Validasi Metode Analisis

Validasi Metode Analisis

Pratiwi Apridamyanti, M.Sc., Apt

Validasi Metode Analisis

Kenapa perlu dilakukan

VALIDASI

Tindakan dalam pembuatan dengan carayang sesuai (bahwa tiap bahan, prosedur, kegiatan, perlengkapan atau mekanismeyang digunakan dalam proses akansenantiasa mencapai hasil yang sesuaidengan yang diinginkan)

Maksud dan t7an validasi

Mengidentifikasi parameter metode yang kritis

Menetapkan batas toleransi yang dapatditerima pada masing2 parameter proseskritis

Memberikan cara/metode pengawasanterhadap parameter proses kritis

VALIDASI METODE ANALISIS

Menurut USP dilakukan untuk menjaminbahwa analisis bersifat akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan terhadap kisarananalisis

Menurut ISO/IEC:17025(2005) dilakukanuntuk menjamin metode analisis memenuhispesifikasi yang dapat diterima sesuai dengantujuan yang dicapai.

6 VMA-2013 [ A ]

Kapan Suatu Metode Analisis Perlu

divalidasi atau revalidasi ?

Sebelum metode diterapkan atau diberlakukanuntuk penggunaan rutin

Bila kondisi berubah dilihat dari tujuan metodetersebut divalidasi [misal: instrumen dengankarakteristik yang berbeda]

Bila metode tersebut berubah dan perubahantersebut diluar lingkup awal metode tersebutsaat divalidasi

[ Huber, in: Nash and Wachter, 2003 ]

7lanjutan.

Bila kontrol kualitas mengindikasikan bahwa metode baku tersebut berubah dengan

berubahnya waktu

Ada maksud untuk membuktikan kesetaraan antara dua metode (metode baru dan metode

baku)

8Metode Compendial/Farmakope

Metode yang termuat di dalam farmakope

sudah divalidasi

Jadi tidak perlu dilakukan validasi lagi

namun

diperlukan verifikasi

Kazakevich, Y. and LoBrutto, R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists, Chpt. 9

9 VMA-2013 [ A ]

Bukti Bahwa Metode Analisis yang diFarmakope/Compendia

Sudah di Validasi

11 VMA-2013 [ A ]

12 VMA-2013 [ A ]

1. Pendekatan validasi metode

a. Metode Spiking

i. Metode spiking buta nol

ii. Metode spiking buta tunggal

iii. Metode spiking buta ganda

b. Metode dengan menggunakan CRM (certified reference material)

Menggunakan bahan referens baku atau sampelautentik yang pendekatan validasinya sudahditerima secara global.

Mis. USP, NIST etc yang telah menyiapkan, menjamin, dan memasarkan berbagai spesiesanalit.

c. Pendekatan kolaboratif antar laboratorium

Uji banding antar laboratorium.

d. Pendekatan dengan membandingkan metodebaru yang diterima.

Membandingkan metode yang telah diterimadengan pendekatan untuk mengembangkanmetode analisis yang baru.

2. Parameter validasi metode analisis

a. Presisi

Menurut ICH-Q2A [1995] (3) dan Eurachem [1993] (2):

Ketelitian suatu metode analisis merupakan kesesuaian/kedekatan hasil tes individual beberapa

penginjeksian/pengukuran suatu seri standar

Ketelitian suatu metode analisis merupakanukuran kemampuan suatu metode untuk

mendapatkan hasil yang mirip (memiliki kedekatan)

satu dengan yang lain

Sebagai ukuran kedekatan tersebut adalah nilai

Per cent Relative Standard Deviation

[ % RSD ]

Bagaimana Menentukan KriteriaKeberterimaan Presisi[ Acceptance Criteria ]

Presisi RSD [ Horwitz vs AOAC ]

20 VMA-2013 [ A ]

Presisi

Standard Deviation (SD) yang terukur dapatdibagi menjadi tiga (3) kategori, yaitu:

1. repeatability (keterulangan)

2. intermediate precision (presisi antara)

3. reproducibility (ketertiruan)

Ruggedness = Intermediate Precision

21 VMA-2013 [ A ]

1.Ripitabilitas

Ripitabilitas diperoleh apabila analisis dilaku-kan:

- di satu laboratorium

- oleh satu analis (operator)

- dengan satu alat

- pada rentang waktu singkat

Analisis tersebut dilakukan paling tidak :

22 VMA-2013 [ A ]

lanjutan

Analisis tersebut dilakukan paling tidak:

- lima (5) atau enam (6) kali penetapan, dari

- tiga matrik yang berbeda, pada

- dua (2) atau tiga (3) macam konsentrasi

yang berbeda

Relative Standard Deviation-nya (RSD)

23 VMA-2013 [ A ]

Repeatability

Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12

24 VMA-2013 [ A ]

2. Presisi antara

Menurut ICH-Q2A, 1995 (3):

Presisi antara:

- merupakan variabilitas jangka panjang

suatu proses pengukuran dan ditentukan

dengan membandingkan hasil-hasil suatu

metode yang dikerjakan dalam satu labora-

torium selama beberapa minggu

25 VMA-2013 [ A ]

lanjutan

Metode presisi antara dapat menggambarkanketidaksesuaian hasil yang diperoleh akibat:

- analis yang berbeda

- alat yang berbeda

- standar dan reagen dari supplier yang

berbeda

- penggunaan kolom dari batch yang

berbeda

[ atau kombinasi hal-hal yang tersebut di atas ]

26 VMA-2013 [ A ]

Tujuan

Tujuan validasi presisi antara adalah:

- untuk memverifikasi (to verify) dalam labo-

ratorium yang sama, suatu metode analisis

akan memberikan hasil yang sama setelah

fase/tahap pengembangan (metode) selesai.

27 VMA-2013 [ A ]

Intermediate Precision


28 VMA-2013 [ A ]

3. Reprodusibilitas

Menurut ICH (1993; 1995):

Reprodusibilitas menggambarkan presisi yang diperoleh antar laboratorium (lihat Tabel 5).

Tujuan dilakukannya validasi reprodusibilitas:

- untuk memverifikasi bahwa metode akan

memberikan hasil yang sama bila metode

tersebut digunakan pada laboratorium yang

berbeda

29 VMA-2013 [ A ]

lanjutan

Reprodusibilitas ditentukan dengan cara:

Menganalisis aliquot sampel yang homogen:

- di laboratorium yang berbeda

- oleh analis yang berbeda

- pada kondisi operasional dan lingkungan

yang mungkin berbeda (tetapi masih

dalam kisaran parameter yang ditentukan

30 VMA-2013 [ A ]

Validasi Reprodusibilitas

Validasi reprodusibilitas penting apabila metode tersebut akan digunakan di labora-

torium yang berbeda

31 VMA-2013 [ A ]

Faktor-faktor yang mempengaruhi

Reprodusibilitas

Perbedaan temperatur dan kelembaban

Operator dengan pengalaman yang berbeda

Peralatan dengan karakteristik yang berbeda

Variasi bahan dan kondisi instrumen

32 VMA-2013 [ A ]

Lanjutan (Faktor-faktor)

Peralatan dan bahan habis pakai dengan usiayang berbeda

Kolom dari suplier yang berbeda dan batchyang berbeda

Pelarut dan pereaksi dengan kualitas yangberbeda

33 VMA-2013 [ A ]

Reproducibility


34 VMA-2013 [ A ]

Kriteria Penerimaan Presisi

Sampel Presisi[ % RSD ]

Sediaan obat 1

Biologis 10 - 15 %

Lingkungan dan Makanan 2 - 20 %

Sangat tergantung pada:

Matriks sampelKonsentrasi analit

Teknik analisis

Huber, in: Nash and Wachter, 2003

35 VMA-2013 [ A ]

Validasi Presisi Metode Kromatografi

Buat larutan uji (obat) dengan konsentrasitertentu ( larutan A ).

Lakukan penginjek-an berulang larutan A.

Pada validasi metode analisis:

- minimum 10 kali injek ke sistem HPLC

- RSD < 1,0 % [direkomendasikan]

- untuk keperluan SST (UKS):

- RSD < 1,0 % untuk 3-5 kali injek

diperlukan.

Beberapa metode mempersyaratkan nilai RSD< 2,0 %.

Ahuja dan Dong , 2005, p.278

36 VMA-2013 [ A ]

Peningkatan Presisi HPLC

Ahuja dan Dong , 2005, p.265

2. Akurasi

Accuracy = Ketepatan

Ketepatan suatu metode analisis

adalah kesesuaian antara hasil uji yang

diperoleh dan nilai sebenarnya yang

diterima

Penentuan Akurasi Metode Analisisdengan cara:

1. Dengan cara membandingkan hasil analisis metodeyang divalidasi dengan hasil analisis yang diperolehmenggunakan metode baku (established reference method)

2. Dengan menganalisis sampel yang diketahuikonsentrasinya (certified reference material, CRM) danmembandingkan hasil analisis terhadap nilaisebenarnya yang dinyatakan dalam CRM

3. Tambahkan (spiking) zat baku dengan konsen-trasiyang diketahui (by weight or by volume) ke dalam, matrik* kemudian:

- lakukan ekstraksi analit injekkan kealat analisis dan hasil yang diperoleh

ditentukan recoverinya (%)

39 VMA-2013 [ B ]

Persyaratan Akurasi

Konsentrasi harus mencakup rentang zat yang dianalisis dan salah satunya adalah

konsentrasi yang dekat dengan nilai limit of

quantitaion (LoQ)

Perkiraan rekoveri tergantung pada:

- matrik sampel

- prosedur penyiapan sampel, dan

- konsentrasi sampel

[ Lihat Tabel AOAC / HORWITZ ]

40 VMA-2013 [ B ]

Akurasi

Misal:

Tiga (3) macam konsentrasi yang mencakup

80, 100, dan 120 %

dari nilai kadar sampel

dan masing-masing konsentrasi direplikasi 3 kali

Accuracy should be reported as % recovery

41 VMA-2013 [ B ]

Rekoveri

Rekoveri =Respon hasil ekstraksi

Respon zat baku*X 100 %

* : yang dilarutkan dalam pelarut murni

42 VMA-2013 [ B ]

Kriteria Penerimaan

43 VMA-2013 [ B ]

Accuracy and Precision


44 VMA-2013 [ B ]

Recovery Results for C.U.

LoBrutto and Patel, 2007

3. Linieritas

Linearitas suatu metode analisis adalah:

kemampuan metode untuk mendapatkan

hasil uji (respon) yang (secara langsung

atau dengan bantuan perubahan

matematik) proporsional terhadap

konsentrasi analit dalam sampel pada

suatu rentang tertentu

Dipersiapkan dengan:

minimum lima (5) level konsentrasi dengan

tiga ( 3 ) replikasi

VMA-2013 [ B ]

Kurva Baku [ 3 replikasi ]

46

Lakukan replikasi !

47 VMA-2013 [ B ]

Linearitas ditentukan dengan menganalisis:

tiga hingga enam kali penginjeksian dari

lima atau lebih konsentrasi zat standar

yang terletak antara

80 - 120 %

rentang

konsentrasi yang diperkirakan

48 VMA-2013 [ B ]

Linearitas dapat disiapkan dengan cara:

1. Minimum 5 konsentrasi zat standar (dari

pengenceran larutan induk)

atau

2. Minimum 5 konsentrasi zat standar (dari

masing-masing penimbangan zat standar)

Mana yang direkomendasikan ?

Mengapa ?

49 VMA-2013 [ B ]

Linearity = Linieritas

- hasil pengukuran menggunakan suatumetode analisis yang berupa: abs, luas area,

atau tinggi puncak menunjukkan proporsio-

nalitas dengan kadar zat yang dianalisis

Syarat:

Y = bX + a

Koefisien korelasi [ r ] 0,999

Kazakevich and LoBrutto, 2007, p.471-481; Ahuja and Rasmussen, 2007, p.292;

Snyder dkk., 1997, p. 691 dan Chan dkk., 2004, p.16.

50 VMA-2013 [ B ]

51 VMA-2013 [ B ]

Linearity Assay & C.U.

52 VMA-2013 [ B ]

Low-Level Linearity

4. Rentang

Rentang suatu metode analisis adalahinterval antara tingkat paling atas danpaling bawah yang sudah terbukti dapatditentukan dengan akurasi, presisi, danlinearitas menggunakan metode sepertiyang ditulis

Rentang biasanyadigambarkan/dinyatakan dalam unit (%, ppm) yang diperoleh dengan metodeanalitik tersebut.

54 VMA-2013 [ B ]

Rentang Minimum

Jenis analisis Rentang [ % ]

PK. Kadar Obat atau SediaanObat

80 - 120

Keragaman kandungan 70 - 130[ atau lebih lebar ]

Uji disolusi +/- 20

ICH, Q 2A and 2B, 2005 / ICH Q2 (R1)

5. LoD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of Quantification)

LoD adalah konsentrasi analitterrendah dalam sampel yang masih

dapat dideteksi tetapi tidak diperlukan

secara kuantitatif

Pada HPLC, LoD adalah jumlah zatyang diinjeksikan untuk menghasilkan

tinggi puncak paling tidak 2 atau 3 kali

tinggi puncak baseline noise level

56 VMA-2013 [ B ]

Limit of Quantitation

LoQ adalah jumlah zat minimum yang diinjeksikan untuk memberikan hasil pengukur-

an secara teliti

Pada HPLC, biasanya tinggi puncak 10 hingga20 kali lebih tinggi dibanding baseline noise

Sejumlah sampel dengan konsentrasi analitmenurun (semakin kecil) diinjeksikan 6 kali,

Hitunglah nilai RSD-nya

57 VMA-2013 [ B ]

6. Ketahanan (Robutness)

Robustness adalah ukuran kinerja(performance) suatu metode analisis

apabila perubahan kecil yang disengaja

diterapkan pada kondisi metode tersebut

Tujuan validasi parameter ini untukmengiden-tifikasi (bila ada) kondisi

metode mana yang paling kritis untuk

menampilkan kinerja metode dengan baik

Mis. Parameter yang dievaluasi

% pelarut organik, pH, kekuatan ionik,

suhu

7. Kekasaran (Ruggedness)

merupakan tingkat reprodusibilitas hasilyang diperoleh dibawah kondisi yang bermacam-macam. Dinyatakan dalam %RSD

kekasaran dalam metode dapat terlihatketika metode tersebut sering digunakan

Mis. Pengecekan terhadap kolom kromatografiberbeda pabrik dgn jenis yang sama, dimanasemua faktor dijaga konstan seperti fase gerakdan reagen yang digunakan.

8. Uji Kesesuaian sistem

Serangkaian uji untuk menjamin bahwametode dapat menghasilkan akurasi danpresisi yang dapat diterima. Persyaratankesesuaian sistem biasana dilakukan setelahdilakukan pengembangan metoe dan validasimetode.

61 VMA-2013 [ B ]

System Suitability Test [ FDA ]


62 VMA-2013 [ B ]

System Suitability Test

Ermer dan Miller, 2005, p.338.

Validasi Metode Analisis

Documents

Transcript of Validasi Metode Analisis