การเตรยมตวอยางเพอการวเคราะห

1 .ตวอยางหญาสด

ควรสมเกบตวอยางทกสวน เกบประมาณ 500 กรม ทาการชงนาหนกของหญา และบนทกไว ทาการสบใหหญามขนาดประมาณ 1 นว (ตวอยางจะแหงเรว และสะดวกตอการบดตวอยาง ) นาตวอยางใสถงผา หรอถงกระดาษ นาไปผงแดดทนท หรอนาไปอบในตอบทอณหภม 60 -65 องศาเซลเซยส จนนาหนกคงท แลวชงนาหนกแหง

2. ตวอยางหญาแหง การสมตวอยางมหลายวธ วธทเหมาะสมคอการใชแทงสมตวอยางทมความยาว ประมาณ 18 นว

เสนผาศนยกลางประมาณ 1 นว ปลายหยกดานโคนจะมทตอกบเครองสวานหมน เพอเจาะในกอนหญาไดสะดวก จะสมเจาะโดยแทงตามขวางชองฟอนๆละ 1-2 จด ในกรณไมมหลาวสมตวอยางสามารถสมตวอยางไดโดย แกะฟอนตวอยางออกและสมโดยใชมอสมจากฟอนโดยตรงระวงการรวงของใบ

3. ตวอยางวตถดบอาหารสตว นาตวอยางมาผสมคลกเคลาใหเขากน แลวทาการสมตวอยางโดยวธแบง 4 โดยนาตวอยางมา

ผสมใหเขากนแลวแบงออกเปน 4 สวนเทาๆกน นาตวอยางทอยตรงขามกนมารวมกน 2 สวน ทาการแยกออกไป สวนทเหลอ 2 สวนนามารวมกน และเกบใสภาชนะ ปดผนกเพอกนความชน เขยนรายละเอยด

ตวอยาง และสงเพอการวเคราะห ประมาณ 500 กรม

2

การวเคราะหอาหารสตวแบบประมาณ ( Proximate Analysis of Feeds)

การวเคราะหทางเคมในอาหารสตวโดยทวไปวธทไดรบความนยมคอวธแบบประมาณ (Proximate analysis) วธการนไดรบการพฒนาโดย Henneberg and Stohmann ในปค.ศ. 1865 ณ สถานวจย Weende ประเทศเยอรมนน (Lloyd et al.,1978) หรอเรยกอกอยางวา Weende System เพอเปนเกยรตแกสถานทททาการวจย วธการวเคราะหแบบประมาณ จะแยกองคประกอบของอาหารสตวเปน 6 กลมใหญๆ คอ (1)นา หรอ ความชน (moistur) (2) เถา (ash) (3)ไขมนหยาบ (crude fat) (4)โปรตนหยาบ(crude protein) (5) เยอใยหยาบ (crude fiber) (6) แปงและนาตาล(nitrogen free extract) 1. การวเคราะหความชน (Moisture)

การวเคราะหหาความชน เปนวธการวเคราะหทตองทาในหองปฏบตการอาหารสตว เนองจากองคประกอบทางเคมอนๆคาทรายงานบนพนฐานรอยละวตถแหง (% dry matter basis,DM) ปรมาณความชนทมอยในอาหารสตวหรอวตถดบอาหารสตวมความสาคญมากเพราะตวอยางทมความชนสงกมโอกาสทจะเสยหรอเปนเชอราจะเกดไดงาย นอกจากนนยงใชคาความชนไปคานวณปรมาณการใหอาหารสตวในการประกอบสตรอาหารสตว

วธการวเคราะหหาความชน ทนยมกนมากคอ การนาตวอยางไปอบทอณหภม 105 องศาเซลเชยส 16-18 ชวโมง หรอ 135 องศาเซลเชยส 2 ชวโมง นาจะระเหยกลายเปนไอออกจากอาหารสตว สวนท เหลอ เรยกวาวตถแหง (dry matter)

อปกรณ 1. เครองชงชนดทศนยม 4 ตาแหนง 2. ถวยอบตวอยางพรอมฝาปด (weighing bottle) ททาดวยโลหะไมเปนสนมหรอ แกวพรอมมฝา

ปดสนท ขนาดเสนผาศนยกลาง≥ 50 มลลเมตร ลก≤ 40 มลลเมตร 3. ตอบ ชนด Forced-air drying oven 4. โถดดความชน หรอ ตดดความชน (desiccator) วธการ 1. นาถวยอบตวอยางพรอมฝา ทลางสะอาดและแหงอบในตอบทอณหภม 135 0C นาน 2ชวโมง

นาออกใสในโถดดความชนและทงใหเยน ไมเกน 2 ชวโมง แลวนามาชงบนทกนาหนก 2. ชงตวอยางอาหารทบดละเอยดขนาด 1 มลลเมตร ประมาณ 2 กรม ใสลงในถวยอบ บนทก

นาหนก ปดฝาถวย แลวเขยาเลกนอยใหตวอยางกระจายเตมพนทสมาเสมอ นาไปอบทอณหภม 135 0C นาน 2 ชวโมงหรอจนนาหนกคงท โดยใหมระยะหาง 1 ถวย ตอความจของต 1 ลตร ขณะทอบตองเปดฝาถวย

3

3. เมอครบกาหนดเวลา นาถวยอบออกใสในโถดดความชนและปดฝาถวย แลวปลอยใหเยน ไมเกน 2 ชวโมง ชงนาหนก

การค านวณ % ความชน = (W1 – W2) x (100) นาหนกตวอยาง

% วตถแหง (Dry matter, DM) = 100 - (% ความชน) W1 คอ นาหนกถวยอบ + นาหนกตวอยางกอนอบ W2 คอ นาหนกถวยอบ + นาหนกตวอยางหลงอบ ขอบเขต วธการนใชสาหรบวเคราะหหาความชน ในพชอาหารสตว อาหารสตว และวตถดบอาหารสตว ยกเวน ตวอยางทมสารประกอบกรดไขมนระเหยได (Volatile Fatty acid) ตวอยางทมนาตาล , Urea สง เอกสารอางอง วธการนดดแปลงมาจาก Moisture in Animal Feed. (7.007) Official Methods of Analysis. 1990. Association of Official Analytical Chemists. 15 th Edition. Animal feeding stuffs – Determination of moisture and other volatile matter content ISO 6496.

4

2. การวเคราะหหาปรมาณเถา (Ash) เถา (Ash) คอ สวนของสารอนนทรย (inorganic) ในอาหารสตว ซงไดแกแรธาตตาง ๆ เมอนา ตวอยางไปเผาทอณหภม 550-600 องศาเชลเซยส นาน 2 ชวโมง สวนทเปนสารอนทรยจะถกเผาไหมหมดไป เหลออย แตสวนของสารอนนทรย คาของเถาทหาไดสามารถบอกถงคณภาพของอาหารสตว ถาคาของเถาสงมากกวาปกตอาจมการปลอมปนของทราย เปนตน

อปกรณ 1. เครองชงชนดทศนยม 4 ตาแหนง 2. เตาไฟฟา 3. เตาเผา (muffle furnace) 4. ถวยสาหรบเผาเถา (porcelain dish) 5. โถดดความชน (dessicator) วธการ 1. นาถวยเปลาอบทอณหภม 100 0C นาน 1 ชวโมง เอาออกใสในโถดดความชนปลอยใหเยน

แลวชงนาหนก 2. ชงตวอยางใสลงในถวยททราบนาหนกแลวประมาณ 2 กรม นาไปทาการเผาบนเตาไฟฟา จน

หมดควน 3. นาตวอยางทเผาไลควน แลวไปเผาตอในเตาเผา (Muffer furnace) อณหภม 600 0C นาน

2 ชวโมง แลวปดสวทชเตาเผา เปดฝาเตาออกรอจนอณหภมภายในเตาลดเหลอประมาณ 100 0C เพอปองกนมใหถวยสมผสอากาศเยนกะทนหน ซงอาจทาใหถวยแตกได

4. นาถวยออกมาใสในโถดดความชน ปลอยใหเยนแลวชงนาหนก การค านวณ

% เถา = (W2 – W1) x 100 นาหนกตวอยาง W1 คอ นาหนกถวย W2 คอ นาหนกถวย + นาหนกตวอยางหลงการเผา

สวนปรมาณอนทรยวตถ (Organic matter, OM) คานวณไดจากผลตางระหวางนาหนกตวอยาง กบ นาหนกเถา ดงน

%OM = 100 - (%ความชน) - (%เถา)

5

3. การวเคราะหหาโปรตน (Crude protein, CP) โปรตนประกอบดวย กรดอะมโนหลายชนด และกรดอะมโนนมธาตไนโตรเจนเปนองคประกอบอย ดงนน การวเคราะหหาปรมาณโปรตนจงวเคราะหในรปของปรมาณไนโตรเจน โดยวธ Kjeldahl แลวคานวณกลบเปนปรมาณโปรตน โดยตวอยางอาหารจะถกยอยดวยกรดซลฟรกเขมขน (H2SO4conc.) ในสภาพทมความรอน และตวเรงปฏกรยา (Catalyst) จนสารละลายใสสารอนทรยวตถจะสลายไป สารประกอบไนโตรเจนทงสวนทเปนโปรตนแท ( True protein ) และไมใชโปรตน (Non-protein nitrogen) ยกเวนทอยในรปไนเตรท (Nitrate,NO3 ) ไนไตร (Nitrite,NO2 ) จะถกเปลยนเปนแอมโมเนยมซลเฟต เมอเตมโซเดยมไฮดรอกไซดทมความเขมขน 40% (w/v) ลงไป แลวไนโตรเจนจะอยในรปของแอมโมเนยมไฮดรอกไซดแกสแอมโมเนยทกลนไดโดยใชกรดบอรกทมความเขมขน 4% (w/v) เปนตวดกจบ นาไปไตเตรทหาไนโตรเจนดวยกรดไฮโดรคลอรก หรอกรดซลฟรกทม ความเขมขน 0.1 (w/v) เพอหาปรมาณกรดทใชทาปฏกรยากจะสามารถคานวณหาปรมาณไนโตรเจนได โดยทวไปแลวโปรตนมไนโตรเจนเปนองคประกอบเฉลย 16% (100/16 = 6.25) ดงนนจงคานวณหาโปรตนหยาบ (Crude protein) โดยใชสตร % CP =%N X 6.25 ในวตถดบบางชนดอาจมคาไนโตรเจนแตกตางกนไป ดงนน คาแฟคเตอรกจะเปลยนแปลงตามชนดตวอยางดงแสดงในตาราง

ชนดตวอยาง % ไนโตรเจน คาแฟคเตอร

พชอาหารสตว เนอสตว ผลตภณฑสตว 16 6.25 ถวเหลอง 17.51 5.71 ถวลสง 18.32 5.46 เมลดขาว 16.81 5.95 นม และผลตภณฑนม 15.68 6.38 ขาวบารเลย ขาวโอต ขาวสาล ขาวฟาง 17.15 5.83 ราขาวสาล 15.85 6.31 เมลดพชนามน (ทานตะวน ฝาย) 18.87 5.30 จมกขาวสาล, corn gluten 17.24 5.80

6

อปกรณ 1. เครองชงชนดทศนยม 4 ตาแหนง 2. เครองยอย (Block digestor) 3. หลอดยอย (Digestion tube) 4. Exhaust manifold และ Aspirator 5. Tube stand 6. ชดเครองกลน (Distilling unit) 7. ชดไตเตรท 8. ตดดควน (Fume hood) สารเคม 1. กรดซลฟรกเขมขน 95 – 98% ( H2SO4 conc., AR grade) 2. สารเรงปฏกรยา [สารผสมระหวาง copper sulfate (CuSO4.5H2O) กบ potassium sulfate

(K2SO4) ในอตราสวน 1 : 9] 3. สารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอกไซด 0.1 นอรมอล 4. สารละลายมาตรฐานกรดซลฟรก 0.1 นอรมอล 5. Potassium hydrogen phthalate (C8H5KO4, AR grade) 6. ฟนอลฟธาลน (Phenolphthalein) 7. สกรนเมทธล เรด อนดเคเตอร (Screened methyl red indicator) 8. กรดบอรกความเขมขน 4% (w/v) 9. สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดความเขมขน 40% (w/v) การเตรยมสารละลาย 1.ฟนอลฟธาลน (Phenolphthalein) ละลายฟนอลฟธาลน (AR grade) 5 กรม ใน 96% ethyl alcohol 400 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยนากลนใหได 500 มลลลตร 2.สารอนดเคเตอร เลอกใชสกรนเมทธลเรดอนดเคเตอร (Screened methyl red indicator,MR) โดยชงเมทธลเรด (AR grade) 0.2 กรม และโบรโมครซอลกรน (BCG) (AR grade) 0.1 กรม ละลายใน 96% ethyl alcohol 100 มลลลตร เกบในทเยนไมถกแสง 3.กรดบอรกความเขมขน 4% (w/v) ละลายกรดบอรก (AR grade) 40 กรม ดวยนากลนรอน รอจนสารละลายเยน ปรบปรมาตรใหได 1 ลตร 4. สารละลายผสมอนดเคเตอร ผสมสารละลายในขอ 2. ในอตรา 1 : 3 (MR:BCG)โดยตวง 20 มลลลตร ผสมในสารละลาย 4 %กรดบอรค 1 ลตร (ขอ 3)

7

5.สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดทมความเขมขน 40% (w/v) ละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH, commercial grade) 400 กรม ดวยนากลน ปรบใหไดปรมาตร 1 ลตร 6.สารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอกไซด 0.1 นอรมอล

6.1 ตมนากลนใหเดอดประมาณ 20 นาท เพอไลแกสคารบอนไดออกไซด ทงใหเยนโดยเกบในภาชนะทมฝาปด 6.2 ชงโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH, AR grade) ทมโซเดยมคารบอเนตนอยกวา 5% ละลายดวยนากลนในขอ 1. ในอตราสวน 1 : 1 โดยนาหนก ลงในขวดเออรเลนเมเยอร เขยาใหละลาย ปดปากขวดไมใหสมผสอากาศ ตงทงใหโซเดยมคารบอเนตตกตะกอนจนไดสารละลายใส (ประมาณ 10 วน) 6.3 เตรยมสารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอกไซด โดยใชสารละลายในขอ 2. 5.4 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยนากลนในขอ 1. จนได 1 ลตร 6.4 ชง Potassium hydrogen phthalate ทอบแหงแลว ณ อณหภม 103 0C ประมาณ 4 ชวโมง ปรมาณ 0.2042 กรม ใสในขวดเออรเลนเมเยอร ละลายดวยนากลน 20 มลลลตร หยดฟนอลฟธาลน 2 – 3 หยด ไตเตรตกบสารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอก-ไซดในขอ 3. จนกระทงไดสารละลายสชมพออน เชนเดยวกบ blank ซงใชนาในขอ 1. หยดฟนอลฟธาลน 2 - 3 หยด ไตเตรตกบสารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอกไซดใน ขอ 3. จนกระทงไดสารละลายสชมพออน 6.5 คานวณหาความเขมขนทแนนอนของสารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอกไซด ในรปนอรมอล (Normallity)

ความเขมขนของสารละลาย NaOH = นาหนกของ Potassium hydrogen phthalate (กรม) x 1000 ปรมาตรสารละลายมาตรฐาน NaOH ทใชไตเตรต(มล.) x 204.229

7 สารละลายมาตรฐานกรดซลฟรก 0.1 นอรมอล 7.1 ตวงกรดซลฟรกเขมขน 95-98% (AR grade) 5.5 มลลลตร ละลายในนากลน ปรบปรมาตรใหได 2 ลตร 7.2 ทาการไตเตรทหาความเขมขนของสารละลายมาตรฐานกรดซลฟรก โดยใช ปเปตดดสารละลายมาตรฐานกรดซลฟรก 10 มลลลตร ใสในขวดเออรเลนเมเยอร หยดฟ-นอลฟธาลน 2-3 หยด นาไปไตเตรทกบสารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอกไซดททราบคาความเขมขนแลว จนไดสารละลายสชมพออน บนทกปรมาตรสารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอกไซดทใช 7.3 คานวณความเขมขน ของสารละลายมาตรฐานกรดซลฟรก 0.1 นอรมอล โดยใชสตร

8

N1V1 = N2V2

N1 = ความเขมขนของสารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอกไซด (นอรมอล) N2 = ความเขมขนของสารละลายมาตรฐานกรดซลฟรกทตองการทราบ (นอรมอล) V1 = ปรมาตรของสารละลายมาตรฐาน โซเดยมไฮดรอกไซดทใชไตเตรต (มลลลตร) V2 = ปรมาตรของสารละลายมาตรฐาน กรดซลฟรกทใช (10 มลลลตร)

วธการท า

การยอยตวอยาง 1. ชงตวอยาง

1.1 ตวอยางอาหารประมาณ 0.5 - 1 กรม ใสลงในหลอดสาหรบยอย (digestion tube) หรอ ในกรณทเปนตวอยางมความชนสงจะชงลงบนกระดาษกรองทปราศจากไนโตรเจน พบกระดาษใสลงในหลอดยอยเพอทาเปน blank

2. เตมสารเรงปฏกรยาประมาณ 5 กรม หรอ Kjeldahl catalyst tablets 2 เมด และเตมกรดซลฟรกเขมขนลงไป 13 – 15 มลลลตร ขนกบปรมาณตวอยางทใชปลอยใหทาปฏกรยาจนไมรนแรง และเตม H2O2 36 % (v/v) 1 มลลลตร กนตวอยางปมตดขางหลอด

3. ตงหลอดยอยใน stand ปด heat shield สวม exhaust manifold ลงบนสวนบนของหลอดยอย

4. ตง stand หลอดยอยและ exhaust ลงบนเครองยอย ยหอ Tecator รน 2020 ทตงอณหภมไวท 420 0C แลว เพอความปลอดภยควรทาการยอยภายในตดดควน เปดเครองดดไอกรด (scruber ) ชวงเรมตนจะเปดแรงประมาณ และยอยเปนเวลา 5 นาท และลดวาวลเพอลดอตราการไหลไอกรดลงประมาณ 3 ทาการยอยจนตวอยางใส ใชเวลาประมาณ 30 – 45 นาท

5. ยก stand พรอมหลอดยอยตวอยางออกปลอยใหเยนเพอรอนาไปกลน การกลน 1.เปดเครองทานาเยน จนไดอณหภมทตงไว 15 องศาเซลเชยส 2. เปดเครองสาควบแรงดนไฟฟา (stabilizer) แลวเปดสวทชของเครองกลน warm เครองกลน (Kjeltec รน 1026) ใช flask และหลอดยอยเปลาใชโปรแกรม Manual กดนาลง 50 มล. และกด steam กลนใหไดปรมาตร 100 – 150 มล. เปนเวลา 5 -7 นาท กด steam เพอปด เชคไนโตรเจนทตดคางอยในระบบโดยหยดฟนอลฟธาลนจะไมเปลยนส 3.นาหลอดและ flask ออกจากเครองกลน

9

4.ตงโปรแกรมเปน Autor โดยกดปม ปรบปรมาณนา(50 มล.), ดาง(25 มล.) stroke (2), ชวงหางของเวลา delay time (0.2 นาท) และเวลาทใชในการกลน (3.6 -3.7 นาท) หรอกลนใหไดปรมาตร 150 มล. 5.นา flask ซงบรรจกรดบอรกความเขมขน 4% ปรมาณ 25 -30 มลลลตร ตงไวบน platform ของเครองกลนและยก platform ขน ใหปลายแทงแกวจมอยใตกรดบอรก 6. ใสหลอดตวอยางทผานการยอยแลว (ขอ 4.) เขากบเครองกลน ปด safety door เครองกลนจะเรมทางาน 7. เมอกลนครบตามเวลาทกาหนด เครองจะหยดทางาน นา flask และหลอดยอยออกจาก

เครองกลน 8. นา flask กรดบอรก ทดกจบแกสแอมโมเนยทถกกลนออก ไปไตเตรตหาไนโตรเจนดวย

สารละลายมาตรฐานกรดซลฟรก การค านวณ

% ไนโตรเจน = 14.01 x (V1 - V2) x N น าหนกตวอยางเปนกรม x 10

14.01= นาหนกมวลโมเลกลของไนโตรเจน V1 = ปรมาตรของกรดทใชไตเตรทตวอยาง (ml) V2 = ปรมาตรของกรดทใชไตเตรท blank (ml) N = ความเขมขนของกรดทใชไตเตรท (N) 10 = คาคงททแปลงจากหนวยกรมเปน % %Crude Protein = % ไนโตรเจน x F F = คาคงทในการเปลยนคาไนโตรเจนเปนโปรตน F = 6.25 สาหรบตวอยางอาหาร อาหารสตว หรอตวอยางอนๆทไมระบเฉพาะ F= 5.71 สาหรบกากถวเหลอง

10

4. การวเคราะหหาไขมน (Crude fat หรอ Ether extract, EE)

ไขมน เปนสารประกอบอนทรยทไมละลายนา แตละลายในสารอนทรย ดงนน ในการวเคราะหหาปรมาณไขมนจงสกดดวยสารละลายอนทรย ระเหยงาย ตวทาละลายทนยมใชกนมากคอ diethyl ether, petroleum ether, dichloromethane, acetone เปนตน สารทถกสกดไดนอกจากไขมน แลวยงมสารบางชนดทถกสกดออกมาพรอมกบไขมนดวย เชน carotenoid, wax, sterine, phosphatedein lecithine และ alkaloid เปนตน จากการทสารทถกสกดมทงพวกทเปนไขมน และไมใชไขมน จงเรยกสารทงสองวา crude fat หรอ ether extract เอกสารอางอง : ดดแปลงวธการจาก AOAC 2000 ส าหรบตวอยาง : พชอาหารสตว วตถดบอาหารสตว และอาหารสตว

อปกรณและสารเคม 1. เครองชงชนดทศนยม 4 ตาแหนง 2. เครองสกดไขมน (Extraction unit) 3. Service unit สาหรบจายความรอน 4. เครองทานาเยน (Cooling) 5. Cellulose thimble, Thimble adapter, Thimble support 6. ถวยรองรบ (Extraction cup), Cup holders 7. ตอบ (oven) 8. โถดดความชน 9. Petroleum ether จดเดอด 35-60 0C

วธการ 1. ชงตวอยางทบดละเอยดขนาด 1 มลลเมตร ประมาณ 1-2 กรม หอดวยกระดาษกรองใสลงใน

cellulose thimble 2. นา thimble ทมตวอยาง นาไปอบไลความชนทอณหภม 105 0C 3 ชวโมง 3. นาถวยเปลาอบทอณหภม 105 0C นาน 1 ชวโมงนาออกมาปลอยใหเยนในโถดดความชน ชง

บนทกนาหนก 4. ทาการ warm เครองสกด โดยเปดสวทชเครองจายความรอนซงตงอณหภมประมาณ 85-90 0C

นานประมาณ 20 นาท หรอรอจนอณหภมสงไวตามทกาหนด ในขณะเดยวกนทาการ warm เครองทาความเยน ซงตงอณหภมไวท 10 0C นา thimbleทมตวอยางตดกบ thimble adapter วางลงใน thimble support จากนนนาเขาในเครองสกดไขมน พรอมทงเปดสวทชปมนาท เครองทานาเยน

11

5. ตวง petroleum ether ประมาณ 50 มลลลตร ใสลงในถวยททราบนาหนกแลว วางลงใน cup holders นาเขาในเครองสกด

6. กดลอคคานของเครองสกดใหแนน เปดวาวลใหสารสกดไหลเวยน ทาการตมตวอยางกบ สารสกด โดยเลอนคนโยกตวอยางไปไวทตาแหนง boiling นาน 30 นาท จากนน ทาการสกดโดยเลอนคนโยกตวอยางไปไวทตาแหนง rinsing นาน 60 นาท ระยะเวลาการตมและการสกดขนอยกบประเภทตวอยาง หากเปนตวอยางทมไขมนสงใหใชเวลานานขน โดยปกตแนะนาใหใชเวลาตมกบเวลาสกดในอตราสวน 1 : 2

7. เมอครบเวลาใหทาการปดวาวลเกบสารสกด นานประมาณ 10 นาท หรออาจชวยใหสารสกดระเหยเรวขน โดยเปดวาวลลดความดนทเครองสกดกอน แลวจงเปดสวทช aspirator ทเครองจายความรอน

8. หลงจากทาการระเหยสารสกดออกจากถวยแลว ทาการปลดลอคคานทเครองสกด นา cup holders ออกจากเครอง นาถวยทมสารสกดไปอบตอในตอบทอณหภม 105 0C นาน 30 นาท นาออกมาทงใหเยนในโถดดความชน แลวจงชงบนทกนาหนก

9. ถาสกดไขมนหลายรอบตอวน รอบท 2 ควรใส petroleum ether ในถวยประมาณ 15-20 มลลลตร

การค านวณ % ไขมน = (W3 – W2) x 100 W1 W1 = นาหนกตวอยาง

W2 = นาหนกถวย W3 = นาหนกถวย + นาหนกไขมน

12

5. การวเคราะหหาปรมาณเยอใยหยาบ (Crude fiber, CF)

เยอใยเปนสารประกอบพวกคารโบไฮเดรทชนดหนง ทพบมากในพชประกอบดวย เซลลโลส เฮมเซลลโลส และลกนน เปนสวนใหญ

คารโบไฮเดรทในอาหาร แบงออกเปน 2 สวนใหญ คอ สวนของเยอใย (crude fiber) และสวนของคารโบไฮเดรตทไมม N เปนองคประกอบหรอเรยกวา nitrogen-free extract สวนของเยอใย คอ สวนของอนทรยวตถทปราศจากไขมน ซงทนตอการยอยของกรดและเบสในความเขมขน สง ในการวเคราะหหาเยอใย เมอนาตวอยางทผานการวเคราะหหาความชนและไขมนแลว มายอยดวยกรดซลฟรก โปรตน แปง และนาตาลจะถกยอยสลายและเมอยอยตวอยางดวยโซเดยม -ไฮดรอกไซด แปงทยงเหลออยจากการยอยดวยกรดซลฟรกจะถกยอยสลายสงทเหลออย คอ เยอใย

เอกสารอางอง : ดดแปลงจาก AOAC2000 และ ISO6865 Semi-automatic method ส าหรบตวอยาง : พชอาหารสตว วตถดบอาหารสตว และอาหารสตว

อปกรณและสารละลาย 1. เครองชงชนดทศนยม 4 ตาแหนง 2. เครองวเคราะหหาเยอใย 3. ครซเบล (Fritted glass crucible) 4. ตอบ (Oven) 5. เตาเผา (Muffle furnace) 6. โถดดความชน 7. สารละลายกรดซลฟรก (H2SO4) ความเขมขน 1.25% 8. สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ความเขมขน 1.25%

วธเตรยมสารละลาย 1. สารละลายกรดซลฟรก ความเขมขน 1.25% (0.255 ± 0.005N)

-ตวงนาประมาณ 500 มลลลตร ใสในบกเกอร ขนาด 2 ลตร -ชงกรดซลฟรก 12.5 กรม แลวคอย ๆ เทใสในบกเกอร ใชแทงแกวคนสารละลายให

เขากน แลวเตมนากลนจนครบ 1 ลตร ปลอยใหเยนแลวจงเทใสขวดเกบสารละลาย 2. สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 1.25% (0.313 ± 0.005N) - ตมนากลนใหเดอดนานประมาณ 20 นาท แลวปลอยใหเยนในภาชนะทมฝาป - ชงโซเดยมไฮดรอกไซด 12.5 กรม ใสในบกเกอร ขนาด 2 ลตร ตวงนากลนท ตมเดอดแลว (ในขอ1.) ประมาณ 500 มลลลตร ใสในบกเกอร ใชแทงแกวคนเปนระยะ ๆ ใหโซเดยมไฮดรอก

13

ไซดละลายจนหมด แลวเตมนากลนอก 500 มลลลตรหรอเตมจนครบ 1 ลตร คนใหเขากน ปลอยใหเยนแลวจงเทใสขวดเกบสารละลาย * การตรวจสอบคาความเขมขนของสารละลาย ท าไดโดยวธการไตเตรท

วธการ 1. นาตวอยางอาหารทสกดไขมนออกถายลงใน beaker ขนาด 600 มลลลตร crucible 2. ตวงสารละลายกรดซลฟรก 1.25% ประมาณ 200 มลลลตร นาเขาเครองยอยเมอสารเดอด

ปรบความรอนลง ใหอณหภม (reflux) จบเวลา 30 นาท 3. เมอครบถายตวอยางลงใสผากรอง ลางดวยนารอน ประมาณ 1 ลตร แลวถายตวอยางลงใน

บกเกอรตามเดม 4. ตวงสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด 1.25% ทอนไวประมาณ 200 มลลลตร นาเขาเครองยอย

เมอสารเดอดปรบความรอนลง ใหอณหภม (reflux) จบเวลา 30 นาท 5. เมอครบเวลาถายตวอยางลงใสครซเบล และลางตวอยางดวยนารอนจนหมดดางจะใชนารอน

ประมาณ 1,500 มลลลตร นาครซเบลทมเยอใยไปอบจนแหงทอณหภม 105 องศาเชลเซยส นาน 16-18 ชวโมง จากนนนาครซเบลออกมาใสโถดดความชน ปลอยใหเยนจากนนชงนาหนก จดบนทก

6. นาครซเบลทชงนาหนกแลวเขาในเตาเผาทอณหภม 5500C นาน 2 ชวโมง จากนนเปดฝาเตาเผา รอใหถวยมอณหภมลดลงประมาณ 150-200 0C แลวนาใสโถดดความชนปลอยใหเยน แลวชงนาหนกครซเบล จดบนทก (โดยสวนของเยอใยคอสวนทถกเผาหายไป)

การค านวณ % เยอใย = (W2 – W3) x 100 W1 W1 = นาหนกตวอยาง W2 = นาหนก crucible + นาหนกตวอยางหลงการอบ W3 = นาหนก crucible + นาหนกตวอยางหลงการเผา

14

7. การวเคราะหหาคารโบไฮเดรททยอยไดงาย ( Nitrogen free extract,NFE )

การวเคราะหหาคารโบไฮเดรททยอยไดงาย โดยการคานวณจาก % NFE = 100-[%Moisture+%Ash+%CP+%EE+%CF] เมอ %Moisture= เปอรเซนตความชน %Ash = เปอรเซนตเถา %CP = เปอรเซนตโปรตนหยาบ %EE = เปอรเซนตไขมนหยาบ %CF = เปอรเซนตเยอใยหยาบ

การตรวจสอบขอผดพลาด จากการวเคราะหแบบประมาณ

การวเคราะหจะท าตวอยางละ 2 ซ า ค านวณขอผดพลาดระหวาง 2 ซ า ดงน (% Error) = ผลตางระหวาง 2 ซ า x 100

ผลวเคราะหทไดคานอย ผลการวเคราะหอยระหวาง 0-2 % ไมควรผดพลาดเกน 10 %

ผลการวเคราะหอยระหวาง 2-4% ไมควรผดพลาดเกน 6 % ผลการวเคราะหอยระหวาง 4-6 % ไมควรผดพลาดเกน 5 % ผลการวเคราะหอยระหวาง 6 % ขนไป ไมควรผดพลาดเกน 3 %

15

การวเคราะหเยอใยในอาหารสตว ( Detergent analysis )

เยอใย เปนสารประกอบทางเคมทเปนองคประกอบทสาคญโดยเฉพาะพชอาหารสตว สารท

จดเปนเยอใยในพชมอยดวยกนหลายชนด ทสาคญไดแก เซลลโลส (cellulose) เฮมเซลลโลส (hemicellulose) และลกนน (lignin) ซงประมาณ 98 % ของปรมาณเยอใยทงหมดทพบในพชจะประกอบดวยสาร 3 ชนดน

วธการทใชวเคราะหเยอใยทใชทดแทนวธแบบดงเดม Weende method ทยงมขอบกพรองคอ ในการวเคราะหเยอใยหยาบ จะมเยอใยบางสวนทสามารถละลายไดในกรด และดาง จะละลายออกไปคอเฮมเซลลโลส และลกนน ทาใหผลการวเคราะหผดพลาด และในป ค.ศ.1960 , Dr.P.J.Van Soest แหงสถาบนวจยและสงเสรมการเกษตร เมองเบลทสวลล มลรฐแมรแลนด ประเทศสหรฐอเมรกา ไดพฒนาเทคนคใหมในการวเคราะหหาสวนประกอบของเยอใยตางๆ โดยใชสารฟอกและเรยกวา Detergent fiber Analysis ซงการวเคราะหโดยใชสารฟอกนสามารถแยกสวนประกอบของเซลออกเปน 2 สวน คอ

1.องคประกอบภายในเซลล (Cell content) หมายถงสารตางๆทอยภายในเซลลของพชเปนสวนทสามารถยอยสลายไดงายประกอบดวย แปง นาตาล โปรตนทละลายไดงาย ไขมน เปนตน 2. องคประกอบทเปนสวนประกอบผนงเซล (Cell wall ) หมายถงสารตางๆทเปนสวนประกอบของผนงเซลลพช ไดแกสารทเปนเยอใยตางๆททาหนาทเปนโครงสรางของพช ทสาคญไดแก เซลลโลส เฮมเซลลโลส ลกนน โปรตนทไมละลายไดงาย การวเคราะหหา Cell wall constituents (CWC)หรอ NDF ทาไดโดยนาตวอยางอาหารไปตมกบสารละลาย neutral detergent สวนทเหลอซงไมละลายในสารละลายทเปนกลางคอสวนของ CWC ซงเปนสารตางๆทเปนสวนของผนงเซลลพชไดแก เซลลโลส (cellulose) เฮมเซลลโลส (hemicellulose) ลกนน (lignin) รวมทง cutin ,siliga และ tannin

การวเคราะหหา Acid Detergent Fiber (ADF) ในพชอาหารสตวและวตถดบอาหารสตว ทาโดยนาเอาตวอยางอาหารไปตมในสารละลาย acid detergent สวนทเหลอทไมละลายคอสวนของ ADF ซงประกอบดวย cellulose lignin ประมาณ 90 % สวนทเหลอ 10 % จะเปนพวก cutin และเถาทไมละลายในกรด ดงนน สวนท หายไป คอ hemicellulose ซงละลายในสารละลายทเปนกรดได ในทนจะใช sulfuric acid ทมความเขมขน 1 นอรมอล (N) และม detergent คอ cetyl trimethyl ammonium bromide จะชวยยอยพวกโปรตนออกไป

การหาปรมาณ Cellulose โดยวธ Detergent analysis หาได 2 วธขนอยกบวธการวเคราะหหา lignin ถาวเคราะหหาแบบ ADL ผลตางระหวาง ADF และ ADL (ADF-ADL) คอคา cellulose ทมสวนของ AIA รวมอย ถาวเคราะหโดยวธ PML ปรมาณ cellulose คอ (ADF-PML-AIA)

16

การวเคราะห lignin ทาไดโดยใชตวอยางทไดจากการหา ADF มาทาการวเคราะหหาlignin โดยใชกรดกามะถนความเขมขน 72 % ซงlignin ทหาไดโดยวธนเรยกวา acid detergent lignin ลกนน ไมจดเปนสารพวกคารโบไฮเดรทแมจะมคารบอน ไฮโดรเจน และออกซเจน แตกจดเปนสวนประกอบทสาคญของผนงเซลพชทาใหเซลลพชมความแขงแรง

วธวเคราะหหา Neutral Detergent Fiber (NDF) อปกรณ

1. ครซเบล (fritted glass crucible) ขนาด 50 ml. 2. ตอบแหง (hot air oven) 3. โถดดความชน (dessicator) 4. เครองชงชนดทศนยม 4 ตาแหนง 5. บกเกอร (beaker) ขนาด 600 ml. 6. เครองวเคราะหเยอใย แบบ manual 7. ขวดฉดนา (wash bottle) 8. ขวดตมนารอน (boiling flask) 9. เครองตมนารอน 10. เครองดดสญญากาศ

สารเคม 1. Sodium lauryl sulphate (USP หรอ purified grade) 2. Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA) dihydrate, crystal, reagent grade 3. Sodium borate decahydrate (Na2B4O7.10H2O, reagent grate) 4. Disodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4), reagent grade 5. Triethylene glycol , reagent grade 6. Sodium sulphite anhydrous, reagent grade 7. Acetone (AR grade) ชนดทปราศจากส และสามารถระเหยไดหมด ไมมสงตกคางเหลออย 8. α – Amylase EC number 3.2.1.1 ชนด heat – stable 9. Distiled or deionized water วธเตรยมสารละลาย Neutral Detergent Fiber 2 ลตร - Sodium lauryl sulphate (USP หรอ purified grade)

- Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA) dihydrate, crystal, reagent grade - Sodium borate decahydrate (Na2B4O7.10H2O, reagent grate) - Disodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4), reagent grade

17

- Triethylene glycol , reagent grade - Distiled or deionized water

1. ชง sodium lauryl sulphate 60 กรม ใสใน beaker ขนาด 400 มลลลตร แลวนามาใสใน Volumetric flask ขนาด 2 ลตร โดยใชกรวยกรองและแทงคนสารละลายชวย เสรจแลวลาง Sodium lauryl sulphate ทตดคางอยใน beaker ดวยนารอน โดยใชขวดฉดนารอน ฉดแลวเทรวมใสใน Volumetric flask เดม เขยาเบา ๆ

2. เตม Triethylene glycol 20 มลลลตร ใสลงใน Volumetric flask ในขอ (1.1) เขยาใหเขากน

3. ละลาย disodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4) 9.12 กรม , Sodium borate decahydrate (Na2B4O7.10H2O) 13.62 กรม และ Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA) dehydrate 37.22 กรม ดวยนากลนทรอนแลวนามาผสมกบสารละลาย ในขอ (1.2) เทใส volumetric flask เขยาใหเขากน แลวเตมนากลนจนถงขดปรมาตรปลอยใหเยนทอณหภมหอง แลวปรบปรมาตรพอดขดดวยนากลนและปรบpHใหได 6.9 – 7.1

ค าเตอนในความปลอดภย 1.Acetone เปนสารระเหยและตดไฟงาย ไมใหระเหยสะสมอยในพนททางาน ใชอปกรณกาจดกลนไอและหลกเลยงการสดดมหรอสมผสกบผว ทาการระเหย Acetone ในตวอยางทบรรจในCrucible กอนเขาตอบแหง 2. sodium lauryl sulphate เปนสารระคายเคองทเยอบผว ควรสวมหนากากกนฝนและสวมถงมอในขณะปฏบตการเตรยมสารละลาย วธการ

1. นา crucible ขนาด 50 ml. ไปอบในตอบ ทอณหภม105 0C นาน 2 ชวโมง เอาออกใสในโถดดความชน (dessicator) ทงใหเยน แลวชงนาหนกบนทกไว

2. ชงตวอยางทแหงและบดละเอยด ขนาด 1 มลลเมตร 0.5-1.0 กรม ใสใน beaker ปากกลมเรยบ ขนาด 600 มลลลตร (ใส Na2SO3 0.5 กรม ในตวอยางทม cutin) สง ลงไปใน beaker ทมตวอยางใบเดม

3. นาสารละลาย Neutral Detergent Fiber ไปตมใหรอน ประมาณ 5 นาท แลวตวงใสลงใน beaker ทมตวอยางอย 50 มลลลตรโดยใชกระบอกตวง นาไปทาการยอย หลง 5 นาท เขยา beaker แลวยกลง ในตวอยางทกรองยากจะเตม 0.1 ml. สารละลายมาตรฐาน α-

18

amylase เขยาใหสารละลายมาตรฐาน α-amylase กบสารละลาย Neutral Detergent Fiber ผสมกน แลวยกขนวางบนเครองวเคราะหเยอใย ทาการ reflux ตอ 60 นาท

4. ทาการกรอง โดยเทสารละลายใน beaker ลงในcrucible ทชงนาหนกแลวท ตอตดกบเครองดดสญญากาศ ลางตวอยางทอยใน beaker ดวยนารอน จนกระทงตวอยางสวนทเหลอทงหมดลงใน crucible จนหมด

5. ลางตวอยางใน crucible ดวยนารอนอกจนหมดฟอง แลวใชขวดฉดนารอนลางตวอยางทตดอยขาง crucible ลงใหหมด แลวดดนาใน crucible ออก

6. จากนนลางตวอยางดวย acetone 3 – 5 ครง หรอจนกระทงสารละลายลางออกจาก crucible ไมมส

7. นา crucible ทมตวอยาง ไปอบในตอบแหง (hot air oven) ทอณหภม 105 0C นาน 8 ชวโมง หรอตลอดคน

8. นา crucible ทมตวอยางออกจากตอบแหง (hot air oven) เอาใสในโถดดความชน (dessicator) ปลอยใหเยน แลวชงนาหนก เพอคานวณหาคา NDF

9. นา crucible เผา (ignite) ในเตาเผา ทอณหภม 550 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง 10. เอาออกใสในโถดดความชน ปลอยใหเยน ชงนาหนกหา ash

วธค านวณ 1. ในกรณทตวอยางนนวเคราะหหาเฉพาะคา NDF

%NDF = [ (W1- W2 x 100 ] - % nuetral insoluble ash W3

เมอ W1= นาหนก crucible + นาหนกตวอยาง W2= นาหนก crucible W3= นาหนกตวอยาง

%NDF insoluble ash คอ % ash ทไดจากขนตอนการเผาในการวเคราะหหา NDF 2. ในกรณทตวอยางนนวเคราะหหาคา Lignin ดวย

%NDF = [(W1- W2 x 100] - % Acid insoluble ash W3 เมอ W1= นาหนก crucible + นาหนกตวอยาง W2= นาหนก crucible W3= นาหนกตวอยาง %Acid insoluble ash คอ % ash ทไดจากขนตอนการเผาในการวเคราะหหา lignin %NDS = 100 - (%Moisture) - (%NDF)

19

เอกสารอางอง Goering, H.K. and P.J. Van Soest. 1970. Forage fiber analysis (apparatus,

reagents, procedures, and some application). Research Service. Handbook number 379 as modified by D.R. Mertens 1992, Personal Communication).

Van Soest, P.J.,J.B. Robertson, and B.A. Lewis. 1991. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber and non-starch polysaccharides in relation to animal nutrition. J. Dairy Science 74:3583-3597.

Mertens, D.R. 1992. Critical conditions in determining detergent fiber. Proceedings of NFTA Forage Analysis Workshop. Denver, CO. p C1 – C8.

http://www.foragetesting.org/lab_porcedure/sectionB/4/part4.1.htm

20

วธวเคราะหหา Acid Detergent Fiber (ADF) อปกรณ 1. ครซเบล (fritted glass crucible) ขนาด 50 ml. 2. ตอบแหง (hot air oven) 3. โถดดความชน (dessicator) 4. เครองชง (balance) ชนดทศนยม 4 ตาแหนง 5. บกเกอร (beaker) ขนาด 600 ml. 6. เครองวเคราะหเยอใย แบบ manual 7. ขวดฉดนา (wash bottle) 8. ขวดตมนารอน (boiling flask) 9. เครองตมนารอน 10. เครองดดสญญากาศ สารเคม 1. Sulfuric acid (H2SO4), reagent grade 2. Cetyl triethyl ammonium bromide (CTAB), reagent grade 3. Acetone , reagent grade 4. Distilled or deionized water วธเตรยมสารละลาย Acid Detergent Fiber 1. ชงซลฟรกเขมขน ( H2SO4 conc, AR grade) 51.08 กรม ใสใน beaker ขนาด 250 มลลลตร แลวเทใส volumetric flask ขนาด 1 ลตร ทมนากลนอยประมาณ 200 มลลลตร 2. ลางกรดทอยใน beaker ดวยนากลน 2 ครง แลวเทลงใน volumetric flask เดม แลวเขยาใหเขากน 3. เตมนากลนใหพอดขด ปดฝา เขยา 3 ครงใหเขากน ปลอยทงไวใหเยนทอณหภมหอง 4. ปรบปรมาตรพอดขด volumetric flask ขนาด 1 ลตร ดวยนากลน เขยา 2-3 ครงใหเขากน 5. หาความเขมขนทแนนอนของสารละลาย H2SO4 ดวยการไทเทรตกบ NaOH - ปเปตสารละลายทเตรยมไดมา 20 ml. ใสลงใน flask ขนาด 250 ml. หยดฟ- นอลพทาลน 3 หยด ไทเทรตสารละลายดวยสารละลาย NaOH ททราบความ เขมขนแลว จนกระทงสารละลายเปลยนเปนสชมพออน - ทาการทดลองซาอก 1 ครง บนทกผลการทดลองและคานวณผลทได หาความ

เขมขนเฉลยของสารละลาย H2SO4

6. ชง CTAB 20 กรม ลงใน beaker ขนาด 250 มลลลตร เทใสลงในขวดสาหรบเกบสารละลาย Acid Detergent Fiber โดยใชกรวยกรองและแทงคนสารละลายชวย ลาง CTAB ทตดคางใน

21

beaker ดวยสารละลาย sulfuric acid ความเขมขน 1 นอรมอล แลวใสลงในขวดเกบสารละลาย Acid Detergent Fiber ทม CTAB อยแลว 3 ครง เขยาใหเขากน แลวเทกรดซลฟรกทเหลอใสในขวดสารละลาย Acid Detergent Fiber และเขยาใหเขากน วธการ 1. นา crucible ขนาด 50 ml.ไปอบในตอบ ทอณหภม 105 °C นาน 2 ชวโมง เอาออกใสใน

โถดดความชน (desiccator) ทงใหเยน แลวชงนาหนกและบนทกไว 2. ชงตวอยางทแหงและบดละเอยด ขนาด 1 มลลเมตร 1 กรม ใสใน beaker ปากกลมเรยบ

ขนาด 600 มลลลตร 3. นาสารละลาย Acid Detergent ไปตมใหรอน ตวงใสลงใน beaker ทมตวอยางอย 100

มลลลตร โดยใชกระบอกตวง นาไปทาการยอย หรอ reflux นาน 1 ชวโมง โดยใชเครองวเคราะหเยอใยชนด manual

4. ทาการกรอง โดยเทสารละลายใน beaker ลง crucible ทชงนาหนกแลวทตอตดกบเครองกรองดดสญญากาศ ลางตวอยางทอยใน beaker ดวยขวดฉดนารอน จนกระทงตวอยางสวนทเหลอทงหมดลงใน crucible จนหมด ลางตวอยางทอยใน crucible 1,200 ml. หรอจนหมดฟอง

5. ลางตวอยางทตดอยขาง crucible ดวยนารอนอก 1-2 ครง โดยใชขวดฉดนา แลวดดนาออกดวย vacuum pump

6. จากนนลางตวอยางดวย acetone 3 ครง หรอจนกระทงสารละลายทไหลออกจาก crucible ไมมส

7. นา crucible ทมตวอยางไปอบในตอบ ทอณหภม 105 0C นาน 8 ชวโมง หรอตลอดคน 8. นา crucible ทมตวอยางออกจากตอบ เอาใสในโถดดความชน (dessicator) ปลอยใหเยน

แลวชงนาหนก เพอคานวณหาคา ADF 9. นา crucible เผา (ignite) ในเตาเผา ทอณหภม 550 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง 10. เอาออกใสในโถดดความชน ปลอยใหเยน ชงนาหนกหา ash

22

วธค านวณ 1. ในกรณทตวอยางวเคราะหเฉพาะคา ADF

%ADF = [(W1 – W2) x 100] - %Acid Insoluble Ash W3

W1 = นาหนก crucible + นาหนกตวอยาง W2 = นาหนก crucible W3 = นาหนกตวอยาง

%Acid insoluble ash คอ % ash ทไดจากขนตอนการเผาในการวเคราะหหา ADF 2. ในกรณทตวอยางนนวเคราะหหาคา Lignin ดวย

%ADF = [(W1- W2 x 100] - % Acid insoluble ash W3 เมอ W1= นาหนก crucible + นาหนกตวอยาง W2= นาหนก crucible W3= นาหนกตวอยาง %Acid insoluble ash คอ % ash ทไดจากขนตอนการเผาในการวเคราะหหา lignin

2. การค านวณหาปรมาณเยอใย Hemicellulose

% Hemicellulose = %NDF - %ADF

เอกสารอางอง Fiber (Acid Detergent) and Lignin in Animal Feed. (973.18) Official Methods of Analysis. 1990. Association of Official Analytical Chemists. 15 th Edition. Fiber (Acid Detergent) and Lignin in Animal Feed. (973.18) Official Methods of Analysis. 2000. Association of Official Analytical Chemists. 15 th Edition. Animal feeding stuffs – Determination of acid detergent fiber content (ADF) and lignin ISO 2004. http://www.foragetesting.org/lab_porcedure/sectionB/4/part4.1.htm

23

วธวเคราะหหา Acid Detergent Lignin (ADL)

อปกรณ 1. ถาดททาดวยโลหะสเตนเลส 2. Beaker ขนาด 250 มลลลตร 3. แทงแกวคนสารละลาย 4. ขวดตมนารอน 5. ขวดฉดนา 6. เครองตมนารอน 7. Vacuum pump 8. ตอบแหง 9. โถดดความชน 10. เครองชง (balance) ชนดทศนยม 4 ตาแหนง

สารเคม

1. Sulfuric acid conc, AR grade 2. Distilled or Deionized water

วธเตรยมสารละลาย 72% H2SO4 1. ตวง H2SO4 conc. 670 มลลลตร คอยๆเทอยางชาๆ ลงใน beaker ขนาด 1,000 มลลลตร ท

มนากลนอยแลว 100 มลลลตร พรอมกบใชแทงแกวคนใหสารละลายเขากนเปนระยะ ในขณะทเตรยมสารละลายนตองให beaker อยในอางนาเยนตลอดเวลา

2. นากระจกนาฬกามาปดไว รอจนสารละลายเยนทอณหภม 20 0C 3. เมอสารละลายเยนลง เตมนากลนลงไปใหไดปรมาตร 1 ลตร คนสารละลายใหเขากนอกครง

เอากระจกนาฬกามาปด ทงใหเยนทอณหภม 20 0C 4. เมอสารละลายเยนลง เทใสลงในขวดสาหรบเกบสารละลาย 72 %H2SO4 กอนนาสารละลาย

72%H2SO4 มาใชจะตองวดความถวงจาเพาะของสารละลายนใหได 1.634 ทอณหภม 20 0C ในการวดเพอหาความถวงจาเพาะ 1.634 ทอณหภม 20 0C นน เรมจาก วางขวดสารละลาย 72%H2SO4 ลงในอางนาเยน ใชปรอทวดอณหภม พออณหภม 20 0C ยกขนจากอางนาเยน เขยาสารละลายกรดซลฟรกเขมขน72%ในขวดเกบสารละลายใหเขากน แลวเทลงในกระบอกตวงขนาด 500 มลลลตร ใชเครองวดความถวงจาเพาะวดใหไดเทากบ 1.634 ทอณหภม 20 0C ถาคาทวดไดสงกวา 1.634 ใหคอยๆเตมนากลนลงไป แตถาตากวา 1.634 ใหเตมกรดซลฟรก

24

เขมขนลงไป จนกวาจะวดไดคาความถวงจาเพาะ เทากบ 1.634 ทอณหภม 20 0C จงจะนาไปใชได

วธการ 1. นา crucible ทมตวอยางซงวเคราะหหา ADF แลวมาเตมสารละลาย 72% H2SO4 ทเยน

(200C) ลงไป ประมาณครง crucible จากนนนาไปวางลงในถาดสเตนเลส ใชแทงแกวคนใหทวเพอใหตวอยางแยกจากกนไมจบกนเปนกอน โดยมนากลนทอยในถาดสเตนเลสระดบทตากวาระดบของแผน fritted glass รกษาอณหภมของcrucible ในถาดสเตนเลสท 20 0 - 23 0C

2. คอยเตมสารละลาย 72% H2SO4 เมอสารละลายใน crucible แหง คนเปนระยะๆ ใชเวลายอยนาน 3 ชวโมง

3. จากนนนาไป suction เพอลางสารละลายกรดออก แลวลางดวยนารอน โดยใชนารอนปรมาณ 1,400 มลลลตร หรอจนหมดกรด จากนนใชขวดฉดนารอน ไลตวอยางทตดอยขาง crucible ใหลงไปใน crucible ใหหมด แลวฉดลาง crucible อกหนงครง

4. นา crucible พรอมตวอยางทยอยแลว ไปอบในตอบแหง (hot air oven) ทอณหภม 105 องศาเซลเซยส นาน 8 ชวโมง จากนนนาออกใสโถดดความชน (dessicator) ปลอยใหเยน แลวชงนาหนกและบนทกไว

% Cellulose = W1 - W4 x 100 W3 เมอ W1 = นาหนก crucible + นาหนก ADF W4 = นาหนก crucible + นาหนกเยอใยหลงการอบ W3 = นาหนกตวอยาง

25

วธวเคราะห Lignin อปกรณ 1. เตาเผา (Muffle furnace) 2. โถดดความชน (Dessicator) 3. เครองชง (Balance) ชนดทศนยม 4 ตาแหนง วธการ 1. นา crucible ทมตวอยางซงวเคราะหหา cellulose แลว นาไปเผา (ignite) ในเตาเผา ท

อณหภม 500 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง 2. เอาออกใสในโถดดความชน ปลอยใหเยน ชงนาหนกหา lignin

วธค านวณ

% Lignin = W4 - W5 x 100 W3 เมอ W4 = นาหนก crucible + นาหนกเยอใยหลงการอบ W5 = นาหนก crucible + นาหนก เยอใยหลงการเผา (ignite)

W3 = นาหนกตวอยาง % เถาทไมละลายในกรด = W5 - W2 x 100 W3 เมอ W5 = นาหนก crucible + นาหนกเยอใยหลงการเผา (ignite)

W2 = นาหนก crucible เปลา กอนนามาใชวเคราะหหา ADF W3 = นาหนกตวอยาง (sample)

เอกสารอางอง Fiber (Acid Detergent) and Lignin in Animal Feed. (973.18) Official Methods of Analysis.

1990. Association of Official Analytical Chemists. 15 th Edition. Fiber (Acid Detergent) and Lignin in Animal Feed. (973.18) Official Methods of Analysis.

2000. Association of Official Analytical Chemists. 15 th Edition. Animal feeding stuffs – Determination of acid detergent fiber content (ADF) and lignin

ISO 2004. http://www.foragetesting.org/lab_porcedure/sectionB/4/part4.1.htm

26

ภาคผนวก

1. การเตรยมสารละลายกรดซลฟรก ความเขมขน 1 N Sulfuric acid (H2SO4), reagent grade (% assay 100) = 49.04 กรม ผลตภณฑแตละบรษทอาจจะมคาแตกตางกนใหดจากฉลากทขางขวดแลวนามาคานวณ สมมตถา % assay = 95 - 97 ใหคดคาเฉลย = 96%

แลวนามาคานวณปรมาณกรดซลฟรกทตองใช ดงน กรดซลฟรก assay 96% ใชปรมาณกรด = 49.04 กรม ถากรดซลฟรก assay 100% ใชปรมาณกรด = 49.04 x100 กรม

96

จะตองใช sulfuric acid assay 96% = 51.08 กรม

2. การเตรยมสารละลาย H2SO4 เขมขน 72 % วธคานวณหาปรมาณกรดซลฟรกทตองใชในการเตรยมสารละลาย H2SO4 เขมขน 72 % เตรยมสารละลาย 72% H2SO4 ความถวงจาเพาะ 1.634 จาก 96% H2SO4 ความถวงจาเพาะ 1.84 (H2SO4 conc) จากสตร N1V1 = N2V2 เมอ N1 = ความเขมขนของ 96% H2SO4 หนวยเปน Normal N2 = ความเขมขนของสารละลาย 72% H2SO4 หนวยเปน Normal V1 = ปรมาตรของ 96% H2SO4 ทตองใชหนวยเปน ml V2 = ปรมาตรของสารละลาย 72% H2SO4 ทตองการเตรยมหนวยเปน ml

จาก 96% H2SO4 ความถวงจาเพาะ 1.84 สารละลาย H2SO4 หนก 100 g มเนอกรดอย = 96 g สารละลาย H2SO4 หนก 1.84 g มเนอกรดอย = 96 x 1.84 g 100 สารละลาย H2SO4 1 ml จะมเนอกรดอย = 96 x 1.84 g 100 สารละลาย H2SO4 1000 ml จะมเนอกรดอย = 96 x 1.84 x1000 g 100 x 1

27

ความเขมขน = 96 x 1.84 x1000 N 100 x (98.08/2) = 36.02 N

96% H2SO4 ความถวงจาเพาะ 1.84 มความเขมขน 36.02 N จาก 72% H2SO4 ความถวงจาเพาะ 1.634

สารละลาย H2SO4 หนก 100 g มเนอกรดอย = 72 g สารละลาย H2SO4 หนก 1.634 g มเนอกรดอย = 72 x 1.634 g 100 สารละลาย H2SO4 1 ml จะมเนอกรดอย = 72 x 1.634 g 100 สารละลาย H2SO4 1000 ml จะมเนอกรดอย = 72 x 1.634 x1000 g 100 x 1

ความเขมขน = 72 x 1.634 x1000 N 100 x (98.08/2)

= 23.99 N

สารละลาย 72% H2SO4 ความถวงจาเพาะ 1.634 มความเขมขน 23.99 N จาก N1V1 = N2V2

36.02 x V1 = 23.99 x 1000 V1 = 23.99 x1000 36.02 V1 = 666.02 ml

ในการเตรยมสารละลาย 72% H2SO4 ความถวงจาเพาะ 1.634 จะตองใชปรมาณกรดซลฟรก ความเขมขน 96% H2SO4 ความถวงจาเพาะ 1.84 เทากบ 666.02 มลลลตร

………………………………......................

29

30

31

32

33

34

35