1

METODE UJI KUALITATIF DNA DENGAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh:

GATI WINDIASTIKA, SP. MP (Calon Pengawas Benih Tanaman)

Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya

Pengujian DNA tanaman merupakan suatu teknik biologi molekular

yang digunakan untuk kepentingan pengujian terhadap materi uji

berdasarkan profil DNA-nya. Pengujian DNA memanfaatkan profil DNA, yaitu

sekumpulan data yang menggambarkan susunan DNA yang dianggap khas

untuk individu yang menjadi sampel. Dalam pengujian DNA, hanya sebagian

kecil berkas DNA yang dipakai untuk pengujian. Sasaran utamanya adalah

bagian DNA yang berisi pengulangan urutan basa. Pengujian DNA yang

meliputi analisis secara kuantitatif dan kualitatif, merupakan tahap lanjutan

pengujian yang harus dilakukan setelah diperoleh isolasi DNA tanaman. Hal

ini dilakukan untuk menentukan kemurnian suatu galur atau kultivar serta

untuk menguji masuknya materi genetik tertentu (misalnya dalam mendeteksi

materi transgenik) ke dalam populasi.

Uji kualitatif DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis dari hasil

isolasi DNA. Metode elektroforesis merupakan teknik yang dapat digunakan

untuk menggambarkan pergerakan molekul-molekul bermuatan dalam medan

listrik ke arah elektroda dengan muatan berlawanan atau teknik yang

didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga di

bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan dalam

elektroforesis adalah gel agarosa, suatu polisakarida yang diekstraksi dari

berbagai jenis ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan

separasi DNA dengan kisaran ukuran yang luas. Elektroforesis gel agarosa

digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari

100 basepairs dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis

poliakrilamid dapat memisahkan 1 basepairs dan dijalankan secara vertikal.

Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan

2

DNA (sekuensing). Berikut ini perbedaan antara elektroforesis gel agarosa

dengan poliakrilamid:

Tabel 1. Perbedaan Elektroforesis Gel Agarosa dan Poliakrilamid

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA ELEKTROFORESIS GEL

POLIAKRILAMID

1. Dapat memisahkan fragmen

DNA antara 100bp – 50kb

tergantung dari konsentrasi gel

agarose yang digunakan

2. Power lebih rendah

3. Medan gerak biasanya horisontal

4. Mempunyai laju pemisahan lebih

cepat

1. Lebih effektif untuk pemisahan

fragmen DNA antara 5-500bp

2. Power ekstrim tinggi

3. Medan gerak secara vertikal dan

listriknya konstan

4. Ukuran perbedaan DNA yang

terpisah sampai 1bp

5. Pembuatannya lebih sulit

dibanding gel agarose, karena

biasanya digunakan poliakrilamid

dengan resolusi yang tinggi.

A. CARA KERJA ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-

sumur pada gel agarosa dan diletakkan pada kutub negatif. Apabila dialiri

arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan

bergerak ke kutub positif. Gel agarosa dengan tebal 0,5 cm akan memaksa

DNA dengan ukuran 5 sampai 60 kb bergerak melewati celah kerangka

agarosa yang membentuk pori-pori dengan ukuran tertentu sesuai dengan

konsentrasi agarosa. Laju migrasi atau kecepatan pergerakan DNA dalam

medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA, tergantung dari

muatan dan berat molekul DNA.

Sebelum dilakukan elektroforesis, sampel perlu ditambahkan larutan

pemberat (loading buffer) yang terdiri dari polietilenglikol atau gliserin,

bromfenol biru dan aquades. Penambahan gliserin ini akan menaikkan

densitas sampel sehingga akan masuk ke dalam sumuran gel agarosa

dengan baik. Sedangkan bromfenol biru merupakan pewarna yang dapat

digunakan untuk mengidentifikasi jalannya sampel pada gel agarosa.

Setelah proses elektroforesis selesai, selanjutnya dilakukan proses

pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat.

Penambahan Etidhium Bromida (EtBr) pada proses visualisasi akan mengikat

DNA sehingga migrasi DNA dapat terdeteksi jika dikenai sinar ultraviolet.

3

Larutan EtBr akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita

fragmen DNA akan terlihat di bawah lampu ultraviolet. Larutan EtBr ini

digunakan sebagai alat untuk mengidentifikasi dan mengukur semi-kualitatif

fragmen DNA yang terseparasi dalam gel. Selain itu larutan EtBr akan terikat

diantara dua untai ganda DNA dan berinteraksi diantara basa molekul DNA,

sehingga menyebabkan pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar kuning

jingga bila disinari ultraviolet pada panjang gelombang yang pendek karena

pewarna ini mengandung zat fluoresence.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel agarosa

akan tampak setelah proses pewarnaan. Satu lajur merupakan arah

pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita yang berjarak sama dari sumur gel

pada akhir elektroforesis mengandung molekul yang bergerak di dalam gel

selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti

bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda

(marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda

dapat digunakan untuk menentukan panjang amplikon atau ukuran molekul

dalam pita sampel dengan mengelektroforesis marka tersebut pada lajur di

gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat

dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya.

B. FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KECEPATAN MIGRASI DNA

Kecepatan migrasi selama DNA bergerak menembus gel agarosa

dipengaruhi oleh beberapa faktor utama, yaitu:

1. Ukuran Molekul DNA

Molekul DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding

yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan

fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya, misal DNA linier lebih

cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel

adalah berbanding terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan

basa-basa.

2. Konsentrasi Gel Agarosa

Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai

dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan.

4

Tabel 2. Konsentrasi Gel Agarosa dan Ukuran Molekul DNA

No Konsentrasi Gel Agarose (%) Effisiensi Range Pemisahan

Pada DNA Linier (kb)

1 0,3 60 – 5

2 0,6 20 – 1

3 0,7 10 – 0,8

4 0,9 7 – 0,5

5 1,2 6 – 0,4

6 1,5 4 – 0,2

7 2,0 3 – 0,1

3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk atau konformasi DNA, kita tahu

bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular, circular-

opened dan linier. Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang

sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju

migrasi ini karena:

a. konsentrasi gel agarosa

b. kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan

c. densitas kembaran superheliks pada bentuk super-helix circular

d. pada beberapa kondisi bentuk super-helix circular lebih cepat

dibanding bentuk linier

e. tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat,

maka pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat

tajam, contoh untuk bentuk super-helix circular

f. konsentrasi EtBr kritis antara 0,1mg/ml-0,5ml/mg

4. Penggunaan Voltage dan Arah Dari Bidang Elektris

Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional.

Idealnya untuk DNA ± 2kb pada gel agarosa bergerak ± 5v/cm. Arah dari

bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang

sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA

akan berubah juga.

5. Komposisi Basa DNA atau Temperatur

Elektroforesis DNA pada gel agarosa tidak dipengarui oleh komposisi

basa DNA maupun oleh suhu kamar saat gel dijalankan. Sehingga dalam

gel agarosa mobilitas elektroforesis fragmen DNA dengan berbagai

ukuran tidak berubah antara 4oC dan 30oC. Pada umumnya gel agarosa

dijalankan pada temperatur kamar. Namun gel yang mengandung

5

agarosa kurang dari 1,5% adalah sangat lunak, sehingga paling baik bila

dijalankan pada 4oC supaya gel cukup keras.

6. Keberadaan Pewarna DNA

Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence

untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela

pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai

15%. Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan

cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan

untuk mendeteksi single atau double-stranded asam nukleat (DNA atau

RNA). PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen, sehingga pengguna

harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja dan lindungi mata

dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.

7. Komposisi Buffer Elektroforesis

Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang

digunakan untuk pembuatan gel agarosa, misal:

a. Tris-acetate: umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling

rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa baik

elektroelusi maupun gel ekstraksi.

b. Tris-borat: resolusi cukup baik, tetapi untuk mengisolasi kembali DNA

dari agarosa kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarosa.

C. PROSEDUR ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Elektroforesis dengan gel agarosa merupakan metode standar untuk

memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul

DNA. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan pemisahan

fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya dengan menggunakan arus

listrik. Prosedur elektroforesis dengan gel agarosa ialah sebagai berikut:

1. Siapkan gel agarosa 0,8 – 1 %. Misal untuk gel agarosa 1 % pada

cetakan ukuran besar, maka bubuk agarosa ditimbang sebanyak 0,7

gram kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer (Gambar 1).

2. Selanjutnya dilarutkan dengan TAE buffer sebanyak 70 ml (Gambar 2).

6

Gambar 1. Bubuk Agarosa Dimasukkan

Dalam Erlenmeyer

Gambar 2. Penambahan Larutan

Buffer TAE

Gambar 3. Erlenmeyer Ditutup dengan

Plastik Wrapping

Gambar 4. Erlenmeyer Dipanaskan

Dalam Microwave

3. Erlenmeyer ditutup dengan plastik wrapping dan diberi lubang kemudian

dipanaskan dalam microwave hingga agarosa larut (Gambar 3 dan 4).

4. Setelah agarosa larut yang ditandai dengan larutan berubah menjadi

bening, dinginkan selama 1-2 menit hingga temperatur hangat-hangat

kuku atau sekitar 80oC.

5. Kemudian larutan agarosa dituangkan dalam cetakan yang telah diatur

keseimbangan posisinya dan telah dipasang sisirnya. Tuangkan dari

sebelah pojok kanan bawah dan dibiarkan memadat selama 30-45 menit

pada suhu ruang (250C) (Gambar 5).

6. Apabila gel telah mengeras, sisir diambil kemudian gel dan cetakannya

dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis dan dituang TAE buffer

sampai gel terendam, sekitar 1 mm di atas gel (Gambar 6).

7. Sampel yang akan dielektroforesis dicampur loading buffer dengan

komposisi 2 μl DNA dan 1 μl loading buffer. Semuanya dicampur dengan

pipet mikro kemudian diinjeksikan ke dalam sumur pada gel agarosa

(Gambar 7).

7

Gambar 5. Larutan Agarosa Dituangkan

Dalam Cetakan

Gambar 6. Gel dan Cetakan

Dimasukkan Ke Dalam Chamber

Gambar 7. Sampel Dimasukkan Pada

Masing-Masing Sumuran

Gambar 8. Proses Running Gel

Agarosa

Gambar 9. Perendaman Gel Agarosa

Pada Larutan TAE yang Telah Ditambahkan EtBr

Gambar 10. Proses Dokumentasi

Pada Chemidoc Gel Imaging

8. Hubungkan elektroda dengan power supply yang dialiri arus listrik 50 Volt

hingga proses running selesai (sekitar 60 menit) atau mencapai sekitar

1,5 cm dari batas bawah gel agarosa (Gambar 8).

9. Setelah selesai, matikan dan ambil gel. Kemudian rendam gel agarosa

sekitar 15-20 menit pada larutan TAE yang telah ditambahkan 5 µl EtBr 1

mg/ml (Gambar 9).

8

10. Pindahkan gel agarosa ke UV-translluminator dan amati hasilnya.

Selanjutnya hasil didokumentasikan dengan menggunakan Chemidoc

Gel Imaging (Gambar 10).

Elektroforesis gel agarosa juga dapat digunakan untuk mengamati hasil

PCR DNA. Perbandingan komposisi yang digunakan antara loading buffer

dan sampel adalah 1 : 5. Marker yang digunakan memiliki ukuran 1 kb

sebanyak 1 μl.

DAFTAR PUSTAKA

Brown, T. A. 2003. Pengantar Kloning Gen, diterjemahkan oleh Prasena.

Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. p.11-15. Haryana. 1989. Petunjuk Laboratorium Rekayasa Genetika. UGM Press.

Yogyakarta. Natow. 2010. Isolasi DNA. Available on http://miraclebiology.blogspot. com.

Diakses tanggal 27 Maret 2012. Mahmuddin. 2010. Elektroforesis Gel Agarosa. Available on http://

mahmuddin.wordpress.com/2010/08/31/elektroforesis-gel-agarosa. Diakses tanggal 27 Maret 2012.

Puspalarasti. 2011. Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas. Available on http://puspalarasati.wordpress.com/author/puspalarasati.Diakses tanggal 27 Maret 2012.

Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA. 1 : 112-113.

Wongsosupantio. 1992. Elektroforesis Gel Protein. Pusat Antar Universitas. UGM. Yogyakarta. p.1-4, 12-13.