VALIDASI METODE VALIDASI METODE ANALISIS MIKROBIOLOGIANALISIS MIKROBIOLOGI

Slamet Ibrahim, Marlia SinggihSekolahSekolah FarmasiFarmasi--ITBITB

PENDAHULUANPENDAHULUANPrinsipPrinsip PraktekPraktek PengujianPengujian yang yang BaikBaik((Good Analytical PracticesGood Analytical Practices) :) :a.a. PengujianPengujian dilakukandilakukan untukuntuk memenuhimemenuhi

suatusuatu tujuantujuan tertentutertentu atauatau kebutuhankebutuhanpenggunapengguna

b.b. PengujianPengujian dilakukandilakukan dengandenganmenggunakanmenggunakan metodemetode, , prosedurprosedur dandanperalatanperalatan yang yang telahtelah terujiteruji untukuntukmenjaminmenjamin kesesuaiankesesuaian dandan tujuantujuanpengujianpengujian

c.c. PengujianPengujian dilakukandilakukan oleholeh personelpersonel yang yang memilikimemiliki kualifikasikualifikasi dandan kompetenkompeten

d. d. HasilHasil pengujianpengujian harusharus ajegajeg atauataukonsistenkonsisten, , tidaktidak dipengaruhidipengaruhi oleholeh faktorfaktorlokasilokasi, , personelpersonel dandan peralatanperalatan

e. e. LaboratoriumLaboratorium pengujipenguji harusharus mempunyaimempunyaiprosedurprosedur jaminanjaminan dandan pengendalianpengendalian mutumutuyang yang memadaimemadai

f. f. LaboratoriumLaboratorium pengujipenguji harusharus diujidiuji dandandievaluasidievaluasi oleholeh badanbadan yang yang kompetenkompeten dandantidaktidak memihakmemihak ((akreditasiakreditasi))

ValidasiValidasi MetodeMetode AnalisisAnalisis

DefinisiDefinisi ::ValidasiValidasi MetodeMetode AnalisisAnalisis adalahadalah prosesprosespembuktianpembuktian atauatau konfirmasikonfirmasi pengujianpengujianyang yang obyektifobyektif didi LaboratoriumLaboratorium, , dandan bahwabahwametodemetode ituitu memenuhimemenuhi persyaratanpersyaratan yang yang telahtelah ditentukanditentukan, yang , yang sesuaisesuai dengandengantujuantujuan penggunaannyapenggunaannya..

ValidasiValidasi MetodeMetode AnalisisAnalisis ((lanjutanlanjutan))TujuanTujuan ::

MengevaluasiMengevaluasi kinerjakinerja metodemetode : : kepekaankepekaan, , selektivitasselektivitas, , akurasiakurasi, , presisipresisi, , dlldll., ., sekaligussekaligusmengujimenguji kelemahankelemahan dandan keterbatasanketerbatasanmetodemetode

MengujiMenguji faktorfaktor--faktorfaktor yang yang dapatdapatmempengaruhimempengaruhi kinerjakinerja metodemetode dandanmengetahuimengetahui besarnyabesarnya pengaruhpengaruh ituituterhadapterhadap hasilhasil analisisanalisis

MelakukanMelakukan verifikasiverifikasi atauatau membuktikanmembuktikankinerjakinerja metodemetode analisisanalisis bakubaku yang yang diadopsi/digunakandiadopsi/digunakan laboratoriumlaboratorium

ValidasiValidasi MetodeMetode AnalisisAnalisis ((lanjutanlanjutan))

SyaratSyarat :: MenggunakanMenggunakan instrumeninstrumen dandan peralatanperalatan

yang yang terkalibrasiterkalibrasi DilaksanakanDilaksanakan oleholeh pesonelpesonel yang yang

kompetenkompeten

JenisJenis ValidasiValidasi MetodeMetode

Validasi primerValidasi primer dilakukandilakukan jikajikalaboratoriumlaboratorium menggunakanmenggunakan mmetode etode analisis analisis barubaru hasilhasil pengembanganpengembangan , , atauataumetode yang di modifikasimetode yang di modifikasi terhadap suatu terhadap suatu metode standard. metode standard.

Validasi sekunderValidasi sekunder dilakukan dilakukan untukuntukverifikasi, verifikasi, jikajika laboratorium menggunakan laboratorium menggunakan atauatau mengadopsimengadopsi metodemetode standardstandard yang yang telah divalidasi.telah divalidasi.

Parameter Parameter ValidasiValidasi metodemetodeanalisisanalisis mikrobiologimikrobiologi

AkurasiAkurasi KecermatanKecermatan Presisi (Presisi (repeatabilityrepeatability, , reproducibilityreproducibility dan dan

intermediate precisionintermediate precision)) KeseksamaanKeseksamaan Sensitivitas Sensitivitas KepekaanKepekaan SelektivitasSelektivitas dandan SpesifisitasSpesifisitas LinearitasLinearitas Rentang Hitung yang diterima Rentang Hitung yang diterima

((acceptableacceptable) (batas atas dan batas ) (batas atas dan batas bawah dari rentang perhitungan)bawah dari rentang perhitungan)

RobustnessRobustness (Ketangguhan) metode(Ketangguhan) metode

PedomanPedoman ValidasiValidasi The United States Pharmacopeia (USP) The United States Pharmacopeia (USP)

27, 200427, 2004 or new editionor new edition International Conference on International Conference on

Harmonization, 1996Harmonization, 1996 Method Validation of Microbiological Method Validation of Microbiological

Methods, guidance note : C & B and ENV Methods, guidance note : C & B and ENV 00002, Singapore Accreditation Council, 2, Singapore Accreditation Council, July July 2002.2002.

FeldsineFeldsine, , et.alet.al., AOAC International ., AOAC International method Committee Guidelines for method Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Method of Food Microbiological Official Method of Analysis, Analysis, Journal of AOAC InternationalJournal of AOAC InternationalVol 85 No 5 2002Vol 85 No 5 2002

Water quality Water quality Guidance on Validation of Guidance on Validation of Microbiological Methods, Technical Report, Microbiological Methods, Technical Report, ISO/TR 13843 : 2000.ISO/TR 13843 : 2000.

Procedure for The Estimation and Procedure for The Estimation and Expression of Measurement Uncertainty in Expression of Measurement Uncertainty in Chemical Analysis, Nordic Committee on Chemical Analysis, Nordic Committee on Food Analysis, NMKL, No.5, 1997.Food Analysis, NMKL, No.5, 1997.

APHA Standard methods for the APHA Standard methods for the Examination of Water and Wastewater, Examination of Water and Wastewater, 20th ed., 1998.20th ed., 1998.

MetodeMetode analisisanalisis mikrobiologimikrobiologi

1.1. MetodeMetode analisisanalisis KUALITATIF KUALITATIF 2.2. MetodeMetode analisisanalisis KUANTITATIFKUANTITATIF

MetodeMetode kualitatifkualitatif

MetodeMetode analisisanalisis yang yang responsnyaresponsnya berupaberupapresence presence atauatau absence (absence (adaada atauatau tidaktidakadaada) yang ) yang dideteksidideteksi baikbaik secarasecara langsunglangsungmaupunmaupun tidaktidak langsunglangsung terhadapterhadap sejumlahsejumlahsampelsampel

MetodeMetode kuantitatifkuantitatif

MetodeMetode analisisanalisis yang yang responsnyaresponsnya berupaberupajumlahjumlah daridari analitanalit , , baikbaik yang yang diukurdiukur secarasecaralangsunglangsung ((misalnyamisalnya : : enumerasienumerasi mikrobamikroba) ) maupunmaupun secarasecara tidaktidak langsunglangsung ((misalnyamisalnya : : NilaiNilai AbsorbansAbsorbans, , intensitasintensitas warnawarna, , impedansiimpedansi, , dlldll) ) terhadapterhadap sejumlahsejumlah sampelsampel..

MetodeMetode AnalisisAnalisis MikrobiologiMikrobiologi KualitatifKualitatif ::99 Uji langsung terhadap mikroba indikatorUji langsung terhadap mikroba indikator99 Metode kultur untuk identifikasi makroskopik dan mikroskopikMetode kultur untuk identifikasi makroskopik dan mikroskopik99 Metode alternatif (Metode alternatif (DyeDye--reduction Test, Electrical Methods, ATP reduction Test, Electrical Methods, ATP

DeterminationDetermination))99 Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya (metode Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya (metode

imunokimia, metode biologi molekuler)imunokimia, metode biologi molekuler)

KuantitatifKuantitatif ::99 Angka Lempeng Total (Angka Lempeng Total (Total Plate CountTotal Plate Count))99 MPN (MPN (Most Probable NumberMost Probable Number))99 Uji potensi antibiotikUji potensi antibiotik99 Uji sterilitas Uji sterilitas 99 Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik)Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik)99 Uji efektivitas pengawet Uji efektivitas pengawet

IdentifikasiIdentifikasi MikroorganismeMikroorganisme

Escherichia coli Salmonella thypi

Identifikasi mikroba

TahapTahap PersiapanPersiapan ValidasiValidasiSebelumSebelum validasivalidasi dilakukandilakukan, , hendaknyahendaknyalaboratoriumlaboratorium menyediakanmenyediakan atauatau menyiapkanmenyiapkanbeberapabeberapa halhal ::1. 1. MikroorganismeMikroorganisme target target atauatau acuanacuan ((lihatlihat SRSR--02 02 ::

persyaratanpersyaratan tambahantambahan untukuntuk akreditasiakreditasilaboratoriumlaboratorium, , PengujianPengujian KimiaKimia dandan BiologiBiologiSNI 17025, DP.01.16, SNI 17025, DP.01.16, JanuariJanuari 2004)2004)

2. 2. PeralatanPeralatan dandan InstrumenInstrumen ukurukur yang yang telahtelahdikalibrasidikalibrasi3. 3. PersonelPersonel yang yang kompetenkompeten4. Program 4. Program StatistikaStatistika untukuntuk menghitungmenghitung, ,

mengevaluasimengevaluasi dandan menginterpretasikanmenginterpretasikan hasilhasilpengujianpengujian

Parameter Parameter ValidasiValidasi

AkurasiAkurasi ((KecermatanKecermatan))

DefinisiDefinisi :: AkurasiAkurasi adalahadalah kemampuankemampuan metodemetode untukuntuk

mengukurmengukur dandan mendeteksimendeteksi nilainilai aktualaktualatauatau nilainilai sebenarnyasebenarnya daridari mikroorganismemikroorganismetarget target dalamdalam sampelsampel

AkurasiAkurasi merupakanmerupakan ukuranukuran ketepatanketepatan atauataukedekatankedekatan hasilhasil pengujianpengujian dengandengan hasilhasilyang yang sebenarnyasebenarnya

AkurasiAkurasi ((KecermatanKecermatan) ) ((lanjutanlanjutan))PerhitunganPerhitungan ::

RekoveriRekoveri ((RecoveryRecovery) = ) = PersenPersen perolehanperolehan kembalikembali% % RekRek = H/A x 100= H/A x 100

GalatGalat RelatifRelatif : (H : (H A)/A x 100A)/A x 100dimanadimana H = H = hasilhasil pengujianpengujian dengandengan metodemetode

A = A = hasilhasil sebenarnyasebenarnya daridarimikroorganismemikroorganisme

targettarget RekoveriRekoveri RelatifRelatif : H/B x 100: H/B x 100

dimanadimana H = H = hasilhasil pengujianpengujian metodemetodeB = B = hasilhasil pengujianpengujian metodemetode standardstandard

AkurasiAkurasi ((KecermatanKecermatan) ) ((lanjutanlanjutan))

Cara Cara pengujianpengujian :: SpikedSpiked--placebo Recovery Methodplacebo Recovery Method Standard Addition MethodStandard Addition Method

MenggunakanMenggunakan 9 kali 9 kali pengukuranpengukuran ( 3 level ( 3 level konsentrasikonsentrasi dengandengan 3 3 replikasireplikasi))

ContohContoh PerhitunganPerhitungan AkurasiAkurasi dandanRekoveriRekoveri MetodeMetode

JumlahJumlah angkaangka lempenglempeng total total GalurGalur TeoritisTeoritis MetodeMetode ujiuji MetodeMetode

BakuBakuI I 125125 126 127126 127IIII 125125 120120 119119IIIIII 125125 120120 118118IVIV 125125 125125 128128VV 125 125 132132 131131

RataRata--ratarata 125 125 125125 125125

PerhitunganPerhitungan

% % RekoveriRekoveri = = Hsl.metodeHsl.metode uji/hsluji/hsl teoritisteoritis x 100%x 100%

= 125/125 x 100% = 100%= 125/125 x 100% = 100%

% % RekoveriRekoveri relatifrelatif = = MetodeMetode uji/metodeuji/metode bakubaku x x 100%100%

= 125/125 x 100% = 100%= 125/125 x 100% = 100%

PresisiPresisi ((KeseksamaanKeseksamaan))DefinisiDefinisi

PresisiPresisi adalahadalah tingkattingkat kesesuaiankesesuaian antaraantarahasilhasil pengujianpengujian individual individual dengandengan hasilhasilratarata--rata rata pengujianpengujian berulangberulang padapada sampelsampelyang yang homogenhomogen dengandengan kondisikondisi pengujianpengujianyang yang samasama

PresisiPresisi : : keterulanganketerulangan ((repeatabilityrepeatability), ), ketertiruanketertiruan ((reproducibilityreproducibility), ), keseksamaankeseksamaanantaraantara ((intermediate precisionintermediate precision))

PresisiPresisi ((KeseksamaanKeseksamaan) ) ((lanjutanlanjutan))Cara Cara PerhitunganPerhitungan

SimpanganSimpangan bakubaku relatifrelatif (SBR = Relative (SBR = Relative Standard Deviation=RSD) Standard Deviation=RSD) untukuntukintermediate precision :intermediate precision :

[(log ai [(log ai log bi )/log bi )/xixi]] 22

2 p2 pai ai dandan bi : bi : hasilhasil pengujianpengujian i (1,2,3,i (1,2,3,n)n)

xi = rataxi = rata--rata = 1/n (log ai rata = 1/n (log ai + log bi) + log bi)

P = P = jumlahjumlah sampelsampel yang yang diujidiuji

ContohContoh PerhitunganPerhitungan Intermediate Precision Intermediate Precision padapada ALT (ALT (angkaangka lempenglempeng total)total)

No. ALT (No. ALT (cfu/mLcfu/mL) ) logaritmalogaritma (II/I)(II/I)22a b a b rata2 (I) a b a b rata2 (I) selisih(IIselisih(II))

11 93 86 1,968593 86 1,9685 1,9345 1,9515 0,0340 1,9345 1,9515 0,0340 0,0003030,000303

22 3434 30 1,5315 1,4771 1,5043 0,0544 30 1,5315 1,4771 1,5043 0,0544 0,0013060,00130633 9898 7373 1,9912 1,8633 1,9273 0,1279 0,0044041,9912 1,8633 1,9273 0,1279 0,00440444 8989 83 1,9494 1,9191 1,9342 0,0303 83 1,9494 1,9191 1,9342 0,0303 0,0002460,00024655 116 104 2,0645 2,0170 2,0407 0,0475 116 104 2,0645 2,0170 2,0407 0,0475 0,0005400,00054066 168 156168 156 2,2253 2,1931 2,2092 0,0322 0,0002122,2253 2,1931 2,2092 0,0322 0,00021277 6262 56 1,7924 1,7482 1,7703 0,0442 56 1,7924 1,7482 1,7703 0,0442

0,0006230,00062388 38 28 1,5798 1,4472 1,5135 0,1326 38 28 1,5798 1,4472 1,5135 0,1326 0,0076790,00767999 330 300 2,5185 2,4771 2,4978 0,0414 330 300 2,5185 2,4771 2,4978 0,0414 0,0002750,0002751010 2300 2040 3,3617 3,3096 3,3357 0,00521 02300 2040 3,3617 3,3096 3,3357 0,00521 0,000244,000244

= 0,015832= 0,015832

SBR = SBR = 0,015832/2 x 10 = 0,02810,015832/2 x 10 = 0,0281

KV = 100 x SBR = 2,81 %KV = 100 x SBR = 2,81 %

SensitifitasSensitifitas dandan SpesifisitasSpesifisitas

DefinisiDefinisi SensitifitasSensitifitas ((KepekaanKepekaan) : ) : KemampuanKemampuan

metodemetode untukuntuk mendeteksi/mengukurmendeteksi/mengukurmikroorganismemikroorganisme target target dalamdalam jumlahjumlahsekecilsekecil mungkinmungkin

SpesifisitasSpesifisitas ((KemenjenisanKemenjenisan): ): KemampuanKemampuanmetodemetode untukuntuk mendeteksi/mengukurmendeteksi/mengukurmikroorganismemikroorganisme tertentutertentu secarasecara cermatcermatdandan seksamaseksama dengandengan adanyaadanyamikroorganismemikroorganisme asingasing atauatau bahan/matriksbahan/matrikslainlain

SensitifitasSensitifitas dandan SpesifisitasSpesifisitas((lanjutanlanjutan))

Cara Cara perhitunganperhitungan SensitifitasSensitifitas : : FraksiFraksi koloni/kulturkoloni/kultur yang yang

positifpositif padapada ujiuji konfirmasikonfirmasi terhadapterhadappengujianpengujian presumtifpresumtif

SpesifisitasSpesifisitas : : FraksiFraksi koloni/kulturkoloni/kultur yang yang negatifnegatif padapada ujiuji konfirmasikonfirmasi terhadapterhadappengujianpengujian presumtifpresumtif

SelektifitasSelektifitas : : LogaritmaLogaritma fraksifraksi koloni/kulturkoloni/kulturyang yang positifpositif padapada ujiuji konfirmasikonfirmasi terhadapterhadapjumlahjumlah pengujianpengujian

SensitifitasSensitifitas dandan SpesifisitasSpesifisitas ((lanjutanlanjutan))UjiUji PresumtifPresumtif JumlahJumlah

positifpositif ((++) ) negatifnegatif ((--))UjiUji KonfirmaKonfirmatiftifPositifPositif ((++)) aa bb a + ba + bNegatifNegatif ((--) ) cc dd c + dc + d

JumlahJumlah ujiuji a + a + c c b +db +da+b+c+da+b+c+d ==nn

SSensitiensitiffitas = a/(a+b)itas = a/(a+b)SSpesifisitas = d/(c+d)pesifisitas = d/(c+d)RasioRasio positif palsu = c/positif palsu = c/((a+c)a+c)RasioRasio negatif palsu = b/(b+d)negatif palsu = b/(b+d)EfisiensiEfisiensi = (= (a+d)/na+d)/nSelektifitasSelektifitas absolutabsolut = RS = log (a/n)= RS = log (a/n)SelektifitasSelektifitas apparent = F = log [(apparent = F = log [(a+c)/na+c)/n]]

ContohContohUjiUji PresumtifPresumtif

JumlahJumlahpositifpositif ((++) ) negatifnegatif ((--))

UjiUji KonfirmaKonfirmatiftifPositifPositif ((++)) 250(a)250(a) 8(b) 2588(b) 258NegatifNegatif ((--) 20(c)) 20(c) 120(d) 140120(d) 140

JumlahJumlah ujiuji 270 128270 128398398

SSensitiensitiffitas = a/(a+b)itas = a/(a+b) = 250/258 = 0,97= 250/258 = 0,97SSpesifisitas = d/(c+d)pesifisitas = d/(c+d) = 120/140 = 0,86= 120/140 = 0,86RasioRasio positif palsu = c/positif palsu = c/((a+c)a+c) = 20/270 = 0,07= 20/270 = 0,07RasioRasio negatif palsu = b/(b+d)negatif palsu = b/(b+d) = 8/128 = 0,06= 8/128 = 0,06EfisiensiEfisiensi = (= (a+d)/na+d)/n = 370/398 = 0,93= 370/398 = 0,93SelektifitasSelektifitas apparent = F = log [(apparent = F = log [(a+c)/na+c)/n] = log 270/398 = ] = log 270/398 =

0,16850,1685

RentangRentang HasilHasil PengujianPengujian

RentangRentang menunjukkanmenunjukkan nilainilai terendahterendah dandantertinggitertinggi hasilhasil pengujianpengujian yang yang dapatdapatditentukanditentukan dengandengan cermatcermat dandan seksamaseksama

Batas Batas terendahterendah ((Lower limitLower limit) ) HasilHasil analisisanalisis / / pengujianpengujian terendahterendah yang yang ditandaiditandai dengandengan galatgalat analisisanalisis 20,0% 20,0% daridariratarata--rata (rata (pengukuranpengukuran minimal 3 kali)minimal 3 kali)

ContohContoh

ALT ALT ((cfu/lempengcfu/lempeng)) GalatGalat bakubaku GalatGalatrelatifrelatif(%)(%)

1010 3,163,16 31,631,61515 3,873,87 25,825,82020 4,474,47 22,822,82525 5,005,00 20,020,02727 5,205,20

19,219,22929 5,395,39

18,618,63030 5,485,48

18,318,3

Batas Batas tertinggitertinggi ((Upper limitUpper limit))HasilHasil analisisanalisis //pengujianpengujian kolonikoloni tertinggitertinggi yang yang masihmasih dapatdapat dihitungdihitung dengandengan cermatcermat dandanseksamaseksama ditandaiditandai dengandengan galatgalat analisisanalisis 15,0% 15,0% daridari ratarata--rata (rata (pengukuranpengukuran minimal 3 kali)minimal 3 kali)

2.LC 2.LC HCHC--1 1 1,96 1,96 [ 2.LC [ 2.LC HC ]HC ]1/2 1/2

RentangRentang hasilhasil pengujianpengujian ((lempenglempeng agar)agar) SampelSampel makananmakanan dandan obatobat--obatanobatan : 25: 25--250 250

cfu/lempengcfu/lempeng SampelSampel air : 30air : 30--300 300 cfu/lempengcfu/lempeng KapangKapang ((AspergillusAspergillus nigerniger) : 8) : 8--80 80 koloni/lempengkoloni/lempeng

Linearity (Linearity (KelinieranKelinieran))((untukuntuk penetapanpenetapan potensipotensi antibiotikaantibiotika))

DefinisiDefinisi KeliniearanKeliniearan adalahadalah kemampuankemampuan metodemetode analisisanalisis

yang yang menunjukkanmenunjukkan bahwabahwa larutanlarutan sampelsampel yang yang beradaberada dalamdalam rentangrentang konsentrasikonsentrasi memilikimemilikiresponrespon analitanalit yang yang proporsionalproporsional dengandengankonsentrasikonsentrasi, , secarasecara langsunglangsung ataupunataupun melaluimelaluitransformasitransformasi matematikamatematikaCara Cara pengujianpengujian

KurvaKurva bakubaku disiapkandisiapkan dandan dianalisisdianalisis 3 kali 3 kali dengandengan konsentrasikonsentrasi antaraantara 50 50 150% 150% kadarkadaraktualaktual (FDA), (FDA), untukuntuk penentuanpenentuan kadarkadar dalamdalamsampelsampel, , tigatiga larutanlarutan bakubaku digunakandigunakan : 80, 100 : 80, 100 dandan 120% 120% konsentrasikonsentrasi targettarget

Linearity (Linearity (KelinieranKelinieran) ) ((lanjutanlanjutan))ParameterParameter

KurvaKurva bakubaku, , dengandengan persamaanpersamaan garisgaris((regresiregresi linear, linear, logaritmalogaritma atauatau polinomialpolinomial))

KepekaanKepekaan analisisanalisis , F = , F = y/ y/ x x untukuntuksetiapsetiap konsentrasikonsentrasi padapada kurvakurva bakubaku

SimpanganSimpangan bakubaku residual residual garisgaris regresiregresiSy/xSy/x = [= [(y(y--))22/n/n--2]2]1/21/2

dimanadimana y = y = responrespon analitanalit = = dihitungdihitung daridari persamaanpersamaan garisgaris

regresiregresi

Linearity (Linearity (KelinieranKelinieran) ) ((lanjutanlanjutan))

KoefisienKoefisien variasivariasi fungsifungsi regresiregresiVVx0x0 = S = S y/xy/x . 100% , (V. 100% , (Vx0x0 2%)2%)

b . xb . x KoefisienKoefisien korelasikorelasi ( r ( r 0,999)0,999)

Linearity (Linearity (KelinieranKelinieran) ) ((lanjutanlanjutan))

PerhitunganPerhitungan KadarKadar

Diameter Hambat

Log Ci

xx

xx

x

a. Menggunakan persamaan garis

D = b log C + a

log Cs = Ds a/ b

dimana :

Cs = kons. analit dlm sampel

Ds = Diameter hambat

b. Menggunakan satu larutan baku danlarutan blangko

log Cs = (Ds a)/(Db a) . log Cb

dimana :

Cb = kons. analit dlm lar.baku

SyaratSyarat sampelsampel untukuntuk ujiuji validasivalidasi

UntukUntuk metodemetode analisisanalisis kualitatifkualitatif, , sampelsampel yang yang digunakandigunakan terdiriterdiri daridari 3 3 macammacam sampelsampel : : sampelsampelyang yang tidaktidak dikontaminasidikontaminasi, , sampelsampel yang yang sengajasengajadikontaminasidikontaminasi padapada jumlahjumlah yang yang mendekatimendekatibatasbatas limit limit deteksideteksi (Low Contamination Level), (Low Contamination Level), sampelsampel yang yang sengajasengaja dikontaminasidikontaminasi padapada jumlahjumlahyang yang tinggitinggi (High Contamination Level)(High Contamination Level)

Low contamination level : 1Low contamination level : 1--5 cfu/25 g 5 cfu/25 g sampelsampelsedangkansedangkan high contamination level : 10high contamination level : 10--50 50 cfu/25 g cfu/25 g sampelsampel

UntukUntuk metodemetode analisisanalisis kuantitatifkuantitatif, , makamakasampelsampel dibagidibagi 4, 4, yaituyaitu : 1 : 1 sampelsampel tanpatanpadiinokulasidiinokulasi, , dandan 3 3 sampelsampel masingmasing--masingmasingdengandengan low , medium low , medium dandan high high contamination level.contamination level.

Low : Low : padapada batasbatas limit limit deteksideteksiMedium : Medium : kirakira--kirakira dengandengan jumlahjumlah 1 log 1 log lebihlebih tinggitinggiHigh : High : kirakira--kirakira dengandengan jumlahjumlah 2 log 2 log lebihlebihtinggitinggi

ValidasiValidasi Kit Kit PereaksiPereaksi

Pertimbangan dalam memilih kit pereaksi Pertimbangan dalam memilih kit pereaksi tidak sematatidak semata mata dari aspek ekonomi, mata dari aspek ekonomi, tetapi termasuk :tetapi termasuk :

Kemudahan penanganan sampel dan Kemudahan penanganan sampel dan pereaksi yang digunakan, pereaksi yang digunakan,

Cara penyimpanan dan stabilitas pereaksi Cara penyimpanan dan stabilitas pereaksi Tingkat toksisitas pereaksiTingkat toksisitas pereaksi Kualitas hasil reaksi yang diberikan oleh Kualitas hasil reaksi yang diberikan oleh

kit tersebut.kit tersebut.

Tahapan dalam proses evaluasi kitTahapan dalam proses evaluasi kit

Tahap ITahap I : Seleksi awal , yaitu mencakup : Seleksi awal , yaitu mencakup evaluasi terhadap kurva standard evaluasi terhadap kurva standard , , ada tidaknya ada tidaknya reduksi data, evaluasi terhadap sensitivitas reduksi data, evaluasi terhadap sensitivitas pereaksi,pereaksi,

Tahap IITahap II : Pemahaman prosedur penggunaan : Pemahaman prosedur penggunaan kit , yaitu untuk mengevaluasi kemungkinan efek kit , yaitu untuk mengevaluasi kemungkinan efek matriks, perolehan kembali, reaksi silang , ada matriks, perolehan kembali, reaksi silang , ada tidaknya interferensi, kemudahan penanganan tidaknya interferensi, kemudahan penanganan sampel dan pereaksisampel dan pereaksi

Tahap IIITahap III : Pengembangan data validasi, yaitu : Pengembangan data validasi, yaitu evaluasi terhadap rentang normal hasil reaksi, evaluasi terhadap rentang normal hasil reaksi, uji pada kondisi abnormal, adanya stimulasi atau uji pada kondisi abnormal, adanya stimulasi atau supresi, dan uji terhadap rentang kontrol supresi, dan uji terhadap rentang kontrol kualitas.kualitas.

Robustness (Robustness (KetangguhanKetangguhan)) metodemetode

PengujianPengujian KKetangguhan etangguhan sebenarnyasebenarnya harusharusdilakukandilakukan padapada saatsaat fasefase pengembanganpengembanganmetode metode dandan tergantungtergantung padapada faktorfaktor--faktorfaktoryang yang berpengaruhberpengaruh padapada pengujianpengujian

JikaJika pengujianpengujian sangatsangat pekapeka terhadapterhadapperubahanperubahan dalamdalam kondisikondisi analisis,makaanalisis,makakondisikondisi pengujianpengujian hendaknyahendaknya dikendalikandikendalikanatauatau dilakukandilakukan dengandengan penuhpenuh kehatikehati--hatianhatian

Robustness (Robustness (KetangguhanKetangguhan)) metode metode ((lanjutanlanjutan))

JenisJenis keragamankeragaman kondisikondisi pengujianpengujian yang yang harusharus diperhatikandiperhatikan :: StabilitasStabilitas sampelsampel PengaruhPengaruh suhusuhu inkubasiinkubasi PengaruhPengaruh waktuwaktu inkubasiinkubasi KondisiKondisi aerobikaerobik atauatau anaerobikanaerobik ((untukuntuk

pengujianpengujian mikrobamikroba tertentutertentu)) PengaruhPengaruh jenisjenis media (media (nutrisinutrisi), ), dlldll

Robustness (Robustness (KetangguhanKetangguhan)) metode metode ((lanjutanlanjutan))

HasilHasil pengujianpengujian dievaluasidievaluasi secarasecaraStatistikaStatistika menggunakanmenggunakan ANOVA ANOVA atauatauAlgoritmaAlgoritma daridari YateYate

VALIDASI METODE ANALISIS MIKROBIOLOGIPENDAHULUANValidasi Metode AnalisisValidasi Metode Analisis (lanjutan)Validasi Metode Analisis (lanjutan)Jenis Validasi MetodeParameter Validasi metode analisis mikrobiologiPedoman ValidasiMetode analisis mikrobiologiMetode kualitatifMetode kuantitatifMetode Analisis MikrobiologiIdentifikasi MikroorganismeTahap Persiapan ValidasiParameter ValidasiAkurasi (Kecermatan)Akurasi (Kecermatan) (lanjutan)Akurasi (Kecermatan) (lanjutan)Contoh Perhitungan Akurasi dan Rekoveri MetodePerhitunganPresisi (Keseksamaan)Presisi (Keseksamaan) (lanjutan)Contoh Perhitungan Intermediate Precision pada ALT (angka lempeng total)Sensitifitas dan SpesifisitasSensitifitas dan Spesifisitas (lanjutan)Sensitifitas dan Spesifisitas (lanjutan)ContohRentang Hasil PengujianContohLinearity (Kelinieran)(untuk penetapan potensi antibiotika)Linearity (Kelinieran) (lanjutan)Linearity (Kelinieran) (lanjutan)Linearity (Kelinieran) (lanjutan)Syarat sampel untuk uji validasiValidasi Kit PereaksiTahapan dalam proses evaluasi kitRobustness (Ketangguhan) metode Robustness (Ketangguhan) metode (lanjutan)Robustness (Ketangguhan) metode (lanjutan)