i

SISTEMATIKA DAN FILOGENETIKA MOLEKULER

BEBERAPA ISOLAT BAKTERI LIMBAH PUSKESMAS

YANG BERPOTENSI SEBAGAI AGEN BIOREMEDIASI

BERDASARKAN ANALISIS GEN 16S rRNA

SKRIPSI TUGAS AKHIR

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan

Pendidikan Diploma IV Kesehatan

Bidang Analis Kesehatan

Disusun Oleh :

Assyfa Ulti Iskandar

G1C015037

PROGRAM STUDI D IV ANALIS KESEHATAN

FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG

2019

ii

HALAMAN PERSETUJUAN

Tugas Akhir dengan Judul

SISTEMATIKA DAN FILOGENETIKA MOLEKULER BEBERAPA

ISOLAT BAKTERI LIMBAH PUSKESMAS YANG BERPOTENSI

SEBAGAI AGEN BIOREMEDIASI BERDASARKAN ANALISIS

GEN 16S rRNA

Assyfa Ulti Iskandar

G1C015037

Telah disetujui oleh:

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Stalis Norma Ethica M.Si Ayu Rahmawati Sulistyaningtyas, M.SiNKk. 28.6.1026.343 NIK. 28.6.1026.311Tanggal: -05-2019 Tanggal: -05-2019

Mengetahui,

Ketua Program Studi D IV Analis Kesehatan

Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan

Andri Sukeksi,SKM, M.si

NIK 28.6.1026.024

iii

HALAMAN PENGESAHAN

Tugas Akhir ini telah diajukan pada sidang ujian jenjang Pendidikan Tinggi

Diploma IV Bidang Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan

Unuversitas Muhammadiyah Semarang

Tanggal Sidang: Mei 2019

Susunan Tim Penguji

No Nama NarasumberTanda

TanganTanggal

1Dr. Sri Darmawati, M.Si

NIK.28.6.1026.040Penguji 1

2Dr. Stalis Norma Ethica, M.Si

NIK.28.6.1026.343Penguji 2

3

Ayu Rahmawati

Sulistyaningtyas, M.Si

NIK.28.6.1026.311

Penguji 3

iv

KATA PENGANTAR

Segala puji syukur kehadirat ALLAH SWT, karena berkat rahmat dan

karunianya sehingga saya dapat menyelesaikan tugas akhir ini dengan judul

“Sistematika dan Filogenetika Molekuler Beberapa Isolat Bakteri Limbah

Puskesmas yang Berpotensi Sebagai Agen Bioremediasi Berdasarkan Analisis

Gen 16S rRNA”.

Saya menyadari bahwa terselesaikannya tugas akhir ini tidak lepas dari

bimbingan, dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada

kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada :

1. Ibu Dr. Stalis Norma Eticha, M.Si selaku Pembimbing I beserta Ibu Ayu

Rahmawati Sulistyaningtyas, M.Si selaku Pembimbing II yang telah

meluangkan waktu dan dengan sabar memberikan bimbingan serta arahan

dalam penyusunan tugas akhir ini.

2. Ibu Dr. Sri Darmawati, M.Si selaku Dosen Penguji yang telah memberi

masukkan untuk tugas akhir ini.

3. Ibu Andri Sukeksi, SKM, M.Si selaku Ketua Program Studi D-IV Teknologi

Laboratorium Medik Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semarang.

4. Bapak Joni Iskandar dan Ibu Nurbaiti selaku kedua orang tua saya dan adik-

adik saya tercinta, terima kasih atas doa, waktu dan motivasinya.

5. Mas Sakti, Mba Nenik, Mas Akbar, dan Mas Abi yang telah banyak

membantu selama proses penelitian di laboratorium Oseanografi Fakultas

Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Diponegoro.

6. Seluruh karyawan Universitas Muhammadiyah Semarang, rekan-rekan studi

angkatan tahun 2015, 2016 atas segala dukungan, serta semua pihak yang

tidak dapat saya sebutkan satu-persatu.

Semarang, 21 Mei 2019

A ssyfa Ulti Iskandar

NIM. G1C015037

v

Sistematika dan Filogenetika Molekuler Beberapa Isolat Bakteri Limbah Puskesmas Yang Berpotensi Sebagai Agen Bioremediasi Berdasarkan

Analisis Gen 16S rRNA

Assyfa Ulti Iskandar1, Norma Stalis Ethica2, Ayu Rahmawati Sulistyaningtyas3

1. Program Studi D IV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang

2. Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang

3. Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang

ABSTRAK

Limbah biomedik cair merupakan salah satu limbah medik puskesmas yang mengandung polutan organik berkadar tinggi dan juga komponen berbahaya. Alternatif untuk mengurangi komponen berbahaya pada limbah cair ini dapat dilakukan dengan cara bioremediasi. Bioremediasi merupakan proses pembersihan atau remediasi secara biologis yang melibatkan organisme hidup termasuk bakteri. Bakteri yang dapat dijadikan sebagai agen bioremediasi adalah bakteri hidrolitik dengan sifat non patogen hingga patogenitas rendah. Berdasarkan dari penelitian Arifiani dan Sabrina (2018) menunjukkan ada 4 isolat dari limbah cair puskesmas yaitu H1, H3, H5 (Puskesmas Halmahera Kota Semarang) dan T3 (Puskesmas Tlogosari Kulon) yang berpotensi sebagai agen bioremdiasi. Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengetahui identitas molekuler dan hubungan kekerabatan antara 4 isolat bakteri tersebut. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif. Identifikasi dilakukan dengan cara mengkonstruksi pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA. Sekuens gen 16S rRNA didapatkan dengan cara amplifikasi gen menggunakan teknik PCR. Desain pohon filogenetik menunjukkan isolat H3 dan H5 mempunyai hubungan kekerabatan paling dekat dibandingkan dengan dua isolat lainnya. Keempat isolat berada pada Class yang sama yaitu Gammaproteobacter dengan Phylum Proteobacter. Isolat H3 dan H5 memiliki genus yang sama yaitu Stenotrophomonas. Diantara keempat isolat yang dapat dijadikan sebagai agen bioremediasi yaitu isolat T3 yang memiliki kemiripan 98,85% dengan Pararheinheimera aquatica.

Kata Kunci: Bakteri sebagai agen bioremediasi, 16S rRNA, Pohon filogenetik

vi

Molecular Systematics and Phylogenetics of Some Bacterial Isolates from Public Health Center Waste that had Potential as Bioremediation Agents

Based on 16S rRNA Gen Analysis

Assyfa Ulti Iskandar1, Norma Stalis Ethica2, Ayu Rahmawati Sulistyaningtyas3

1. Four years Diploma of Medical Laboratory Technology Study Program, Nursing and Health Faculty, Muhammadiyah University of Semarang

2. Biology Molecular Laboratory, Nursing and Health Faculty, Muhammadiyah University of Semarang

3. Microbiology Laboratory, Nursing and Health Faculty, Muhammadiyah University of Semarang

ABSTRACT

Liquid biomedical waste is one of the medical waste of community health center which contains high levels of organic pollutants and also dangerous components. The alternative way to reduce the hazardous components in liquid waste is bioremediation. Bioremediation is a biological cleansing or remediation process that involves living organisms such as bacteria. Bacteria that can be used as bioremediation agents are hydrolytic bacteria with non-pathogenic to low pathogenenic. Based on research by Arifiani and Sabrina (2018), there were 4 isolates from public health center liquid waste namely H1, H3, H5 (Halmahera Health Center Semarang City) and T3 (Tlogosari Kulon Health Center) which have potential to become bioremdiation agents. The purpose of this analytical reaserch study was to determine molecular identity and the relationship between the 4 bacterial isolates. Identification was done by phylogenetic trees construstion based on 16S rRNA gene sequences. The 16S rRNA gene sequence can be obtained by gene amplification using the PCR technique. The phylogenetic tree design showed that H3 and H5 isolates had the closest relationship compared to the other two isolates. All of the bacterial isolates are from the Gammaproteobacter class with Proteobacter phylum. The isolates of H3 and H5 have the same genus Stenotrophomonas. Among the four isolates that can be made as bioremediation agents are T3 isolates which have a similarity 98.85% with Pararheinheimera aquatica.

Keywords: Bacteria for bioremediation agent, 16S rRNA, phylogenetic tree

vii

SURAT PERNYATAAN

Yang bertanda tanda di bawah ini menyatakan dengan sungguh-sungguh bahwa

Tugas Akhir ini adalah karya sendiri, disusun tanpa tindakan plagiarisme sesuai

dengan peraturan yang berlaku di Universitas Muhammadiyah Semarang

Nama : Assyfa Ulti Iskandar

NIM : G1C015037

Fakultas : Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan

Program Studi : D IV Analis Kesehatan

Judul : Sistematika dan Filogenetika Molekuler Beberapa Isolat Bakteri

Limbah Puskesmas yang Berpotensi Sebagai Agen Bioremediasi

Berdasarkan Analisis Gen 16S rRNA

Jika dikemudian hari ternyata saya melakukan tindakan plagiarisme, saya akan

bertanggung jawab sepenuhnya dan menerima sanksi yang dijatuhkan Universitas

Muhammadiyah Semarang kepada saya.

Semarang, Mei 2019

(Assyfa Ulti Iskandar)

viii

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL................................................................................ iHALAMAN PERSETUJUAN..................................................................... iiHALAMAN PENGESAHAN...................................................................... iiiHALAMAN SURAT PERNYATAAN....................................................... ivABSTRAK................................................................................................... vABSTRACT................................................................................................. viKATA PENGANTAR................................................................................. viiDAFTAR ISI................................................................................................ viiiDAFTAR TABEL........................................................................................ xDAFTAR GAMBAR................................................................................... xiBAB I PENDAHULUAN............................................................................ 1

1.1 Latar Belakang................................................................................ 11.2 Rumusan Masalah........................................................................... 41.3 Tujuan Penelitian............................................................................ 41.4 Manfaat penelitian.......................................................................... 51.5 Originalitas Penelitian...................................................................... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA.................................................................. 72.1 Limbah Biomedik Puskesmas........................................................ 7

2.1.1. Pengertian Limbah Biomedik Puskesmas................................... 72.1.2. Dampak Limbah Biomedik Terhadap Lingkungan..................... 82.1.3. Bioremediasi Limbah Biomedik.................................................. 92.1.4. Bakteri Hidrolitik sebagai Agen Bioremediasi............................ 10

2.2 Sistematika dan Identifikasi Secara Molekuler............................. 112.2.1. Gen 16S rRNA............................................................................ 12

2.2.1.1. Ekstraksi Dna.......................................................................... 122.2.1.2. Polymerase Chain Reaction (PCR)........................................ 132.2.1.3. Elektroforesis.......................................................................... 15

2.3 Sekuensing DNA........................................................................... 162.4 Hubungan Kekerabatan dengan Filogenetik.................................. 17

2.4.1. Konstruksi Pohon Filogenetik..................................................... 202.5 Kerangka Teori.............................................................................. 232.5 Kerangka Konsep........................................................................... 242.6 Hipotesis........................................................................................ 24

BAB III METODE PENELITIAN.............................................................. 25

ix

3.1 Jenis Penelitian.............................................................................. 253.2 Tempat dan waktu penelitian......................................................... 253.3 Definisi Operasional...................................................................... 253.4 Objek Penelitian............................................................................. 253.5 Alat dan Bahan............................................................................... 26

3.5.1. Alat.............................................................................................. 263.5.2. Bahan........................................................................................... 26

3.6 Prosedur Penelitian........................................................................ 263.6.1. Subkultur Isolat Bakteri............................................................... 263.6.2. Ekstraksi Dna Metode Chelex..................................................... 273.6.3. Polymerase Chain Reaction (PCR) 16S rRNA........................... 273.6.4. Elektroforesis............................................................................... 273.6.5. Sekuensing DNA......................................................................... 283.6.6. Konstruksi Pohon Filogenetik..................................................... 28

3.7 Alur Penelitian............................................................................... 293.8 Teknik Pengumpulan dan Analisa Data......................................... 29

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................... 304.1 Hasil................................................................................................. 30

4.1.1. Subkultur Isolat Bakteri............................................................... 324.1.2. PCR 16S rRNA dan Elektroforesis............................................. 334.1.3. Isolasi DNA................................................................................. 344.1.4. Sekuensing dan BLAST.............................................................. 354.1.5. Konstruksi Pohon Filogenetik..................................................... 38

4.2 Pembahasan...................................................................................... 404.2.1. PCR 16S rRNA dan Elektroforesis............................................. 414.2.2. Basic Local Alignment Search Tools (BLAST).......................... 414.2.3. Hubungan Kekerabatan............................................................... 41

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN....................................................... 455.1 Kesimpulan...................................................................................... 455.2 Saran................................................................................................. 45DAFTAR PUSTAKA.................................................................................. 47LAMPIRAN................................................................................................. 53

x

DAFTAR TABEL

HalamanTabel 1. Originalitas Penelitian.................................................................... 5 Tabel 2. Definisi Operasional...................................................................... 25 Tabel 3. Morfologi Sel................................................................................. 30Tabel 4. Morfologi Koloni........................................................................... 30 Tabel 5. Uji Patogenitas............................................................................... 31 Tabel 6. Uji Penghasil Enzim Lipase dan Protease..................................... 32 Tabel 7. Konsentrasi Kemurnian DNA........................................................ 33Tabel 8. Hasil BLAST................................................................................. 38

xi

DAFTAR GAMBARHalaman

Gambar 1. Kerangka Teori........................................................................... 23Gambar 2. Kerangka Konsep....................................................................... 24Gambar 3. Alur Penelitian........................................................................... 29Gambar 4. Uji Patogenitas........................................................................... 31Gambar 5. Uji Penghasil Enzim Lipase dan Protease.................................. 32Gambar 6. Subkultur Isolat Bakteri............................................................. 33Gambar 7. Visualisasi Hasil Elektroforesis................................................. 35Gambar 8. Pohon Filogenetik...................................................................... 39

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Pusat Kesehatan Masyarakat (Puskesmas) merupakan fasilitas yang

dilaksanakan oleh pemerintah daerah untuk menyelenggarakan upaya pelayanan

kesehatan, baik promotif, preventif, kuratif maupun rehabilitatif. Puskesmas

berperan sebagai fasilitas pelayanan kesehatan perseorangan tingkat pertama

untuk mencapai derajat kesehatan masyarakat yang setinggi-tingginya di wilayah

kerjanya (Permenkes RI, 2014). Puskesmas dapat menghasilkan limbah nonmedik

dan limbah medik. Limbah biomedik merupakan salah satu limbah medik yang

berupa padatan, cairan, benda tajam, limbah laboratorium dan kontainer obat yang

dihasilkan dari kegiatan kesehatan baik untuk manusia maupun hewan (Ethica

dkk., 2018) Semakin tinggi aktivitas pelayanan kesehatan yang dilakukan oleh

puskesmas maka semakin tinggi pula jumlah limbah yang dihasilkan (Arifiani

dkk., 2018).

Air limbah rumah sakit merupakan akumulasi limbah domestik dan limbah

biomedik cair. Pengolahan limbah biomedik cair dapat dilakukan dengan metode

pengolahan secara fisika, kimia dan biologi. Pengolahan limbah cair secara fisika

digunakan untuk menghilangkan padatan yang tersuspensi dengan metode

sedimentasi dan filtrasi. Pengolahan secara kimia pada limbah cair melibatkan

penambahan bahan kimia untuk mengubah atau dekstruksi kontaminan.

Sementara itu pada pengolahan secara biologi dilakukan dengan bantuan

mikroorganisme karena melibatkan berbagai mekanisme biologis untuk

mengurangi dan menghilangkan bahan organik biodegradable dari air limbah ke

tingkat yang dapat diterima sesuai ambang batas yang telah ditentukan (Riffat,

2012). Limbah biomedik cair mengandung polutan organik berkadar tinggi,

sehingga dapat diolah secara biologi (Mora dkk., 2015; Arifiani dkk.,2018). Hasil

pengolahan biologi umumnya adalah senyawa senyawa yang lebih sederhana

termasuk bahan – bahan anorganik yang kemudian akan diolah secara kimia

(Rudyatmi, 2016; Ethica dkk., 2018).

Sebagian besar penanganan limbah biomedik di Indonesia banyak dilakukan

dengan metode non-remediasi seperti insinerator, autoklaf dan instalasi

2

pengolahan air limbah (IPAL) (Ethica dkk., 2018). IPAL digunakan untuk

mengembalikan mutu air limbah agar dapat memenuhi standar (Prastiwi dkk.,

2015). Pembangunan IPAL memerlukan biaya yang sangat tinggi, sehingga tidak

semua lembaga yang menjalankan kegiatan kesehatan mampu mendirikan IPAL

terutama rumah sakit atau puskesmas kecil. Pengolahan limbah biomedik dengan

menggunakan insinerator menyebabkan permasalahan pencemaran udara dan

kebisingan (Mora dkk., 2015; Habibi, 2015; Sabrina dkk., 2018). Selain itu,

pembakaran limbah menggunakan insinerator juga menghasilkan emisi gas yang

memberikan efek rumah kaca (DKP, 2018; Ethica dkk., 2018). Oleh sebab itu

penanganan limbah biomedik secara bioremediasi perlu dilakukan.

Bioremediasi merupakan proses pembersihan atau remediasi secara biologis

yang melibatkan organisme hidup termasuk bakteri untuk mengurangi atau

menghilangkan polutan pada daerah terkontaminasi, yang menghasilkan

pemulihan ke keadaan semula tanpa gangguan lebih lanjut terhadap lingkungan

lokal (Vidali, 2001; McKew dkk., 2007; Ali dkk., 2009; Ethica dkk., 2018). Agen

biologis utama pada proses bioremediasi yaitu mikroorganisme dan enzim

(Prihati, 2012; Ethica dkk., 2018). Kelompok enzim hidrolase (hidrolitik) dan

enzim oksidoreduktase merupakan enzim yang paling banyak dieksplorasi untuk

keperluan bioremediasi. Beberapa contoh enzim hidrolitik antara lain protease,

selulase, esterase, lipase, fosfatase, kutinase, dan amilase (Piotrowska, 2005;

Schmidt, 2006; Arifiani dkk., 2018). Potensi bakteri penghasil protease dan lipase

sudah teruji, namun penggunaannya dalam bioremediasi puskesmas belum banyak

digunakan.

Umumnya bakteri terdapat pada limbah biomedik dari lingkungan rumah

sakit adalah Escherichia sp, Serratia sp, Achinetobacter sp, Klebsiella sp,

Salmonella sp, Staphylococcus sp, Enterococcus sp, Streptococcus sp dan

Pseudomonas sp. (Saini dkk., 2004; Rastogi dkk., 2011; Anitha dan Jayraaj, 2012;

Ethica, 2018). Bakteri hidrolitik yang memiliki tingkat patogenitas rendah atau

non patogen dan dapat memetabolisme zat-zat organik mempunyai peran penting

dalam mempercepat proses degredasi sehingga akan mengurangi kemungkinan

mikroorganisme patogen berkembang biak, bahaya infeksi dan kontaminasi akibat

mikroorganisme patogen tersebut (Emmimol dkk., 2012; Sabrina, 2018).

3

Hasil penelitian dari Ethica dan Raharjo (2014) berhasil mengkarakterisasi

isolat bakteri hidrolitik penghasil lipase Alcagenes sp.JG3 yang mampu

mendegradasi lemak sekaligus gliserol, sehingga berpotensi menjadi agen

bioredegradasi limbah organik (lemak) yang efektif. Akan tetapi strain bakteri ini

tergolong bakteri yang bersifat patogen. Berdasarkan dari penelitian Arifiani dan

Sabrina (2018) menunjukkan ada 4 isolat dari limbah puskesmas Halmahera Kota

Semarang dan puskesmas Tlogosari Kulon besifat non patogen atau patogenitas

rendah yang memiliki potensi sebagai agen bioremediasi limbah biomedik cair

yaitu menghasilkan enzim lipase dan protease namun belum diketahui identifikasi

dan sistem taksonominya.

Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk mengetahui identitas dan

klasifikasi taksonomi suatu mikroorganisme yaitu dengan teknik molekuler.

Kelebihan identifikasi molekuler adalah mampu mengidentifikasi secara lebih

akurat dan spesifik. Metode sekuensing 16S rRNA merupakan cara

mengidentifikasi mikroorganisme yang dapat membedakan sifat fenotip yang unik

(Ethica, 2018). Produk atau hasil dari melipatgandakan gen 16S rRNA yang

didapat menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) disekuensing

sehingga didapatkan urutan basa nukleotidanya. Data dari hasil sekuensing DNA

dapat dilacak melalui database Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)

pada National Center for Biotechnology Information, National Institute for

Health, USA (www.ncbi.nlm.nih.gov) kemudian dideposit ke GenBank untuk

mendapatkan nomor akses. Software MEGA X dapat menghubungkan

kekerabatan antar mahluk hidup melalui gambaran pohon filogenetik. Walaupun

ada gangguan kontaminasi dan masalah sensitivitas yang kurang memadai,

metode sekuensing 16S rRNA ini tidak terpengaruh oleh variasi fenotipik atau

bias teknologi, dan memiliki potensi untuk mengurangi kesalahan (Ethica, 2018).

Penggunaan agen bioremediasi untuk mengolah limbah biomedik

puskesmas masih sedikit. Hal tersebut disebabkan oleh kemampuan puskesmas di

Indonesia dalam mengelola limbah tersebut masih terbatas. Hasil penelitian

Arifiani (2018) dan Sabrina (2018) menunjukkan adanya 4 isolat bakteri yaitu H1,

H3, dan H5 (Puskesmas Halmahera Kota Semarang) dan T3 (Puskesmas

Tlogosari Kulon) yang bersifat non patogen atau patogenitas rendah, dari

4

kelompok bakteri indigen penghasil lipase dan protease yang berpotensi sebagai

agen bioremediasi untuk menangani limbah biomedik puskesmas. Akan tetapi

identitas dan klasifikasi taksonomi bakteri tersebut belum diketahui, sehingga

perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui identitas molekuler bakteri penghasil

enzim lipase dan protease yang bersifat non patogen atau patogenitas rendah dari

limbah biomedik Puskesmas Halmahera Kota Semarang dan Puskesmas Tlogosari

Kulon.

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang ada, maka rumusan masalah pada

penelitian ini adalah:

a. Apakah identitas molekuler beberapa isolat bakteri yang berpotensi sebagai

agen bioremediasi limbah biomedik Puskesmas Halmahera Kota Semarang

dan Puskesmas Tlogosari Kulon berdasarkan sekuens 16S rRNA?

b. Bagaimakah hubungan filogenetik beberapa isolat bakteri yang berpotensi

sebagai agen bioremediasi limbah biomedik Puskesmas Halmahera Kota

Semarang dan Puskesmas Tlogosari Kulon berdasarkan sekuens 16S rRNA?

1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1.Tujuan Umum

Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mengetahui identitas molekuler

dan hubungan kekerabatan spesimen bakteri pada beberapa isolat bakteri yang

berpotensi sebagai agen bioremediasi limbah biomedik Puskesmas Halmahera

Kota Semarang dan Puskesmas Tlogosari Kulon.

1.3.2.Tujuan Khusus

Tujuan khusus pada penelitian ini adalah:

a. Melakukan identifikasi molekuler menggunakan PCR 16S-rRNA pada

beberapa isolat bakteri dari agen bioremediasi limbah biomedik Puskesmas

Halmahera Kota Semarang dan Puskesmas Tlogosari Kulon.

b. Mengkonstruksi pohon filogenik berdasarkan hasil sekuensing atau

pengurutan DNA beberapa isolat bakteri dari agen bioremediasi limbah

biomedik Puskesmas Halmahera Kota Semarang dan Puskesmas Tlogosari

Kulon menggunakan software MEGA X.

1.4. Manfaat

5

1.4.1.Manfaat bagi Peneliti

Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah wawasan serta pengetahuan

tentang cara mengidentifikasi secara molekuler dan mengetahui hubungan

kekerabatan bakteri hidrolitik dari limbah biomedik puskesmas yang berpotensi

sebagai agen bioremediasi.

1.4.2. Manfaat bagi Masyarakat

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi pengetahuan jenis bakteri

yang berpotensi sebagai agen bioremediasi dari limbah puskesmas.

1.4.3.Manfaat bagi Institusi

Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai bahan bacaan dan

referensi bagi mahasiswa mengenai identifikasi molekuler bakteri yang berpotensi

bioremediasi berdasarkan analisis gen 16S - rRNA dan konstruksi pohon filogenik

dengan software MEGA X.

1.5. Keaslian/ Originalitas PenelitianTabel 1. Originalitas Penelitian

No. Nama Penulis dan Tahun Judul Penelitian Hasil Penelitian

1 Ethica dkk., 2014 Detection Of

Genes Involved In

Glycerol

Metabolism Of

Alcaligenes sp.

JG3

Hasil uji penggunaan gliserol in vitro

menunjukkan bahwa Alcaligenes sp.

JG3 dapat tumbuh pada medium

dengan gliserol sebagai sumber karbon

secara aerobik, namun tidak secara

anaerobik. Dapat disimpulkan bahwa

Alcaligenes sp. JG3 mampu melakukan

metabolisme gliserol secara aerobik,

sehingga berpotensi untuk digunakan

sebagai pendegradasi limbah minyak

dan lemak yang efektif

2 Arifiani dkk., 2018 Isolasi Bakteri

Penghasil Lipase

dan Protease yang

Berpotensi

sebagai Agen

Bioremediasi

Limbah Biomedis

Cair Puskesmas

Halmahera Kota

Dari 7 isolat hasil seleksi patogenitas

diperoleh 3 isolat bakteri yang bersifat

non patogen H2, H3, H5 dan 1 isolat

bakteri dengan tingkat patogenitas

rendah H1. Hasil seleksi penghasilan

enzim proteolitik menunjukkan isolat

H5 mampu menghasilkan enzim

protease, sedangkan hasil seleksi

penghasilan enzim menunjukkan

6

Semarang. bahwa dua isolat, yaitu H1 dan H3

mampu menghasilkan enzim lipase.

Dengan demikian isolat bakteri H1, H3

dan H5 merupakan bakteri yang

berpotensi sebagai agen bioremediasi

limbah biomedik cair.

3 Sabrina dkk., 2018 Potensi Bakteri

Indigen Penghasil

Enzim Protease

Dan Lipase

sebagai Agen

Bioremediasi

Limbah Biomedis

Puskesmas

Tlogosari Kulon

Dari 6 isolat bakteri hasil uji

patogenitas menunjukkan 3 isolat yaitu

T2, T3 dan T5 memiliki tingkat

patogenitas rendah. Hasil seleksi

penghasilan enzim proteolitik

menunjukkan 1 isolat yaitu T3 mampu

menghasilkan enzim protease dan

lipase sekaligus. Dengan demikian

isolat T3 berpotensi untuk dijadikan

sebagai agen bioremediasi limbah

biomedik cair.

Perbedaan antara penelitian ini dan penelitian yang telah dilakukan oleh

Ethica (2014), Arifiani (2018) dan Sabrina (2018) terletak pada identifikasi

molekuler. Penelitian Ethica (2014), berhasil mengidentifikasi bakteri dengan

kemampuan degradasi gliserol. Namun bakteri tersebut besifat patogen sehingga

tidak dapat dijadikan sebagai agen bioremediasi limbak biomedik. Penelitian yang

dilakukan Arifiani (2018) dan Sabrina (2018) meneliti bakteri indigen penghasil

lipase dan protease yang berpotensi sebagai agen bioremediasi limbah biomedik

cair dan bersifat non patogen atau patogenitas rendah dari limbah Puskesmas

Halmahera Kota Semarang dan Puskesemas Tlogosari Kulon. Namun isolat

bakteri yang diperoleh masih belum diketahui identitasnya. Penelitian ini

mengidentifikasi secara molekuler dari beberapa isolat bakteri indigen yang

bersifat non patogen atau patogenitas rendah penghasil enzim protease dan lipase

yang berpotensi sebagai agen bioremediasi limbah biomedik cair dan dari limbah

Puskesmas Halmahera Kota Semarang dan Puskesemas Tlogosari Kulon dan

bagaimana hubungan kekerabatannya.

7

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Limbah Biomedik Puskesmas

2.1.1.Pengertian Limbah Biomedik Puskesmas

Pusat kesehatan masyarakat (Puskesmas) akan menghasilkan limbah yang

berasal dari setiap kegiatan pelayanan kesehatan kepada masyarakat. Limbah

merupakan suatu hasil dari kegiatan manusia yang tidak lagi digunakan, dipakai,

atau dibuang dan tidak terjadi dengan sendirinya. Limbah layanan kesehatan

meliputi semua hasil buangan dari instalasi kesehatan, fasilitas penelitian,

laboratorium, maupun limbah hasil perawatan yang dilakukan di rumah seperti

dialisis dan suntikan insulin (Pruss dkk., 2005; Notoadmojo, 2007; Arifiani,

2018). Semakin tinggi aktivitas pelayanan kesehatan yang dilakukan oleh

puskesmas maka semakin tinggi pula jumlah limbah yang dihasilkan (Arifiani

dkk., 2018).

Secara umum limbah yang dihasilkan puskesmas baik berupa padatan, gas

dan cairan, terdiri dari dua jenis. Jenis yang pertama yaitu limbah non medik yang

termasuk di dalamnya limbah domestik rumah sakit. Jenis yang kedua yaitu

limbah medik yang dihasilkan dari kegiatan kesehatan baik untuk manusia

maupun hewan, termasuk di dalamnya limbah biomedik (Ethica dkk., 2018).

Limbah biomedik merupakan salah satu limbah medik yang bersifat biologis.

Limbah biomedik dihasilkan selama proses diagnosis, perawatan atau imunisasi

manusia yang terkontaminasi cairan, suntikan, jarum suntik, ampul, organ tubuh

ataupun bagian tubuh pasien, plasenta, termasuk limbah mikrobiologi (Ola-Adisa

dkk., 2015). Limbah biomedik mengandung komponen berbahaya seperti bakteri,

virus, jamur, bahan kimia beracun, sisa obat, dan bahan radio aktif terlarut yang

apabila tidak diolah dapat mencemari lingkungan dan beresiko terhadap manusia

dan makhluk hidup lainnya (Mwaikono dkk., 2015).

Limbah biomedik puskesmas itu sendiri terbagi menjadi menjadi dua yaitu

limbah padat dan limbah cair. Sekitar 75 – 90 % jumlah limbah biomedik

tergolong tidak berbahaya, namun apabila kedua golongan limbah biomedik ini

bercampur maka seluruhnya akan menjadi berbahaya karena dapat merusak

kesehatan dan lingkungan. Bahaya kontaminasi menjadi sifat yang menonjol pada

8

limbah biomedik. Untuk menghindari bahaya kontaminasi yang ada limbah

biomedik pukesmas harus terdegradasi seluruhnya sebelum masuk ke tempat

pembuangan akhir (Singh dkk., 2007; Ethica dkk., 2018).

2.1.2.Dampak Limbah Biomedik Terhadap Lingkungan

Limbah yang dihasilkan dari aktivitas pelayanan kesehatan seperti rumah

sakit dan puskesmas dapat membahayakan kesehatan masyarakat, contohnya

berupa virus dan kuman yang berasal dari laboratorium. Limbah cair dan limbah

padat yang berasal dari rumah sakit merupakan media penyebar gangguan atau

penyakit bagi petugas, penderita maupun masyarakat. Contoh gangguan tersebut

dapat berupa pencemaran udara, pencemaran air, tanah, pencemaran makanan dan

minuman. Pencemaran tersebut adalah agen-agen kesehatan lingkungan yang

mempunyai dampak besar terhadap manusia (Ethica dkk., 2018; Arifiani dkk.,

2018).

Limbah puskesmas umumnya belum dikelola dengan baik. Sebagian besar

pengelolaan limbah infeksius tidak ada perbedaannya dengan cara pengelolaan

limbah medik noninfeksius. Selain itu masih banyak yang menggabungkan antara

limbah medik infeksius dan limbah medik non-infeksius. Padahal penggabungan

limbah tersebut membuat permasalahan limbah medik semakin besar. Limbah

puskesmas dapat mengandung berbagai macam mikroorganisme yang tergantung

pada jenis dan cara pengolahan yang dilakukan. Limbah yang mengandung bahan

organik dan bahan anorganik dapat diukur dengan parameter BOD, COD, TSS,

dan lain-lain. Sedangkan limbah padat terdiri dari sampah mudah terbakar,

sampah mudah membusuk, dan lain-lain (Ethica dkk., 2018).

Limbah medik kemungkinan besar mengandung mikroorganisme patogen

atau bahan kimia beracun yang berbahaya dan dapat menyebabkan penularan

infeksi penyakit ke sekitar lingkungan puskesmas yang disebabkan oleh teknik

pelayanan kesehatan yang kurang memadai, kesalahan penanganan bahan

terkontaminasi dan peralatan, serta penyediaan dan pemeliharaan sarana sanitasi

yang kurang baik (Arifiani dkk., 2018).

Terdapat beberapa kelompok masyarakat yang mendapatkan gangguan

karena limbah buangan puskesmas. Pertama, pasien yang datang ke puskesmas

untuk mendapatkan pertolongan pengobatan dan perawatan. Kelompok ini adalah

9

kelompok yang paling rentan. Kedua, karyawan puskesmas dalam menjalankan

tugasnya selalu kontak langsung dengan pasien yang sakit. Ketiga,

pengunjung/pengantar pasien yang berkunjung ke puskesmas. Keempat,

masyarakat yang bertempat tinggal di sekitar puskesmas, apalagi jika limbah

puskesmas dibuang ke lingkungan tanpa adanya pengolahan limbah, akibatnya

dapat menurunkan derajat kesehahatan masyarakat di lingkungan tersebut. Oleh

karena itu puskesmas wajib mengelola limbah dari aktivitas pelayanan kesehatan

dengan baik dan benar dengan melakukan kegiatan sanitasi puskesmas (Ethica,

2018).

2.1.3.Bioremediasi Limbah Biomedik

Air limbah puskesmas umumnya merupakan kumpulan dari limbah

domestik dan limbah cair. Limbah tersebut mengandung senyawa polutan organik

yang cukup tinggi, sehingga dapat diolah secara biologis (Mora dkk., 2015). Salah

satu pengolahan limbah secara biologis adalah dengan bioremediasi. Bioremediasi

adalah proses degradasi limbah secara biologis dalam kondisi terkedali, sehingga

berubah menjadi bahan yang tidak berbahaya atau kadarnya lebih rendah dari

batas konsentrasi yang di tetapkan oleh otoritas pengawas limbah. Metode ini

merupakan pemanfaatan bioteknologi yang ramah lingkungan dan hemat biaya,

didasari dengan proses biodegredasi yang terjadi karena adanya peran enzim

mikoorganisme. Bioremediasi pada limbah biomedik pukesmas merupakan

penerapan pengolahan biologis untuk pembersihan kontaminan yang berasal dari

limbah biomedik yang berbentuk cair (Ethica dkk., 2018).

Metode bioremediasi pada umunya menggunakan organisme indigen dari

kelompok fungi, alga dan bakteri sebagai agen bioremediasi limbah biomedik

(Ethica dkk., 2018). Orgenisme indigen merupakan organisme asli yang sudah ada

di area terkontaminasi bahkan sebelum terjadinya proses kontaminasi.

Penggunaan mikroorganisme untuk bioremediasi limbah biomedik cair yang telah

banyak digunakan, salah satunya dari kelompok fungi Tremetes versicolor mampu

mendegradasi bahan kimia obat dan antibiotik. Kelompok bakteri telah dilaporkan

bahwa Pseudomonas dan Alcaligenes juga dapat digunakan untuk menangani

limbah biomedik sisa bahan farmasi (Zhang dkk., 2016; Santoro., dkk 2015).

Sementara itu dari kelompok alga, Scenedesmus dan Daphnia merupakan agen

10

biologi yang dilaporkan potensial menangani total coliform dan polutan organik

pada limbah biomedik cair (Berto dkk., 2009).

2.1.4.Peran Bakteri Hidrolitik sebagai Agen Bioremediasi

Enzim dihasilkan oleh semua makhluk hidup untuk mengkatalisis reaksi

biokimia dalam tubuh makhluk hidup tersebut sehingga reaksi-reaksi itu dapat

berlangsung lebih cepat (Sianturi, 2008). Secara umum enzim dapat

dikelompokan menjadi 6, yaitu: hidrolase, oksidoreduktase, transferase, liase,

isomerase dan ligase. Dari 6 kelompok enzim tersebut, kelompok yang paling

berperan dalam bioremediasi adalah kelompok enzim hidrolase (hidrolitik) dan

oksidorekduktase (Ethica dkk., 2018).

Contoh enzim hidrolitik antara lain protease, selulase, esterase, lipase,

fosfatase, kutinase, dan amilase. Dari sub kelompok enzim hidrolitik selulase,

enzim hemiselulase, selulase, dan glikosidase merupakan enzim-enzim yang

penting karena kemampuannya mendegradasi biomassa. Kelompok enzim

hidrolitik mempunyai kemampuan mengkatalis reaksi pemecah hidrolistik C-C,

C-O, C-N, P-O, dan ikatan lain tertentu termasuk ikatan asam anhidrida. Reaksi

hidrolitik melibatkan pelepasan gugus fungsional ke dalam air. Enzim hidrolitik

akan mengkatalisasi reaksi - reaksi tipe hidrolisis melalui tiga mekanisme utama

yaitu memecah ikatan ester, memecah ikatan peptida dan memecah ikatan

glikosida (Schmidt, 2006; Ethica dkk., 2018; Arifiani dkk., 2018).

Bakteri hidrolitik merupakan bakteri yang mampu mensekresikan enzim

hidrolitik yang digunakan untuk mengkatabolisasi komponen utama biomassa

seperti polisakarida, protein dan lemak. Enzim hidrolitik mampu memecah ikatan

kimia utama dalam molekul beracun melalui mekanisme hidrolisis yang

menyebabkan molekul beracun tersebut berkurang tingkat toksisitasnya.

Keuntungan dari kelas enzim hidrolitik adalah ketersediaan yang sangat besar,

rendahnya streoselektivitas kofaktor dan mentoleransikan penambahan pelarut

yang dapat larut dalam air (Kaigar dan Rao, 2011; Ethica dkk., 2018).

Buzzini dan Martini (2002) mampu mengisolasi berbagai koloni bakteri dan

fungi yang menghasilkan berbagai jenis enzim hidrolitik ekstraseluler amilase

ekstraseluler, esterase, lipase, protease, pektinase dan kitinase. Mikroorganisme

yang berhasil diisolasi tersebut dilaporkan berperan dalam proses biodegradasi

11

limbah organik beracun, sehingga berpotensi sebagai agen bioremediasi (Emimol

dkk., 2012). Sebanyak 348 spesies yeast (terdiri dari 193 Ascomycetes dan 155

Basidiomycetes) serta 46 strain mirip Aureobasidium pullulans (Ethica dkk.,

2018; Arifiani dkk., 2018). Bakteri hidrolitik, terutama yang memiliki tingkat

patogenitas rendah hingga non patogen dan dapat memetabolisme zat-zat organik

mempunyai peran penting dalam mempercepat proses degredasi sehingga akan

mengurangi kemungkinan mikroorganisme patogen berkembang biak dan akan

mengurangi bahaya infeksi dan kontaminasi akibat mikroorganisme patogen

tersebut (Emmimol dkk., 2012; Sabrina dkk., 2018).

2.2. Sistematika dan Identifikasi Secara Molekuler

Sistematika memiliki peran penting di dalam dunia biologi yaitu untuk

menyediakan pengetahuan mengkarakterisasi organisme sekaligus mengenalinya

untuk memahami keanekaragaman mahluk hidup. Sistematika bertugas dalam

megkonstruksi hubungan evolusi dari kelompok organisme biologi. Terdapat dua

pendekatan untuk mengetahui hubungan evolusi yaitu secara fenetika dengan

berdasarkan karakter atau ciri yang sama pada organisme biologi dan secara

kladistika yang banyak digunakan pada penelitian sistematika dengan cara

mempelajari perjalanan evolusi atau perubahan karakter atau ciri dari setiap

kelompok organisme atau yang biasa disebut dengan filogenetika. Untuk

mengetahui bagaimana sistematika berdasarkan filogenetika suatu organisme

dilakukan identifikasi secara molekuler (Hidayat dkk., 2008).

Identifikasi merupakan kegiatan yang dilakukan untuk mendapatkan suatu

informasi atau data agar dapat mengetahui dan menetapkan suatu identitas mahluk

hidup berdasarkan ciri-ciri, karakter atau sifat yang ada pada mahluk hidup

tersebut. Identifikasi pada mikroorganisme berfungsi untuk membedakan antar

spesies mikroorganisme seperti jamur, alga, bakteri dan lainnya. Terdapat

berbagai cara untuk mengidentifikasi bakteri yaitu berdasarkan pendekatan

fisiologis dengan pengamatan morfologi baik secara mikroskopis maupun

makroskopis, uji biokimia dan identifikasi dengan pendekatan molekuler. Metode

identifikasi berdasarkan karakteristik fisiologis dan uji biokimia membutuhkan

waktu yang cukup lama sedangkan pada identifikasi berbasis molekuler waktu

yang dibutuhkan jauh lebih singkat yaitu melalui analisis sekuensing DNA

12

(Ethica, 2018). Identifikasi secara molekuler dapat digunakan untuk mengetahui

kedekatan atau kekerabatan antara isolat-isolat bakteri dengan metode analisis gen

16S rRNA. Metode ini merupakan metode untuk identifikasi berbasis molekuler

lebih cepat dengan tingkat spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi (Rinanda,

2011). Metode ini juga dapat digunakan untuk mempelajari filogenetik dari

bakteri (Sukartiningrum, 2012).

2.2.1.Gen 16S rRNA

Gen pengkode RNA ribosomal (rRNA) adalah gen yang paling lestari

(conserved). Porsi sekuens rRNA dari tiap organisme yang secara genetik

berkorelasi umumnya adalah sama. Dengan ini setiap organisme yang mempunyai

jarak kekerabatan tertentu dapat disejajarkan sehingga lebih mudah untuk

menentukan perbedaan dalam sekuens yang menjadi ciri khas organisme tersebut

(Rinanda, 2011).

Gen 16S RNA ribosom atau 16S rRNA dikode oleh gen 16S rDNA dan

merupakan daerah konservatif yang digunakan untuk mendunga hubungan

kekerabatan secara alami diantara spesies. Gen 16 rRNA adalah salah satu

komponen dari subunit kecil 30S pada ribosom prokariot. Panjang sekuens dari

16S rRNA mencapai 1500 bp yang diperoleh dengan amplifikasi metode PCR.

Sekuens basa tersebut digunakan untuk mengkontruksi pohon filogenetik. Gen

16S rRNA di bagian ujung sekuens merupakan daerah yang disebut dengan

hypervariable region. Daerah ini merupakan bagian yang membedakan antar

organisme. Primer yang digunakan dalam amplifikasi sekuens akan mengenali

daerah yang lestari dan mengamplifikasi hypervariable region, dengan demikian

akan diperoleh sekuens yang khas. (Patantis, 2009; Rinanda, 2011). 16S rRNA

mepunyai fungsi antara lain membantu dalam pengikatan dua subunit ribosom

yaitu unit 50S dan 30S, menerjemahkan posisi protein dari ribosom, berinteraksi

dengan 23S dan menjaga stabilitas pasangan kodon-antikodon melaui

pembentukan ikatan hidrogem antara atom N1 dari adenine dengan OH pada

mRNA (Coenye dkk., 2003; Sukartiningrum, 2012)

2.2.1.1. Isolasi DNA

Molekul DNA harus dipisahkan dari material seluler lainnya sebelum dapat

diperiksa. Protein sel yang menyelubungi dan melindungi DNA dapat

13

menghambat kemampuan menganalisis DNA. Oleh karena itu, metode untuk

mengekstrasi DNA telah dikembangkan untuk memisahkan protein dan materi

seluler lainnya dari molekul DNA. Selain itu, kuantitas dan kualitas DNA sering

diukur sebelum proses lanjutan lainnya untuk memastikan akan didapatkan hasil

yang optimal. Isolasi DNA secara umum memiliki tahapan-tahapan yang meliputi

isolasi dari jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, isolasi dalam larutan,

purifikasi serta presipitasi atau pemadatan (Yosephi, 2010).

Isolasi DNA dalam prosesnya terdapat tiga larutan penting, yaitu larutan

buffer untuk lisis, larutan buffer untuk digesti, dan protein kinase K. Proses

penghancuran sel (lisis) secara kimia dilakukan dengan mamanfaatkan senyawa

kimia seperti EDTA (Etil Ediamin Tetra Asetat) dan SDS (Sodium Dodesil

Sulfat). EDTA akan merusak atau menghancurkan sel dengan cara mengikat ion

magnesium. Ion ini berfungsi dalam mempertahankan integritas sel dan

mengingkatkan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. SDS yang

merupakan sejenis deterjen digunakan untuk merusak membran sel (Yosephi,

2010).

Kotoran atau debris sel yang ditimbulkan akibat proses penghancuran sel

dapat dibersihkan dengan cara sentrifus sehingga yang tertinggal di dasar tabung

hanya molekul nukelotida (DNA, RNA, serta protein). Protein dapat dihilangkan

dengan bantuan enzim proteinase, sedangkan RNA juga dibersihkan dari larutan

dengan RNAse sehingga DNA dapat diisolasi seutuhnya. Terdapat tiga teknik

primer yang digunakan dalam laboratorium forensik DNA untuk isolasi DNA,

yaitu isolasi organik (fenol-kloroform), isolasi Chelex, dan kertas FTA (Yosephi,

2010)

2.2.1.2. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain

Reaction (PCR), yaitu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu

sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. PCR merupakan suatu teknik untuk

amplifikasi atau perbanyakan DNA secara enzimatik menggunakan primer dari

potongan urutan basa tertentu. Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai

tunggal yang mempunyai urutan synthesizer. Primer oligonukleotida di sintesis

14

oleh DNA yang memiliki panjang berkisar antara 20-30 basa (Samborok dkk.,

2001; Sukartiningrum, 2012).

PCR melibatkan beberapa tahap berulang atau siklus yang pada umumnya

dilakukan antara 20 hingga 40 siklus. Terjadi duplikasi pada setiap siklus jumlah

target DNA untai ganda. Denaturasi termal memisahkan Untai ganda DNA target

(unamplified DNA) kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu

untuk memberi waktu pada primer (anneal primers) menempel pada daerah

tertentu dari DNA target. Tahap polimerase DNA atau elongation digunakan

untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan menggunakan dNTPs yaitu

blok pembangun asam nukleat yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

Buffer yang mengandung MgCl2 mempengaruhi hasil dari proses PCR.

Konsentrasi ion Mg2+ berpengaruh besar pada proses primer annealing, denaturasi,

spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi. Proses PCR dilakukan

menggunakan alat yang disebut thermocycler (Hasibuan, 2015).

Proses PCR terdiri dari tiga tahapan utama, yaitu denaturasi, penempelan

primer (annealing), dan polimerisasi rantai DNA (elongation and extention).

Denaturasi merupakan proses pemisahan untai ganda DNA yang menjadi cetakan

(template) tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase. Berikut

keseluruhan tahapan proses PCR (Hasibuan, 2015):

1) Pra denaturasi

Awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi

DNA Polimerase (hot-start atau baru aktif setelah dipanaskan terlebih dahulu).

2) Denaturasi.

DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini

disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan

hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi

enzim tidak berjalan, misalnya aktifitasi reaksi polimerisasi sudah pada siklus

yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90C – 95C.

3) Penempelan Primer (annealing)

Primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan

primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer

dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada

15

suhu 50C – 60C. Selanjutnya, DNA polimerase akan berikatan sehingga ikatan

hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila

dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya misalnya pada 72C

4) Reaksi Polimerisasi (elongation)

Primer yang telah menempel akan mengalami perpanjangan pada sisi 3‟nya

dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan template DNA polimerase.

Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer

akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai

ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n) x.

Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi,

seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan

menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8

dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial.

PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap

siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3‟ dari

potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di

kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-

ujung 5‟-nya.

5) Ekstensi (Extention)

Dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72C) selama 5-15 menit untuk

memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara

sempurna.

6) Tahap pendinginan (Cooling down)

Tahap ini merupakan tahap terakhir setelah proses PCR berakhir berguna

untuk menurunkan suhu dari tinggi ke rendah.

2.2.1.3. Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu teknik yang berdasarkan pada pergerakan

molekul bermuatan dalam media penyanggah matriks stabil dibawah pengaruh

medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa (Gaffar, 2007;

Khotimah, 2013). Produk PCR akan dimasukkan kedalam sumur pada gel agarosa

dan diletakkan pada kutub negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunkan

larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutub positif. Kecepatan

16

migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA.

Migrasi DNA ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA

yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar,

sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran

panjangnya (Indriani, 2013).

Panjang dan bentuk DNA akan mempengaruhi migrasi DNA. Fragmen

DNA yang berukuran besar akan bermigrasi lebih lambat dibandingkan dengan

fragmen DNA yang berukuran lebih kecil. Sehingga elektroforesis dapat

memisahkan fragmen berdasarkan ukuran panjang DNA. Pada voltase rendah,

kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.

Tetapi, jika penggunaan voltase dinaikkan, mobilitas molekul DNA meningkat

secara tajam. Ini mengakibatkan pemisahan molekul DNA di dalam sel menurun

dengan meningkatnya voltase yang digunakan (Muladno, 2010; Indriani, 2013).

Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik akan

sangat sedikit dan migrasi DNA sangat lambat. Larutan buffer berkekuatan ion

tinggi akan meningkatkan panas, sehingga aliran listrik menjadi maksimal.

Larutan buffer yang digunakan adalah TAE (Tris Acetic Acid) dan TBE (Tris

Boric Acid). Larutan etidium bromide (EtBr) digunakan untuk visualisasi, larutan

tersebut akan masuk di antara ikatan hydrogen yang terletak pada DNA, sehingga

di bawah lampu UV pita fragmen DNA akan terlihat (Muladno, 2010; Indriani,

2013).

2.3. Sekuensing DNA

Produk PCR yang telah dimurnikan ditentukan urutan nukleotidanya

dengan metode sekuensing. Pada tahap sekuensing produk PCR dengan ukuran

tertentu digunakan sebagai cetakan. Primer pada tahap PCR juga digunakan dalam

sekuensing, hanya saja masing-masing primer digunakan secara terpisah dalam

satu siklus sekuensing (forward saja atau reverse saja). Berbeda dengan PCR,

produk yang dihasilkan dari sekuensing memiliki ukuran yang berbeda-beda. Hal

ini disebabkan sekuensing ditambahkan ddNTP (di-deoxyribonuclease

Triphosphat) atau dNTP terminator yaitu modifikasi dari dNTPs dengan

menghilangkan gugus 3’- OH pada ribosa yang dilabel dengan zat warna.

Terminator ini pada satu siklus akan berikatan secara acak dan menghentikan

17

proses pembacaan. Pada tiap basa terminator (ddATP, ddGTP, ddCTP, atau

ddTTP), terdapat zat warna fluoresen yang dapat menyerap panjang gelombang

yang berbeda sehingga basa terminator akan dapat dibaca dengan fluorometri

(Sukartiningrum, 2012).

Sekuens DNA terbentuk dari hasil pensejajaran pembacaan primer reverse

dan forward dan umumnya disebut sebagai sekuens konsensus (consensus

sequence). Sekuens konsensus ini kemudian dibandingkan dengan data sekuens

yang tersedia di database menggunakan software tertentu. Proses pembandingan

ini disebut dengan proses Basic Local Alligment Search atau BLAST (Tindi

dkk.,2017). Beberapa sistem dapat menentukan urutan nukleotida melalui

pembacaan satu primer, namun pembacaan dengan dua primer memberikan hasil

yang lebih akurat. Situs yang digunakan untuk membandingkan sekuens 16S

rRNA adalah National Center for Biotechnology Information, National Institute

for Health, USA yang kemudian akan dideposit ke GenBank (Madilana dkk.,

2018).

2.4. Hubungan Kekerabatan dengan Filogenetika

Banyak penelitian filogenetik telah lama menggunakan karakter morfologi.

Beriring dengan pesatnya perkembangan teknik dan teknologi di dalam biologi

molekuler, seperti Polymerase Chain Reaction (PCR) dan sequencing DNA,

penggunaan sekuen DNA dalam penelitian filogenetik telah meningkat pesat dan

telah dilakukan pada semua tingkatan taksonomi, misalnya famili, ordo, dan

spesies. Filogenetik molekuler menggabungkan teknik biologi molekuler dengan

statistik untuk merekonstruksi hubungan filogenetik (Hidayat dkk., 2008).

Filogenetik digambarkan sebagai klasifikasi secara taksonomi dari

organisme berdasarkan pada sejarah evolusi mereka, yaitu filogeni mereka dan

merupakan bagian integral dari ilmu pengetahuan yang sistematik dan mempunyai

tujuan untuk menentukan hubungan antar kelompok dari organisme berdasarkan

pada karakteristik dan sifat mereka. Filogenetik adalah pusat dari evolusi biologi

seperti penyingkatan semua paradigma dari cara organisme hidup dan

berkembang di alam (Dharmayanti, 2011).

Konstruksi pohon filogenetik merupakan hal yang terpenting dan menarik

dalam studi evolusi. Terdapat beberapa metode untuk mengkonstruksi pohon

18

filogenetik dengan data molekuler yaitu nukleotida atau asam amino. Analisis

filogenetik dari kelompok atau keluarga sekuen nukleotida atau asam amino

merupakan analisis untuk menentukan bagaimana keluarga tersebut diturunkan

selama proses evolusi. Hubungan evolusi diantara sekuen digambarkan dengan

menempatkan sekuen sebagai cabang luar dari sebuah pohon. Hubungan cabang

pada bagian dalam pohon mengambarkan tingkat dimana sekuen yang berbeda

saling berhubungan. Dua sekuen yang sangat mirip akan terletak sebagai

neighboring outside dari cabang-cabang dan berhubungan dalam cabang umum

(Common branch) (Mount, 2001; Dharmayanti, 2011).

Pemikiran dasar penggunaan sekuen DNA dalam studi filogenetik adalah

bahwa terjadi perubahan basa nukleotida menurut waktu, sehingga akan dapat

diperkirakan kecepatan evolusi yang terjadi dan akan dapat direkonstruksi

hubungan evolusi antara satu kelompok organisme dengan yang lainnya.

Beberapa alasan penggunaan sekuen DNA, yang pertama yaitu DNA merupakan

unit dasar informasi yang mengkode organisme. Kedua DNA lebih memudahkan

dalam mengekstrak dan menggabungkan informasi mengenai proses evolusi suatu

kelompok organisme, sehingga mudah untuk dianalisis. Ketiga DNA dapat

memudahkan dalam pembuatan model dari peristiwa evolusi secara komparatif.

Dan alasan keempat yaitu DNA menghasilkan banyak informasi yang beragam,

dengan demikian akan ada banyak bukti tentang kebenaran suatu hubungan

filogenetik (Hidayat dkk., 2008).

Analisis filogenetik sekuen asam amino dan protein biasanya akan menjadi

wilayah yang penting dalam analisis sekuen. Selain itu, dalam filogenetik dapat

menganalisis perubahan yang terjadi dalam evolusi organisme yang berbeda.

Berdasarkan analisis, sekuen yang memiliki hubungan yang dekat dapat

diidentifikasi dengan menempati cabang yang bertetangga pada pohon. Saat

keluarga gen ditemukan dalam organisme atau kelompok organisme, hubungan

filogenetik diantara gen dapat memprediksikan kemungkinan yang satu

mempunyai fungsi yang ekuivalen. Prediksi fungsi ini dapat diuji dengan

eksperimen genetik. Analisis filogenetik juga digunakan untuk mengikuti

perubahan yang terjadi secara cepat yang mampu mengubah suatu spesies, seperti

virus (Dharmayanti, 2011).

19

Ketika sekuen nukleotida atau protein dari dua organisme yang berbeda

memiliki kemiripan, maka mereka diduga diturunkan dari sekuen common

ancestor. Sekuen penjejeran akan menunjukkan dimana posisi sekuen adalah tidak

berubah/conserved dan dimana merupakan divergent atau berkembang menjadi

berbeda dari common ancestor. Pada studi sekuen penjejeran sekuen atau

alignment adalah hal yang tidak dapat dihindarkan. Tujuan dari proses penjejeran

adalah mencocokkan karakter-karakter yang homolog, yaitu karakter yang

mempunyai nenek moyang yang sama. Ketika menghomologikan sekuen, kolom

dari penjejeran dapat digunakan untuk berbagai macam aplikasi seperti

mengidentifikasi residu dengan struktur yang analog atau yang mempunyai fungsi

yang serupa atau untuk mengkonstruksi pohon filogenetik. Akurasi dari program

penejejeran sekuen yang lebih dari dua set/multiple sequence alignment telah

dihasilkan oleh berbagai macam studi komperatif (Blackshields dkk., 2006; Edgar

dan Batzoglou 2006; Notredame, 2007; Kemena dan Notredame, 2009;

Dharmyanti, 2011).

Metode paling umum dalam melakukan multiple sequence alignment.

Pertama melakukan penjejeran kelompok sekuen yang mempunyai hubungan

dekat dan kemudian secara sekuensial ditambahkan sekuen yang berhubungan

namun lebih berbeda. Penjejeran yang diperoleh diakibatkan karena sebagian

besar sekuen yang mirip dalam kelompok sehingga tidak merepresentasikan

sejarah yang sesungguhnya dari perubahan evolusi yang telah terjadi. Banyak

metode analisis filogenetik yang mengasumsikan bahwa masing-masing posisi

sekuen protein atau asam nukleat yang berubah secara independen satu sama yang

lain, kecuali evolusi sekuen RNA (Dharmayanti, 2011).

Seringkali hasil penjejeran sekuen memperlihatkan adanya gap yang

ditandai garis-garis dalam penjejeran tersebut. Gap menunjukkan adanya insersi

atau delesi dari satu atau lebih dari karakter sekuen selama evolusi. Sekuen dalam

struktur core seperti protein tidak mengalami insersi atau delesi dikarenakan

subtitusi asam amino harus cocok dengan lingkungan paket hidrofobik dari core.

Gap jarang ditemukan pada multiple sequence alignment yang menunjukkan

sekuen core. Beberapa variasi termasuk insersi, delesi sangat mungkin ditemukan

di daerah loop pada bagian luar struktur tiga dimensi, sebab pada bagian ini tidak

20

berpengaruh banyak terhadap struktur core. Daerah loop berinteraksi dengan

molekul kecil, membran dan protein lain dilingkungan (Mount, 2001;

Dharmayanti, 2011).

Gap dalam penjejeran merepresentasikan perubahan mutasi dalam sekuen

termasuk insersi, delesi atau penyusunan ulang materi genetik. Ekspektasi bahwa

panjang gap dapat terjadi sebagai akibat adanya introduksi tunggal yang

memutuskan berapa banyak perubahan individu telah terjadi dan apa perintahnya.

Beberapa program filogenetik memberikan Gap, tetapi tidak ada clear-cut model

seperti bagaimana seharusnya mereka diperlakukan. Beberapa metode

mengabaikan gap yang terjadi atau hanya memfokuskan dalam penjejeran yang

tidak mempunyai gap. Walaupun gap dapat berguna untuk petanda filogenetik di

beberapa situasi. Pendekatan lainnya untuk menangani gap adalah mencegah

analisis situs individu dalam penjejeran sekuen, dan menggantikan dengan

menggunakan skoring kemiripan atau similarity score sebagai dasar dari analisis

filogenetik (Dharmayanti, 2011).

2.4.1.Konstruksi Pohon Filogenetik

Pohon filogenetik adalah sebuah grafik dua dimensi yang menunjukkan

hubungan diantara organisme atau lebih spesifik lagi adalah sekuen gen dari

organisme. Pemisahan sekuen disebut taxa (atau taxon jika tunggal) yang

didefinisikan sebagai jarak filogenetik unit pada sebuah pohon. Pohon terdiri dari

cabang-cabang luar (outer branches) dan daun-daun (leaves) yang

merepresentasikan taxa dan titik-titik (nodes) dan cabang merepresentasikan

hubungan diantara taxa. Hal ini sangat penting untuk mengenali bahwa masing-

masing titik dalam pohon direpresentasikan sebuah pemisahan garis evolusi gen

ke dalam dua spesies yang berbeda (Dharmayanti, 2011).

Panjang masing-masing cabang pada titik berikutnya menunjukkan jumlah

sekuen yang berubah yang terjadi sebelum level pemisahannya. Total panjang

semua cabang dalam pohon disebut sebagai panjang pohon. Pohon yang juga

bercabang dua atau binary tree, mempunyai dua cabang yang berasal dari masing-

masing titik. Situasi ini adalah satu dari yang diperkirakan selama evolusi, dan

hanya memisahkan spesies baru pada waktu itu. Pohon dapat mempunyai lebih

dari satu cabang yang berasal dari sebuah titik jika pemisahan taxa juga

21

sedemikian dekat sehingga mereka tidak dapat dipecahkan atau menjadi pohon

yang sederhana (Dharmayanti, 2011).

Konstruksi pohon filogenetik dapat diklasifikasikan menjadi 2 kategori yang

digunakan sebagai strategi untuk menghasilkan pohon filogenetik terbaik.

Kategori pertama adalah memeriksa keseluruhan atau sejumlah besar

kemungkinan pohon filogenetik dan memilih satu yang terbaik dengan kriteria-

kriteria tertentu. Biasanya disebut dengan metode exhaustivesearch. Metode

maximum parsimony, Fitch Margoliash dan maximum likehood termasuk dalam

kategori ini. Kategori yang kedua adalah memeriksa hubungan topologi lokal dari

pohon dan mengkonstruksi pohon terbaik deng an langkah demi langkah. Metode

Neighbor-joining dan beberapa metode Distance lainnya adalah termasuk dalam

kategori yang kedua ini (Dharmayanti, 2011).

Software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) yang

diciptakan oleh Masatoshi Nei pada tahun 1993 sering digunakan untuk

mengkonstruksi pohon filogenetik. Metode yang sering digunakan pada software

ini adalah neighbor-joining. Metode ini menggunakan cara mengkombinasi

sekuen-sekuen untuk mendefinisikan cabang-cabang pohon yang diprediksikan

dan untuk menghitung panjang-panjang cabang dari pohon (Dharmayanti, 2011).

Metode neighbor-joining digunakan ketika rata-rata evolusi dari pemisahan

lineage adalah di bawah pertimbangan yang berbeda-beda. Ketika panjang cabang

dari pohon yang diketahui topologinya berubah dengan cara menstimulasi tingkat

yang bervariasi dari perubahan evolusi, metode neighbor-joining adalah yang

paling sesuai untuk memprediksi pohon dengan benar. Neighbor-joining

menyeleksi sekuen yang jika digabungkan akan memberikan estimasi terbaik dari

panjang cabang yang paling dekat merefleksikan jarak yang nyata diantara

sekuen. Program ClustalW digunakan pada neighbor-joining distance method

sebagai panduan untuk multiple sequence alignment. (Dharmayanti, 2011). Huruf

W pada ClustalW memiliki kepanjangan weighting yang berarti memiliki

kemampuan untuk menyediakan bobot pada sekuen dan parameter program

(Mount, 2004).

Akar pada pohon menggambarkan titik percabangan pertama atau asal dari

masing-masing populasi dengan anggapan bahwa laju evolusi berjalan konstan.

22

Pola percabangan pohon dibentuk berdasarkan jarak matrik antar pasangan

populasi yang dapat menggambarkan fusi genetik yang terjadi pada kelompok

tersebut. Panjang cabang menggambarkan jumlah substitusi basa yang dapat

berupa polimorfisme DNA atau haplotipe. Metode pengolahan data yang dipakai

harus sesuai dengan set data yang ada, agar menghasilkan pola percabangan

(topologi) serta panjang cabang yang benar. Kesalahan dalam mengkonstruksi

pohon filogenetika dapat diperkecil dengan dilakukan sampling ulang pertanda

genetik lain pada sampel yang sama dan kemudian membandingkan kedua

gambaran pohon tersebut. Tindakan tersebut membutuhkan biaya besar sehingga

hampir tidak mungkin dilakukan. Sebagai gantinya pada tahun 1979 Efron

menemukan metode sampling ulang (resampling) dari data yang telah ada yang

dikenal dengan analisis bootstrap. Analisis Bootstarp merupakan metode untuk

menguji seberapa baik set data model atau penyusunan cabang dalam prediksi

pohon filogenetik dengan resampled dari kolom multiple sequence aligment untuk

membentuk beberapa penjejeran baru (Dharmayanti, 2011).

23

2.5. Kerangka Teori

Gambar 1. Kerangka Teori

Puskesmas

Limbah medik Limbah non medik

Pensejajaran Sekuens (BLAST)

Sistematika molekuler

Bakteri sebagai agen bioremediasi

Filogenetika

Bakteri non patogen atau patogenitas rendah

Bakteri peghasil enzim proteolitik

Limbah biomedik

Identifikasi Molekuler:

Isolasi DNA

PCR

Elektroforesis

Gen 16S rRNA

24

2.6. Kerangka Konsep

Gambar 2. Kerangka Konsep

2.7. Hipotesis

Identitas molekuler dan hubungan filogenetik beberapa isolat berpotensi

sebagai agen bioremediasi berdasarkan analisis gen 16SrRNA Puskemas

Halmahera dan Puskesmas Tlogosari Kulon dapat diketahui.

Bakteri limbah puskesmas

yang berpotensi sebagai

agen bioremediasi

Sistematika dan filogenetika

molekuler berdasarkan

analisis gen 16S rRNA

25

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Jenis Penelitian

Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian deskriptif. Penelitian

deksriptif merupakan penelitian yang bertujuan untuk menggambarkan atau

mendeskripsikan fenomena yang ditemukan, baik berupa faktor resiko maupun

suatu efek atau hasil (Arikunto, 2010).

3.2. Tempat dan Waktu

Tempat penelitian akan dilaksanakan di Laboratorium Oseanografi Fakultas

Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK) Universitas Diponegoro, Semarang dan

pelaksanaan penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari – Februari 2019.

3.3. Definisi Operasional

Variabel yang digunakan dalam penelitian ini dapat didefinisikan sebagai

berikut:Tabel 2. Definisi Operasional Variabel

No. Variabel Definisi

1. Bakteri yang berpotensi

sebagai agen bioremediasi

dengan patogenitas rendah

atau non patogen

Bakteri hidrolitik yang mampu menghasilkan enzim

lipase dan protease dengan sifat patogenitas rendah

atau non patogen

2. Gen 16SrRNA Potongan gen 16S ribosome deoxyribonucleic acid

pada bakteri yang digunakan untuk identifikasi

molekuler

3. Pohon Filogenetik Suatu gambaran mengenai hubungan atau

kekerabatan antar mahluk hidup

3.4. Objek Penelitian

Objek dari penelitian ini adalah isolat bakteri hidrolitik yang berpotensi

sebagai agen bioremediasi yaitu bersifat non patogen atau patogenitas rendah dan

mampu menghasilkan enzim lipase dan protease. Objek merupakan bakteri yang

berasal dari bak primer penampungan limbah Puskesmas Halmahera Kota

26

Semarang dan Puskesmas Tlogosari Kulon (Afriani dkk.,2018; Sabrina

dkk.,2018).

3.5. Alat dan Bahan

3.5.1.Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan digital, cawan

petri, erlenmeyer 250ml, autoclave, microwave, biosafety cabinet, ose bulat,

spirtus, plastik wrap, inkubator, tisu, mikrotube eppendorf 1,5 ml dan 0,2 ml, blue

tip, white tip, mikropipet, mikro-centrifuge, vortex, isotemp block heater,

Spektrofotometer NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)., thermalcycle, botol duran

100 ml, cetakan dan sisir gel, alat elektroforesis, power supply, UV transluminator

dan software MEGA X.

3.5.2.Bahan

Bahan yang dipakai dalam penelitian ini adalah isolat bakteri dari

Puskesmas Halmahera Kota Semarang dan Puskesmas Tlogosari Kulon yang

berpotensi sebagai agen bioremediasi (Afriani, 2018; Sabrina 2018) yang

tersimpan di laboratorium Oseanografi Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

(FPIK) Universitas Diponegoro, media Nutrient Agar (NA), aquadest, alkohol

70%, ddH2O, saponin 0.5%, Phospate Buffer Citrate (PBS), Chelex 20%, primer

27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) dan primer 1492R (5’-

TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’), mastermix bioline, biology molecular

agarose marker, buffer Tris-Acetic acid EDTA (TAE), Ethidium Bromide (EtBr).

3.6. Prosedur Penelitian

3.6.1. Subkultur Isolat Bakteri

Untuk membuat media NA, Cawan petri dibungkus dengan kertas. Serbuk

agar bacteriological Lp 0011 ditimbang sebanyak 1,5 g dan Nutrient broth agar

1,3 g kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan aquadest

sebanyak 100 ml. Erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil, di-autoclave selama

20 menit dengan suhu 121C. Setelah selesai cawan petri kemudian di-microwave

dengan kekuatan high (150-200C) selama 3-5 menit, ditunggu hingga dingin.

Agar dituang ke dalam cawan pertri didalam Biosafety cabinet yang sudah

dibersihkan. Setelah agar padat isolat bakteri murni hasil isolasi penelitian

sebelumnya (Afriani, 2018; Sabrina, 2018), diambil dengan ose bulat goreskan

27

pada media, dimasukkan ke dalam inkubator selama satu hari dengan suhu 35-

37C. Kemudian media diperiksa adanya kontaminasi atau tidak (Lestari dkk.,

2018).

3.6.2. Isolasi DNA Metode Chelex

Sel bakteri dari koloni yang sudah murni tanpa kontaminasi pada media

diambil secukupnya dengan ose bulat dan dicampurkan dalam eppendorf 1,5 ml

yang sudah ditambahkan 50-100 l ddH2O. Kemudian diambil 1l saponin 0.5%

dicampurkan dengan vortex dan didiamkan selama 1 malam dengan suhu 4C.

Sampel di-centrifuge dengan kecepatan 12000 RPM selama 5 menit, supernatant

dibuang. Menambahkan 100 l ddH2O dan 50 l chelex 20%, direbus dengan

isotemp block heater selama 10 menit dengan suhu 95C dan setelah 5 menit

pertama di-vortex. Selanjutnya centifuge dengan kecepatan 12000 rpm selama 5

menit. Supernatan dipindah ke eppendorf yang bersih dan steril. Konsentrasi DNA

diukur dengan menggunakan Spektrofotometer NanoDrop 2000 (Thermo

Scientific) dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Hasil ekstraksi DNA

disimpan dalam freezer dengan suhu -20C (Madilana dkk., 2018)

3.6.3. Polymerase Chain Reaction (PCR) 16S rRNA

Primer 27F ditambahkan ke dalam eppendorf 0,2 ml sebanyak 1 l dan

Primer 1492R sebanyak 1 l pada dasar eppendorf. DNA template ditambahkan

sebanyak 3 l, ddH2O sebanyak 7,5 l dan mastermix bioline 12,5 l. Kemudian

thermocycle diatur dengan tahap awal atau pra-denaturation 96C selama 1 menit,

denaturation 96C selama 15 detik, annealing 55C selama 15 detik, elongation

72C selama 10 detik, extention 72C selama 12 menit, dengan siklus sebanyak 34

kali dan cooling down 4C (Madilana dkk., 2018).

3.6.4. Elektroforesis

Serbuk agarose ditimbang sebanyak 0,3 g masukkan ke dalam botol duran

100 ml larutkan dengan 30 ml buffer TAE, di-microwave selama 3-5 menit dengan

suhu high (150-200C) hingga mendidih, ditunggu hingga agak dingin, larutan gel

dimasukkan kedalam cetakan gel. Jika sudah padat atau keras sisir dan penutup

cetakan dilepas dengan hati hati. Gel dimasukkan kedalam chamber alat

elektroforesis, ditambahkan buffer TAE hingga menggenangi gel. Kemudian

marker dan produk PCR dimasukkan ke dalam setiap sumuran yang berbeda

28

sebanyak 5l. Alat elektroforesis ditutup dan kabel dipasang sesuai warna pada

alat elektroforesis maupun power supply. Kabel merah untuk arus positif dan kabel

hitam untuk arus negatif. Power supply diatur selama 25 menit dengan tegangan

100 volt. Setelah itu gel diambil dan direndam dengan EtBr selama 15 menit

ditempat gelap, gel diletakkan di dalam UV transluminator untuk mengamati ada

tidaknya gen pada produk PCR (Lestari dkk., 2018).

3.6.5. Skuensing DNA

Produk PCR dikemas dan dikirim ke PT. Genetica Science Jakarta untuk

dianalisis skuens 16S rRNA. Kemudian hasil pelacakan melalui program database

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) pada National Center for

Biotechnology Information, National Institute for Health, USA

(www.ncbi.nlm.nih.gov) dideposit ke GenBank untuk memperoleh nomer akses

(Madilana dkk., 2018).

3.6.6. Konstruksi Pohon Filogenetik

Membuat pohon filogenetik dengan hasil sekuens 16S rRNA menggunakan

software MEGA X (Kumar dkk., 2016; Yusmalinda dkk., 2017).

29

3.7. Alur Penelitian

Gambar 3. Alur Penelitian

3.8. Teknik Pengumpulan dan Analisan Data

Pada penelitian ini menggunakan teknik pengumpulan data secara

observasional yaitu data yang didapat langsung dari hasil pengamatan pada

penelitian.

Subkultur isolat bakteri

Isolasi DNA dengan metode Chelex

Amplifikasi PCR 16S rRNA

Produk dari PCR 16S rRNA dikirim dan dianalisis sekuen DNA di PT. Genetika Science (Jakarta, Indonesia)

Hasil pelacakan melalui program database Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) pada National Center for

Biotechnology Information, National Institute for Health, USA (www.ncbi.nlm.nih.gov) dideposit ke GenBank untuk

memperoleh nomer akses.

Konstruksi pohon filogenetik beberapa sekuens 16S rRNA dengan MEGA X

30

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Isolat yang berpotensi sebagai agen bioremediasi yaitu H1, H3, H5

(Puskesmas Halmahera Kota Semarang) dan T3 (Puskesmas Tlogosari Kulon)

dilakukan pengamatan secara mikroskopis untuk mengetahui morfologi sel yaitu

dengan pengecatan gram dan makroskopis untuk mengetahui morfologi koloni

dengan pengamatan pada media Nutrient Agar (NA). Hasil pengamatan secara

mikroskopis dan makroskopis isolat H1, H3, H5 dan T3 dapat dilihat pada tabel 3

dan 4 sebagai berikut: Tabel 3. Morfologi Sel (Arifiani, 2018; Sabrina, 2018)

Nama Isolat Kode Isolat Bentuk Susunan Hasil Pengecatan Gram

H1 1.A-3.1 Basil Soliter Gram-negative

H3 1.A-3.3 Basil Pendek Soliter Gram-negative

H5 2.A-3.2 Basil Pendek Berderet Gram-negative

T3 B.100.3 Basil Soliter Gram-negative

Tabel 4. Morfologi Koloni

Nama Isolat Bentuk Warna Ukuran (cm) Tepi Elevasi

H1 Round Putih keruh 0,2 Entire Convex

H3 Round Kuning 0,1 Entire Convex

H5 Round Kuning terang 0,2 Entire Convex

T3 Round Putih 0,25 Entire Raised

Tabel 3 hasil dari pengecatan gram menunjukkan keempat isolat merupakan

bakteri gram-negative. Isolat H1 dan T3 berbentuk basil, isolat H3 dan H5

berbentuk basil pendek. Isolat H1, H3 dan T3 memiliki susunan soliter sedangkan

H5 memiliki susunan berderet. Pada tabel 4 hasil dari pengamatan pada media

Nutrient Agar (NA) semua bakteri memiliki bentuk koloni round dengan tepi

entire.

Uji patogenitas telah dilakukan pada penelitian sebelumnya yaitu

menggunakan media MacConkey (MC) dan media Blood Agar Plate (BAP) 5%

darah domba. Bakteri bersifat non patogen yaitu bakteri yang mampu

31

menfermentasikan laktosa pada media MC ditandai dengan perubahan warna pada

media yang ditumbuhi koloni menjadi merah jambu. Media BAP digunakan untuk

menggolongkan bakteri berdasarkan tipe hemolisa. Bakteri non patogen

merupakan bakteri dengan tipe γ-hemolisis yaitu tidak mampu menghemolisikan

darah yang ditandai dengan tidak adanya perubahan warna pada media di area

atau zona sekitar koloni yang tumbuh (Arifiani, 2018; Sabrina, 2018).

Keempat bakteri ini kemudian ditanam pada media tributirin untuk

mengetahui bakteri dapat meghasilkan enzim lipase dan media Skim Milk Agar

(SMA) untuk mengetahui bakteri dapat meghasilkan enzim protease. Penanda

positif yaitu apabila terdapat adanya zona bening pada media (Arifiani, 2018;

Sabrina, 2018). Hasil pengamatan uji patogenitas beserta uji penghasil enzim

lipase dan protease isolat H1, H3, H5 dan T3 dapat dilihat pada gambar dan tabel

sebagai berikut:

(A)

H1 H3 H5 T3

(B)

H1 H3 H5 T3

Gambar 4. Uji Patogenitas media MC (A) dan BAP (B) (Arifiani, 2018; Sabrina, 2018)

Tabel 5. Uji Patogenitas (Arifiani, 2018; Sabrina, 2018)

Nama Isolat Kode Isolat MC BAP

H1 1.A-3.1 Non Laktosa Fermenter γ-hemolisis

H3 1.A-3.3 Laktosa Fermenter γ-hemolisis

H5 2.A-3.2 Laktosa Fermenter γ-hemolisis

T3 B.100.3 Non Laktosa Fermenter γ-hemolisis

32

(A)

T3 H1, H3, H5

(B)

H1, H3, H5Gambar 5. Inokulasi pada media tributirin (A) dan SMA (B) (Arifiani, 2018; Sabrina, 2018)

Tabel 6. Uji penghasil enzim lipase dan protease (Arifiani, 2018; Sabrina, 2018)Nama Isolat Kode Isolat Media Tributirin Media SMA

H1 1.A-3.1 - Terdapat zona bening

H3 1.A-3.3 - Terdapat zona bening

H5 2.A-3.2 Terdapat zona bening -

T3 B.100.3 Terdapat zona bening Terdapat zona bening

Tabel 5 dan gambar 4 diatas menunjukkan bahwa isolat H1 dan T3

merupakan bakteri dengan patogenitas rendah karena tidak mampu menfermentasi

laktosa namun kedua bakteri ini memiliki tipe γ-hemolisisa, H3 dan H5

merupakan bakteri dengan patogenitas lebih rendah karena mampu

menfermentasikan laktosa dan bakteri dengan tipe γ-hemolisis Tabel 6 dan

gambar 5 menunjukkan isolat H1 dan H3 merupakan bakteri penghasil enzim

lipase, isolat H5 merupakan bakteri penghasil enzim protease dan isolat T3

merupakan bakteri yang mampu menghasilkan enzim lipase dan protease

sekaligus.

4.1.1.Subkultur Isolat Bakteri

Subkultur isolat bakteri proses bertujuan untuk membuat bakteri menjadi

murni dan baru sehingga dapat digunakan dalam proses isolasi DNA (Lestari dkk.,

2018). Media yang digunakan yaitu media Nurtient Agar (NA). Hasil inokulasi

subkultur keempat isolat bakteri dapat dilihat pada gambar 6 sebagai berikut:

33

H1 H3 H5 T3

Gambar 6. Subkultur 4 Isolat Bakteri (dokumentasi pribadi)

Gambar 6 merupakan hasil inokulasi subkultur 4 isolat bakteri pada media

Nutrient Agar yang masih berumur satu hari. Gambar 6 juga menunjukkan tidak

adanya kontaminasi sehingga dapat dilanjutkan ke tahap berikutnya yaitu isolasi

DNA.

4.1.2. Isolasi DNA

Isolasi DNA pada penelitian ini menggunakan metode chelex. Metode ini

bertujuan untuk mengekstrasi DNA telah dikembangkan untuk memisahkan

protein dan materi seluler lainnya dari molekul DNA (Yoshepi, 2010). Hasil isolasi

kemudian diperiksa konsentrasi kemurniannya menggunakan NanoDrop 2000

(Thermo Scientific) dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian

hasil isolasi DNA keempat isolat bakteri dapat dilihat pada tabel 7 berikut init:Tabel 7. Konsentrasi kemurnian DNA per 1l dengan menggunakan NanoDrop 2000

Nama Isolat Konsentrasi Asam

Nukleat (g/ml)

A260 A280 Rasio Absorbansi

Kemurnian

H1 36,3 0,726 0,346 2,10

H3 191,2 3,824 2,111 1,81

H5 2,6 0,051 0,069 0,75

T3 56,6 1,131 0,651 1,74

Tabel 7 menunjukkan bahwa rasio rata - rata kemurnian dari isolasi DNA 4

isolat yaitu 0,75 – 2,10. Hasil Isolasi DNA dikatakan murni apabila rasio

absorbansi 260/280 berkisar antara 1,8 – 2,0 (Mulyani dkk., 2011). DNA template

34

isolat H3 memiliki konstentrasi paling tinggi yaitu 191,2 g/ml dan H5 memiliki

konsentrasi terendah yaitu 2,6 g/ml.

4.1.3.PCR 16S rRNA dan Elektroforesis

Setelah Isolasi DNA dilanjutkan dengan tahap Polymerase Chain Reaction

(PCR) suatu teknik untuk amplifikasi atau perbanyakan DNA secara enzimatik

menggunakan primer dari potongan urutan basa tertentu (Sukartiningrum, 2012).

Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA pada penelitian ini yaitu:

a. Primer Forward: 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)

b. Primer Reserve: 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)

Selain primer bahan yang digunakan yaitu mastermix dengan merek bioline.

Mastermix adalah campuran buffer PCR MgCl2 yang mengandung ion Mg2+, taq

DNA polimerase, dNTPs yaitu blok pembangun asam nukleat yang terdiri dari

dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Alat yang digunakan pada proses PCR adalah

thermocycle (Hasibuan, 2015). Sebelumnya diatur dengan tahap awal atau pra-

denaturation 96C selama 1 menit, tahap DNA menjadi single helix atau

denaturation 96C selama 15 detik, penempelan primer atau annealing 55C

selama 15 detik, elongation 72C selama 10 detik, extention 72C selama 12

menit, dengan siklus sebanyak 34 kali dan tahap terakhir yaitu pendinginan atau

cooling down 4C dengan waktu yang tak terbatas.

Produk PCR kemudian diperiksa keberadaan gen dan ukuran basa

nukleotidanya dilakukan dengan elektroforesis yaitu suatu teknik yang

berdasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyanggah

matriks stabil dibawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan

adalah gel agarosa (Gaffar, 2007; Khotimah, 2013). Produk PCR dimasukkan

kedalam sumur pada gel agarosa yang berada pada kutub negatif. Kemudian hasil

elektroforesis dilihat pada alat UV transluminator. Gambar berikut merupakan

hasil visualisasi gel agarose dengan sinar UV dari produk PCR keempat isolat

bakteri:

35

Gambar 7 Visualisasi Hasil Elektroforesis dengan UV Transluminator

Pada gambar 7 menunjukkan bahwa hasil amplifikasi berdasarkan ukuran

pita marker 4 isolat bakteri memiliki ukuran ≥1000 bp. Pita atau band DNA isolat

H5 merupakan band yang paling tipis dan band DNA isolat H3 yang paling tebal

dan tampak jelas diantara isolat lainnya.

4.1.4.Sekuensing dan Basic Local Alligment Search Tools (BLAST)

Produk PCR 16S rRNA dikirim ke PT. Genetika Science yang berada di

Jakarta, Indonesia untuk analisis sekuens atau urutan basa nukeotida. Kemudian

sekuens gen 16S rRNA dari kedua primer forward dan reserve disejajarkan

(Dharmayanti, 2011). Tahap editing sekuen ini dilakukan dengan software MEGA

X. Berikut merupakan urutan basa nukleotida 4 isolat bakteri:

a. Sekuens isolat H1 dengan panjang basa nukeotida 1405 bpAGGTTACTTCGGTAACTGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACCTTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCTTCTTGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTCCTAAAGTCGGATTAAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGGCCCTACCAAGGCGGACGATCTGTAGCGGGTCTTGAGAGGATGATTCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTTAAGCGAGGAGGAGGCTCCTTTAGTTAATACCTAAAGTGAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTTTTAAGTCGGATGTGAAATCCCTGAGCTTAACTTAGGAATTGCATTCGATACTGGAAAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAAAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAAGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGT

36

GGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACTAAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTAGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCCTGTCCTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGGGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCATCGGGTCAAGCCGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACAACTTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGTTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTCGCGAGAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGCTACC

b. Sekuens isolat H3 dengan panjang basa nukeotida 1416 bpTGCAGTCGAACGGCAGCACAGTAAGAGCTTGCTCTTACGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATGCATCGGAATCTACTCTGTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGCCCGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAGAGCCCACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAAAGCATTCGGTTAATACCCGATTGTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTGTTTAAGTCTGTCGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAATTGCGATGGAAACTGGGCGACTAGAGTGTGGCAGAGGGTAGTGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGACTGCCTGGGCCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTGGGCCTTGACATGCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACCGTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTGAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTGCC

c. Sekuens isolat H5 dengan panjang basa nukeotida 1393 bpTCTTATTAGTTGCGAACGGGTGAATAGCTGAGGAATGACCTGCCCTCTACTCTGGGATGGGGGTGGACAACTGGAACTATTCCCTGATAGGAGCGTCCACCTAATGGTGGGTGTTGGAAATCTTCGGACCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGCCCGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAGAGCCCACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAAAGCATTCGGTTAATACCCGATTGTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCAGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTGTTTAAGTCTGTCGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAATTGCGATGGAAACTGGGCGACTAGAGTGTGGCAGAGGGTAGTGGAATTCCTGGTGTAGCACTGAAATGCCTAAAGATCAGGAGGAACATCCGTGGTCGAAGGCGACTGCCTGGGCCAACACTGACACTGAGGCACGAAACCCTGGGGAGCAAACACGATTACATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGAGTGCAATTTGGCACGCACTATCCAAGCTAACTCGTTAAGTTCGTCTCCTGCTCGTGTCGTGAGAAGTTGGGTTAAATTCCGCCACGAACGCCACCCTTGTTCCATGTTTCCAACCAGTTGTGGGGGGGACTCATGGGAGACCCCCGGGGTCCAATCGGGGGGAAGGGAGGGAGGCGTCCAATTCTCCTTCCCCCTATGTCCCAGGGTTCCCCCATGCTACAAATGGTAGGGCAAGAGG

37

GTGGCAAACTGTGAGGGGAACCCTCCCCAGAAACCCTATTTCAGTCCGGAGGGAGTCTGCCTTCGACCCATGGTCGGAAATCGCTAGTTATCAGATATCAGCATTTGCGGGAAATACGCCCGGGCCCGGCCACCGCCCGTCAAGTCCCAAAAAGTGTGACCCCCGGAACCAGGTACCTTACCCTCTGGAGGACCCTCGCACGTGACCCCCATTTTCT

d. Sekuens isolat T3 dengan panjang basa nukeotida 1389 bpTGCAGTCGAGCGGGGTTTTCGGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCGTAGGAAGCTACCCGATAGAGGGGGATACCAGTTGGAAACGACTGTTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGTGTGGGACCTTCGGGCCACATGCTATCGGATGCGCCTACGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAGGAAGAGTTGAGTGTTAATAGTACTCAGCTTTGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGTTTTTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGAAACTGGAAAACTAGAGTGTGTGAGAGGGGGGTAGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGCACAACACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGCTGTTCGTGGTCTTGTACTGTGAGTAGCGCAGCTAACGCACTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAAGACTGCAGAGATGCGGTTGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCCCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTATGTACAGAGGGAGGCAAGCTGGCGACAGTGAGCGGATCTCTTAAAGCATATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAAATCAGAATGTTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTACCACTTTGGAT

Sekuens DNA terbentuk dari hasil pensejajaran pembacaan primer reverse

dan forward dan umumnya disebut sebagai sekuens konsensus (consensus

sequence). Sekuens konsensus ini kemudian dibandingkan dengan data sekuens

yang tersedia di database menggunakan software tertentu (Madilana dkk., 2018).

Hasil analisis sekuens gen 16S rRNA dilacak kesamaan atau homologi terhadap

sekuens 16S rRNA milik bakteri lainnya yang ada pada GenBank dengan program

BLAST pada www.ncbi.nih.gov.blast. Seluruh data sekuens bakteri dan bakteri

pembanding yang akan dihubungkan kekerabatannya di multiple sequence

alignment dengan program ClustalW kemudian disimpan dalam format MEGA

(*.mega) atau FASTA (*.fasta). Hasil dari Basic Local Alignment Search Tools

(BLAST) keempat isolat bakteri dapat dilihat pada tabel 8 sebagai berikut:Tabel 8. Hasil BLAST 4 isolat bakteri

Nama Acession Ukuran basa Kedekatan spesies Persentase

38

Isolat Number nukleotida (bp) kemiripan (%)

H1 LC482255 1405 Acinetobacter schindleri 98,01

H3 LC482254 1416 Stenotrophomonas maltophilia 99,79

H5 LC482253 1393 Stenotrophomonas acidaminiphila 97,69

T3 LC482252 1389 Pararheinheimera aquatica 98,85

Pada tabel 8 menunjukkan bahwa isolat H1 mempunyai kemiripan sebanyak

98,01% dengan Acinetobacter schindleri. Isolat H3 mempunyai kemiripan

sebanyak 99,79% dengan Stenotrophomonas maltophiphila. Isolat H5 mempunyai

kemiripan sebanyak 97,69% dengan Stenotrophomonas acidaminiphila. Isolat T3

mempunyai kemiripan sebanyak 98,85% dengan Pararheinheimera aquatica

4.1.5.Konstruksi Pohon Filogenetik

Software MEGA yang diciptakan oleh Masatoshi Nei pada tahun 1993 yang

sering digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik. Pada software ini

metode yang digunakan adalah neighbor-joining yaitu mengkombinasi sekuen-

sekuen untuk mendefinisikan cabang-cabang pohon yang diprediksikan dan untuk

menghitung panjang-panjang cabang dari pohon (Dharmayanti, 2011). Hasil

konstruksi keempat isolat bakteri dapat dilihat pada gambar 8 sebagai berikut:

39

Gambar 8. Pohon filogenetik metode neighbor-joining isolat bakteri yang berpotensi sebagai agen

biremediasi yaitu isolat H1, H3, H5 (Pusekesmas Halmahera Kota Semarang) dan T5 (Puskesmas

Tlogosari kulon) dianalisis bootstrap dengan 1000 kali pengulangan.

Pohon filogenetik pada gambar 8 dari keempat isolat menunjukkan bahwa

isolat H3 dan H5 yang memiliki hubungan kekerabatan paling dekat dibandingkan

dengan dua isolat lainnya karena terdapat cabang yang menghubungkan

keduanya. H1 memiliki cabang yang sama dengan Acinetobacter schindleri

dengan nilai bootstrap 100%. Isolat H3 memiliki cabang yang sama dengan

40

Stenotrophomonas acidaminiphilia dengan nilai bootstrap 54%. Isolat H5

terhubung dengan cabang Stenotrophomonas maltophilia yang juga terhubung

dengan cabang isolat H3 dan Stenotrophomonas acidaminiphilia dengan nilai

bootstrap 99%. Isolat T3 memiliki cabang yang sama dengan Pararheinheimera

aquatica dengan nilai bootstrap 90%. Kesamaan cabang ini menunjukan bahwa

adanya hubungan kekerabatan.

4.2. Pembahasan

Bakteri yang dapat dijadikan sebagai agen bioremediasi yaitu bakteri

dengan tingkat patogenitas rendah hingga non patogen dan mampu menghasilkan

enzim proteolitik yang mempunyai peran penting dalam proses degredasi

(Emmimol dkk., 2012; Ethica dkk.,2018; Sabrina dkk., 2018). Penelitian

sebelumnya oleh Arifiani (2018) dan Sabrina (2018) ditemukan adanya 4 Isolat

yang berpotensi sebagai agen bioremediasi yaitu H1, H3, H5 (Puskesmas

Halmahera Kota Semarang) dan T3 (Puskesmas Tlogosari Kulon).

Tabel 5 dan gambar 4 menunjukkan bahwa isolat H1 dan T3 merupakan

bakteri dengan patogenitas rendah, sedangkan isolat H3 dan H5 merupakan

bakteri dengan patogenitas yang lebih rendah dibandingkan kedua isolat lainnya.

Uji bakteri penghasil enzim bertujuan untuk mengetahui bakteri yang dapat

meghasilkan enzim lipase dengan ditanam pada media tributirin dan penghasil

enzim protease yang ditanam pada media Skim Milk Agar (SMA). Tabel 6 dan

gambar 5 menunjukkan isolat H1 dan H3 merupakan bakteri penghasil enzim

lipase, isolat H5 merupakan bakteri penghasil enzim protease dan isolat T3

merupakan bakteri yang mampu menghasilkan enzim lipase dan protease

sekaligus (Arifiani, 2018; Sabrina, 2018).

Pengamatan secara makroskopis untuk mengetahui morfologi sel pada

tabel 3 menunjukkan keempat isolat merupakan bakteri gram-negative, isolat H1

dan T3 berbentuk basil, isolat H3 dan H5 berbentuk basil pendek. Pengamatan

secara makroskopis untuk mengetahui morfologi koloni pada tabel 4

menunjukkan keempat isolat mempunyai bentuk yang sama yaitu round atau

lingkaran dengan tepi entire. Hasil subkultur pada gambar 6 menunjukkan

keempat isolat tidak terdapat adanya kontaminasi bakteri atupun mikroorganisme

lain, sehingga dapat dilanjutkan ke tahap isolasi DNA.

41

42

4.2.1. Isolasi DNA, PCR dan Elektroforesis

Hasil dari kemurnian konsentrasi isolasi DNA pada tabel 7 menunjukkan

adanya perbedaan konsentrasi kemurnian yang cukup jauh dari 1,8 – 2,0 (Mulyani

dkk., 2011) yaitu DNA template isolat H5 dengan rasio absorbansi kemurnian

0,75 dan konsentrasi asam nukleat sebesar 2,6 g/ml. Hal ini kemungkinan

diakibatkan oleh adanya perbedaan perlakuan atau kesalahan selama proses isolasi

DNA berlangsung. Hal tersebut juga mempengaruhi hasil elektroforesis setelah

PCR pada gambar 7 yang mengakibatkan pita atau band DNA isolat H5 terlihat

lebih tipis dari isolat yang lainnya. Band DNA pada isolat H3 yang paling tebal

tampak jelas. Semakin tebal dan mengumpul band DNA menunjukkan tingkat

konsentrasi yang tinggi dan kondisi DNA total yang diisolasi masih utuh

(Irmawati, 2003; Ludiyasari, 2014).

4.2.2. Basic Local Alignment Search Tools (BLAST)

Gen 16S rRNA umumnya memiliki ukuran panjang basa nukleotida sekitar

1500 bp (Clarridge, 2004; Rinanda, 2011). Hasil sekuensing menunjukkan kisaran

ukuran basa nukleotida 1393 – 1416 bp. Menurut Schlaberg dkk., 2012 bakteri

dengan kemiripan urutan basa nukleotida ≥97% sampai dengan <99% merupakan

bakteri yang merujuk ke arah spesies yang sama, <97% menunjukan bakteri

tersebut identik dengan spesies bakteri pembanding dan lebih konservatif bahwa

bakteri tersebut merupakan spesies baru, <95% mengidentifikasikan bahwa

bakteri tersebut merupakan bakteri dengan genus baru. Hasil BLAST pada tabel 8

menunjukkan bahwa Isolat H1 mempunyai kemiripan sebanyak 98,01% dengan

Acinetobacter schindleri. Hal ini menunjukkan isolat H1 merupakan spesies yang

sama dengan Acinetobacter schindleri. Isolat H3 mempunyai kemiripan sebanyak

99,79% dengan Stenotrophomonas maltophilia yang menunjukkan bahwa H3

merupakan spesies yang sama persis dengan Stenotrophomonas maltophilia.

Isolat H5 mempunyai kemiripan sebanyak 97,69% dengan Stenotrophomonas

acidaminiphilia menunjukkan H5 merupakan spesies yang sama dengan

Stenotrophomonas acidaminiphilia. Isolat T3 mempunyai kemiripan sebanyak

98,85% dengan Pararheinheimera aquatica menunjukkan T3 merupakan spesies

sama dengan Pararheinheimera aquatica.

43

4.2.3. Hubungan kekerabatan

Pohon filogenetik pada gambar 8 dikonstruksi menggunakan neighbor-

joining dimana sekuen yang jika digabungkan akan memberikan estimasi terbaik

dari panjang cabang yang paling dekat mengambarkan jarak yang nyata diantara

sekuen (Dharmayanti, 2011) dan dianalisis bootstrap dengan 1000 pengulangan.

Semakin besar nilai bootstrap maka semakin tinggi tingkat kepercayaan topologi

hasil rekonstruksi pohon filogenetik (Ubaidillah dkk., 2009; Pangestika dkk.,

2015). Menurut Hall (2001) Nilai percabangan bootstrap 95% merupakan nilai

pengelompokkan yang dapat dipercaya dan nilai bootstrap 25% merupakan nilai

yang tidak dapat dipercaya. Hubungan kekerbatan yang tidak dekat dapat

dikarenakan adanya gap berupa garis putus-putus pada hasil alignment

(Pangestika dkk., 2015).

Isolat H1 memiliki cabang yang sama dengan Acinetobacter schindleri

dengan nilai bootstrap 100% menunjukkan isolat H1 memiliki hubungan

kekerabatan yang sangat dekat Acinetobacter schindleri. Hasil BLAST isolat H1

juga menunjukkan kemiripan sebanyak 98,01% dengan Acinetobacter schindleri.

Acinetobacter schindleri berasal dari genus Acinetobacter. Bakteri ini diisolasi

dari spesimen klinis manusia (Nemec dkk., 2001; Loubinoux dkk., 2003). Bakteri

ini merupakan bakteri yang berpotensi atau kemungkinan bersifat patogen

oportunistik (Laurent dkk., 2006). Hal ini menandakan bakteri ini memiliki sedikit

kemungkinan untuk dijadikan sebagai agen bioremediasi limbah cair puskesmas

karena sifat patogenitasnya.

Isolat H3 dan Stenotrophomonas acidaminiphilia berada pada cabang yang

sama dengan nilai boostrap 54% yang menunjukkan Isolat H3 memiliki hubungan

kekerabatan yang cukup dekat dengan Stenotrophomonas acidaminiphilia.

Terdapat cabang pula yang terhubung dengan cabang isolat H3 dan

Stenotrophomonas acidaminiphilia yaitu Stenotrophomonas maltophilia dengan

nilai bootstrap 60%. Hal ini menunjukkan Stenotrophomonas maltophilia

memiliki hubungan kekerabatan yang cukup dekat dengan isolat H3 dan

Stenotrophomonas acidaminiphilia. Hasil BLAST menunjukkan isolat H3 99,79%

spesies yang sama dengan Stenotrophomonas maltophilia. Stenotrophomonas

maltophilia berasal dari genus Stenotrophomonas. Bakteri ini merupakan bakteri

44

gram-negative dengan bentuk basil, aerobik, non gula fermenter dan mampu

menghasilkan enzim lisin. Bakteri ini bersifat patogen oportunistik (Singhal dkk.,

2017). Sehingga masih diragukan dan kemungkinan kecil untuk dijadikan agen

bioremediasi limbah cair puskesmas karena sifat patogennya.

Isolat H5 terhubung dengan cabang Stenotrophomonas maltophilia yang

juga terhubung dengan cabang isolat H3 dan Stenotrophomonas acidaminiphilia

dengan nilai bootstrap 99%. Hal ini berarti isolat H5 memiliki kekerabatan yang

sangat dekat diibaratkan seperti saudara satu nenek dengan ketiga bakteri tersebut.

Hasil BLAST juga menunjukkan isolat H5 memiliki kemiripan dengan

Stenotrophomonas acidaminiphilia sebanyak 97,69%. Stenotrophomonas

acidaminiphilia merupakan spesies bakteri yang berasal dari genus

Stenotrophomonas, penampungan utamanya adalah tanah dan tanaman (Ryan

dkk., 2009). Bakteri yang ini diisolasi dari air limbah industri di Meksiko ini

merupakan bakteri gram-negative, berbentuk basil, aerobik, dan koloni berwarna

kuning (Assih dkk., 2002). Bakteri ini mampu menurunkan hidrokarbon polisiklik

yaitu senyawa organik yang bersifat toksik terhadap biota laut (Mangwani dkk.,

2014). Bakteri ini memungkinkan sebagai agen bioremediasi karena

kemampuannya menurunkan hidrokarbon polisiklik namun, masih agak diragukan

karena bakteri ini bersaudara dekat dengan Stenotrophomonas maltophilia.

Isolat T3 memiliki cabang yang sama dengan Pararheinheimera aquatica

dengan nilai boostrap 90% yang menunjukkan Isolat T3 mempunyai hubungan

kekerabatan yang cukup dekat dengan Pararheinheimera aquatica.

Pararheinheimera aquatica berasal dari genus Pararheinheimera. Bakteri ini

merupakan bakteri gram-negative, aerobik dengan bentuk basil. Bakteri ini

diisolasi dari kolam budidaya air tawar di Taiwan ketika menyaring bakteri untuk

senyawa antimikrobia. Bakteri ini muncul akibat generasi aktivitas enzim L-lisin

oksidase yaitu antimikrobia yang digunakan untuk membuat zona hambat pada

bakteri yang bersifat patogen salah satunya Staphylococcus aureus (Chen dkk,

2010). Bakteri ini memungkinkan sebagai agen bioremediasi karena

menghasilkan enzim L-lisin yang merupakan satu keluarga dari enzim

oksidoreduktase. Enzim oksidoreduktase merupakan salah satu enzim yang

45

berperan penting dalam bioremediasi untuk mendegradasi biomassa (Ethica dkk.,

2018).

Dari keempat isolat bakteri, Isolat H3 dan H5 memiliki hubungan

kekerabatan paling dekat dibandingkan dengan dua isolat lainnya. Kedua isolat

yang berasal dari Puskesmas Halmahera Kota Semarang ini terhubung pada

percabangan yang diibaratkan saudara satu nenek. Isolat H1 terdapat juga cabang

yang menghubungkanya dengan isolat H3 dan H5 namun cabang ini terletak

sangat jauh. Walaupun isolat H1, H3, dan H5 diambil dari tempat yang sama akan

tetapi, hasil menunjukkan isolat H1 merupakan bakteri dengan genus yang

berbeda dan berkerabat jauh dengan isolat H3 dan H5. Isolat T3 merupakan isolat

yang paling jauh hubungan kekerabatannya dan diambil dari tempat yang berbeda

dengan ketiga isolat lainnya. Dari keempat isolat ini menunjukkan isolat H3 dan

H5 berasal dari genus yang sama yaitu Stenotrophomonas. Keempat isolat ini

berada pada Class yang sama yaitu Gammaproteobacter dengan Phylum

Proteobacter.

46

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari hasil penelitian dari keempat isolat bakteri yang berpotensi sebagai

agen bioremediasi yaitu isolat H1, H3, H5 yang diambil dari Puskesmas

Halmahera Kota Semarang dan isolat T3 yang diambil Puskesmas Tlogosari

Kulon, dapat disimpulkan bahwa:

1. Hasil identifikasi secara molekuler dengan sekuens gen 16S rRNA

menunjukkan:

a. Isolat H1 merupakan spesies yang berasal dari genus Acinetobacter yaitu

Acinetobacter schindleri dengan tingkat kemiripan sebanyak 98,01%.

b. Isolat H3 merupakan spesies yang berasal dari genus Stenotrophomonas

yaitu Stenotrophomonas maltophilia dengan tingkat kemiripan 99,79%.

c. Isolat H5 merupakan spesies yang berasal dari genus Stenotrophomonas

yaitu Stenotrophomonas acidaminiphilia dengan tingkat kemiripan 97,69%.

d. Isolat T3 merupakan spesies yang berasal dari genus Pararheinheimera

yaitu Pararheinheimera aquatica. dengan tingkat kemiripan 98,85%.

2. Hubungan kekerabatan antara empat isolat bakteri yang berpotensi sebagai

agen bioremediasi, Isolat H3 dan H5 mempunyai hubungan kekerabatan

paling dekat dibandingkan dengan dua isolat lainnya. Isolat H1 dengan

isolat H3 dan H5 memiliki hubungan kekerabatan namun dengan jarak yang

jauh, dan isolat T3 memiliki hubungan kekerabatan yang paling jauh dengan

ketiga isolat lainnya.

3. Hasil dari penelitian ini juga menunjukkan dari keempat isolat yang dapat

dikategorikan sebagai agen bioremediasi limbah cair puskesmas yaitu isolat

T3 dengan spesies Pararheinheimera aquatica. Isolat H1, H3 dan H5

memiliki kemungkinan kecil untuk dijadikan sebagai agen bioremediasi

karena berpotensi memiliki sifat patogen oportunistik.

5.2 Saran

Penelitian ini masih terdapat beberapa kekurangan terutama pada isolasi

DNA yang mempengaruhi hingga hasil akhir. Mengingat adanya ketebatasan

47

waktu dan hal lain, sehingga tidak dapat dilakukan penelitian ulang. Saran untuk

penulis berikutnya:

1. Agar segera mengulang tahap isolasi DNA apabila ditemukan adanya

konsentrasi absorbansi kemurnian yang sangat rendah.

2. Selalu mendokumentasikan semua kegiatan atau tahapan terutama pada

hasil penelitian walaupun hasilnya kurang baik untuk disimpan sebagai

pembanding.

48

DAFTAR PUSTAKA

Arifiani, N. dan Ethica, S.N., 2018. Isolasi Bakteri Penghasil Lipase dan Protease yang Berpotensi sebagai Agen Bioremediasi Limbah Biomedis Cair Puskesmas Halmahera Kota Semarang. Prosiding Seminar Nasional Mahasiswa Unimus. Oktober, 2018, Semarang, Indonesia. Vol.1. Hal. 276 – 282.

Ali N., Hameed, A. And Ahmed, S., 2009. Physicochemical characterization and bioremediation perspective of textile effluent, dyes and metals by indigenous bacteria. Journal of hazardous materials, 164(1), pp.322-328.

Arikunto, 2010. Prosedur Penelitian: Suatu Pendekatan Praktek. Jakarta: Rineka Cipta.

Assih, A.E., Ouattara A.S., Thierry, S., Cayol, J.L., Labat, M. dan Macarie, H., 2002. Stenotrophomonas acidaminiphilia sp.nov., A Stricly Aerobic Bacterium Isolated from An Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB) reactor. International Journal of Systematic and Evolution Microbiology, 52, pp.559-5568.

Bestari, N.C. and Suharjono, S., 2016. Uji Kualitatif dan Kuantitatif Isolat Bakteri Lipolitik dari Limbah Cair Pabrik Pengolahan Ikan Kecamatan Muncar, Banyuwangi. Biotropika: Journal of Tropical Biology, 3(3), pp.151-155.

Chen, W.M., Lin, C.Y., Young C.C. and Sheu S.Y., 2010. Rheinheimera aquatica sp. Nov., Antimicrobial Activity-Producing Bacterium Isolated from Fresh Water Culture Pond. Journal of Microbiol Biotechnol, 20(10), pp.1386-1392.

Darmawati, S., Sembiring, L., Asmara, W. and Artama, W.T., 2015. Identifikasi bakteri batang gram-negatif pada darah widal positif berdasarkan karakter fenotipik.

Darmawati, S., Sembiring, L., Asmara, W., Artama, W.T. and Kawaichi, M., 2014. Phylogenetic relationship of Gram-negative Bacteria of Enterobacteriaceae Family in the Positive Widal Blood Cultures based on 16S rRNA Gene Sequences. Indonesian Journal of Biotechnology, 19(1), pp.64-70.

Dharmayanti, I.N.L.P., 2011. Filogenetika Molekular; Metode Taksonomi Organisme Berdasarkan Sejarah Evolusi. Wartazoa, 1(21), pp.1-10.

Departemen Kesehatan RI, 2014, Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 128/Menkes/SK/II/2004, tentang Konsep Dasar Puskesmas, Jakarta.

Djaja, I.M., & Maniksulistya, D., 2006. Gambaran Pengelolaan Limbah Cair di Rumah Sakit X Jakarta Februari 2006. Jurnal Makara-Kesehatan, 10(2).

DKP, 2018, Pengelolaan Limbah Bahan Berbahaya dan Beracun (B3) http://dkp.kecamatangunungsindur.bogorkab.go.id/index.php/multisite/post/1498/pengelolaan-limbah-bahan-berbahaya-dan-beracun-b3-#WrAEaGaB3-Y. Diakses tanggal 10 Januari 2019.

49

El Aila N.A., et.al. 2010. The Development of a 16S rRNA Gene Based PCR for the Identification of Streptococcus pneumoniae and Comparison with Four Other Species-Specific PCR Assays. BMC Infectious Diseases, 104(10), pp.1-8.

Emmimol, A. 2012. Screening of microbes producing extracellular hydrolytic enzyme from Corporation waste dumping site and house hold water for the enhancement of bioremediation methods. IOSR-JPBS, 4, pp.54-60.

Ethica, S.N., Saptaningtyas, R., Muchlissin, S.I. and Sabdono, A., 2018. The development method of hospital biomedical waste using hydrolitic bacteria. Health and Technology, pp.1-16.

Ethica, S.N., Bioremediasi Limbah Biomedik Cair, 2018, pp 1-158, Deepublish Publisher, Yogyakarta, ISBN 978-602-475-503-4.

Ethica, S.N., and Raharjo, T.J., 2014. Detection of genes involved in glycerol metabolism of Alcaligenes sp. JG3 (Doctoral dissertation, Universitas Gadjah Mada).

Ethica, S.N., Muchlissin, S.I., Saptaningtyas, R., Sabdono, A., 2018. Protease Producers Predominate Cultivable Hydrolytic Bacteria Isolated from Liquid Biomedical Waste. Asian Journal of Chemistry 30(9): 2035-2038 DOI: 10.14233/ajchem

Ethica, S.N., Oedjijono, O., Semiarti, E., Widada, J. and Raharjo, T.J., 2018. Genotypic and Phenotypic Characterization of Alcaligenes javaensis JG3 Potential as an Effective Biodegrader. BIOTROPIA-The Southeast Asian Journal of Tropical Biology, 25(1), pp.1-10

Ethica, S.N., Semiarti, E., Widada, J., Oedjijono, O. and Joko Raharjo, T., 2017. Characterization of moaC and a nontarget gene fragments of food‐borne pathogen Alcaligenes sp. JG3 using degenerate colony and arbitrary PCRs. Journal of Food Safety, 37(4), pp.12345.2.

Ethica, S.N., Nataningtyas, D.R., Lestari, P., Istini, I., Semiarti, E., Widada, J. and Raharjo, T.J., 2013. Comparative evaluation of conventional versus rapid methods for amplifiable genomic DNA isolation of cultured Azospirillum sp. JG3. Indonesian Journal of Chemistry, 13(3), pp.248-253.

Fuentes, M.S., Alvarez, A., Saez, J.M., Benimeli C.S. and Asmoroso, M.J., 2014. Methoxyclor bioremediation by defined consortium of enviromental Streptomyces strains. International Journal of Enviromental Science and Technology, 11(4), pp.1147-1156.

Gautam, V., Thapar, R., & Sharma, M., 2010. Biomedical waste management: Incinerator vs. Environmental safety. Indian journal of medical microbiology, 28(3), pp.191.

Glasser, H., Chang, D.P.Y., dan Hickman, D.C., 1991. An analysis of biomedical waste management: Incineration. Journal of the Air & Waste Management Association, 41(9), pp.1180-1188. Jakarta.

50

Gaffar, S. 2017. Buku Ajar Bioteknologi Molekuler. Bandung: Universitas Padjajaran.

Hall, B.G. 2001. Phylogenetic Trees Made Easy: A How - To Manual for Molecular Biologist. Sinaueer Associates, Inc. Sunderland, Massachussetts, USA.

Hasibuan E., 2015. Peranan Teknik Polymerease Chain Reaction (PCR) Terhadap Perkembanagn Ilmu Pengetahuan. Karya Tulis Ilmiah. Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.

Hidayat, T. dan Pancoro, A., 2008. Kajian Filogenetika Molekuler dan Perannya dalam Menyediakan Informasi Dasar untuk Meningkatkan Kualitas Sumber Genetik Anggrek. Jurnal AgroBiogen, 4(1), pp. 35-40.

Himedia. 2003. Technical Data for Nutrient Agar. HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.

Indriani I., 2013. Identifikasi Kandungan Daging Babi dalam Pada Dendeng Sapi yang Beredar di Swalayan Puwokerto Menggunakan Metode Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Puwokerto.

Khotimah. 2013. Identifikasi Daging Babi dalam Daging Kebab yang Beredar di Puwokerto Menggunakan Metode Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Puwokerto.

Lau, S.K.P., Woo P.C.Y., Teng J.L.L., Leung K.W., Yuen K.Y., 2002. Identification by 16S Ribosomal RNA Gene Sequencing of Arcobacter butzleri Bacteraemia in a Patient with Acute Gangrenous Appendicitis. J Clin Pathol: Mol Pathol 55 pp.182–185.

Laurent, D., Lergrand P., Soussy, C.J. dan Cattoir V., 2006. Bacterial Identification, Clinical Signifiance and Antimicrobial Susceptibilities of Acinetobacter ursingii and Acinetobacter schindleri Two Frequently Misdentified Opportunistic Phatogens. Journal of Clinical Microbiology ,44(12), pp. 4417-4478

Leboffe, M.J & Pierce, B.E. 2011. A Photographic Atlas for The Microbiology Laboratory. 4Th Edition. Morton Publishing Company. USA.

Lestari, D.A., Muchlissin S.I., Mukaromah A.H., Darmawati S. dan Ethica S.N., 2018. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Bacillus Megaterium IROD3 dari Oncom Merah Pasca Fermentasi 72 Jam. Seminar Nasional Edusainstek FMIPA UNIMUS. 2018, Semarang, Indonesia. Hal. 31-39.

Loubinoux, J., Amrouche, L.M., Fleche, A.L., Pigne, E., Huchon, G., Grimont, P.A.D. dan Bouvet, A., 2003. Bacteremia Caused by Acinetobacter ursingii. Journal of Clinical Microbiology, pp.1337-1338.

Ludyasari, A. 2014. Pengaruh Suhu Annealing Pada Program PCR Terhadap Keberhasilan Amplifikasi DNA Udang Jari (Metapenaeus elengans) Laguna

51

Segera Anakan Cilacap Jawa Tengah. Skripsi. Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang.

Mangwani, M., Shukia, S.K., Kumari, S., Rao, T.S. dan Das, S., 2014. Characterization of Stenotrophomonas acidaminiphilia NCW-702 biofilm for implication in the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Journal of Applied Microbiology, 117, pp.1012-1024.

Magray, M.S.U.D., Kumar A., Rawat A.K., dan Srivastava S., 2011. Identification of Escherichia coli through Analysis of 16S rRNA and 16S-23S rRNA Internal Transcribed Spacer Region Sequences. Bioinformation, 6(10), pp.370-371.

Madilana, R.N., Wijayanti D.P. dan Sabdono A., 2018. Bakteri Simbion Karang Porites dari Perairan Gunungkidul, Yogyakarta dan Aktivitas Antibakteri terhadap Bakteri Patogen Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, Buletin Oseanografi Marina, 7(1), pp.43–50.

McKew, B.A., Coulon, F., Ykimov, M.M., Denaro, R., Denaro, R., Genovese, M., Smith, C.J., Osborn, A.M., Timmis, K.N. and McGenity, T.J., 2007. Efficacy of intervention strategies for bioremediation of crude oil in marine systems ad effects on indigenous hydrocarbonoclastic bacteria. Enviroental Microbiology, 9(6), pp.1562-1571.

Mora, S.G.R., Alarcon, A., Ricandio, M.R. dan Vannoye, V. 2017. Bioremediation of Wastewater for Reutilization in Agricultural System: A Review. Applied Ecology and Environment Research, 15(1), pp.33-50.

Mount, D.W. 2001. Phylogenetic Prediction in: Bioinformatic, Sequence and Genome Analysis. Cold Spring Harbor laboratory. New York Press, pp.237-280.

Mulyani, Y., Purwanto, A. dan Nurruhwati, Isni., 2011. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Dini Koi Herpes Virus (KHV) pada Ikan Mas (Crypinus carpio L.). Jurnal Akuatika, 2(1).

Mwaikono, K.S., Maina, S., Sebastian, A., Kapur, V., & Gwakisa, P. (2015). 16 Rrna Amplicons Survey Revealed Unprecedented Bacterial Community in Solid Biomedical Wastes. American Journal of Microbiological Research, 3(4), pp.135-143.

Nemec A, De Baere T, Tjernberg I, Vaneechoutte M, Van der Reijden TJ. And Dijkshoorn L. 2001. Acinetobacter ursingii sp. nov. and Acinetobacter schindleri sp. nov., isolated from human clinical spesimen. International Journal of System and Evolution Microbiology, 51, pp.1891-1899.

Pangestika, Y., Budiharjo, A. dan Kusumaningrum, H. P., 2015. Analisis Filogenetik Curcuma zedoaria (Temu Putih) Berdasarkan Gen Internal Transcribed Spacer (ITS). Jurnal Biologi, 4(4), pp.8-13.

Piotrowska, A., 2005. Application of enzymes fo bioremediation. Part 1. Oxidoreductases. Ekologi i Technika, 13(6), pp.259-265.

52

Prastiwi, P.R. 2015. Studi Evaluasi Pengolahan Air Limbah Pada Rumah Sakit Jayapura. Jurnal. Teknik Pengairan Konsentrasi Konservasi Sumber Daya Air Fakultas Teknik Universitas Brawijaya, Malang.

Riffat, R., 2012. Fundamental of Wastewater Treatment and Engineering, CRC Press Book.

Rinanda, T., 2011. Analisis Sekuansing 16S rRNA di Bidang Mikrobiologi. Jurnal Kedokteran Syiah Kuala. 3 Desember, 2011, Aceh, Indonesia. Hal. 172-177.

Ryan, P., Monchy S., Cardilane, M., Taghavi, S., Crossman, L., Avison, M.B., Berg, G., Leile, D.V.D. dan Dow, J.M., 2009. The Versatility and adaption of bacteriA from the genus Stenotrophomonas. Nature Review Microbiology, 7, pp.514-525.

Sabrina, A. N. dan Ethicha, S.N., 2018. Potensi Bakteri Indigen Penghasil Enzim Lipase dan Protease yang Berpotensi sebagai Agen Bioremediasi Limbah Biomedis Puskesmas Tlogosari Kulon. Prosiding Seminar Nasional Mahasiswa Unimus. Oktober, 2018, Semarang, Indonesia. Vol.1. Hal. 268– 275.

Schwarz, P., Bretagne, S., Gantier, J.C., Gracia-Hermoso, D., Lortholary, O., Dromer, F. And Dannaoui, E., 2006. Molecular identification of zygomycetes from culture and experimentally infected tissues. Journal of Clinical Microbiology, 44(2), pp.340-349.

Saitou, N. dan Mei, M. 1987. The Neighbor-Joining Method: A New Method for Constructing Phylogenetic trees. Mol. Bio. Evol. 4, pp.406-425.

Saitou, N. dan Imanishi, T. 1989. Relative Effeciencies of the Fitch-Margoliash, Maximum Parsimony, Maximum-Likehood, Minimum Evolution and Neighbor-Joining Methods of Phylogenetic tree construction in obtaining the correct tree. Mol. Bio. Evol. 6(5), pp.514-525.

Schlaberg, R., Simmon, K.E. and Fisher, M.A. 2012. A Systematic Approach for Discovering Novel Clinically Relevant Bacteria. Emenging Infectious Diseasses, 18(3).

Singlah, L., Kaur, P. and Gautam, V., 2017. Stenotrophomonas maltophilia: From Trivia to Grevious. Journal of Medical Microbiology, 35(4), pp.469-479.

Sukartiningrum, S.D., 2012. Penentuan Pohon Filogenetik Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Berdasarkan 16S rRNA. Skripsi. Departemen Kima Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlanggan, Surabaya.

Supriyatna, A., Jauhari, A. A., & Holydaziah, D. 2015. Aktivitas enzim amilase, lipase, dan protease dari larva Hermetia illucens yang diberi pakan jerami padi. JURNAL ISTEK, 9(2).

Susilowati, A., & Listyawati, S. 2001. Keanekaragaman Jenis Mikroorganisme Sumber Kontaminasi Kultur In vitro di Sub-Lab. Biologi Laboratorium MIPA Pusat UNS. Biodiversitas, 2, pp.110-114.

53

Tindi, M., Mamangkey, N.G.F. dan Wultur, S., 2017. DNA Barcode dan Analisis Filogenetik Molekuler Beberapa Jenis Bivalvia Asal Perairan Sulawesi Utara Berdasarkan Gen COI. Jurnal Pesisir dan Laut Tropis, 1(2), pp.32-38.

Ubaidillah, R. dan Sutrisno, H. 2009. Pengantar Biosistemik: Teori dan Praktikum. LIPI Press, Jakarta.

Vidali, M., 2001. Bioremediation. An overview. Pure and Applied Chemistry, 73(7), pp.1163-1172.

Vidali, M., 2001. Microorganisms relevant to bioremediation. Current opinion in biotechnology, 12(3), pp.237-241.

Ward, O.P 1983. Proteinase. Di dalam Microbial Enzyme and Biotechnology. W.M. Fogart. Applied Science Publisher. New York.

Willey, I.M. Sherwood, L.M. dan Woolverton, C.J. 2009. Prescott’s Principles of Microbiology. McGraw-HILL Higher Education. USA.

Yusmalinda, H.L.A., Anggoro, A.W., Suhendro, D.M., Ratha, I M.J., Suprapti, D., Kreb, D. dan Cahyani, N.K.D., 2017. Identifikasi Jenis Pada Kejadian Cetacea Terdampar di Indonesia dengan Teknik Molekuler. Jurnal Ilmu dan Teknologi Kelautan Tropis, 9(2), pp.465-474.

Yosephi, V., Dhanardono, T. dan Saebani. 2010. Perbedaan Kualitas DNA yang Diekstraksi dari Akar Rambut dengan Fase Pertumbuhan. Jurnal Kedokteran Diponegoro, 5(4), pp.1846-1854.

54

LAMPIRAN

Lampiran 1

Subkultur Isolat Bakteri

Pembuatan Media Nutrient Agar

Menyiapkan 10 cawan petri dibungkus degan kertas dan erlenmeyer 250 ml

Agar bacteriological Lp 0011 1,5 g

Nutrient broth agar 1,3 g

Aquadest 100 ml

Homogenkan, erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil, di-autoclave selama 20

menit dengan suhu 121C. Kemudian microwave dengan kekuatan high (150-

200C) selama 3-5 menit.

Lampiran 2

Polymerase Chain Reaction (PCR) 16S rRNA

Pembuatan produk PCR :

Primer 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) 1 l

Primer 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) 1 l

DNA template 3 l

ddH2O 7,5 l

Mastermix bioline 12,5 l

Jumlah 25 l

Kemudian thermocycle diatur dengan

Pra-denaturation 96C 1 menit

(Siklus

sebanyak

34 kali)

Denaturation 96C 15 detik

Annealing 55C 15 detik

Elongation 72C 10 detik

Extention 72C 12 menit

Cooling down 4C Tanpa batas

55

Lampiran 3

Skuensing DNA

Grafik dari hasil sekuensing primer forward dan reserve

Proses editing sekuens forward dan reserve dengan pensejejeran menggunakan

program alignment ClustalW

56

Lampiran 4

Program Basic Local Alignment Search Tools (BLAST)

Memasukkan data awal

Hasil dari BLAST

H1

57

H3

H5

58

T3

Hasil pensejajaran sekuens pada GenBank

59

Lampian 5

Data telah dideposit ke GenBank dengan nomor akses

H1 (LC482255)

H3 (LC482254)

60

H5 (LC482253)

T3 (LC482252)

61

Lampiran 6

Multiple Sequences Alignment (Pensejejeran multiple atau banyak sekuens)

Program ClustalW

Hasil Multiple Sequences Alignment

Garis-garis merupakan gap atau jarak yang memisahkan

62

Lampiran 7

Konstruksi Pohon Filogenetik

Metode Neighbor-Joining Analisis Bootstrap degan pengulangan 1000 kali

Hasil gambar pohon filogenetik

63

Gambar Pohon filogenetika

64

Lampiran 8

Dokumentasi selama penelitian di Laboratorium Oseanografi Fakultas

Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK) Universitas Diponegoro

Hasil Isolasi DNA

Kemurnian Isolasi DNA dengan

NanoDrop 2000

Primer, Mastermix dan ddH2O yang digunakan pada proses PCR

Pengaturan proses PCR pada Thermalcycle

Produk PCR Proses Elektroforesis

Visualisasi gel agarose dengan UV Transluminator

Pengiriman Produk PCR ke PT. Genetika Science

64

Gambar original pohon filogenetik 4 Isolat bakteri