS!l S-transferazlarla

GSH konju;:p,tbrına dönüştüğü dışında bir bilgi bulun:na:naktadır. Nite:Ci::ı,

klorlu insektisitleriıı ::1et3boliz:ııalarırıııı bunca yıldır çoic. çalışılmış

ve anlaşıl11ış ol'Tlasının beklenir olmasına kar.-;,ılık bunun hiç de böyle

olmadığı bildiril:nişti.r (159). Bu nedenle de hangi yolaklarla, ya da

hangi mekanizmalarla olduğu konusunda bir yorum yapma'.< gdç olmakla

-30-

birlikte, endosulf anın o'.csi<latif stres oluşturduğu anL:ışılr'lakt::ı, daha

ileri araştır:nalara ihtiyaç oldu:ıu görülmektedir. Dalıcı yüksek dozlarlcı.,

tekrarlanan dozlarla ve başta GS:I-Px ve GSH S-tr:rnsferaz aktivitesi,

olmak üzere ilave parametrelerle çalış~a uygun olacaktır.

IV.4. CPR Uygulaması ile Gözlenen Sonuçlar

CPR, I, 5. 3. 1 de sözü edildiği şekilde, nadir de olsa ağır SSS

toksisitesi gösteren bir antibiyotik grubunun üyesidir. Sersemlik,

halusinasyonlar, depresyon, iconfüzyon ve ınanik reaksiyonl::ır da tarif

edilmiş olmakla birlikte; treınorlar, epileptik nöbetler ve konvülsiyonlar

tarzında ağ1.r reaksiyonların, özellikle yaşlılanla sık gözlendiği

bildirilmektedir (1S4-186). Bunun dışında giivenli, iyi tolere edilen,

etkin bir ilaç olarak tanı:nla.ıao CPR 1 e ve fluorokinoo

antibiyotiklere ilişkin veriler,% 90 1 dan fazla bir oranda ctii spektrumu

ve farmakokLnctik

veriler çok azdır;

bilgilerini içermektedir. Hetabo] izması. na ilişkin

hızlı metabolize edildiği, yapısı bilinen 4

metabolitinin olduğu ve bunların da antibiyotik etki gösterdiği şeklinde

ki bilgilerden öteye gitmemektedir (l 79-182).

Devam et::ıekte olan bir çalışmamızda sıçan beyin dokusunda CPR ile

LP' nin indüklendiii gözlenmiştir. Bu nedenle, LP I ye !<arşı doğrudan ya

da dolaylı koruyucu etkileri olan, GS!l sistemine olası etkilerinin

incelen~ıcsi düşünülrrniştür.

CPI~ iki zıyrı uygulama yolu ile verilerek incelemmi'?tir. Çünizü inscrn­

larda gôzlendiği bildirilen SSS etkilerinin he:n oral, hem pare:-ıteral

uygulama ile görülebildigi bildirilmektedir. ip uygulama pratik nedenler­

le seçilmiş, iv uygulamayla hayvanlar strese edilmemeye ç3lışılrnıştı.r.

Ölçümler ilacın absorbsiyonunun hızlı ve yarılan:ua ö~rünün kısa olmcısı

nedeniyle son uygulamadan 2 saat sonra dekapitasyonu ta'.öbcn yapılrııışt1r.

100 mg/lcg, ip, CPR dozu, sıçanlarda te,'.( dozla toksik olmadığı bildirilen

(yapımcı firma dökümanları) bir doz olduğu için seçilı:ıiştir, Etkinin

doza bağımlılıgını izlemek için, % 50 farklı bir doz, 150 m~/kg denenmiş-

-81-

tir. Oral uygulama için seçilen 500 mg/kg/gün' lük doz ise, sıçanda

28 günlük tekrarlanan doz toksisite testlerinde, maksimum tolere

edilebilir doz olarak bulunan dozdur (Aynı dökümanlar),

Elde edilen sorıuçlar, önceliği ip uygulamaya vererek, beyin ve

karaciğer verilerini ayırarak şöyle yorumlanıp tartışılabilir:

IV.4.1, CPR'ın Beyin Glutatyon Siste~ine Etkileri

Tablo 14'de görülen sonuçlar, ip, CPR uygulaması ile beyinde, GS:{

veya total GSH'ın değişmediğini fakat, GSSG yüzdesinin doza bağımlı

olarak arttığını, dolayısıyla da GSH redoks oranının (GSH/GSSG) veya

redoks indeksinin azaldığını ortaya koymaktadır. Ancak 150 rng/kg ile

elde edilen değerlerin kontrollerden farkı önemli iken, 100 mg/kg ile

gözlenen farklar istatistiksel olarak önemsizdir.

500 :ng/kg/gün, ig, tekrarlanan doz CPR ile elde edilen sonuçlar

da yukarıdaki sonuçlara paraleldir ve GSSG yüzdesindeki azal:na (dolayı­

sıyla redoks oranındaki artış) daha fazladır.

150 mg/kg, ip, CPR ile birlikte E vitamini uygulanan sıçanlarda

GSH düzeyleri değişmemektedir, Ancak E vitamini ilavesi ile GSSG yüzdesi­

nın azaldığı, re(loks oranının düştüğü gözlenmiştir. Ayrıca E vita:nini

uygula:nası ile elde edilen değerlerin kontrol grubu de:~erlerinden öne'nli

bir farkı yoktur, Dolayısıyla E vita:nininin, GS::I redoks duru:nunu kontrol

değerlerine yaklaşacak ölçüde düzelttiği söylenebilir.

150 mg/kg CPR ile birlikte allopurinol uygulanan grupta gözlenenler

ise, GSSG düzeylerinin allopurinol uygulaması ile önemli ölçüde azaldığı­

nı göstermiştir. Ancak diğer değerlerde önemli bir fark bulum:ıamıştır,

Kinolon grubu antibiyotiklerle gözlenen nörotoksisite konusunlb

çok fazla Ç3lışma yoktur. Ancak bu etkinin GA:3A reseptörü antagonisti

etki göstermelerine ba;lı oldu<'ıu o sanılmaktadır (185,187-189). Diğer

-82-

taraftan farklı küıolonların GABA 1 nın reseptörüne baglarnnasırn i:1hibe

etme derecesi ile SSS toksisitesi <lerecesi arasında bir ilişki d2

gözlenmiş değildir. Nitekim nalidiksik asidin de SSS etkileri vardır,

fakat GABA reseptörlerine bağlan:ııa derecesi çok düşüktür (189).

:1.emeli beynindeki başlıca inhibitör transmitter olan GA 13A' nın

sentezi ve etkisi beynin en önemli eksitatör ar:ıinoasitlerin<len olan

L-glutamik asitle hassas bir denge içinde sürer. Başka bir ifade ile

glutamik asit GA3A prekürsörüdür ve GABA' nın yıkıl:nasını takiben tri!rnr­

boksilik asit siklusunda oluşur, Sıçan hipokampal kesitlerinde, glutaıııa­

tın ve diğer eksitatör aminoasit, aspartatın, salıverilmelerinin serbest

radikallerle indüklendiği gözlenmiştir (199). Gerek bu son çalışmada

gözlenen, gerekse bir nöroeksitotoksin olan kainat ile in vitro koşullar­

da gözlenen serebellar nöronal hasarın ksantin oksidaz (XO) inhi\ıisyonu

ile önlendiği bildirilmektedir (199,200). Daha önce de de[;inildiği gibi

allopurinol ile XO'nın inhibisyonunda, XO ile o; - oluşu~·..ı inhibc

edilmekte, ayrıca allopurinol • OH toplayıcı işlevi görmektedir (149,

151). Aynı koruyucu etki nöronal kültür ortamına yine O{ - toplayıcı

olan SOD veya • Oi! toplayıcı olan mannitol ilavesi ile de sağlan:nıştır

( 200). Bu gözlemler, eksi ta toksinle oluşan nöronal hasarın, isker'li-reper­

füzyon hasarında olduğu gibi XO'ın aracılığı ile oluşan 02

9 1'2 ba1lı

olduğu şeklinde yorumlanmıştır (200).

Winrow ve Supro'1lania:n (191) CP:'<. ile intrakra;ıüı.l basınç artışı

bildirirken, Gerdnarczyk ve di::;. (190), serebral glukoz ve 02

met:ı'ıoliz­

masındn önemli bir de~işme olmaksızın beyin lu:ın akı:;ıın<la öne•ııli bir

azalma gözlemişlerdir. Son derece duyarlı bir teknik olan po?.itro:ı ernis-

yon toı:ıografisi ile elde edilen bu son sonuçlar, CPR' ın SSS

toksisitesinin aydınlatılmasın3. yönelik bir araştırma çerçevesinr.le elde

edilmiştir. Bunun klinik öneminin açık olmadığı bilcliriL:ıekle beraber,

iskemi-reperfüzyon hasarına benzer bir durum·.ı yaratması olası lıgı da

düşünülebilir. Nitekin CPR preparatlarının prospektuslarında d::ı bulunan

"serebral kan akımı düşük olanlarda kullanıl::ıaması 11 uycJ.rısı da bu gözlem

ve yorumla uyumludur.

-33-

Çalışmamıza allopurinol bu nedenle dahil edil;uiştir. Arıcak allopuri-

nal ile redoks oranında bir yükselme ve GSSG yüzdesinde bir azalma

gözlenmekle birlikte farklar öne;nli bulun:namıştır ve allopurinol grubu

değerleri kontrol grubundan yine de yüksektir. Bu sonuçlar allopurinol'ün

dozu ve dozla:ııı ile ilişkili olabilece~i gibi, deney sayısının düşüklüğü

de önemli bir farkı gözlemeyi engellemiş olabilir. Ancak bu konunun

daha ileri incelemeye deıer olduğu anlaşılmaktır.

Diğer taraftan E vitamini ile elde edilen sonuçlar açık bir koruyucu

etki ortaya koymaktadır. Bilindi.~i gibi beyin dokusu, oksijen tüketi:ninin

fazlalığı, çoklu doymamış yağ asidi (PUFA) t3şıyan fosfolipid içeriğinin

yüksekliği ve serbest radikal oluşturabilen bir çok biyokimyasal sistemin

varlığı nedeniyle peroksidasyona fazla duyarlıdır (201), Beynin farklı

bölgelerinin duyarlılığı da farklıdır. Fosfolipid membranlarla etkileşip,

stabilizasyon ve bütünlüJün korun:nasında öne:nli olan E vitamini, bu

nedenle beyin dokusunun LP' ye karşı korunmasında son derece öne:nli bir

görev almaktadır. Nitekirıı E vitamininin SSS'deki koruyucu rolü, eksi!di­

ğinde gözlenen nörolojik bozukluklarla da kanıtlanmıştır (51).

Bu nedenlerle 150 mg/kg, ip, CPR ile birlikte verilen E vita:nininin

GSH redoks durumunu koruması, CPR'ın beyinde oksidatif bir stres yarattı­

ğını güçlendiren bir bulgu olara:c değerlendirilebilir.

IV .4. 2. CP'.{' ın :Karaci:ler Glutatyon Sistc::ıine Etkileri

ip, cp;:;: uygulaması ile karacqerde gözlenen sonuçlar içinde en

öne;11lisi, GSH azal:nasıdır. Doza bağır.ılılı!c göstNrcı.e:nekle birli!<tc GS!I

ve Total GS!-I düzeylerinde ~ 25 - 40 oranında bir azabıa saptnnmı.ştır.

Buna karşılık GSSG yüzdesinin yüksek, dolayısıyla da GS!l/GSSG oranı:nn

düşük oldu~u görülmektedir.

Bu etki tekrarlanan oral doz CPR ile daha belirgin olarak gözlen;:ıiş­

tir. GS1l düzeylerinde fazla bir düşüş olmamakla birlii<.te GSSG yüzdesi

yüksektir (p( 0.001) ve redoks oranı öne~li ölçüde düşmüştür.

-84-

E vi ta'Tiininin etkisi incelendiğinde GSq azalmasını etkile:nediği,

fakat GSSG yüzdesini. önemli ölçüde düşürdüğü ve re<loks oranını yt.ikseltti­

ği görülmektedir, i3öylece E vitamini kontrollere kıyasla redoks durumunu

düzel tirken, GS!l düzeylerindeki öne:nli düşüşe etkili olma:nıştır. Bu

da CPR' ın muhtemel bir GSH konjugasyonu yolağı ile :11etabolize e:iilr.ıesi

olasılığını düşündürmektedir. Ancak bu konuda bir veriye rastlanmamıştır.

Allopurinol ile elde edilerı veriler de E vitaminine paraleldir.

Dolayısıyla CPR' ın karaciğer dokusunda da oksidatif strese neden olar ak

GSH redoks durumunu degiştirdi:';i söylenebilir,

Sonuç olarak; sıçan beyin ve karaciJer dokularında GS\l redoks duru:,ıu

ölçülerek, çalışılan, biri inscktisit, biri antibiyotik iki madcic i1e,

oksidatif stres oluştuğu göst8rilmiştir. Deney sayılarının arttırılması

başta olmak üzere, bc1şka parametrelerin de ilavesi ile dah::ı ileri çalış­

maların gerekli oldu~u anlaşılmaktadır. Her iki maddenin de GABA inhibi­

törü olmaları ve benzer SSS toksisite profilleri göstermeleri ilginçtir.

Ayrıca yine GABA' nın, reseptörü bağlanr:ıasını inhibe eden scfalosporinler

ile hepatik .glutatyon redoks durumunun de?;işti;ıinin gözle:ımi.ş ol::ıası

ve bu bulgunun, bu ilaçlarla gözlenen hipoprotrombine:;ıik etkinin meka­

nizması olarak ileri sürül:nesi de, üzerine e~ilmcğe deJcr bir bulgl:

olarak değerlendirilebilir (202).

KAYNAKLAR

1- r•ıeister, A.: On the Discovery of Glutathione. TIBS, 13,

1G5-1ES l19S8)

Hopk ıns, F. •.:.. On an Au~oxıdisable Constıtuent ot the

Cell. Biochem .. J. 15, 286-305 (1921)

-· A Briei History of Glutathıone and a

SurvEy ot its i":eta.::ıolıs;n anG Functıo,-,:. "f.3lutatnıone:

Cnemıca:.ı., Bıocnemıcai .a.nd Medıcal u.

L.1 0:.ı.;:ır,ın, r--. rcc.., . .:."'a", iJ. Av · :.ınc-1:;. c, .Jo.ın

Asc:oroıc Acıo an □ Glut,2;.t:hione. l:ıocr,em. J. 30, 1446-

:ı.462 ( 19-~,8ı

5 Kı·e~zetscnmar, M., Klınger, W.: The Hepa~ıc Glutathione

System-Influences of

145-164 < 199(!)

Xenobiotics. E:<p. Pathal. 1 38,

6- Meister, A. ' Anderson, M. E. Glutathiane. Ann. Rev.

Biochem. 711-760 (1983)

, - ı·ıeısteı·, A.: Glut,:;.tnıone Deticiency Pı·oduceci by Inhi-

□ i~ion of ıts Bynthesis, an~ its Reversal; Applications

51,

f2ra5es, A<,aaemısl< Avna.ndlıng. Insti~uonen far Bıo;.c:emı.

9- Wal lenfels,

halten von

Biochem. Z.

K., Sb·effer, C. :

Cyst:eın und

346, 119-132 (1966)

Das Dis~oziationsv2r-

SH-Verb ı ncu.nyen.

10- Streıtwıeser, A.: Solvolytıc Dısola.cement F:ea.ctıans at

Saturated Carbon Atoms. Chem. fi.ev., 56, 571-744 ( 1956)

11- Gilbert, H. F.: Redo;< Control af Enzyme Activities oy

Thiol/Disulfide E:<change. Meth. EnzymoL, 107, 330-351

( 19B4)

12- Gılbert, H. F. : E<iolog ic:.>.l L·isul f ides: The Third

Messenger? J. Biol. Chem. 257, 1550-1555 (19b2)

13- ~han, X. ' Aw, T. y. ' Jones, D. F • Glutatnione-

Dependent Protection Against Oxidative Injury. Pnarmac.

Ther., 47, 61-71 (1990)

14- Slivka, A., Mytiline□u, C., Cohen, G.: Histocheınical

Evalu.ation of Glutatnıane in E<rain. Brain Res., 409,

275-284 (1987)

15- E-e:ız ı.., G., Fa.stor:!.s, O., Marzatico, F. 1 Vi l ld, R. F.:

Age-Related Effect Inducec by O:<.ıda.tive Stress on the

Cereoral Glutathıone ~ys.;em. Neurochem. f;:es., 14, 473-

481 (1989)

I.' Boda, D.: The Fat"io ot ü:<iaize□ /heoucec

Glutathione as an Index of Oxidatıve Stress ın Varıous

Experimental Models af Shock Syndrome. Biomed. Biochim.

Acta, 48, .'.2/3 1 SS-3-.::57 (1989)

17- Jenkinson, s. G. ' Marcum, R. F. ' Pickard, J. s. !

Orzechowski, Z., Lawrwnce, R. A. ' Jordan, J. M. :

Glutathione Disulfide Formation Occuring During Hypoxia

anc Reoxygenation of ~at Lung. J. Lab. Clın. Med., 112,

471-480 { 19813)

16- SLes, Erıgelius, R. ' Akerboom, T. F'. M. :

Intrahepatic Glutathione Status. " Functions of

•..'iiu+:a.thıone: i-iochemıc,=l, F'hysıologıcal, lo:<icologıcal,

and Clinıcai Asoects" de. A. Larsson, S. Orrenıus, H.

Holmgren B. Mannervik, Reven Fress, New Y□ rk, 1983.

1'?- igarasni, T., Satoh, T., Vena, K., t(itawaga, H.: Sex-

F>:elated Differences in the Hepar;ıc Glutathıone Level

and Related Enzyme Actıvıties in Rat. J. Biacnem., 93,

33-36 {1983)

20- Cha, E. s. ' Jonnsan, N., Snıaer, 8. C. F.,: ı·ıs,;:;ue

Glutathione a,;:; a Cy,;:;t (e) ine Feservoir Durıng Cystıne

Depletion in Growıng Rats. J. Nutr., 114, 1853-1862

(1984)

8. , Foreme.n, w •• Segal, Cysteine ancı

Glutathione Levels in Developıng Rat r-.Idney and Lıver.

F-'ediar;rıc Res., 22, 605-608 (19Eı7!

'"''""- S•ene<.:e, 3. M., .=a.n □ urg, B. L.: ~egulaı;ıon of f..:ellula.r

Glutathıone. Hm. J. Physiol., 257, L163-L173 (1989,ı

,~ kıchm~n, r. ~., Meıster, A.: ~egulation ot T-6lutamyl

cysteine Synthetase by Non-allosterıc Feedback

Inhıbıtıon by Glutathıone. J. Biol. Chem., 250, 1422-

1426 (1975)

:24- Tatei:hı, H., T. • Shinya, 5 •• Naruse, A.,

Sakamoto, Y.: Stuc:ıes on tne R.egu.altion of Glutathıone

Level in the rat Liver. J. Biocnem., 75, 93-103 (1974)

:::::;- Tatsıı=:n.t, H., Higa5h1, T., Nc.ruse, A., Naka.s;-ııma, t,:.,

Shiazaki, H., Sakamoto, y. : Ra-c Liver Glutathione:

ı::::·ass!.b.!.e F.oJ.e as a ri:eservoır of L-,.:ysteıne. J. Nutr.,

107, 51-60 (1977)

26- Finı-.:els-ceın, J. D., M2.rtın, J. J.: Metnioneine Meta-

□ ol ısm in Mammals: Distribution of Hamacysteıne Between

Competıng F'athways.

( 1984)

J. Eıal. Chem., 259, 9508-951.3

'27- Sh2.n, X., Aw, T. Y., Shapira, ,;., Janes, D. P • 0:<ygen

Dependence Glutathione Synthesis in Hepatocytes.

To:<icol. Appl. Pharmac., 100 1 267-270 (1989)

28·~ Gr!.ffıth, O. W., Meister, A.: Tr.;;ı.nslocation of Intra-

cellulat· Glutathione to Membrane-Bound -T-Glutamyl

·1r:1.t1<;;;peµ-cıda.-;::;e cı.s a 0iscrete Step in the ı--GLutamyl

Cycle: Glutathıouria After Inhibition of Transpeptictase

;:•rcc. N~.tl . .:+c2.a. Scı., 76, 2c.5-272 l191<e?)

29- Aw, T .Y., GoKh~ens, M., Ren, C., Kaplawıtz, N.: ~:Ine­

tics of Glui:;athıone Efflu:< from Isoiatea Rat Hepato­

cytes. Am., J. Physiol., 250, 6236-6243 (1986)

3,)- Lash, L. H., Jones, O. P.: ~enal Glutathıone Transport.

Characteristics of the Sodium-Dependent System in the

Basal-Lateral T1embrane. J. Biol. Chem. , 259, 145üB-

14514 ( 1984)

31- Hagen, T. M. • Aw, T. Y., Jones, D. P • Glutathione

Uptake and Fro-ı::ectıon Agaınst 0:<idative InJury in

Isolated Kidney Cel ls. Kidney Int. 1 34 1 74-81 ( 1988)

haç,en, T. M., Brown, L. A., Jones, D. r· • F'rotection

Agaınst i='araquat-induced :inJury by E:,ogenous ı3SH ın

Fulmonary Alveolar Type II Cells. E-'iochem. fha-.rmac.,

35, 4537-4542 {1986)

--·--· Anderson, M. E. 1 Br:!.ages, R. J., i"leister, A.: .0irect

Evidence far Inter-G-rgan Tr2.n:port of G:iutatnıone ana

that the Non-Filtration Renal Mechanism far Glutathione

Ut ı l i zat on I nvol ves T-Glutamyl Transpept ıoase. Biochem.

Biophys. Res. Commun., 96 1 848-853 ( 1980)

34- E=iaglow, .J. E., V,a;.rnes, M. E. 1 Epp 1 E. R. 1 Clark, E.

D. • Tuttıe, s. W., Held, K. F. • . - Role of Glutathiane a.nd

C!ther Thiols in Cellular Res~onse ta ~adiation and

Drugs. Drug Metab. Rev., 20, 1-12 (1989)

;;eea, .J • : ~.egu 1 at;. arı OT hecuı:tıve

Glutathione. Biochem. F'narmacol., 35, 7-13 (1986ı

3o- 7 r·~bole, D. L., ~ones, D. P., Edmcnson, D. E.: ~ffect

of Hypoxia on tert Butylhydropero:dde-Induced Oxidative

lnjury ın Hepatocytes. Molec. Pharmac. , .34, 413-4:2(ı

( 1988)

37- f:"etterer, F-rctective Role of Glutathione and

Glutathione Trans-ferases in Muta.genesis and Carcıno­

genesis. Mut. Res., 202, 343-361 (1988}

38- Sl ivı-::a., A. ' Spina, M. B. ' Cohen, G.: f-'educeo and

Oxidized Glutathione ,n Human and Monkey Brain.

Neuroscı. Lett., 74, 112-118 (1987)

39- Hs9har, . ' Fi.eddy, B. G., tc:rishna, G · i-listocnemical

Lacalizatian of Gluta.thıone in Tıssues . .J. r-iıstochem.

Cytochem. , 774-779 < 1975)

40- GrifTıth, :J. Determin2.tıon ot Glutathione ana

Glutathione Disulfide Using Glutathione Reductase and

2-Vinylpyridine. Anal. Biochem., 106, 207-212 (1980)

41- hndersan, M. E. ' Meister, A. : Dynamiı: State of

Glutathione in Blood Plasma. J. Biol. Chem., 255, 9530-

9533 < 1980)

42- Griffith, O. W., Novogradsky, A., Meister,A.: Excretion

of Cysteine and Gamma-Glutamylcysteine Moieties ,n

Human and Eı~perimental An imal Gamma-Glutamyl Trans-

pept:..d2.se Deficıency. froc. Na.ti. Acad. Scı.,

33a7 c19ao,

43- Lunn, G., Dale, G. L., Beutler, E.: Trans~art Accaunts

far Glutatnione Turnover in Human Erytılrocytes. 5lood,

54, 238-244 <1979)

44- r.eec, D. J.: Glutathi □ne: ·1·0:<ıcalogic:al Implıc:ations.

Ann. Rev. Pharmac:ol. To:<icol. 1 -30, 603-6-31 (1990)

45- Facifıci, R. 1 Davies, K. J. A.: Protein Degradation as

.an Inde:-: of Ü>:idative Stress. Meth. Enz:ymol., 186, 485-

502 \ 199(,)

46- Hallıwell, 8.: Tel1 Me A□out Free Radicals, Doctor: A

Review. J. Royal Soc. Med., 8~, 747-752 (1989)

C • J •• Segura-Aguılar, J .• Monsalve, E. •

Hermenegilcto, C., Nıes, c.., F'uertas, F. J., Roma., J.:

Antı □ :<iaa.nı:; and Glutathıone-Relatea Enzymatıc Act i-

vi-cies ın Rat :3cıatıc Nerve. Neuro-ı:;a:<icol. lerat:ol.,

12, 603-605 (19901

4E- ~rnster, L.: •.J:<ygen as a.n Environmen-ı::al F"oıson. Cnem.

Serip., 26, -525-534 (1986i

49- C•la-fsoottır, K., Reed, O. J.; h.etentıon of ü:(ıdized

Glutathione by Isolated Rat Liver r-ııtochonaria During

Hydropera:~ide Treatment. Biochim. Pıophys. Acta, 964,

.377-.38:" ( 1988)

50- Change, B. • Sies, h. • Eıoveris, A. : Hyaroper□:( ide

Metabol ism in Mammal ian Organs. F"hysiol. Rev. 1 59, 527-

51- Cnow, C. k. : Vıtamın c. and Oxıd2tıve Stress. Free

Radical Biology and t1edicine, 11, 215-232 (1991)

5~-- wenceı, M.: Glu~atnıone Feroxıoase. ••~nzymatıc fıasıs ot

Deto:-:ıcatıon Vol. I" de, Ed. W. c,. JaKoby, Ac2-.aemıc

F'ress, New York, 1980. s. 333-.352

T,;;ı--:ahasnı, 1<. 1 Avıssar, N. • Whitin, J •• Conen, H.:

F"urıfication and Characterıza'tion ot Human r·ıasına

Glut.3.tnıone r''era:-:iaase. A Se!.ero.-;lycaproteın Distincı:;

from 'the t<noı.,n Cellular Enzyme. Archs.Bıachem.Biophys.

256, 677-656 (19E.S)

54- Burk, R.F., Lawrence, h. A.: Non-selenium Dependent

Glutathione Pet·oxidase. " Functıons of Glutathione in

Liver and l(ıdney"de, Ed., H. Sies, A. Wendel.

Springer, Berlin, 1978. s. 114-119.

55- Numan, I. T., Hcs.ssan, M. Q., Stohs, S. J.: Protecti.ve

Effects of Antıa:ndants Agaınst Endrin-Inouced Lipid

Per□:<idation, Glutathione Depletion, and Lethality in

Rats. Arch. Environ. Can tam. To:<icol., 19, 302-306

56- D'ı4quino, M., Dur,stet·, C., Willson, k. L.;; 'lıtamırı A

and Glutathıone-Mediated Free radical Damage: Competing

n.eactıons ı,,nt.-ı r- □ :ı.yuns.ö.tu.r~.tea fatty Acıds C'.nd ',)itamın

C. Biochim. Bıophys. Res. Commun., 161, 1199-ı:(!3

(1989)

57- tc.osower, N. E. M.: The Glutathione Status

of Cel ls. Int. Rev. Cytol., 54, 109-160 (1978)

58- Tamba, M., Sımone, G., {Juıntiliani, M.: Interaction o-ı-

Thıyl Free f;adicals wi th 0:<ygen: A Pulse Radıolysis

Study. Int. J. Radiat. Biol., 50, 595-600 (1986>

59- Bur!<., K. F.: Glutathione Dependent f'ı•otection by Rat

Liver Micrasomal Protein Against Lipid Peroxidation.

6icc:-.ım. Gıopııys. Acta.~ 757, ::ı-::.e d9E3)

60- Gi □ son, D. D., Ha-.wryika, J. , McCay, P. t:I. : GSH

Dependent Inhibıı:ıon of Lıpid Pero:naatıon Properties

OT a Patent Cytosol ic System which Protec'I: Cel 1s

Membranes. Lipids, 20, 704-711 C1985)

61- Weob, J. L.: Comparıson of SH Reagents. ''Enzyme a.nd

Metabolic Inhibitors Vol. III" de. Ed. J.

Academic Press, New York, 1966. s. 795-819.

L. Web □,

62- Ma.nnervik, B. : Mercaptans. "Metabolic Basis of

Deto:<ication" da. Ed. W. B. Jakoby, J. R.

Caldwell. AcadeıTiic Fress, New Yark, 1982. s.

Benci, J.

185-206

63- Oleinick, N. L., Xue, L. Y., Frie□ man 1 L. fi.., Donahue,

L. L., i3-ıaglow, J. E.: Inhibıtıan of F:adıatıon-lnouced

DNA-Proteın Cross-link Repaır by Glutaı:hıone Depletion

with L-Buthionıne Sulfo:<ımine. NCI Monogr., o, :.='25-229

< 1988)

64- McCoy, R. N., Hill, t<. E., Ayan, M. A., Steın, J. H.,

Burk, R. F.: 0:<idant Stress Fol lowing Renal Ischemia:

Changes ın the Glutathione Redo:< Ratıo. ı<ianey Int.,

33, 812-817 (1988)

65- Granger, D. N., fi.utili, G., McCaro, J. M.: Su.peroxıde

Radicals ın Felıne Intestinal Ischemia. Gastroentero-

logy, 81, 22-28 (1981)

66- Shlafer, M. , Kane, P. F., i<ırsh, M. M.: Supero:<ide

Dismutase Plus Catalase Enhance the Effıcacy of Hypo­

thermıc Cardioplegia ta F'rctec'C the Globally Ischemıc,

Reperfused Heart.

830-839 ( 1982)

J. Thorac. Cardıovasc.

67-- f'a;;t, A., rlarken, A. H., t:<urton, L. ,, .• , F.ociell, T. L.,

Pıermattei, D., Schorr, W. J., Parker, N. B., Berger,

c.. M., Horesn, I. R., Teraaa, L. S., Lınas, S. L. L.,

Cneronis, J. C. ' Repine, J. E. : Xanthine Oxidase-

Derıvea hydrogen Pera:<ide Contributes to Ischemia

Reperfusıon-lnduced Edema in Gerbil Braıns. J. Clin.

Invest., 81 1 1556-1562 (1988)

68- Ceconi, C. , Curello, S., Cargnoni, A., Ferrarı, h.,

Albertini, A., Visioli, O.: The Role of Glutathione

Status ın the Frctec"t"ıon Agaınst Iscnemıc and Feper­

fusion damage. Effects of N-Acetyl Cysteine. J. Molec.

Cell. CarC!lOl • .2•), '::-1::: \1986)

69- r·aller, M. S., ':=ikora, J. J.: henal War1<:, Gluı:;aı:;nıone

and Sı..ı.sceptibilıty ta Free Radical-Medıated Postisc:he­

mic: ınJLtry. t:·_ıdney Int., .33, 84.3-649 (1'768)

70- Uraizee, A., Reimer, K.A. 1 Murry, C. E., Jennings,R.B.:

F=1.ılure □ i 3upera:<ide Oi'S'mutase ta Limit Size of Mıo-

cardial Infarctıon After 4(ı Mınutes of Ischemia and 4

Days of Reperfusion in Dogs. Circulation, 75 1 1237-1248

< 1987)

71- Jaeschke, H., Smıth, C. V., Mitchell, J. R.: Reactive

Ü!<ygen Specie-s During Ischemia-Reflow Injury

Isolat;acı Ferfused hat Liver. ~'. Cl in. invest. 81 1 1240-

1246 (1988)

72- Ja.Esc;-,ı--e, H., Smitiı, C. V., Mitchell, J. R.: Hypo:nc

Damage Generates Reactive 0:<ygen Species in Isolated

Fer·iuse,:; F-at Liver. Bıocnem. Biopnys. Res. Comm., 150 1

568-574 (1988)

ı.::,- Aw, T.Y., Anders.son, i:i.S., Jones, D.P.: i'1itochondrıal

transmembrane lan Distrıbutıon uur1ng Ano:<ıa. Am. J.

PhysioL, 252 (Cell Physiol 21), C356-C.361 (1987)

74- Stein, H. J. ' Gostnuızen, M. M. J., Hinder, R. A.,

Lamprechts, H.: Oxygen free Radicals and Glutathione in

Hep<a<.tic Iscnemia/f;eperfusion Injury. J. Surg. F..es., 5ü,

398-402 ( 1991 )

H.: Oxıoatıve Stress in Chemical Toxicity.

Arch. Taxıcal. 1 60, 144-149 (1987)

76- Sie-:::, H. , kett:erer, B. : Glutathıane ConJugatıon.

Mechanisms and Biological Significance. Academic Pı-ess,

Lan don, 1 '?138.

77- Russo, A., Mitchell, J. B., Degr.;;.if, W., Spiro, I.,

Gamson,J.: The Effect af Cellula.r Glutathione Elevation

on the Oxygen Enhancement j=;:atıo. hadıat. Res.,

232-239 ( 1985)

103,

78- Carmıchael, J. Adams, D. J., Walf, C. R • Glutathıone

Transfera.se Levels in Mause Granulocytes Followıng

Cyclopho-sphamide Administration. Cancer Res., 46, 735-

739 (1986)

79- Vamvak.as, ' . .....,naers, M. w. : Formation of F.eactıve

Intermediates by Phase II i::nzymes:Glutathione-Dependent

Bioact:.v.;;_tıc:ın F-.eactıon:c;. Bıalogıcosl Feactive interme-

diates IV. Ed. C. M. Wıtmer et al, Plenum Press, New

E,~,- Z::•eGraii, W.G., Fusso, A., r-ııtcnell, J. 5.: Glutathıone

Depleı::ian Greatly F.:educes Neocarzıno-sı::at1n Lytoı:: □ :(ıty

in Chinese r.<='.mster V79 Cells. J. Biol. Chem. 1 26ü,

8.312-8315 ( 1985)

81- husso, A., Degra.fT, w. G., Friedman, N., Mıtchell, _r.

B.: Selective Modulation of Glutathione Levels in Human

Normal Versus Tumor Cells and Subsequent Dıfferential

Response to Chemotherapy Drugs. Ca.,cer Res., 46, 2845-

2848 (1986)

82- Bump, F'. A., Yu, N. Y., Brown, J. M.: Raoiosensiti-

;.:atıon af Hypc:nc Tumor Cells by Depleting Intracel­

lular Glutathione. Ocience, 217, 544-54-5 {1982)

E3- ;-, ccn, c. J. ' Stol:be, C. C. ' baer, A: Comc ineci

Radıaı::ıan-F--ratective and ~adıation-Sensitizing Agents

:;:::;::;:: ı=::aıJıos~nsır,ız5.tıon oy i"ıısonıd,;.zole a5 a f"unctıon

of Concentratians of C:noogenous Glutathıone ar E:< □-

genous Thials. Int. j. Raoiat. Oncol. Bial. Fhys., ız,

1151-1155 (1986)

84- i••cL2.y, P. b., Gibson, D. D., Fong, tc.. L., rlornbroak 1 t<.

R • Effect of Gluta~hıone Peroxiaase Activity an Lipid

Peroxidation in Biological Membranes. Biachim. Bıophys.

Acta, 431, 459-468 (1976)

85- Wefers, R. Sıes, H.: The Pratectian by Ascorbate and

Glutathıone Agaınst Mırosomal Lipid F'eroxidation is

Depenoenı: on •,;itamin E. Eur. J. Eiocnem., 174, .35.3--357

C 1988)

26- Ursinl, C • i'1aiorino, ı•i. ' Va.lente, M. , Ferri, L.,

Gregolin, C.: Furıficatıon from Pig Liver of a Froteın

which Proı:ects Liposomes and Eıiomembranes Trom F'ero:sı-

dative Degradaı:ion and Exhibits Glutathione Peraxidase

Activity on Phasphotidylcholine Hydropero:<ides.Biochim.

Eıiophys. Acta, 710, 197-:Z11 11982)

87- Ursini, F., Maiorino, M., Gregolin, C.:The Selenoenzyme

Phospholipid Hydropero;<ide Glutathione F'er□ :< idase.

Biachim. Biaphys. acta, 839, 62-71 (1985)

88- McCay, P. B. ' Gibsan, D. D. , Hornbrook, k. R. :

Gluı:athıone-Dependent Inhibition of Lipid Fero:<idation

by a 3oluble, Heat-Labile Factor not Glutathione

F·ero:dwase. Fean. Froc., -+(,, ı9S--:2(.ı5 {ı7eıı

89- Haenen, G. R. M. M. 1 T5□ i, .J. N. L. ı. T., \,ermet..ılen,

N. F. E., Tımınet"men, H., B..:.ı.st, A.: Hydroxy-2,.3-trans-

nonenal Stımulates Microsomal Lipid Pero:<idation oy

reaucıng ı:he Glutathione-0epenaenc Protectıon. Archs-

Biochem. Biophys., 259 1 449-456 (1987)

90- !""la.enen, G. R .. M. M., \,'ermeulen 1 N. t=·. E., Tsoi, J. N.

L. ı. T., ha.ge-ı;ii, H. M. N. 1 limmermen, H. 1 Bast, A.

Activation of the Mıcrosomal Glutathıone S-Transferase

and Reduction of Glutathione Depencient FTotectıon

against Lipid Feroxiaation by Acralein. Eııochem.

Ph.armac., .37, 19.3-3-1938 {1988)

91- ~-rvor . ' A. : The r"rEe-Aa.ciic.2l Theory o-f Aging

Revisited: H Critic;ue ana a Su.ggesteO Disease-Specitic

Tneory. "Modern Eıioiogical Tneories of Hgıng"ae. Ed. 1-1.

r. \.<ı-2.•'r,e~·, H. N. Eu.tier, 5prot 1 h. L., Scnneiaer, E.

L. 1 Kaven F'ress, New Yark, 1987.

,..:,_1-lurk, ~-tosn, s. E:1-Rasniay, F. H. ,

Othman, Shaneen, o. : Chanyes in Glutatnıone, Glu-

tathione Reductase and Glutathione-Transferase as a

Function oı' Cell Concentration and Age. Pharmacology,

34, 1-8 (1987}

'7-3- Farooqui,M. Y. H. ' Day, w. Zamorono, D. M. :

Glutathione and Lipid Fero:odati □n in the Aging Rat.

Camp. Biochem. Physiol. 1 888 1 177-180 (1987)

94- ~owar·c, R. O., McDonal, G. J., Dunn, 8., Cre~sey, W.

A.: ~xper·ımencal Chiorprom-oz:ıne La.taracts. Invest.

Opht.a1. B, 413-421 (1969)

S-5- Cc>.lvin, ti. I., Medveoov<:::ı-::y, C., Worgul, i:ı. V.: Near-

Total Glutatnione Depieti □n and Hge-~-pe-cıfıc •.::2.taract

lnduced by Gutnionıne '.;:ulto:<ımıne in Mice. ::C,cience-,

2.33, 553-355 (1986)

96- Sp ına, M. B. ' Corlen, G. : L·opamıne ı urnover ana

Glutatnione Oxiaation: lmplicatıon F'arl<:ınson

Disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 86 1 1-398-1400 (1989)

97- Jocelyn, P. C.: Biochemistry of the SH Group. Assays of

Thiols and Disulphides. Academic Press, 1972.s. 1-37-162.

98- AnCerson, M. E. : Determination of Glutathıone and

Glutathiane Disulfide in Pıologıcal Samples. Meth.

Enzymol., 113 1 548-55.3 (1985)

99- Aı.::erooom, T P. M., Sies, H.: Assay of Glutathione,

Glutathione Disulfioe, and Glutathione Mixed Disulfides

in E-iological Se?.mp les. Metil. Enzymol., 77, 373-382

(1981)

ıüü- Haze.!. ton, G. A. 1 Lang, C. A.: Glutathıone Cantents of

Tissues in the Aging Mause. 2-ıoctıem. J., 188, L5-30

(19>30)

lül- i::edlak, J. ' i..ınsay, R. H. : Estımation of Tota ı,

Protein-Bound, and Nanprateın Sulthyoryl Groups ,n

Tissue with Ellman's Fi.ea,~enı::. Anal. Biocrıem., 25, 192-

205 (1968)

102- Martin, H., Mcllwain, H.: Glutathione, U:d.oized, and

Reduced, in the Brain and in Isolated Cerebral tissues.

c<ıocnem. J., 71, 275-280 (195'7)

103- Ellman, G. L.: Tissue Sulfhydryl Groups. Arc:hs. Bıchem.

1U4- Miı::chell, J. R., Jollow, "· J. ' w. z. '

Gi l i.ette, J. fı'.., Bracıe, 8. B.: Acetamınapnen-lnaucEa

Hepatic Necrosis. IV. F-ro-ı:;ective /;'ole of Glut"atnione.

J. Pharmacol. E:{p. Ther., 187, 211-217 (1973;

ı,:,s- Eyer, F·., f"odhradsky, D.: Eva.iuation of the l'-ıicromethod

for Determination of GlLıt-athıane Usıng En:::yma-ı:;ıc

Cycling and ELı.man's heagent. Anal. Eıoctıem., 15-3, 57-

66 ( 1986i

106- Kret"2scnmar, M. ' :ı :.nger, w.: Gamma-Glutamyl Trans-

peptidase in Liver Homagenates af Dıfı'erent rats of

Ages: ı::nzyme l<inet ıcs and Age Course of t-.,., cı.nd V.,.,..,,..

ı... 1...:ersucnsı:;1er1<:. 32, 41-47 (19139)

107- Cahn, v. H., Lyle, J. : Fluorometrıc Hssay Tor

Glutattıiane. Anal. Bıocnem., 14, 434-440 (19661

ıc,_;- Hissin, J. ' hilf, R • A Fluorome-ı:;rıc r1ettıoa far

l)e-ı:;erminat ion OT Ü:( idi zed and ı~,eoucea Giu-ı:;aı:;n iane in

Tissues. Anal. i:lıochem, 74, 214-226 ( 1976.•

J. Biol. Chem. 1 194, 119 (1952)

11C1- Sıes, rl., hf·:erooom, F'. M.: Gluta.thione Disulfiae ı_GSSG)

Efflu:< from Cells and Tissues. Meth. En;::ymol., 105,

445-451 (1984)

111- Pıntoıne, B., h~nimı-f·our, A., Srest, G., Magdalou, .J.,

Galte-=<.u, M.: üifferenı:;ial Tıme-Course of Incuction oT

Rat Lıver •.3c>.mm-a-G 1 u ta.my 1- Trcı.no;: -ferc3.se and Drug-r1eta.-

ooLısıng Enzymes ın Endoplasmic ı:;.eticulum, Golgı a.nd

Plasma Membranes after a Sıngle Phenobarbital lnJecı:;ion

Evaıuc.tion of r·roteın Varıd.tıons by lwo-Dımensıonal

Elec tr~ophores is. Cell Biochem. - ~ r-unc., ....,, 217-2.31 ( 1987)

1 ı.:z- ı-lcdrich, F"itot, H. C. : Enzymes oi Glutathıone

Metabolism as Biochemical Maı-kers During Hepatocar-

.:::ınogenE-Sl:<c;. Cancer Metast. f.,;:ıv., 6, 155-178 (1987)

113- Laish;;::ıs, B. A., Ogawa, !<., f;ooerts, E. 1 Faroer, E.:

Gamma-Glutamyl Transpeptidase: A Positive Mar~:er far

Cultured Rat Liver Cells Derived from Putc,_tive Pre-

malıgnant an □ Malıgnant Lesıons. J. Natl. Cancer Inst.,

60, 1009-1016 ( 1978)

114- Cwens, C. W. 1. 1 Belcher, R. V.: A Colorimetric Micro­

Metnod tor the Ueterminaticn of Gluı;athione. Biochem.

J., 94, 705-711 {1965i

:;.15- ı 1e1,:;:2, F.: t::nzymic Meı=.ıoc:! Quantitative Determinatıon

of Nanogram ~ınc-Lını:s of Taı;al and Gxiaı;::ec Glutathıone:

Appl iccı_tions ta Mamınalian Blood and O1:ner lissues.

Anal. Ciocnem., "2.7, S02-5Z'.? (196"1)

116- Oshino, N. ' Cı-ıance, B. : Properties of Glutathıone

h:elease übservea Durıng Reouction of Organıc Hydro-

peroı{ide, Demethylation of AıTiinopyrine and O:~idation

of Some Sut:ıstances in ferfusect rat Lıver, and Their

Implications for the F"hysiological Function af Catalase

Eıiochem. J., 162, 509-525 (1977)

117- Brene, J. E. ' Burch, H. Enzymatic Assay far

Glutathıone. An~l. Biochem., 74, 169-197 ll976)

118- Guntherberg, H. ' Rast, J. ' The True 0:<iciized

Glutathıone Content af red Blood Cells Obtaınea by new

Enzymıc and paper Chromatographıc Methods. Anal.

Bıochem., 15 1 205-210 (1966)

119- Srivas.:a.va, S. L., &eutler, E.: Accurate Measurement oT

O:dt1ized Glutathione Content af Human, rabbıt, and Rat

Red Blood Cell5 and tissues. Anal. Biochem., 25, ?ü-76

(1968)

120- Anderson, M. E., Pawrıe, F., Puri, R. N., Meister, A.:

Glutathione Monoethyl Ester: Preparatian, Uptake by

Tissues, and Conversion ta Glutathiane. Arch. Biachem.

Biophys. 239, 5.38-548 ( 1985)

121- Adams, J. D. ' Lauterburg, B. H. 1 Mitchell, J. R. :

Plasma Glutathione and Glutathione Disulfiae ın tne

Rat: Regulatıon and f.:.asponse ta O:ddat"ıve Stress. J •

Pharm. E:<p. Ther. 1 227, 749-754 (1983)

12::- wencell, f". ı'1easurement of Oxidized Glutathıone and

Total Glutathione in the F-erfused Rat heart. Biacnem.

J., 117, 661-665 (1970)

123- Reed, D. J., Bacs□n, J. R., Beatty, F". W., Brodie, A.

E., Ellis, w. w., PottEw, D. w. : High-Performance

Liquıa Chromatography Analysıs of Nanomole Level-s of

Glutathione, Glutathione Disulfide, and Relateo Thials

and Disulfides. Anal. Biochem., 106, 55-62 (1980)

124- 0:;;:cımder, M., Louter, A. J. H., Lingeman, H. 1 Voagt, W.

H. , Fre i, R. w. ' Bloemendal, M. : Determination af

Gx ı d i zea, Feduced and Proteın-Bouna Gluta.th ıone in Eye

Lenses by High-Ferformance Liquid Chromatograpny and

Electrochemical Detection. J. Chromatog., 570, 19-28

( 1 991 /

i25- Stein, A. F. Diils, R. L., t'-.laassen, C. [, • Hıgh-

Performance Liquid Chromatographic Analysis of

Glutathıone and its Thiols and Disulfide Degraaation

Products. J. Chromatogr., 381, 259-270 (1986)

126- Evans, h. M. ' Bishap, f(. s. : On the Ex:istence of

Hi therto Unrecogn i zed Dietary Factor essential tor

reproduction. Science, 56, 650-651 (1922)

127- Tappei, A. L.: Vitamın E and Free Radical Pero:<idation

of Lipids. Ann. New York Acad. Sci. 203 1 12-28 (1972)

128- Lu.cr<:y, J. A.: Functıona.l and Struct:ural Aspects oT

Biologıcal Membranes: A Suggested Structural Role of

Vı;;amın e ı the Control o-f l"!emora.ne f'ermeabılıty an □

Sta□ ility. Ann. New Yari<: Acad. Sci., 203• 4-11 (1972)

129- C2.ti9nani, G. L. 1 Chytil, F. 1 Ueroy, W. J.: Vitamln E

Def ic ıency: Immunochemical Evidence for Increased

Accumulatıon ot Liver Xantnine Oxıdase. Proc. Natl.

Acad. Sci., 71, 1966-1968 {1974i

130- Chow, C. K., Gaırola, C.: Influence of LJietary Vitamin

E and selEnium on r-let2,.bolic Actıvation of Chemicals "to

Muta.gens. J. Agri. Foad Chem., .32, 443-447 (1984)

131- Meydani, N., Barklund, M. P., Liu, S., Meydanı, M.,

Miller, R., Cannan, J. G. 1 Morrow, F. D., Rocklin, R.,

Blumberg, J. B. : Vitamın E Supplementation t::nhances

Cel 1-Med ı.ated Immun i ty ın Heal tily Elderly Suo Jects • .:ı.

J. Clin. Nutr. 1 52, 557-563 (1990)

132- ChGw, C. ,= .• ~ t::ftec<ı; OT L'ietary Vıtamın E anc :::.elenıum

on Rats: Fyruva'te l<ınase, Glutatnıane t=·eroxiaase ana

□Kıdatıve Damage. Nutr. Res., 10, 183-194 {1990)

1.33- Chen, L. H., Chang, H. M.: Effects of Higıı Level of

Vitamin C on Tissue Antio:<ıoant Status of Guınea Pigs.

J. Int. Vitamin N:utr. Res. 1 49 1 87-91 (1979)

134- Erendıch, A., Machlin, L. J. 1 Scardurra, O., Eıurton, G.

W., Wayer, O. D. M.: The Antio:ddant Role of Vitamin C.

Adv. Free r21.ciıc. Bıol. r--ıed., 2, 419-4.ı; (1986)

135- Flotıe, L., Gunzler, l<I. L., Schock, h. h.: Glutathione

F"ero:<ıda-se: A Seıenoenzyme. FE:BS Lett., 132-134

{1973)

136- ~ecay, L. C. Scholz, ~- ~-, Thomas, C. E., Mas~aro, ~-

J.: Vitamin E D1ccpenden.; Keducec Glut:at.ııane innıbıtıon

of ra.-ı; Lıver Mıcroslm,=;.l Lipid Pero:noation. Life sci.,

31, 571-576 (1982i

::.37- Gr,=;.nam, K. S. 1 ı=;_ecidy, C. C. 1 Scholz, R. W. <. reduced

Glutathione Effects on ı::ı:-Tocopherol Concentration of

Rat Lıver Micra-somes Undergoing NADPH- Dependent Lıpıd

Pero:<idation. Lipids 1 24, 909-914 (1989)

138- Chou, P. T., Khan, A. U.: L-A-scorbic Acid Quenching of

Singlet Delta Moleculer Oxygen in Aqueus Media:General-

izeo Antioxidant Property of Vitamın c. Biochem.

Biohys. res. Comm., 115, 932-937 (1983)

139- Chaw, tc..: V:;_ tam in E and Blooo. Worlcı Rev. Nutr. Dietet.,

45, 133-166 ( 1985)

140- Nik:;_, Tsuchıya., J. ' ianimura, R. • Kamıya, 'y.:

Regeneratıon of Vıtaının E From a-Chroman □:<y R2.dıcal ay

Glutathione and Vitamin C. Chem. Lett., 789-792 (1982)

141- Packer, J. E., SlatEr, T. F., Wıllson, R. L.: Direct

Observation of a Free Radical Interaction Between

Vitamin E and Vitamin C. Nature, 278, 737-738 <1979)

142- McCay P. B.: Vitamin E: Interactions with Free Radicals

and Ascorbate. Ann. Rev. Nutr., 5 1 52.3-540 (1985)

143- Sata, K. , Niki, E. ' Shimasaki, H. : Fr·ee Rad ica l

Mediated Chain 0:<idatıon of Low density Lipoprotein and

ıts Synergıstıc innioıtıon by Vıtamin E and Vitamin C.

Arch. Biochem. Biophys., 279, 402-405 (1990)

144-- Bur~Gn, G. W., Wrons1<:a, V., Stone, L. Foster, D. O.,

Ingold, K. U.: i::ı.okinetıcs ol' Jıetary hR~-ıx-Toc:opnerol

in the Male Guınea Pıg at Three üietary Levels of

Vi'tamin C and Two levels af Vitamın E. Evidenc:e that

Vıtamin C Does not" Spare" Vitamin E in viva. Lıpids,

25, 199-210 (1990)

145- Chow, C. 1(.: Interrelationstıip of Cellular Antıo:<idant

Defense Systems. "Cellular Antioxidant Defence

Mechan i sms, vo 1. II" de. Ed. C. K. Chow, CRC Press,

Boca Raton, 1988. s. 217-237.

146- Dilıberto, E. Jr., Dea, G., Carter, C., Allen P. L.:

Tissue Subcellular and Submitochondrial Distribution of

Semıdenyaroascoroate Fıeouct.ase: Possıble Role oı' Semı-

dehydroascorOate Reductase in Cofactor Regeneration. J.

Ncu.rocMem. ,::..:;, 5o.3-::68 (198:2)

147- Burton, G. l.J., Ingold, K. U.: Vıt.amin E: An Applic.ation

OT the Prıncıples of i=·hysical Oı·ganic Chemistry ta 1:ne

E:{p l □ r-3.t ion of its Structure and Functıon. Acc □unts

Chem. Re;;., 19 1 194-201 (1986)

145- Gılmö.n, A. G., Gaaaman, L. S. 1 Rall, ,. W., Murad, F.:

Drug Therapy of Inflammation. "Goodman ancı Gi lmans 's:

The Pharmacological Bas is of Therapeutics., 7th Ed. "de.

Eo. A. G. Gilman, L. S. Goodman, ı. W. Rall, F. Muraa,

Mac Millan, New York, 1985. s. 710-715.

Grootveld, M. • He>lliwell, B. • 149- Moorhouse,

Quinlan, J. G. Gutteriage, J. N. C.: Al lopurinol and

Ü;<ypurinol a.re Hydro:<yl Radical Scavengers. FEBS Lett.,

150- Terada, L. S., Lef1.;, J. A., Repıne, ..;·. E.: Mea.surement

of Xanthıne O;<ıdase 2ıological Tissues. Mer.n.

Enzymol., 186, 651-656 (1990i

151- Sussman, M. s.' Bulkley, G. B.: Oxygen-Derıved Free

Radicals ın Reperiusion InJury. Meth. Enzymol., 186,

711-722 ( 1990)

152- Itan, T. ' k.awakami, M., Yamauch i, y. : Effect of

Allopurinol on Ischemia and Reperfusıon-Inauced

Cerebral Injury ın Spontaneously Hypersensitive Rats.

Stroke, 17, 1284-1287 (1986>

153- Mı.nk, R. B., Dutka, A. J.' Hal lenDeck, J. M. :

Al lopur inal f-'re"Creatment Impraves Evoked Response

Recovery Foı loı-ıing Global Cereoral rsctıemıa in Dogs.

Stroke, 660-665 ( 1991 )

154- i<<:<ta, T. ' ri l derman, J. ' . . . _. na ;;om ı, N.'

Lieoer, C. s. : Role of Xanthıne Oxıdase ın Ettıan□ l-

lnduced Lipid Pero:<idation in Rats. Gastroenterol,, 98,

20.::-21c, (1990)

155- Oei, H. h. H., Zogonas, H. C., McCord, J. M., Schaffer,

s. w. : Role of Acetaldehyae and Xanthine O:<idase in

Ethanol-Induced Oxidative Stress. Res. Comm. Chem.

Pathol. Pharmacol. 1 51 1 195-203 (1986)

156- Siems, W., !<owalews1<:1, J., Jakstadt, M., Carnelia, 5.,

Schimke, I., Gerber, G.: Effects af Allopurinol on the

Glutathiane Status and Thiobarbıturic Acid Reactive

Subs~ances tTBA-fiS) in Isctıemıc Rat Intestine.

Pharmazie, 43, 438-439 ( 1988)

157- ·ı C. i:-aş □ c:d.anl.:.;.._ Devlet Planlama Teş;-:ııatı: .imyasal

Madde Ar.21.ş t ı rmas ı "Zıraı Mücadele r::.açları Aktif

Hammaddeleri ". TüMAS, AnkaTa, 1990.

C. R., Hanc2-, R. J - : The f'astıcı □e Manual,

9ttı. Ed. Tile Brıtisn Crop Frotec-cıon Council, Surrey,

1991.s.

,•:atsumura, r.: .:..::fterenı::ıal Toxıcıı:;ies oi lnsec-cıcioes

and f-ı.3.J.ogenaı:;ed Aromatıcs. F'ergamon F'res=>, 0:<f□rd, 1984.

Liiect OT ~cmın ı st,•a_ t ıc.; of DDT an □

t.n □ osulfan Drı Cy r.c:cn t·ome F-450 and Gluta-ı;tııone-S-

1ransferase ın Lung and Lıver of Rats. bull. Envıron.

Con-ı;am. Toxicol. 34, 55-62 (1985)

161- Siddıquı, M. J., Anjum, F., Qadrı,S. S. H.: Some

Metabolic Changes Induced by End □sLılfan in Hepatıc and

Exı:rahepatic Tissues of Rat. J. Environ. Health,

B22, 553-564 (1987)

16.:- Yaowa□, V. b · Effect of Endosulfan on Glutathione S-

lransferase and Gluı;aı:;ı,ıone Cantenı; □ 7 the ı-=·r-emoul t

f'ıeld Craw, Hy,:;ı·c.:::ıromus. Bull. Cnv·ırcn.

Cantam. To:s:ıcol., 4 . .:::, 577-6<)2 (19891

'..::rınıvac:;, ' . ' s. O. C. ,

Ramamur-ı;nı, ~;.:Acute ano Cnronıc io;:ıci-ı;y of ~ncosulfan

Efiec,: on Lipıc ı"'.Eta_.::ıolıs,TI. Bul 1. Cnvıron.

C.ontam. To::icol. 4"/, 918-924 (1991)

164- An sari, R. A.' Sıdd ıqui, M. J. ' Gupta,

To:<icity of i::ndosulfan: Distribution of o:- and

Isomers of F-.asemic Endosulfan Following Oral

Administration ın Rats. Toxicol. Lett., 21, 29-.33

{ 1984)

16::5- Gupta, P. I< .• ' Satya, Chaneıra, V. ' D. K •

Terat □genic and Embrıyoı: □ :(ıC Effect af Enaosulfan in

Rats. Ac:ta Pnarmacol. To:<icol., 42, 15;)-152 {1978)

160- Gucta, P. K.: Dıstribution of Enciosulfan ın Plasma ana

Brain Aftet- Oral Hdministra--ı:;ıı:::;n ta Rats.

To;-:ıcology, 9, .371-377 ( ı97B)

lô-7- :uar.:, v. r .. : ı~ıechanıs,-ns of To:<ıc Hctıon ana Structure-

Actıvity Relatıonships far Organochlorine and Synthetic

i='yret\,roıd lnsectıcıdes- E"nvıron_ Health F'eı·spect., 87,

255-262 {1990)

165- Ecobichon, D. J.:Toxic Effects of Pesticides. ''Casarett

and Doull 's To:<icology: The Basic Science of Poisons,

4th Ed. "de. Ed_ M. O. Amdur, J. Doull, C. f<laassen. Mac

Millan, :'Jew York, 1991. s.565-cı22.

169- Narayan, s. ' Dani, H. t1., Misra, U. f( .• : Chanyes ın

Lipid Profiles of Liver ,"licrosomes of Rats Followinç,

In.:ratec:lıal Adminis-ı:;ra.:ıon of DDT or Er.aosulfa.n. J.

Environ. Sci. Healtn, B25, 243-257 (1990/

Ea,;p2.1, H., cı-,a.uhar., S. 2., ;"11sra, l..J. ı: __ :

Lıpıd Fet·c::ıdatıon ın Lung ana Lıver ot Ra.;s Gıven Doı·

and Enoosul fan lntr·atechally. bu 11. En" ıran. Contam.

To:<ical., 34, 63-67 (1985)

171- Sinı;ı-,, S. k. Panı:::.ay, R. S. Gonaaal Taxıcıty o~ Short

Term Chronic Endosulfan E:<p □sur·e ta Male Rats. Ind. J.

E:<p. Biol. 27, .341-346 ( 1989)

172- Gupta, P. Gupta, R. C.: Effect of Endosulfan Pı·e-

treatment on Organ Weignts and on i='entobarbital

Hypnosıs in Rats. To:ücoiogy, 7 1 283-288 (1977)

17::- i::ı2.lhoff, A., Eıc~:er, □ erg, h. U.: issue 0ıstrıbutıon of

Cipr·oflo: c.1cın r"oli.owın,; üral and Intravenous Admınıs-·

.;r.atıor,. lntectıon, 1:., .38-41 (1985)

V,. : ,.:L•. :;_ r,c; l ones. ";-"·rcç,r2ss ın Cru,;,ı Researcn,

Vol .. :.ı"oe.::_c;_ Verl,:,;.g,

ı7S- !::2r9en, T., 7~ .. ::;rsteın:son, S. B.: F'harmoco1<:1netıcs ana

B:;_oavailability of Cip raf l □ :<ac ın. "F'rac:eed ings Curı-ent

Ci ır,ıcal i=rac:tıce Serıes .34. 1st Internatıonal

C ıprof lo:<ac in Workshap LeverkLlsen, 1985"de. td. H. C.

Neu, H. Wenta, Ams-1:erc.am , 1986.

.:c:. 111-1~1.

176- ua.v:..s, h:. L., Koup, J. R., Wıiiıams-Wart·en, J., Weber,

A., Smitn, A. Fhaı·maca~ınetıcs of Trıree Üt"al

+=aı'ffiL)l,e:ltlOnS of C:..proilo:<c.1.c:..:-ı. Ant~mıcruo. Agenı::

C:rıemoı:n2ı·. ~~, 74-77 (1935,

i'•·· ı.' G. H..

f-;usta.ma-nte, C. I., St2.ndıfarci, H. C.: Effect of Dose

Sıze on :2!.o.avail.='.bılıty of Cipro-flo:<ctcın. Antimicroo.

Agents Chemother., 31, 956-958 (1987)

178- Dan, M., Verbin, N., Gorea, A., Nagar, H., Berger, S.

A.: Concentrations of Ciprofloxacın in Human Liver,

Galloladder, and Bile After Oral Administration. Eur.

J. Clin. Pharmacol., 32, 217-218 (1987)

179- Beerman, D., Scholl, H., Wingender, W., Forster, D.,

Beub ler, E., w. R • . . Metabolism of Cipro-

floxacin ın Man. "Proceedings Current Clınical Practice

Serıes 34. ısa Internatianal Ciprofloxacin Worksnop

Lever~usen, ı955''ce. Ed. H. C. Neu, H. Wenta, E~cerpta

Med ica, Amsterdam 1986. s. 141-149.

18ü- Borner, Lode, H. ' l-!off jen, G. ' Prinzi9, c. '

Glatzel, P., Wı ley, R.: Liquid Chromatograpflıc Deter­

mination of Ciprofloxacin and Seme Metaboli'tes in Human

Body Fluids. J. Clin. Biochem., 24, 325-331 (1986)

ısı- Scholl, H. ' Schmidt, K. ' Weber, B. : Sensitive and

Selectıve Determination of Picogram Amounts of Cipro-

f l □ :<ac in and its Metabolites in Biological Samples

Usıng High-Performance Liquid Chromatography and

Photothermal Post-Column Derivatization. J.Chromatogr.,

~16, 3~!-330 (1987)

182- Bergan, T. Thors'teinsson, s. B. ' Ranwedder, R. ,

Schall, H. Elimin.ation of Ciprofl □ :<acin and Three

ı"'.""J<.:•r !"te-i:;.,ı.scl: t-2·::; anü Ccnsec:ıuer.ces o, Recıucec Renal

Functian. Chemotherapy, 3~, 393-405 U9a9/

Current Clınical F'ra.ctice Series 34. 1st; lnt2rnati.:m<:<l

Ciproflo:<acin Workshop Leverkusem, 1985"de. Ed. H. C.

Neu, H. Wente>., Excerpta Medicc1., Amsterdam 1986.

s. 62-71.

184-- Rahm, v., Schacht, F' • Safety of Ciproflo:<acin. A

Review. Scand. J. Infect. Dis., Suppl. 60, 120-128

(1989)

185- Christ, W.: Central Nervous System To:<icity of

Quinolones: Huma.n and Animal Finciings. J. Antimicrob.

Ciıemother., 26, Suppl. 3219-225 (1990)

186- Slavich, I. L., R. r.' HQas, E. J.: Grena Mal

Epileptic Seızures Durrng Ciproflo:<ı=<cin Therapy. JA/'"1A,

2611 4 (1989;,

E-ekiguchı, M., Une, C;sada, Y .:

Structure-Epileptigenici ty Qui.nolone-s wi. tn Specıal to

their Tn teractıon wi tn -r-Aminobu. tyric Acid Recep tm'

Si tes. Hntimıcroc. Agents Ct-ıemother., . .::...:,, 1704-171)8

(1989}

188- Unseld, E., Ziegler, G., Gemeinhardt, A., Janssen, U.,

Klotz, U.: Possible Interaction □f Fluoroquinalones

wı th the Eenzociazepine-GABA"" -Receptar Complex. Br. J.

Clin. Pharmac., 30, 6.3-70 (1990)

189- Tsuji, A., Sata, r-i., kume, Y., Tame.ı, I., Okezaki, E. 1

Naga.:-a, G., kata, H.: Inhiuitory Effects of Quınoli:ıne

Antioacterıal Agen-ı.s on T-rlmınobutı,-rıc Acıd Bıncing to

Fı.ecep-cor Si tes in Ra t ~raın Membranes. Hntimicrob.

Ac,ents G--,emother., 32, 19()-194 (1988)

190- Berdnarczyk,

Miralm., F.

E. M., Nels□n, A. D., Adler, L. P.,

D.:Comparıson af the Effect of

Temoflo:,acin, Ciprofloxacin ar Pla.seoo on Cereoral

Blood Flow, Glucose and ı];{ygen Metabolism in Healthy

Subjects by

Clin. F"harm.

Means of F'ositron Emission Tomogra.phy.

Ther., 50, 165-171 {1991)

191- Winrow 1 A. P., Supramaniam, G.: Benign Intracranial

Hypertension After Cipro-flo:<acin Administration. Arch.

Dis. Child., 65, 1165-1166 (1990)

~'7::- Yalçın, 5., f:eç-3.ı-:.-Tor-:er, N., Uysal, M., Sivas, A., ez,

H.: Cr,°"'_ngs.>s in Gluta1;hıone Cor.tent and Giutattııor,e S-

Tran5-ferase Ac-tivi tıe;; in l"ıouse Af ter Carbon Tetra.-

chlorıoe Into:<ication. IRC3 Med 3ci., 101 640 (1982>

Gcıcı, M. R., M. A., Induction of

Lipıd F-'ero:<ıcıa tıon oy He:<5.c;;lorccyclGr.E:,.;.ne, Dıelorın,

TCDD, Carbon Tetrachlorı □e, and He:<ö.cnlorobenzene in

Ra ts. dull.

(1988)

Environ. Contam. To:<icol., 40, 255-262

194- Antanes-Madeira, 8. C., Madeira, V. M. C.: lnteraction

of Insecticides wi th Lipid Membranes. Biochem. Biophys.

Acta, 550, .'384-392 (1979)

195 - Lang, Maıer, P.: Lıpıd Pero:<ıdation [•epenaent

Aldrın Epo:<idation ın Liver Micrasomes, Heptocytes ana

Gr.a.nu:ı.a tıon Tissu.e Cells. Bıoc. Biop. R., 138, 24-32

{1986)

Dam.age and Cclc.n9es in tne Glutathıane Redax ::=yst2m ın

Erythrocytes from Hats Jreated wıth rle:<acnloracyclo-

he:<ane. F d. Chem. T o:<ic., 29, 459-462 (1991)

197- barr □s, S. B. M. 1 '../idela, L. A., Simuzu, !<., Van

Halsema, L., Junqueira, v. B. C.: Lindane-induced

O:ddative Stress. II. Time Course af Changes in Hepatic

Glutat!rione Status. Xenobiotica, 18, 1305-1310 (1988)

198- Numan, I. T ., Hassan, M. Q.,Stohs, S. J.: Endrin-

Induced Depletian of Glutathione and Inhibition of

Glutat;-ııone FerG:ndase Activıty ın Rats. Gen. F'harmac.,

21, 625-628 (1990/

\,'. 1 r-- .: Amıno Acid

Rei.ease from Rat Hıppocampal Si.ices as a Consequence of

Fr•ee-Fı.z..a:..:a.i ı-orm-<=."Cı □n. J. ,"\ıeuroc:ıem., 51 1 196ü-1963

(1988)

2(ı(ı- Dyıc:ens, A., Stern, A., Trenkner, E.: Mec.ıanısm of

!<aina te To:üci ty to Cerebeiiar New·ons In vi tro ıs

Analogous ta Reperfusion Tissue Injury. J. Neurochem.,

49, 1222-1228 (1987)

Z01- Diva.<:aran, F'., \,'ilggıns, R. C.: Tocopherol in Braın

Metabolism and Diseo.se: A Review. Met;ab. Brain Dis. 1

::, 1-16 (195Tı

202- Mi tchell, M. c., t'L.:;.llat, A., Lipsky,

Cephalosporin-Induced Alteration in Hepatic Glutathione

F:edo:< State. J. Clın. Inves,:;., 86, 1589-1594 (1990i

ÖZET

Bu çalışmada oksidatif stres indüklemesi olası, biri insektisit,

diğeri antibiyotik iki maddenin, sıçan karaciğer ve beyin dokularında

glu tatyon redoks durumu üzerindeki etkileri incelenmiştir. Dokuların

Total GSi1 (GSli + GSSG) ve GSSG d;jzeyleri, bir enzi:natik döngü yönter:ıi

ile ölçül:nü,<ştür.

Siklodien grubu klorlu bir insektisit olan ve ülkemizde en çok

kulla:nlan iasektisitlerden birini teş~i1 eden endosulfanın, oral tek

dozla, doza bağır.ılı olarak, beyin ve karaciğerde glutatyon redoks

duruı:mnu değiştirdiği gözlenmiştir.

Fluorokinolon grubu bir antibiyotik olan CPR ile, iki ayrı doz

ve iki uygulama yolu ile elde edilen sonuçlar da, beyinde ve karaciğerde

olutat)'Or1 redoks durumunun değiştiğini göstermiştir, Ayrıca, kan:ıcqerde o

önemli GSll azalması gözlenmiştir. CPR ile birlüte E vitamini ve

allopurinol uyısulaması ile elde edilen koruyucu etkiler de, bu maddenin

oksidatif stres yapıcı etkileri olduğu bulgusunu desteklemektedir,

SUMMARY

Possible oxidative stress inducing effects of two xenobiotics,

an insecticide and an antibiotic, have been exa:nined on the changes

in glutathione redox status in rat cerebral and hepatic tissues. Total

glutathion (GSil + GSSG) and GSSG were r.ıeasured by an enzymatic cycling

procedure.

Endosulfaıı, a chlorinated hydrocarbon insecticide of cyclodiene

group and one of the most consumed insecticide in Turkey, dose­

dcpendently ütduced, in both tissues, an alteration in glutathion redox

status.

The effects of fluoroquirıolone antibiotic, ciprofloxacin have been

exarnined following two different doses and two different ways of

admirıistration. Alteratio:1 i:ı. glutathion redox status in both tissues

have been observed, in addition to a significant decrease in hepatic

GSil. The protective effects of concominant applications of vitamin

E an<l allopurinol have supported the data suggesting an oxidative stres

inducing effect of the antibiotic.

ÖZGEÇMİŞ

1967 yılında Trabzon'da doğdum. Lise öğrenimimi Ünye Lisesi 'nde

tamamladım. 1989 yılında Hacet tepe Üniversitesi Eczacılık Fakül tesinde:ı

mezun oldum. 1990 yılından bu yana Hacettepe Üniversitesi Eczacılık

Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabil.im Dalı 'nda Araştır;na Görevlisi

olarak çalışmaktayım.