VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID...

VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR

KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Yosua Agung Santoso

NIM : 168114018

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i




SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Yosua Agung Santoso

NIM : 168114018

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019


ii

Persetujuan Pembimbing




Skripsi yang diajukan oleh:

Yosua Agung Santoso

NIM : 168114018

Telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

Dr. Christine Patramurti, Apt. tanggal 25 November 2019


iii

Pengesahan Skripsi Berjudul




Oleh:

Yosua Agung Santoso

NIM : 168114018

Dipertahankan di hadapan Pantia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal: 17 Desember 2019

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.

Panitia Penguji: Tanda tangan

1. Dr. Christine Patramurti, Apt. ….……................

2. Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. ……………….....

3. Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt. ………………….


iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana

layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiatisme dalam naskah

saya, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 25 November 2019

Penulis

Yosua Agung Santoso


v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Saya yang bertanda tangan dibawah ini, mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

Nama : Yosua Agung Santoso

Nomor Mahasiswa : 168114018

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:




beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan

data, medistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya

maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya

sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 25 November 2019

Yang menyatakan

(Yosua Agung Santoso)


vi

ABSTRAK

Dalam proses memenuhi syarat standarisasi bahan baku produk bahan

alam menjadi produk obat herbal terstandar, diperlukan metode analisis yang

reliabel dan mampu memenuhi kebutuhan proses standarisasi bahan baku yang

akan dibuat produk obat herbal terstandar. Proses standarisasi bahan baku ekstrak

rimpang kunyit memerlukan metode analisis yang optimum dan valid guna

menetapkan kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit. Kurkumin di dalam

ekstrak rimpang kunyit yang memiliki tiga bentuk senyawa yaitu kurkumin,

demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin, sehingga diperlukan metode

analisis dengan selektivitas dan sensitivitas yang cukup tinggi. Oleh karena itu,

metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit yang reliabel perlu

ditetapkan.

Metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit menggunakan

HPLC telah dioptimasi dalam penelitian sebelumnya. Pada penelitian ini,

dilakukan validasi metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit

menggunakan HPLC fase terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air

(65:5:30 v/v), fase diam oktadesilsilan (C-18), serta laju alir 1,0 mL/menit.

Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi parameter selektivitas, linearitas,

rentang, akurasi, dan presisi.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode yang diuji memiliki

koefisien korelasi dan koefisien determinasi 0,999 (≥ 0,99) dan nilai resolusi

1,533 (≥ 1,5). Selain itu, akurasi intra-day dan inter-day adalah antara 97,03-

100,08% dan 96,11-99,88% (di dalam 85%-110%) dan presisi intra-day dan inter-

day adalah antara 0,10-1,65% dan 0,31-2,59% (≤ 4%). Metode yang diuji realibel

sehingga dapat digunakan untuk menetapkan kadar kurkumin dalam ekstrak

rimpang kunyit.

Kata Kunci: Ekstrak rimpang kunyit, HPLC, Kurkumin, Validasi


vii

ABSTRACT

In the process of meeting the standardization requirements of product raw

materials to become standardized herbal medicine, a reliable analysis method is

needed for standardization process for the raw material that will be make into a

standardized herbal medicinal products. The process of standardization of

turmeric rhizome extract raw materials requires an optimal and valid analytical

method to determine curcumin levels in turmeric rhizome extract. Curcuminoid in

turmeric rhizome extract which has three forms of compounds namely curcumin,

demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin, so that analytical methods with

high selectivity and sensitivity are needed. Therefore, the method of curcumin

analysis in a reliable turmeric rhizome extract needs to be established.

Curcumin analysis method in turmeric extract using HPLC has been

optimized in previous studies. In this study, the method of analysis of curcumin in

turmeric rhizome extract was validated using reverse phase HPLC with the mobile

phase of acetonitrile:methanol:water (65:5:30 v/v), octadesilsilan (C-18)

stationary phase, and flow rate 1,0 mL / minute. This study aims to validate the

parameters of selectivity, linearity, range, accuracy, and precision.

The results showed that the method tested had a correlation coefficient and

determination coefficient of 0.999 (≥ 0.99) and a resolution value of 1.533 (≥ 1.5).

In addition, intra-day and inter-day accuracy is between 97.03-100.08% and

96.11-99.88% (within 85% -110%) and intra-day and inter-day precision is

between 0,10-1.65% and 0.31-2.59% (≤ 4%). The tested method is reliable so it

can be used to determine the level of curcumin in turmeric rhizome extract.

Keywords: Curcumin, HPLC, Turmeric Rhizome Extract, Validation


viii

HALAMAN PERSEMBAHAN

Successful and unsuccessful people do not vary greatly in their abilities. They

vary in their desires to reach their potential.

-John Maxwell-

Sujud syukurku kusembahkan kepadaMu ya Allah, Tuhan Yang Maha Esa

Dengan in saya persembahkan karya ini untuk

Kedua orang tua saya yang telah memberikan kasih sayang

Setiap guru dan dosen, yang dengan sabar mendidik saya selama ini

Teman-teman yang selalu mendukung, merajut memori setiap harinya, tawa yang

setiap hari kita miliki, dan solidaritas yang luar biasa

Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menjadi tempat saya menimba

ilmu selama ini melalui pembelajaran kontekstual dan aplikatif.


ix

PRAKATA

Puji dan Syukur pada Tuhan Yang Maha Esa penulis panjatkan atas

berkat dan penyertaan-Nya dari awal penyusunan sampai tahap akhir penelitian

sehingga naskah skripsi berjudul Validasi Metode Analisis High Performance

Liquid Chromatography Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar Kurkumin Dalam

Ekstrak Rimpang Kunyit dapat terselesaikan. Skripsi ini merupakan bagian dari

penelitian Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. yang berjudul “Micropaticles to

Potentially Improve Bioavailability of Curcumin and Antidiabetic Activities in Pre

Clinical Studies: Combining Solid Dispersion Technology and Metabolism

Suppressors” berdasarkan SK nomor 035b/LPPM USD/IV/2019.

Dalam proses penyelesaian naskah skripsi, penulis menerima banyak

dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin

mengucapkan banyak terima kasih kepada:

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma

2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan dosen pembimbing yang

telah berperan seperti orang tua dan senantiasa memberikan masukan, arahan,

serta pendampingan dengan sabar selama proses penyusunan skripsi.

3. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik dan

dosen penguji yang selalu memberikan masukan, pendampingan, dan kritik

yang membangun.

4. Bapak Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt., selaku dosen penguji yang

senantiasa memberikan kritik, masukan, dan saran yang membangun.

5. Mas Bimo (Laboran Laboratorium Kimia Instrumen Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma), Bapak Bimo (Laboran Laboratorium Analisis

Pusat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma), dan Bapak Kayat

(Laboran Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma) yang telah membantu dan memfasilitasi kegiatan penelitian di

laboratorium.


x

6. Rekan penelitian Maria Philomia Christanti Raga, Sinta Susanti, dan Christin

Nesia Sukma Wijayanti atas dukungan, solidaritas, suka-duka, dan kerja sama

selama proses penelitian.

7. Pihak lain yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Selama proses penyusunan skripsi penulis menyadari bahwa masih

terdapat banyak kekurangan dalam naskah ini. Oleh karena itu, penulis sangat

terbuka terhadap segala masukan, saran dan kritik yang membangun agar naskah

skripsi ini dapat menjadi lebih baik dan bermanfaat. Akhir kata, semoga naskah

skripsi ini dapat bermanfaat dan berguna bagi pembaca.

Yogyakarta, 25 November 2019

Penulis


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL……………………………………………..…..

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………...…

HALAMAN PENGESAHAN………………………………………..

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………...

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI…………………….

ABSTRAK…………………………………………………………...

ABSTRACT…………………………………………………………...

HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………...

PRAKATA…………………………………………………………...

ii

iii

iv

v

vi

vii

vii

ix

DAFTAR ISI………………………………………………………… xi

DAFTAR TABEL.....………………………………………………... xii

DAFTAR GAMBAR………………………………………………… xiii

DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………….... xiv

PENDAHULUAN…………………………………………………… 1

METODE PENELITIAN…………….……………..…….................. 4

HASIL DAN PEMBAHASAN……..…...…………...……………… 9

KESIMPULAN………..….…………...……………………….……. 16

SARAN………………….....…..………………………...................... 16

DAFTAR PUSTAKA………………...…...…………………………. 17

LAMPIRAN…………….…..…………...…………….……………..

BIOGRAFI PENULIS………………………………………………..

19

39


xii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Data waktu retensi, resolusi dan tailing factor senyawa

kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit ……….............

10

Tabel II. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 7 seri konsentrasi

baku kurkumin ………………...…..………………........

11

Tabel III. Data rentang………………………………...…………...

Tabel IV. Data intra-day akurasi dan presisi kurkumin …………...

Tabel V. Data inter-day akurasi dan presisi kurkumin …………...

13

15

15


xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Kromatogram larutan baku kurkumin konsentrasi 0,5

µg/mL …………………………………………………

Gambar 2. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5

µg/mL …………………………………………………

Gambar 3. Stacking kromatogram kurva baku kurkumin replikasi

ketiga……......................................................................

Gambar 4. Kurva baku kurkumin replikasi ketiga ………..……....

Gambar 5. Stacking kromatogram adisi baku kurkumin…………..

9

10

12

12

14


xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku kurkumin…….

Lampiran 2. Kromatogram perolehan kembali……………………..

Lampiran 3. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5

µg/mL………………………………………………....

Lampiran 4. Data AUC perolehan kembali dan presisi…………….

19

32

36

37


1

PENDAHULUAN

Sampai saat ini telah banyak pemanfaatan tanaman obat tradisional oleh

masyarakat Indonesia untuk menanggulangi beberapa penyakit. Manfaat

penggunaan obat tradisional tersebut secara luas telah dirasakan oleh masyarakat.

Hal ini juga tercermin dengan semakin meningkatnya penggunaan obat

tradisional, sehingga memberi dampak meningkatnya produksi obat dari industri

obat tradisional. Penggunaan senyawa bahan alam tersebut giat dilakukan sebagai

alternatif pengobatan di samping obat sintesis (Pulido et al., 2016).

Badan Pengawasan Obat dan Makanan (BPOM) mendorong

perkembangan obat herbal sampai tingkat obat herbal terstandar bahkan sampai ke

tingkat fitofarmaka yang bertujuan untuk menjamin keamanan obat herbal yang

akan digunakan oleh masyarakat. Obat herbal terstandar adalah sediaan obat

bahan alam yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan

uji praklinik dan bahan bakunya telah di standarisasi (BPOM, 2014). Proses

pengembangan produk bahan alam menjadi produk obat herbal terstandar

memerlukan proses standarisasi bahan baku yang dilanjutkan dengan proses uji

praklinik pada hewan untuk membuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah

(BPOM, 2014). Dalam proses memenuhi syarat standarisasi bahan baku ekstrak

rimpang kunyit menjadi produk obat herbal terstandar, diperlukan metode analisis

yang reliabel dan mampu memenuhi kebutuhan proses standarisasi bahan baku

yang akan dibuat produk obat herbal terstandar.

Proses standarisasi bahan baku ekstrak rimpang kunyit memerlukan

metode analisis yang optimum dan valid guna menetapkan kadar kurkumin dalam

ekstrak rimpang kunyit. Kurkuminoid di dalam ekstrak rimpang kunyit memiliki

tiga bentuk senyawa yaitu kurkumin, demetoksikurkumin dan bis-

demetoksikurkumin, sehingga diperlukan metode analisis dengan selektivitas dan

sensitivitas yang cukup tinggi. Metode analisis diharapkan selektif sehingga

mampu memisahkan senyawa kurkumin yang ada di dalam ekstrak rimpang

kunyit dari bentuk turunan lainnya yaitu demetoksikurkumin dan bis-

demetoksikurkumin dengan baik. Metode analisis diharapkan mampu mengukur


2

kadar kurkumin dengan sensitivitas yang baik sehingga dapat lebih baik dalam

penetapan kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit.

Dalam berbagai penelitian yang pernah ada sebelumnya menunjukkan

bahwa kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit dapat ditetapkan dengan

metode Spektrofotometri UV-Vis, KLT-Densitometer dan HPLC fase terbalik.

Beberapa metode spektrofotometri UV-Vis telah dikembangkan untuk analisis

kadar kurkumin (Setyaningsih et al., 2016; Jankun et al., 2016). Pada penelitian

menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis didapat hasil berupa kadar

kurkuminoid total karena metode tersebut tidak mampu memisahkan kurkumin

dari bentuk turunan lainnya yaitu demetoksikurkumin dan bis-

demetoksikurkumin. Metode spektrofotometri UV-Vis kurang selektif dibanding

dengan metode kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair yang mampu

memisahkan kurkumin dari bentuk turunan lainnya.

Beberapa metode kromatografi lapis tipis telah dikembangkan untuk

menyediakan kebutuhan metode yang lebih selektif dibanding metode

spektrofotometri UV-Vis yang dapat diandalkan untuk penentuan kadar kurkumin

dalam ekstrak rimpang kunyit (Phattanawasin et al., 2009; Gantait et al., 2011;

Setyaningsih et al., 2016). Metode kromatografi lapis tipis terbukti mampu

memisahkan kurkumin dari bentuk turunan lainnya yaitu demetoksikurkumin dan

bis-demetoksikurkumin. Pada penelitian menggunakan metode kromatografi lapis

tipis mampu memberikan pemisahan sempurna puncak kurkumin dari puncak

senyawa derivat kurkumin dengan Rf 0,50 dan Rs 2,62. Linearitas metode

ditunjukkan oleh nilai r sebesar 0,996. Metode KLT ini memberikan presisi dan

akurasi sesuai dengan regulasi yaitu RSD ≤ 3,50 dan perolehan kembali 94-105%.

Metode kromatografi lapis tipis memiliki sensitifitas yang cukup tinggi, mampu

mengukur kadar terendah kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit hingga 1,3

μg/mL. Metode kromatografi lapis tipis kurang sensitif dibanding dengan metode

kromatografi cair yang mampu mengukur kadar sampel hingga satuan ng/mL

(ppb).

Beberapa metode Reverse Phase High Performance Liquid

Chromatography (RP-HPLC) telah dikembangkan untuk menyediakan kebutuhan


3

metode yang selektif dan sensitif yang dapat diandalkan untuk penentuan

kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit (Wichitnithad et al., 2009; Ali et al.,

2014; Monton et al., 2016; Setyaningsih et al., 2016; Fonseca et al., 2017;

Khismatrao et al., 2018). Pada penelitian menggunakan metode RP-HPLC mampu

memberikan pemisahan sempurna puncak kurkumin dari puncak senyawa derivat

kurkumin dengan Tf 0,9-1,2 dan Rs 1,5-2,0. Linearitas metode ditunjukkan oleh

nilai r sebesar 0,99. Metode RP-HPLC mampu memberikan presisi dan akurasi

sesuai dengan regulasi yaitu RSD ≤ 4% dan perolehan kembali 92,47-105,70%.

Metode RP-HPLC juga memiliki sensitifitas yang tinggi, mampu mengukur kadar

terendah kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit hingga 6 ng/mL. Penelitian

mengenai deteksi kadar kurkumin dilakukan oleh Ali, Haque, dan Saleem dengan

menggunakan fase diam C-18 dan komposisi fase gerak asetonitril:metanol:air

dengan perbandingan 40:20:40 v/v (Ali, et al., 2014). Pada penelitian kali ini,

penulis mengacu pada penelitian Ali, Haque, dan Saleem dengan menggunakan

modifikasi sistem fase gerak yang sudah dioptimasi pada penelitian sebelumnya.

Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian penelitian penetapan

kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit dengan menggunakan metode

HPLC fase terbalik yang terdiri dari tahap optimasi dan validasi. Penulis akan

melakukan validasi terhadap metode tersebut. Proses validasi metode analisis

dilakukan untuk memastikan bahwa parameter kinerja metode analisis mampu

mengatasi masalah analisis dan menunjukkan bahwa metode analisis yang

digunakan layak digunakan untuk analisis senyawa kurkumin (ICH, 2005).

Validasi metode dilakukan ketika metode baru diterapkan untuk mengatasi

permasalahan analisis tertentu, ketika metode yang sudah baku direvisi, ketika

metode baku diterapkan di laboratorium yang berbeda, mendemonstrasikan

kesetaraan dua metode, serta apabila adanya perubahan instrumen dan analit

(Gandjar dan Rohman, 2007). Beberapa parameter validasi yang digunakan

meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi (USP, 2017).


4

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas pro

analysis, meliputi ekstrak rimpang kunyit dengan kandungan kurkuminoid 95%

(PT. Phytocemindo Reksa), baku kurkumin tingkat kemurnian 98% (Nacalai Inc.),

metanol grade for liquid chromatography (E. Merck), asetonitril grade for liquid

chromatography (E. Merck), dan aquabidestilata. Bahan lainnya diperoleh dari

Laboratorium Kimia Analisis Instrumen Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penilitian ini meliputi seperangkat HPLC

merk Shimadzu dengan detektor UV (LC-2010C HT Shimadzu), kolom C-18

(Knaurer) dengan dimensi 250 x 4,6 mm dan ukuran pori 5 µm; seperangkat

komputer (Dell B6RDZIS Connexant system RD01-D850 A03-0382 JP France

S.A.S); printer (HP Deskjet 1000 J110a); ultrasonikator (RETSCH); neraca

analitis ultramicro (RADWAG®) seri UYA 2.3Y dengan kapasitas timbang

maksimal 2,1 g, minimal 0,01 mg, dan d = 0,1 µg; neraca analitis (Scaltec) dengan

kapasitas timbang maksimal 60/210 g, minimal 0,001 g, d = 0,01 mg, dan e = 1

mg; jarum suntik (Terumo); syringe filter 0,45 µm (Ministar®); pompa vakum;

whatman membrane filter dengan ukuran pori sebesar 0,45 µm dan diameter

sebesar 47 mm; corong buchner; mikropipet (Socorex); dan peralatan-peralatan

yang biasa digunakan di dalam laboratorium analisis farmasi.

Tata Cara Penelitian

Pembuatan fase gerak

Fase gerak terbuat dari asetonitril, metanol dan air dengan perbandingan

65:5:30 v/v. Setiap komponen disaring dengan menggunakan kertas saring

whatman pada corong buchner, dibantu dengan pompa vakum, kemudian

diawaudarakan selama 15 menit dengan ultrasonikator. Pencampuran komponen

fase gerak dilakukan di dalam instrumen HPLC.


5

Pembuatan Larutan Baku Kurkumin

Pembuatan larutan stok kurkumin 1000 µg/mL

Sebanyak kurang lebih 1,0 mg baku kurkumin yang ditimbang seksama

dilarutkan dalam mikrotube dengan metanol sampai tanda batas 1 ml sehingga

diperoleh larutan stok kurkumin 1000 µg/mL.

Pembuatan larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL

Sebanyak 100 µL larutan stok baku kurkumin 1000 µg/mL diambil

kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol sampai tanda batas 1 ml

sehingga diperoleh larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL.

Pembuatan larutan intermediet baku kurkumin 10 µg/mL

Sebanyak 100 µL larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL diambil

kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol sampai tanda batas 1 ml

sehingga diperoleh larutan intermediet baku kurkumin 10 µg/mL.

Pembuatan seri larutan baku kurkumin

Pembuatan seri larutan baku kurkumin (konsentrasi 40; 35; 30; 25; 20; 15;

dan 10 µg/mL)

Sebanyak 400 µL; 350 µL; 300 µL; 250 µL; 200 µL; 150 µL; 100 µL

larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL masing-masing dimasukkan dalam

mikrotube, kemudian diencerkan dengan metanol sampai tanda batas 1 ml

sehingga diperoleh seri larutan baku kurkumin dengan konsentrasi 40 µg/mL; 35

µg/mL; 30 µg/mL; 25 µg/mL; 20 µg/mL; 15 µg/mL; dan 10 µg/mL.

Pembuatan seri larutan baku kurkumin (konsentrasi 5,0; 2,5; 1,0; 0,5; 0,1;

dan 0,05 µg/mL)

Sebanyak 500 µL; 250 µL; 100 µL; 50 µL; 10 µL; 5 µL larutan

intermediet baku kurkumin 10 µg/mL masing-masing dimasukkan dalam

mikrotube, kemudian diencerkan dengan metanol sampai tanda batas 1 ml

sehingga diperoleh seri larutan baku kurkumin dengan konsentrasi 5,0 µg/mL; 2,5

µg/mL; 1,0 µg/mL; 0,5 µg/mL; 0,1 µg/mL; dan 0,05 µg/mL.

Preparasi larutan ekstrak rimpang kunyit

Ditimbang kurang lebih 10 mg ekstrak rimpang kunyit dengan seksama,

kemudian dilarutkan dalam labu takar 10,0 mL dengan metanol hingga tanda


6

batas sehingga diperoleh larutan ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 1000

µg/mL (larutan A). Sebanyak 1,0 mL larutan A diambil kemudian dilarutkan

dengan menggunakan metanol dalam labu takar 10,0 mL sampai tanda batas

sehingga diperoleh larutan ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 100 µg/mL

(larutan B). Sebanyak 100 µL larutan B diambil kemudian dilarutkan dengan

menggunakan metanol pada mikrotube sampai tanda batas 1 ml sehingga

diperoleh larutan ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 10 µg/mL (larutan

C). Sebanyak 50 µL larutan C diambil kemudian dilarutkan dengan menggunakan

metanol pada mikrotube sampai tanda batas 1 ml sehingga diperoleh larutan

ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 0,5 µg/mL (larutan D).

Validasi Metode Analisis

Selektivitas

Larutan baku kurkumin konsentrasi 0,5 µg/mL diinjeksikan ke dalam

HPLC fase terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v) serta

fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0 mL/menit, kemudian

larutan ekstrak kurkumin dengan konsentrasi 0,5 µg/mL diinjeksikan ke dalam

HPLC fase terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v) serta

fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0 mL/menit. Replikasi

dilakukan sebanyak 3 kali, sehingga diperoleh waktu retensi senyawa kurkumin

dan nilai daya resolusi.

Kurva Baku Kurkumin

Larutan seri baku kurkumin dengan konsentrasi 25 µg/mL; 20 µg/mL; 15

µg/mL; 10 µg/mL; 5,0 µg/mL; 2,5 µg/mL; 1,0 µg/mL yang telah dibuat disaring

dengan syringe filter lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan

diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan fase gerak

asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v) serta fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju

fase gerak 1,0 mL/menit. Luas area kurkumin akan ditunjukkan oleh

kromatogram. Kurva baku diperoleh dengan memplotkan luas area kurkumin

dengan kadar baku kurkumin.


7

Linearitas dan Rentang

Larutan seri baku kurkumin dengan konsentrasi 40 µg/mL; 35 µg/mL; 30

µg/mL; 25 µg/mL; 20 µg/mL; 15 µg/mL; 10 µg/mL; 5,0 µg/mL; 2,5 µg/mL; 1,0

µg/mL; 0,5 µg/mL; 0,1 µg/mL; dan 0,05 µg/mL yang telah dibuat disaring dengan

syringe filter lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan diinjeksikan ke

dalam HPLC fase terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v)

serta fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0 mL/menit.

Pembacaan seri baku kurkumin dilakukan sebanyak 3 kali replikasi.

Akurasi dan Presisi

Intra-day dan inter-day presisi dan akurasi dilakukan dengan

menggunakan sampel ekstrak rimpang kunyit kosentrasi 0,5 µg/mL yang

ditambahkan tiga tingkatan konsentrasi baku kurkumin yang berbeda, dilakukan

replikasi 3 kali untuk masing-masing konsentrasi dan mengulangi penelitian

selama tiga hari berturut-turut pada. Baku kurkumin yang ditambahkan memiliki

tingkat konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi yaitu 1 µg/mL, 10 µg/mL, 20

µg/mL secara berurutan. Sebanyak 50 µL larutan ekstrak rimpang kunyit dengan

konsentrasi 10 µg/mL diambil kemudian ditambahkan 100 µL larutan intermediet

baku kurkumin 10 µg/mL, dilarutkan dengan menggunakan metanol pada

mikrotube sampai tanda batas 1 ml (Larutan Adisi 1). Sebanyak 50 µL larutan

ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 10 µg/mL diambil kemudian

ditambahkan 100 µL larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL, dilarutkan

dengan menggunakan metanol pada mikrotube sampai tanda batas 1 ml (Larutan

Adisi 2). Sebanyak 50 µL larutan ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 10

µg/mL diambil kemudian ditambahkan 200 µL larutan intermediet baku kurkumin

100 µg/mL, dilarutkan dengan menggunakan metanol pada mikrotube sampai

tanda batas 1 ml (Larutan Adisi 3). Setiap larutan disaring dengan syringe filter

dan diawaudarakan selama 5 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam HPLC fase

terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v) serta fase diam

oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0 mL/menit. Semua percobaan

dilakukan dalam 3 replikasi untuk setiap tingkatan konsentrasi, kemudian nilai

recovery dan koefisien variasi dapat dihitung.


8

Analisis Hasil

Selektivitas

Parameter ini ditentukan dengan nilai resolusi puncak dari senyawa

kurkumin yang didapat. Perbandingan waktu retensi yang sama antara baku

kurkumin dan senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit membuktikan

bahwa puncak tersebut adalah benar merupakan puncak dari senyawa kurkumin.

Metode analisis yang diuji dikatakan selektif apabila memiliki nilai resolusi ≥ 1,5

(AOAC, 2019).


Nilai koefisien korelasi (r) merupakan nilai yang menentukan linearitas

suatu metode. Koefisien korelasi diperoleh dari plot perbandingan AUC baku

kurkumin terhadap konsentrasi baku kurkumin. Metode analisis dikatakan linear

apabila memiliki nilai koefisien korelasi lebih besar dari 0,99 (AOAC, 2019).

Rentang diperoleh dengan melakukan penambahan 3 konsentrasi di atas titik

tertinggi kurva baku dan 3 konsentrasi dibawah titik terendah kurva baku. Nilai

koefisien determinasi (R2) didapat dari pengkuadratan koefisien korelasi rentang

baku kurkumin dengan konsentrasi 0,05 µg/mL-40 µg/mL. Rentang yang baik

memiliki nilai koefisien determinasi lebih besar dari 0,99 menunjukkan metode

analisis mampu memastikan kadar kurkumin dalam analit tidak mengalami

ekstrapolasi (AOAC, 2019).

Akurasi dan Presisi

Akurasi suatu metode ditunjukkan dengan nilai perolehan kembali. Nilai

tersebut dapat diperoleh dengan membandingkan konsentrasi sampel yang

didapat dengan konsentrasi analit sebenarnya melalui rumus perolehan kembali.

Syarat nilai perolehan kembali yang dapat diterima sesuai dengan konsentrasi

baku kurkumin yang ditambahkan adalah 85-110% (AOAC, 2019). Presisi suatu

metode ditunjukkan dengan nilai koefisien variasi. Syarat nilai koefisien variasi

yang dapat diterima sesuai dengan konsentrasi baku kurkumin yang ditambahkan

adalah ≤ 4% (AOAC, 2019).


9

HASIL DAN PEMBAHASAN

Validasi metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit

dilakukan dengan menggunakan kolom C18; perbandingan fase gerak

asetonitril:metanol:air sebesar 65:5:30; laju alir 1,0 mL/menit; pembacaan pada

panjang gelombang 420 nm; volume injeksi 20 µL; dan waktu pembacaan selama

7 menit. Seluruh prosedur tersebut telah dioptimasi dalam penelitian sebelumnya

dengan nilai tailing factor sebesar 1,180; resolusi pada konsentrasi 45 µg/mL

sebesar 1,739; dan waktu retensi sebesar 5,289. Parameter yang divalidasi dalam

penelitian ini meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

Penentuan Selektivitas

Selektivitas adalah parameter yang menunjukkan kemampuan metode

analisis dalam membedakan dan menghitung analit dari senyawa lain dalam

sampel. Selektivitas merupakan informasi yang menunjukkan bahwa substansi

yang diukur adalah substansi yang dikehendaki untuk dianalisis (FDA, 2018).

Gambar 1. Kromatogram larutan baku kurkumin konsentrasi 0,5 µg/mL; “A” merupakan

puncak senyawa kurkumin.

Pada Gambar 1 di atas, tampak bahwa setelah menit ketiga, tidak ada puncak dan

tidak ada gangguan yang ditemukan sehingga tidak akan menganggu hasil analisis

puncak senyawa kurkumin. Pada Gambar 1 dan Gambar 2, tampak bahwa

perbandingan waktu retensi yang sama antara baku kurkumin dan senyawa

kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit yang sama yaitu pada 5,3 menit

membuktikan bahwa puncak tersebut adalah benar merupakan puncak dari

senyawa kurkumin.

A


10

Gambar 2. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5 µg/mL; “A”, “B”, dan “C”

merupakan puncak kurkumin, demetoksikurkumin, dan bis-demetoksikurkumin secara berurutan.

Selektivitas metode dapat dilihat dari nilai resolusi peak senyawa yang

hendak dianalisis. Daya resolusi bernilai paling tidak 1,5 di antara dua puncak

akan mengkonfirmasi bahwa senyawa dalam sampel sepenuhnya terpisah

sehingga jumlah masing-masing senyawa dapat diukur secara akurat (AOAC,

2019). Keterpisahan senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit konsentrasi

0,5 µg/mL dengan peak yang berada disebelahnya dapat dilihat pada

kromatogram Gambar 2. Data resolusi senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang

kunyit konsentrasi 0,5 µg/mL disajikan dalam Tabel I. Daya resolusi rata-rata

senyawa kurkumin dalam ekstrak kurkumin konsentrasi 0,5 µg/mL bernilai

sebesar 1,533. Metode memiliki nilai resolusi lebih dari 1,5 sehingga metode yang

diuji memenuhi parameter selektivitas.

Tabel I. Data waktu retensi, resolusi dan tailing factor senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit

Konsentrasi

(µg/mL)

Rata-rata

Waktu

Retensi

RSD

(%)

Rata-rata

Resolusi

RSD

(%)

Rata-rata

Tailing

factor

RSD

(%)

0,5 µg/mL 5,326 ± 0,01 0,21 1,533 ± 0,01 0,57 1,289 ± 0,01 0,85

15 µg/mL 5,345 ± 0,02 0,42 1,801 ± 0,01 0,82 1,256 ± 0,01 1,00

30 µg/mL 5,333 ± 0,01 0,25 1,778 ± 0,03 1,61 1,255 ± 0,01 0,76

45 µg/mL 5,304 ± 0,02 0,28 1,696 ± 0,04 2,45 1,208 ± 0,01 1,07

A

B

C


11

Penentuan Kurva Baku

Kurva baku diperoleh dari hubungan respon instrumen yang berupa nilai

Area Under Curve (AUC) terhadap konsentrasi baku kurkumin. Seri konsentrasi

baku yang terdapat dalam kurva baku harus mampu menjangkau kadar sampel

analit. Pembuatan kurva baku pada penelitian ini menggunakan seri konsentrasi

baku kurkumin 1 µg/mL; 2,5 µg/mL; 5 µg/mL; 10 µg/mL; 15 µg/mL; 20 µg/mL;

dan 25 µg/mL.

Tabel II. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 7 seri konsentrasi baku kurkumin

Konsentrasi

(µg/mL)

AUC

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

1 196744 208490 208132

2,5 513113 481414 517977

5 981099 954252 1036290

10 1980578 2095571 2018970

15 2903036 3009783 2988214

20 4037150 4041326 4270044

25 4765075 4714627 5259697

a 25754,061 45726,009 -35472,449

b 193586,198 193444,343 210797,849

Koefisien korelasi 0,9991 0,9990 0,9992

Dari data tiga replikasi seri konsentrasi baku kurkumin yang disajikan

pada Tabel II, seri konsentrasi kurva baku yang digunakan adalah seri kurva baku

dengan nilai koefisien korelasi paling mendekati 1,0, yaitu seri konsentrasi kurva

baku replikasi ketiga dengan nilai a sebesar -35472,449; nilai b sebesar

210797,849; dan koefisien korelasi 0,9992. Kurva baku dapat dikatakan linear

ketika memiliki nilai koefisien korelasi lebih besar dari 0,99 (AOAC, 2019).

Kurva baku yang digunakan memiliki nilai koefisien korelasi lebih dari 0,99 yaitu

sebesar 0,9992 sehingga kurva baku bersifat linear.

Persamaan kurva baku diperoleh dari plot perbandingan AUC baku

kurkumin terhadap konsentrasi baku kurkumin. Hubungan antara konsentrasi

baku kurkumin dengan nilai AUC kurkumin dapat dilihat pada Gambar 2.

Semakin tinggi konsentrasi baku kurkumin, maka respon instrumen berupa nilai

AUC akan meningkat. Hubungan tersebut dapat dilihat secara visual pada Gambar

3 dan Gambar 4. Persamaan berupa y=bx+a didapat dari kurva baku (b adalah


12

slope; a adalah intercept; y adalah AUC; dan x adalah kadar kurkumin).

Persamaan yang didapatkan dari seri konsentrasi baku kurkumin replikasi ketiga

adalah y = 210797,849 x – 35472,450. Kadar kurkumin (x) didapat dengan

memasukkan nilai AUC ke dalam y pada persamaan.

Gambar 3. Stacking kromatogram kurva baku kurkumin replikasi ketiga

Gambar 4. Kurva baku kurkumin replikasi ketiga

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

uV

y = 210797,849x - 35472,450

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0 5 10 15 20 25 30

AU

C

Konsentrasi (µg/mL)

Kurva Baku Kurkumin

25 µg/mL

20 µg/mL

15 µg/mL

10 µg/mL

5 µg/mL

2,5 µg/mL

1 µg/mL


13


Rentang kurva baku diperoleh dengan menambahkan tiga seri konsentrasi

di atas titik tertinggi kurva baku dan tiga konsentrasi di bawah titik terendah dari

seri konsentrasi baku yang telah ditetapkan. Tujuan dari dibuatnya rentang kurva

baku adalah untuk memastikan respon instrumen terhadap analit yang berada di

luar kurva tetap berada dalam rentang yang ditetapkan dan kadar kurkumin dalam

analit tidak mengalami ekstrapolasi. Pada penelitian ini, seri konsentrasi baku 0,05

µg/mL; 0,1 ng/mL; 0,5 µg/mL; 1 µg/mL; 2,5 µg/mL; 5 µg/mL; 10 µg/mL; 15

µg/mL; 20 µg/mL; 25 µg/mL; 30 µg/mL; 35 µg/mL; dan 40 µg/mL digunakan

sebagai rentang. Data ketiga replikasi rentang dapat dilihat pada Tabel III.

Tabel III. Data rentang

Konsentrasi

(µg/mL)

AUC


0,05 10751 9783 11199

0,1 17310 19974 18748

0,5 107333 107388 112155

1 196744 208490 208132

2,5 513113 481414 517977

5 981099 954252 1036290

10 1980578 2095571 2018970

15 2903036 3009783 2988214

20 4037150 4041326 4270044

25 4765075 4714627 5259697

30 6113689 6046586 6077211

35 6910579 6979475 6956811

40 7959603 7984655 7977384

Koefisien

korelasi

(r)

0,9996

0,9995

0,9994

Koefisien

determinasi

(R2)

0.9992

0,9990

0,9988

Dari data tiga replikasi rentang yang disajikan pada Tabel III, digunakan

rentang replikasi pertama dengan nilai koefisien korelasi paling mendekati 1,0.

Dari data rentang replikasi pertama diperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar

0,9996 dan koefisien determinasi (R2) sebesar 0,9992. Data hasil penelitian

menunjukkan metode memiliki koefisien korelasi ≥ 0,99 (0,9996) dan koefisien


14

determinasi ≥ 0,99 yaitu sebesar 0,9992 yang berarti peningkatan konsentrasi

kurkumin mempengaruhi peningkatan AUC kurkumin sebesar 99,92%. Kurva

kalibrasi standar baku kurkumin menunjukkan linearitas yang sangat baik dan

koefisien korelasi yang tinggi selama rentang 0,05-40 µg/mL. Dengan demikian,

dapat disimpulkan bahwa metode analisis kurkumin yang diuji bersifat linear serta

peningkatan konsentrasi kurkumin memiliki pengaruh yang signifikan terhadap

peningkatan AUC kurkumin.

Akurasi dan Presisi

Akurasi suatu metode ditunjukkan dengan nilai perolehan kembali,

sedangkan presisi suatu metode ditunjukkan dengan nilai koefisien variasi dari

tiga tingkatan konsentrasi yang berbeda. Nilai perolehan kembali didapat dengan

menggunakan larutan ekstrak rimpang kunyit dan larutan ekstrak rimpang kunyit

yang diadisi baku kurkumin. Nilai perolehan kembali ditetapkan dengan paling

sedikit tiga konsentrasi (rendah, sedang, dan tinggi) dan paling sedikit tiga kali

pengukuran tiap konsentrasi dengan penambahan baku kurkumin. Pada penelitian

ini, dilakukan penentuan akurasi dan presisi intra-day dan inter-day untuk

kuantifikasi kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit. Penambahan baku kurkumin

dilakukan dengan tiga tingkatan konsentrasi, yaitu 1 µg/mL (rendah), 10 µg/mL

(sedang), dan 20 µg/mL (tinggi). Penambahan baku kurkumin dilakukan sebanyak

tiga replikasi untuk setiap tingkatan konsentrasi dan dilakukan selama tiga hari

berturut-turut.

Gambar 5. Stacking kromatogram adisi baku kurkumin

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

uV

Adisi baku kurkumin

Non adisi


15

Tabel IV. Data intra-day akurasi dan presisi kurkumin

Senyawa

Intra-day

Konsentrasi

baku yang

ditambahkan

(µg/ml)

Konsentrasi

yang didapat

kembali

(µg/ml)

Perolehan

Kembali

(%)

RSD

(%)

Kurkumin

1,00 0,97 ± 0,016 97,03 1,65

10,00 9,78 ± 0,010 97,75 0,10

20,00 20,02 ± 0,045 100,08 0,22

Tabel V. Data inter-day akurasi dan presisi kurkumin

Senyawa

Inter-day

Konsentrasi

baku yang

ditambahkan

(µg/ml)

Konsentrasi

yang didapat

kembali

(µg/ml)

Perolehan

Kembali

(%)

RSD

(%)

Kurkumin

1,00 0,96 ± 0,025 96,11 2,59

10,00 9,78 ± 0,031 97,76 0,31

20,00 19,98 ± 0,409 99,88 2,00

Berdasarkan data perolehan kembali kurkumin yang disajikan pada Tabel

IV dan Tabel V, nilai persen perolehan kembali intra-day dan inter-day untuk

kurkumin adalah antara 97,03-100,08% dan 96,11-99,88% secara berurutan.

Berdasarkan nilai-nilai tersebut, dapat disimpulkan bahwa metode analisis

kurkumin yang diuji memenuhi parameter akurasi.

Berdasarkan AOAC 2019, suatu metode analisis yang duji dikatakan

memenuhi parameter presisi ditunjukkan dari nilai persen koefisien variasi atau

persen relative standard deviation. Berdasarkan data yang disajikan pada Tabel

IV dan Tabel V, nilai persen koefisien variasi atau persen relative standard

deviation intra-day dan inter-day untuk kurkumin adalah antara 0,10-1,65% dan

0,31-2,59% secara berurutan. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa metode

analisis kurkumin yang diuji memenuhi parameter presisi.


16

KESIMPULAN


HPLC fase terbalik dengan kolom C18; fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30

v/v); laju alir 1,0 mL/menit yang telah dioptimasi dan divalidasi pada penelitian

ini memiliki waktu retensi senyawa kurkumin yang lebih cepat dengan

keterpisahan senyawa kurkumin dalam sampel ekstrak rimpang kunyit yang

sepenuhnya terpisah sehingga jumlah senyawa kurkumin dapat diukur secara

akurat, memiliki waktu kerja dan pemakaian fase gerak yang lebih efisien

dibandingkan dengan metode yang pernah ada pada penelitian-penelitian

sebelumnya serta memiliki linearitas, akurasi dan presisi yang baik.


HPLC fase terbalik dengan kolom C18; fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30

v/v); laju alir 1,0 mL/menit memenuhi parameter validitas linearitas (r=0,9996

dan R2=0,9992), selektivitas (nilai resolusi pada ekstrak rimpang kunyit

konsentrasi 0,5 µg/mL sebesar 1,531), akurasi intra-day dan inter-day (persen

perolehan kembali adalah 97,03-100,08% dan 96,11-99,88% secara berurutan)

serta presisi (persen relative standard deviation antara 0,10-1,65% dan 0,31-

2,59% untuk intra-day dan inter-day precision secara berurutan) sehingga metode

analisis kurkumin yang diuji dapat digunakan untuk penetapan kadar kurkumin

dalam ekstrak rimpang kunyit.

SARAN

Penelitian terkait penetapan kadar kurkumin dalam sampel ekstrak

rimpang kunyit dapat menggunakan metode yang telah divalidasi ini.


17

DAFTAR PUSTAKA

Aggarwal, B.B., Bhatt, I.D., Ichikawa, H., Ahn, K.S., Sethi, G., Sundaram, C.,

Seeram, N., Shisodia, S., 2006. Curcumin-Biological and Medicinal

Properties. Turmeric: The Genus Curcuma, 1(6), 297-368.

Ali, I., Haque, A., Saleem, K., 2014. Separation and Identification of

Curcuminoids in Turmeric Powder by HPLC Using Phenyl Column.

Analytical Methods, 6(8), 2526-2536.

AOAC, 2019. AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical

Methods for Dietary Supplements and Botanicals. 1-27.

BPOM, 2014. Pedoman Uji Klinik Obat Herbal. Badan Pengawas Obat dan

Makanan Republik Indonesia.

Fonseca, B., Gremião, M.P.D., Chorilli, M., 2017. A Simple Reversed Phase High

Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method for Determination of

In Situ Gelling Curcumin-loaded Liquid Crystals in In Vitro Performance

Tests. Arabian Journal of Chemistry, 10(7), 1029-1037.

Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi: Analisis. Pustaka Pelajar,

Yogyakarta.

Gantait, A., Barman, T., Mukherjee, P.K., 2011. Validated Method for Estimation

of Curcumin in Turmeric Powder. Indian Journal of Traditional Knowledge,

10(2), 247–250.

Günzler, H., Williams, A., 2008. Handbook of Analytical Techniques. Wiley-

VCH, Germany.

International Conference on Harmonization, 2005. Harmonized Tripartite

Guideline Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.

International Conference on Harmonization, Genova.

Jankun, J., Wyganowska, M., Dettlaff, K., JelinSka, A., Surdacka, A., Watróbska,

D., Jankun, E., 2016. Determining Whether Curcumin Degradation is

Actually Bioactivation. International Journal of Molecular Medicine, 37(5),

1151–1158.

Jayaprakasha, G.K., Jagan Mohan Rao, L., Sakariah, K.K., 2002. Improved HPLC

Method for the Determination of Curcumin, Demethoxycurcumin, and

Bisdemethoxycurcumin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50,

3668-3682.

Kazakevich, Y., LoBrutto, R., 2007. HPLC for Pharmaceutical Scientists. Wiley-

Interscience, Hoboken.

Khismatrao, A., Bhairy, S., Hirlekar, R., 2018. Development and Validation of

RP-HPLC Method for Simultaneous Estimation of Curcumin and Piperine.

International Journal of Applied Pharmaceutics, 10(5), 43.

Meyer, V., 2010. Practical High-Performance Liquid Chromatography, 5th

ed.

John Wiley and Sons Ltd, Switzerland.

Monton, C., Charoenchai, L., Suksaeree, J., Sueree, L., 2016. Quantitation of

Curcuminoid Contents, Dissolution Profile, and Volatile Oil Content of

Turmeric Capsules Produced at Some Secondary Government Hospitals.

Journal of Food and Drug Analysis, 24(3), 493-499.

Murti, Y.B., Hartini, Y.S., Hinrichs, W.L.J., Frijlink, H.W., Setyaningsih, D.,


18

2019. UV-Vis Spectroscopy to Enable Determination of the Dissolution

Behavior of Solid Dispersions Containing Curcumin and Piperine. Journal of

Young Pharmacists, 11(1), 26–30.

Narayani, S.S., Aravanan, S., Bharathiaraja, S. Mahendran, S., 2016. Extraction,

Partially Purification and Study on Antioxidant Property of Fucoxanthin

from Sargassum cinereum. Journal of Chemical and Pharmaceutical

Research, 8(3), 610-616.

Phattanawasin, P., Sotanaphun, U., Sriphong, L., 2009. Validated TLC-Image

Analysis Method for Simultaneous Quantification of Curcuminoids in

Curcuma longa. Chromatographia, 69(3), 397–400.

Pulido, M., Moreno, J., Ramirez, C., Ramirez, M.C., 2016. Curcumin and Health.

Molecules, 21(3), 1-22.

Setyaningsih, D., Murti, Y.B., Fudholi, A., Wouter, L.J., Mudjahid, R., Martono,

S., Hertiani, T., 2016. Validated TLC Method for Determination of

Curcumin Concentrations in Dissolution Samples Containing Curcuma longa

Extract. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 14(2), 147–157.

Setyaningsih, D., Murti, Y.B., Martono, S., Hinrichs, W.L.J., Hertiani, T.,

Fudholi, A., 2016. A Novel Reversed Phase High Performance Liquid

Chromatography Method To Accurately Determine Low Concentrations Of

Curcumin In Rat Plasma. International Journal of Pharmaceutical and

Clinical Research, 8(5), 377–386.

Unites States Pharmacopeial Convention, 2017. The United States Pharmacopeia

40 National Formulary 35 (USP40-NF35). Unites States Pharmacopeial

Convention Inc, USA.

Wichitnithad, W., Jongaroonngamsang, N., Pummangura, S., Rojsittthisak, P.,

2009. A Simple Isocratic HPLC Method for the Simultaneous Determination

of Curcuminoids in Commercial Turmeric Extracts. Phytochem. Anal., 20(3),

314-319.


19

Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku kurkumin

1. Konsentrasi 0,05 µg/mL replikasi 1


20



21



22

4. Konsentrasi 1 µg/mL replikasi 1


23



24



25



26



27



28



29



30



31



32

Lampiran 2. Kromatogram perolehan kembali

1. Non Adisi replikasi 2


33

2. Adisi 1 (rendah) replikasi 2


34

3. Adisi 2 (sedang) replikasi 2


35

4. Adisi 3 (tinggi) replikasi 2


36

Lampiran 3. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5 µg/mL


37

Lampiran 4. Data AUC perolehan kembali dan presisi

Hari ke-1

Konsentrasi

(µg/mL)

AUC


Non Adisi 61.140 55.207 59.584

Adisi 1 255.555 270.817 266.107

Adisi 2 2.128.933 2.121.389 2.112.352

Adisi 3 4.314.040 4.284.998 4.297.718

Hari ke-2

Konsentrasi

(µg/mL)

AUC


Non Adisi 66.312 67.427 62.451

Adisi 1 264.025 267.789 269.075

Adisi 2 2.125.597 2.124.012 2.117.891

Adisi 3 4.271.521 4.290.006 4.282.694

Hari ke-3

Konsentrasi

(µg/mL)

AUC


Non Adisi 57.397 60.079 68.172

Adisi 1 257.957 268.193 261.569

Adisi 2 2.127.297 2.115.848 2.130.882

Adisi 3 4.193.744 4.102.837 4.419.138

Senyawa

Hari ke-1

Konsentrasi

baku yang

ditambahkan

(µg/ml)

Konsentrasi

yang didapat

kembali

(µg/ml)

Perolehan

Kembali

(%)

RSD

(%)

Kurkumin

1,00 0,96 ± 0,037 95,92 3,87

10,00 9,77± 0,039 97,67 0,40

20,00 20,10 ± 0,069 100,50 0,34


38

Senyawa

Hari ke-2

Konsentrasi

baku yang

ditambahkan

(µg/ml)

Konsentrasi

yang didapat

kembali

(µg/ml)

Perolehan

Kembali

(%)

RSD

(%)

Kurkumin

1,00 0,97 ± 0,012 97,25 1,28

10,00 9,77 ± 0,019 97,75 0,20

20,00 20,02 ± 0,044 100,08 0,22

Senyawa

Hari ke-3

Konsentrasi

baku yang

ditambahkan

(µg/ml)

Konsentrasi

yang didapat

kembali

(µg/ml)

Perolehan

Kembali

(%)

RSD

(%)

Kurkumin

1,00 0,95 ± 0,025 95,17 2,59

10,00 9,79 ± 0,037 97,85 0,38

20,00 19,81 ± 0,773 99,07 3,90

Contoh perhitungan perolehan kembali pada adisi 1 replikasi pertama:

Persen perolehan kembali = (Cf – Cu) x 100/Cu

= (1,421 – 0,467) x 100/1

= 95,36%

Contoh perhitungan koefisien variasi pada adisi 1:

Koefisien variasi (CV) = SD/rata-rata x 100%

= 0,016/0,97 x 100%

= 1,65%


39

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul Validasi Metode Analisis

High Performance Liquid Chromatography Fase

Terbalik Pada Penetapan Kadar Kurkumin Dalam

Ekstrak Rimpang Kunyit ini bernama lengkap Yosua

Agung Santoso. Penulis dilahirkan di Magelang pada

tanggal 11 Oktober 1997 sebagai anak pertama dari dua

bersaudara, dari pasangan Lewi Santoso Wibowo dan

Melasari Lestyodewi. Pendidikan formal yang telah

dienyam penulis yakni pendidikan tingkat Sekolah Dasar

di SD Kristen Indonesia Magelang (2003- 2009),

pendidikan tingkat Sekolah Menengah Pertama di SMP

Negeri 1 Magelang (2009-2012), dan pendidikan tingkat

Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 1 Magelang

(2012-2015). Penulis kemudian melanjutkan studi Strata-1 di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2016. Selama menempuh

pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Santa Dharma penulis aktif dalam

berbagai kegiatan dan organisasi. Di bidang akademik, penulis pernah menjadi

Asisten Dosen Praktikum Kimia Dasar 2017/2018, Asisten Dosen Praktikum

Biokimia 2018/2019, dan Asisten Dosen Praktikum Kimia Analisis 2018/2019.

Selain itu pada tahun 2018, penulis pernah mengikuti lomba Olimpiade Nasional

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam bagi Mahasiswa Perguruan Tinggi (ON

MIPA-PT) Bidang Kimia Tahun 2018.


VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID...

Documents

Transcript of VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID...