LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM TEKNOLOGI BAHAN ALAM

UJI BRINE SHRIMP LETALITY TEST (BSLT)

DISUSUN OLEH :

1. ASTRIE KUSUMA W (2007210028)

2. CHANDRA SIRAIT (2007210036)

3. DEDE KOMARUDIN (2007210044)

4. DEVI CAROLINE (2007210048)

5. DHANIYO (2007210050)

6. DHARMAYANTI (2007210051)

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PANCASILA

2010

I. TEORI DASAR

Uji Toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test)

Senyawa yang diduga memiliki aktifitas anti kanker, harus di ujikan terlebih dahulu pada hewan percobaan. Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan menggunakan larva udang Artemia salina Leach sebagai hewan uji merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa antikanker baru yang berasal dari tanaman. Hasil uji toksisitas dengan metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksis senyawa anti kanker. Selain itu, metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat dan cukup akurat (Meyer, 1982). Lebih dari itu uji larva udang ini juga digunakan untuk praskrining terhadap senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor. Dengan kata lain, uji ini mempunyai korelasi yang positif dengan potensinya sebagai antikanker (Anderson, 1991).

Artemia salina Leach merupakan komponen dari invertebrata dari fauna pada ekosistem perairan laut. Udang renik ini mempunyai peranan yang penting dalam aliran energi dan rantai makanan. Spesies invertebrata ini umumnya digunakan sebagai organisme sentinel sejati berdasarkan pada penyebaran, fasilitas sampling, dan luasnya karakteristik ekologi dan sensifitasnya terhadap bahan kimia (Calleja M.C, Persoone G, 1992).

Pengujian Lethalitas telah digunakan dengan sukses untuk isolasi biomonitor dari cytotoxic (Siqueira, M. J et. al., 1998), antimalaria (Perez, H, et.al., 1997), insektisida (Oberlies, N. H.,et.al., 1998), dan antifeedent (Labbe, C., et.al., 1993) campuran dari ektrak tumbuhan. Hasil dari skrening dari air, hydroalcoholic dan ekstrak alkohol dari beberapa tumbuhan obat penting yang digunakan dalam pengobatan tradisional untuk lethalitas merujuk pada larva Artemia salina yangdiperkenalkan.Suatu konsentrasi mematikan (Lethal Concentration) adalah analisa secara statistik yang menggunakan uji Whole Effluent Toxicity (WET) untuk menaksir lethalitas sampel effluen. Test akut digunakan di Wisconsin untuk menaksir kondisi "akhir dari pipa" (yaitu, effluent yang tidak dilemahkan, sebagai adanya dibebaskan pada lingkungan).

Konsentrasi effluen dimana 50% dari organisme mati selama test (LC50) digunakan sebagai pemenuhan titik akhir (endpoint) untuk Test Whole Effluent Toxicity (WET) akut. Dalam rangka mengkalkulasi LC50, salah satu dari konsentrasi test harus menyebabkan > 50% kematian. LC50, yang lebih rendah berarti semakin beracun effluent tersebut. Sebagai contoh, LC50 > 100% berarti kekuatan penuh effluent tersebut tidak membunuh lebih dari separuh organisme. LC50 sama dengan 50% berarti separuh effluent mempunyai kekuatan membunuh 50% dari organisme tersebut.

Uji toksisitas dimaksudkan untuk memaparkan adanya efek toksik dan atau menilai batas keamanan dalam kaitannya dengan penggunaan suatu senyawa. Pengukuran toksisitas dapat ditentukan secara kuantitatif yang menyatakan tingkat keamanan dan tingkat berbahaya zat tersebut (Cassaret dan Doull’s, 1975). Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan salah satu metode skrining untuk menentukan ketoksikan suatu ekstrak ataupun senyawa. Kematian Artemiasalina Leach digunakan sebaga i parameter untuk menunjukkan adanya kandunganzat aktif tanaman yang bersifat sitotoksik. Apabila harga LC50 _ 1000 μg/mL ekstrak tersebut dapat

dikatakan toksik. Bila kematian sebagai responnya, maka dosis penimbul kematian pada 50% populasi dengan spesies yang sama dalam waktu spesifik dan kondisi percobaan sesuai diistilahkan sebagai median lethal dose atau LD50. Obat yang diberikan sebagai konsentrasi diistilahkan sebagai Median Lethal Concetration atau LC50 (Cassaret dan Doull’s, 1975). Menurut Meyer dkk. (1982) tingkat toksisitas dari ekstrak tanaman dapat ditentukan dengan melihat harga LC50-nya. Apabila harga LC50 lebih kecil dari 1000 μg/ml dikatakan toksik, sebaliknya apabila harga LC50 lebih besar dari 1000 μg/ml dikatakan tidak toksik. Tingkat toksisitas tersebut akan memberi makna terhadap potensi aktivitasnya sebagai antitumor. Semakin kecil harga LC50 semakin toksik suatu senyawa.

KLASIFIKASI Artemia salina, Leach

a. Klasifikasi

Artemia salina Leach adalah udang tingkat rendah yang hidup sebagai zooplankton. Artemia pada tahun 1778 diber i nama cancer salinus,yang kemudian diubah menjadi Artemia salina pada tahun 1819 oleh Leach

Klasifikasi Artemia pada dunia hewan adalah sebagai berikut :

Divisi : Animal

Phylum : Arthropoda

Kelas : Crustaceae

Subkelas : Branchiopoda

Ordo : Anostraca

Familia : Arthemidae

Genus : Artemia

Species : Artemia salina Leach

( Mudjiman, 1995)

b. Morfologi Artemia salina, Leach

Artemia salina, Leach diperdagangkan dalam bentuk telur istirahat yang dinamakan kista. Kista ini bentuk bulatan-bulatan kecil berwarna kelabu kecoklatan dengan diameter berkisar 200-300 μm (Mudjiman,1995). Kista berkualitas baik, apabila diinkubasi dalam air berkadar garam 5-70 permil akan menetas sekitar 18-24 jam. Artemia yang baru menetas disebut nauplius, berwarna orange, berbentuk bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 mikron, lebar 170 mikron dan berat 0,002 mg. Nauplius berangsur –angsur mengalami perkembangan dan perubahan morfologis dengan 15 kali pergantian kulit hingga menjadi dewasa. Pada setiap pergantian kulit dis ebut instar (Mujiman, 1995). Ada beberapa tahap penetasan Artemia yaitu tahap hidrasi, tahap pecah cangkang, dan tahap payung atau tahap pengeluaran. Tahap hidrasi terjadi penyerapan air sehingga kista yang diawetkan dalam bentuk kering tersebut akan menjadi bulat dan aktif bermetabolisme. Tahap selanjutnya adalah tahap

pecah cangkang dan disusul dengan tahap payung yang terjadi beberapa saat sebelum nauplius keluar dari cangkang (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995). Tahap penetasan Artemia seperti pada gamb ar 1.

Gambar 1. Tahap penetasan telur Artemia

Artemia dewasa biasanya berukuran panjang 1-2 cm yang ditandai adanya tangkai mata yang jelas terlihat pada kedua sisi bagian kepala, antena sebagai alat sensori, saluran pencernaan yang terlihat jelas, dan 11 pasang thorakopoda. Pada Artemia jantan, antena berubah menjadi alat penjepit, sepasang penis terdapat dibagian belakang tubuh, sedangkan pada Artemia betina antena mengalami penyusutan. Sepasang indung telur atau ovarium terdapat di kedua sisi saluran pencernaan, dibelakang thorakopoda (Mujiman,1995). Gambar 2 merupakan gambar morfologi nauplius Artemia salina Leach.

Gambar 2. Morfologi nauplius Artemia salina

(Mujiman, 1995)

c. Lingkungan hidup

Artemia salina hidup planktonik di perairan berkadar garam tinggi antara 15-30 permil, suhu yang dikehendaki berkisar antara 25°C-30°C, oksigen terlarut sekitar 3 mg/L dan pH antara 7,3-8,4. Artemia salina, Leach tidak dapat mempertahankan diri dari pemangsa musuh- musuhnya karena tidak mempunyai alat atau cara untuk membela diri, salah satu cara untuk menghindarkan diri dari pemangsa hewan lain dengan berpindah kekondisi alam berupa lingkungan hidup berkadar garam tinggi. Pada umumnya pemangsa tidak dapat hidup lagi pada kondisi itu (Mudjiman,1995). Makanan Artemia salina terdiri atas ganggang renik, bakteri dan cendawan. Dalam pemeliharaan makanan yang diberikan adalah katul padi, tepung terigu, tepung kedelai, dan ragi (Mudjiman,1995).

d. Perkembangbiakan dan siklus hidup

Perkembangbiakannya yaitu jenis biseksual dan jenis partenogenenetik Keduanya dapat terjadi ovovivipar atau ovipar. Pada ovovivipar keluar dari induknya sudah berupa anak yang dinamakan nauplius, sedangkan pada ovipar anak keluar dari induknya berupa telur, bercangkang tebal yang dinamakan siste. Perkembangbiakan jenis biseksual harus melalui proses perkawinan antara induk jantan dengan induk betina. Pada jenis parthenogenesis tidak ada perkawinan karena memang tidak pernah ada jantannya. Jadi, betina akan beranak dengan sendirinya tanpa perkawinan (Mudjiman,1995). Siklus hidup Artemia salina seperti pada gambar 3.

Gambar 3. Siklus Hidup Artemia salina Leach (Mudjiman,1995)

e. Penetasan telur Artemia salina Leach

Telur yang siap menetas berwarna coklat keabu-abuan. Untuk media penetasan dapat digunakan air laut biasa (kadar garam ± 30 permil). Tapi untuk mencapai hasil penetasan yang lebih baik, kita perlu menggunakan air berkadar garam 5 permil. Ini dapat dibuat dengan mengencerkan air laut dengan air tawar. Sebelum ditetaskan telur-telur tersebut perlu dicuci terlebih dahulu, yakni dengan direndam di dalam air tawar selama 1 jam, baru kemudian dimasukan

e. Penetasan telur Artemia salina Leach

Telur yang siap menetas berwarna coklat keabu-abuan. Untuk media penetasan dapat digunakan air laut biasa (kadar garam ± 30 permil). Tapi untuk mencapai hasil penetasan yang lebih baik, kita perlu menggunakan air berkadar garam 5 permil. Ini dapat dibuat dengan mengencerkan air laut dengan air tawar. Sebelum ditetaskan telur-telur tersebut perlu dicuci terlebih dahulu, yakni dengan direndam di dalam air tawar selama 1 jam, baru kemudian dimasukan dalam wadah penetasan. Suhu air yang baik selama proses penetasan adalah antara 25-30 C. Sedangkan kadar oksigennya harus lebih dari 2 mg/L. Untuk merangsang proses penetasannya media penetasan tersebut perlu disinari dengan lampu yang dipasang di samping wadah. Dalam waktu 24-36 jam setelah pemasukan telur, biasanya telur-telur itu sudah menetas menjadi anak Artemia yang dinamakan nauplius (Mudjiman,1995).

f. Penggunaan Artemia salina Leach dalam penelitian

Suatu metode uji hayati yang tepat dan murah untuk skrining dalam menentukan toksisitas suatu ekstrak tanaman aktif dengan menggunakan hewan uji Artemia salina Leach. Artemia sebe lumnya telah digunakan dalam bermacammacam uji hayati seperti uji pestisida, polutan, mikotoksin, anestetik, komponen seperti morfin, kekarsinogenikan dan toksikan dalam air laut. Uji dengan organisme ini sesuai untuk aktifitas farmakologi dalam ekstrak tanaman yang bersifat toksik. Penelitian menggunakan Artemia salina memiliki beberapa keuntungan antara lain cepat, mudah, murah dan sederhana. Penelitian dengan larva Artemia salina Leach telah digunakan oleh Pusat Kanker Purdue, Universitas Purdue di Lafayette untuk senyawa aktif tanaman secara umum dan tidak

spesifik untuk zat anti kanker. Namun demikian hubungan yang signifikan dari sampel yang bersifat toksik terhadap larva Artemia salina Leach ternyata juga mempunyai aktifitas sitotoksik. Berdasarkan hal tersebut maka larva Artemia salina Leach dapat digunakan untuk uji toksisitas (Meyer et al., cit Wahyuni,S.,2002).

II. CARA KERJA1. Persiapan larva udang

Siapkan air laut sintetik dengan melarutkan 38 g garam laut buatan dalam 1 L air suling. Bejana penetas disekat sehingga memiliki dua sisi ruang, yaitu sisi terbuka dan tertutup. Telur udang laut artemia salina leach ditaburkan dalam bejana penetas yang berisi air laut sintetik dan disimpan dibawah lampu dengan sisi terbuka mengahadap lampu. Setelah 24 jam, telur yang sudah menetas menjadi nauplii dipindahkan ke tempat lain, 24 jam setelah itu nauplii terssebut sudah dapat digunakan sebagai hewan uji.

2. Uji BSLT Tahap I

Siapkan 12 vial untuk potensi masing-masing 3 konsentrasi dilakukan triplo, adapun tingkatan potensi toksisitas rendah (1000,100,10) dan 3 vial untuk kontrol. 3 vial Larutan kontrol. Larutan stok dibuat, kemudian dimasukkan kedalam vial yang telah disiapkan untuk masing-masing konsentrasi tersebut, kemudian diuapkan dengan sempurna. Setiap konsentrasi dibuat dalam 3 vial. Kemudian kedalam masing2 vial dimasukkan air laut sintetik kira-kira 3 ml dan 10 ekor nauplii udang laut, selanjutnya ditambahkan air laut sintetik sampai diperoleh 5 ml. Vial tersebut diletakkan dibawah lampu, setelah 24 jam dihitung jumlah larva yang mati.

3. Uji BSLT Tahap II

Hal yang diamati dalam uji ini adalah jumlah mortalitas udang yang disebabkan oleh ekstrak tanaman. Senyawa aktif akan menghasilkan jumlah mortalitas yang tinggi. Data yang diperoleh akan diolah untuk mendapatkan nilai LC50 (Lethal concentration 50 %) dengan tingkat kepercayaan 95% menggunakan metode analisis probit. LC50 merupakan besarnya konsentrasi (ppm) ekstrak uji untuk dapat mematikan 50% dari hewan uji. Komponen yang diuji bioaktivitasnya dengan metode BSLT dinyatakan sangat toksik. Apabila memiliki LC50 < 30 ppm, apabila memiliki LC50 > 1000 ppm

Nilai LC50 yang diperoleh dari uji bioaktivitas akan dibandingkan dengan kalium bikromat yang digunakan sebagai standard toksisitas. Kalium bikromat larut dalam air dan praktis tidak larut dalam alkohol, tidak higroskopis, berbentuk granul dengan kristal prisma merah jinggga.

4. Analisa Data

Nilai LC50 diperoleh dengan regresi log probit

III. Perhitungan Uji BSLT Cara I

Konsentrasi (rpm) (X)

Log D M H AM AH M/T % Kematian (Y)

1000 3 30 0 76 0 76/76 100%100 2 29 1 46 1 46/47 97,87%

1 17 13 17 14 17/31 54,84%a = 39,0767 LC50 = a+bx

b = 22,58 x = 50-a/b

r = 0,8862 = 50-39,0767/22,58

= 0,4838

LC5 = 3,0465 μg

1 2 30

20

40

60

80

100

120

Series 1Linear (Series 1)Linear (Series 1)Linear (Series 1)Series 2Series 3

log D

% KEMATIAN

`

Cara II (Data Probit)

Konsentrasi Jumlah yang mati n ∑M % Kematian Probit (Y) Log D (X)1 2 3

1000 0 0 0 30 30/30 100 8,09 3100 0 1 0 30 29/30 96,67 6,83 210 5 2 6 30 13/30 43,33 4,83 1

Blangko 8 6 8 30 22/30 73,33 3,02 -

a = 3,3233 y = a + bx

b = 1,63 5 = a + bx

r = 0,9915 x = 5-a/b

x = 5-3,3233/1,63

= 3,0166 (LC50= 1038,9628 μg/ml)

I. Rpm 1000Y = a+bx8,09= 3,3233 + 1,63 xx = 2,9244LC50 = 840,1481 μg/ml

II. Rpm 100Y = a+bx6,83 = 3,3233 + 1,63 xx = 2,1513LC50 = 141.6934 μg/ml

III. Rpm 10Y = a+bx4,83 = 3,3233 + 1,63 xx = 0,9798 LC50= 9,5445 μg/ml

1 2 30

20

40

60

80

100

120

Series 1Series 2Linear (Series 2)Series 3Linear (Series 3)

log D

probit

IV. PEMBAHASAN1. Uji BSLT digunakan sebagai uji permulaan untuk mengetahui aktivitas dari suatu zat atau

senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak atau suatu isolat murni.2. Pada perbenihan larva udang Artemia salina digunakan air laut buatan yang dibuat dengan

menggunakan garam yang tidak mengandung iodium karena bila menggunakan garam yang mengandung iodium maka larva udang akan tumbuh lebih besar dan akan mengaburkan data dari BSLT yang didapat.

3. Pada uji BSLT digunakan larva udang Artemia salina yang telah berumur 48 jam. Pada saat penetasan setelah 24 jam larva udang yang telah menetas di pindahkan ketempat lain hal ini bertujuan agar umur dari larva udang yang digunakan sama. Ditakutkan bila tidak dipindahkan ada larva udang yang baru menetas setelah 24 jam. Dan terbawa dalam percobaan sehingga usia dari larva udang tidak seragam.

4. Pada blangko hanya digunakan pelarut/pengencer dari estrak untuk melihat pengaruh pelarut terhadap larva udang. Seharusnya pada blangko tidak ada larva udang yang mati namun pada percobaan terdapat beberapa larva udang yang mati ini kemungkinan disebabkan pelarut (etanol) yang tidak menguap seluruhnya setelah dikeringkan.

5. Pada pengujian BSLT dibuat larutan dengan konsentrsi yang berbeda-beda mulau dari 1000,100,dan 10μg/ml. Ini bertujuan untuk melihat pengaruh konsentrasi dari ektrak terhadap aktivitasnya(LC50)

6. Pada percobaan dibuat triplo agar didapat data statistik yang dapat baik sehingga dapt dihitung secara statistik dari data yang didapat. Jika dilakukan simplo mungkin bisa terjadi kesalahan dan tidak ada data lain yang dapat dipakai.

7. Pada pecobaan dilakukan pengeringan untuk mengeringkan pelarur yang digunakan agar tidak mengaburkan data yang didapat. Apakah larva udang yang mati karena aktivitas dari ekstrak atau palarutnya.

8. Pada hasil percobaan didapat LC50 sebesar 10µg/ml (cara 1) dan 13,825μg/ml (cara2). Dapat diketahui bahwa ektrak dari kunyit memilki akvitas yang toksik(persyaratan toksik≤ 30μg/ml). Dan dalam percobaan yang dilakukan mayer bila hasil LC50 ≤30μg/ml diperkiraakan bahwa ektrak tersebut dapat berguna sebagai anti kanker.

9. Pada percobaan dilakukan perhitungan jumlah larva udang yang mati dengan menghitung larva udang yang hidup. Karena sulit untuk menghitung larva udang yang mati sehigga dihitung dengan mengamati yang hidup.

10. Pada percobaan larva udang yang digunakan ditempatkan dekat cahaya agar larva udamg dapat hidup dengan suhu yang sesuai. Dan didapat data larva udang yang tidak dipengaruhi oleh kondisi lingkungan dari tempat hidup larva udang

V. KESIMPULANDari percobaab diatas di dapat :LC50 :10 μg/ml (Cara I)LC 50 :13,285 μg/ml (Cara II)

VI. DAFTAR PUSTAKA

1. Soedibyo, Mooryati. 1998. Alam Sumber Kesehatan Manfaat dan Kegunaan. Jakarta. Balai Pustaka

2. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. 1978. Materia Medika Indonesia II. Jakarta. Departemen Kesehatan

3. World Health Organization. 1998. Quality Control Method for Medicinal Plant Materials. Geneva

4. Hariana H. Arief, Drs. 2008. Tumbuhan Obat dan Khasiatnya ed. III. Jakarta

5. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta.

6. Petunjuk Praktikum Teknologi Bahan Alam. 2010

7. Anonimous. 1994. Hasil Penelitian Dalam Rangka Pemanfaatan Pestisida Nabati. Prosiding Seminar di Bogor 1 – 2 Desember 1993. Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat. Bogor.

8. Anonimous. 1989. Vademekum Bahan Obat Alam. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.

9. Darwis SN. 1991. Tumbuhan obat famili Zingiberaceae. Bogor, Puslitbang Tanaman Industri: 39-61.

10. Kartasapoetra, G. 1992. Budidaya tanaman berkhasiat obat: kunyit (kunir). Jakarta, PT. Rineka Cipta: 60.

11. Kloppenburg-Versteegh, J. 1988. Petunjuk lengkap mengenai tanamantanaman di Indonesia dan khasiatnya sebagai obat-obatan tradisional (kunir atau kunyit-Curcuma domestica Val.). Jilid 1: bagian Botani. Yogyakarta, CD.RS. Bethesda: 102-103.

12. Moko, Hidayat; Mulyoto; Ismiyatiningsih. 1993. Pengaruh beberapa zat pengatur tumbuh dan mulsa terhadap pertumbuhan tanaman kunyit. Buletin Pertanian Tanaman Rempah dan Obat, 8 (1) 1993: 30-38.

13. Muhlisah, Fauziah. 1996. Tanaman obat keluarga (toga): kunyit. Cet.2. Jakarta, Penebar Swadaya: 40-41.

14. Nugroho, Nurfina A. 1998. Manfaat dan prospek pengembangan kunyit. Ungaran,Trubus Agriwidya. 86 hal.

15. Soedibyo, BRA Mooryati. 1998. Alam sumber kesehatan, manfaat dan kegunaan: kunyit. Cet.1. Jakarta, Balai Pustaka: 230-231.

16. Wijayakusuma, H.M. Hembing; Dalimartha, Setiawan; Wirian, A.S.  1992. Tanaman berkhasiat obat di Indonesia: kunyit; Curcuma longa Linn (Jiang Huang). Jilid 4. Jakarta, Pustaka Kartini: 93-94.