PENUNTUN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR

Disusun oleh :

Dra. Hj. Dewi Rusmiati

Dra. Hj. Sulistianingsih, M. Kes

Dr. Tiana Milanda, M.Si.

Sri Agung Fitri Kusuma, M.Si.

Tina Rostinawati, M.Si.

Dr. Med. Melisa Intan Barliana

UNIVERSITAS PADJADJARAN

FAKULTAS FARMASI

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

JATINANGOR

2015

KATA PENGANTAR

Penuntun Praktikum Mikrobologi Dasar ini disusun sebagai penuntun

bagi para mahasiswa dalam melakukan praktikum Mikrobiologi Dasar di

FakuItas Farmasi Universitas Padjadjaran. Tujuan utamanya adalah membantu

para mahasiswa Farmasi dalam mempelajari teknik dan prosedur dasar

laboratorium mikrobiologi.

Materi praktikum Mikrobiologi Dasar meliputi pengenalan mikroskop,

tcknikpewarnaan, penyiapan alat dan media, pengenalan berbagai sifat fisiologis

bakteri sertacara identifikasi bakteri. Materi-materi tersebut disusun dari

berbagai buku Mikrobiologi Dasar, baik teori maupun penuntun praktikum.

Penyusun menyadari bahwa buku ini masih jauh dari sempurna, namun

demikian diharapkan tetap dapat membantu mahasiswa atan siapa saja yang

berminat pada bidang mikrohiologi. Akhir kata, tegur sapa dan koreksi untuk

perbaikan buku kami sangat harapkan.

Jatinangor, 2015

Penyusun

TATA TERTIB DAN BENTUK LAPORAN

TATA TERTIB LABORATORIUM

Untuk mencegah kontaminasi alat dan bahan serta melindungi diri dari

kecelakaan di laboratorium, para mahasiswa diwajibkan mematuhi tata tertib

laboratorium sebagai berikut :

1. Baca dan pelajari praktikum yang akan dikerjakan, sebelum memasuki

laboratorium.

2. Letakkan tas dan benda-benda lain yang tidak diperlukan di tempat yang

tersedia. Gunakan jas laboratorium selama bekerja di laboratorium.

3. Bersihkan meja laboratorium dengan desinfektan sebelum dan sesudah

praktikum.

4. Cuci tangan dengan air dan sabun sebelum dan sesudah praktikum.

5. Jangan makan, minum atau merokok di laboratorium. Jauhkan tangan dan

mulut, hidung dan telinga selama praktikum.

6. Perlakukan semua mikroorganisme sebagai patogen (mampu menimbulkan

penyakit) Tidak diperkenankan membawa keluar biakan mikroorganisrne dari

laboratorium.

7. Usahakan biakan mikroorganisme tidak tercecer dan tidak tercampur dengan

mikroorganisme lain. Jika tercecer, tuangkan desinfektan di atasnya, biarkan

beberapa menit, lalu bersihkan dengan kertas isap. Jika tabung berisi

mikroorganisme pecah, tuangkan desinfektan ke atasnya, biarkan beberapa

menit, buang ke tempat sampah.

8. Jika mahasiswa terkontaminasi atau terluka, hubungi segera asisten

laboratorium.

9. Ose harus disterilkan dengan memijarkan seluruh kawatnya sebelum dan

sesudah digunakan.

10. Jika pipet yang sama digunakan lebih dan satu kali, letakkan pada penyangga

rak tabung reaksi.

11. Api pada pembakar spirtus harus dimatikan, jika tidak digunakan.

12. Biakan yang sudah tidak diperlukan harus diserahkan kepada asisten.

13. Kaca obyek, kaca penutup dan pipet direndam dalam larutan yang berisi

desinfektan, lalu dicuci dengan air dan sabun. Labu ukur, erlenmeyer dan beker

glass dbasuh dengan desinfektan, lalu dicuci dengan air dan sabun. Tabung

reaksi dan cawan petri diletakkan dalam panci berisi air, rebus sampai mendidih.

lalu cuci dengan air dan sabun.

1 4. Bersihkan lensa-lensa mikroskop menggunakan kapas dan xylene.

15. Rapihkan kembali laboratorium tempat anda bekerja.

BENTUK LAPORAN

A. PENGAMATAN MIKROSKOPIS

Semua pengamatan mikroskopis harus digambarkan dan diwarnai sesuai

dengan pengamatan di bawah mikroskop, pada buku gambar khusus. Setiap halaman

diberi garis pinggir lalu dibagi menjadi 2 bagian. Setiap bagian diperuntukkan untuk 1

pengamatan. Pada bagian atas, dituliskan :

- Nomer dan nama kegiatan

- Tanggal pengamatan

- Zat kimia (yang dipakai)

- Sampel (mikroorganisme)

Hasil pengamatan digambarkan dalam sutui zona lingkaran dan diberi

keterangan yang diperlukan. Buku gambar dikumpulkan dan diperiksa pada tengah

semester.

B. LAPORAN

Kegiatan selain pengamatan mikroskopis, diwajibkan untuk diserahkan dalam

bentuk laporan praktikum. Laporan dibuat oleh masing-masing kelompok praktikan

dengan format sebagai berikut:

1. Cover laporan, terdiri dari nomor dan nama kegiatan, fnama dan nomor induk

mahasiswa serta nama laboratorium tempat prakikum berlangsung.

2. Format dalam, terdiri dari :

- tujuan

- teori singkat

- alat dan bahan

- prosedur kerja

- data pengamatan dan hasil perhitunan

- pembahasan

- kesimpulan dan saran

- daftar pustaka

- Laporan dapat ditik maupun ditulis tangan (rapih).

- Laporan harus diserahkan 1 minggu setelah praktikum tersebut berlangsung.

- Perpindahan jam/hari praktikum hanya boleh dilakukan atas seizin Kepala

Laboratorium Mikrobiologi Dasar.

- Mahasiswa yang mengikuti praktikum kurang dari 80% atau tidak menyerahkan

hasil pengamatan mikroskopis dan laporan, tidak diperkenankan mengikuti

ujian praktikum.

Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik

Gambar 1

Saran saran Kerja Aseptis :

1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam

tabung/cawan/Erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang

memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.

2. Pinset, batang pengaduk dll dapat disemprot dengan alcohol 70% terlebih

dahulu lalu dibakar.

3. Ujung jarum inoculum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau

dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transper

panas yang terjadi.

4. Usahakan bagian alat yang diharapka dalam kondisi steril didekatkan ke

bagian api.

5. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar Bunsen tetapi jika

kerja di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin

terjamin kondisi aseptisnya.

KEGIATAN I

MIKROSKOP MEDAN TERANG

TUJUAN

Memperkenalkan prinsip-prinsip penting Mikroskopi cahaya, bagian-bagian

mikroskop majemuk, penanganan dan pemeliharaan serta penggunaan mikroskop yang

baik.

TEORI SINGKAT

Mikroskop Medan Terang

Mikroskop Medan Terang (bright field microscope) adalah mikroskop dengan medan

rnikroskopis atau medan yang mengelilingi spesimen terlihat terang, sedangkan obyek

yang diamati tampak lebih gelap dari latar belakangnya. Hal ini disebabkan cahaya dari

suatu sumber masuk melalui sistem-sistem lensa tanpa mengalami perubahan, sehingga

terbentuk medan yang terang. Mikroskop yang dipakai saat ini umumnya menggunakan

dua sistem lensa terpish, yaitu lensa obyektif dan lensa okular, maka mikroskop ini

disebut pula sebagai mikroskop majemuk.

Pada umumnya, mikroskop ini menghasilkan perbesaran maksimum sekitar 1000X.

Ketajaman bayangan pada perbesaran maksimum tergantung pada pengaturan

diafragma, kondensor, minyak emersi dan faktor-faktor lain

Gambar l. Mikroskop Majemuk

1

Lensa dan Perbesaran

Lensa mikroskop terdapat pada kondensor, obyektif dan okular. Kondensor

merupakan lensa pengumpul cahaya di bawah pentas yang memusatkan cahaya pada

spesimen. Lensa obyektif merupakan lensa yang terletak dekat dengan spesirnen dan

lensa okular merupakan lensa pada ujung atas mikroskop, dekat dengan mata.

Lensa pada kondensor memusatkan kerucut cahaya pada medan specimen.

Sebagian berkas cahaya daam kerucut cahaya akan langsung menembus lensa obyektif,

untuk mcmbentuk cahaya latar belakang atau medan terang. Berkas cahaya yang

mengenai obyek akan difokuskan lensa obyektif sehingga membentuk bayangan nyata.

Bayangan tersebut diperbesar oleh lensa okular untuk menghasilkan bayangan maya.

Kebanyakan mikroskop laboratorium dilengkapi tiga lensa obyektif, yaitu lensa

16 mm (berkekuatan rendah 10 X), lensa 4 mm (berkekuatan tinggi 40-45 X) dan lensa

celup minyak 1,8 mm (97-100 X). Lensa-lensa tersebut terletak pada suatu bidang yang

dapat diputar. Angka 16, 4 dan 1,8 menyatakan jarak fokus (focal length), sedang angka

10 X, 45 X dan 100 X nenyatakan daya perbesaran. Perbesaran total diperoleh dengan

mengalikan perbesaran obyeklif dengan perbesaran okular.

Ujung lensa obyektif celup minyak sangat kecil sehingga hanya sedikit cahaya

yang masuk, maka diafragma iris kondensor harus dibuka penuh dan penghematan

cahaya dilakukan dengan bantuan minyak emersi.

Resolusi dan Daya Pisah

Bila lensa difokuskan pada suatu obyek, maka dua titik terpisah pada benda

tersebut akan membentuk dua bayangan. Tetapi kedua bayangan tersebut dapat terlihat

sebagai satu titik akibat adanya difraksi. Resolusi adalah kemampuan lensa untuk

memisahkan kedua bayangan sebagai bagian-bagian yang terpisah. Difraksi

menyebabkan resolusi tidak mungkin sempurna.

Jarak terpendek yang masih mungkin untuk melihat dua bayangan sebagai

bagian-bagian terpisah disebut daya pisah lensa. Daya pisah ditentukan oleh panjang

gelombang cahaya dan tingkap numeris (numerical aperlure atau NA) sistem lensa

obyektif dan kondensor. Hubungan tersebut dinyatakan daam persamaan berikut :

Dari persamaan tersebut terlihat, bahwa makin pendek panjang gelombang atau makin

besar tingkap numeris, maka makin kecil nilai r (dayapisah) atau makin tinggi resolusi

mikroskop.

Tingkap numeris (NA) adalah pernyataan matematis kerucut cahaya yang

dihantarkan kondensor pada spesimen dan dikumpulkan oleh lensa obyektif.

NA = n sin , dimana n adalah indeks bias medium diantara lensa obyektif dan

spesimen, sedang sin O adalah sinus setengah sudut yang dibentuk kerucut cahaya dari

kondensor yang melewati spesimen menuju lensa obyektif. Bila digunakan lensa

obyektif kering, maka n adalah indeks bias udara (n = 1). Sedang untuk Obyektif celup

minyak n adalah indeks bias minyak emersi celup (n=1,56).

2

Daya pisah = panjang gelombng

Tingkap numeris

r =

NA obyektif + NA kondensor

Iluminasi

Bola pijar lebih disukai sebagai cahaya, sebab warna, dan intensitasnya lebih

mudah dikendalikan. Bila mikroskop dilengkapi dengan cermin, maka selalu

menggunakan sisi cermin yang datar. Sisi cermin yang datar dapat memantulkan

berkas-berkas cahaya paralel yang diperlukan mikroskopyang menggunakan

kondensor.

Manipulasi kondensor dan diafragma iris diperlukan untuk mendapatkan

kontras kedalaman medan dan daya pisah yang optimum. Agar kondensor dapat

memusatkan semua berkas cahaya pada spesimen, maka harus terletak pada posisi

tertinggi.

Jumlah berkas cahaya yang memasuki lensa obyektif tergantung pada jenis

obyektifnya. Semakin besar daya pembesaran obyektif, semakin banyak cahaya yang

diperlukan. Jumlah cahaya yang masuk dapat diatur dengan membuka dan menutup

diafragma iris, yang terletak antara kondensor dan sumber cahaya. Sebaliknya, bila

menggunakan obyektif celup celup, diafraglna harus dibiarkan terbuka penuh.

ALAT DAN BAHAN

1. Mikroskop majemuk medan terang.

2. Spesimen jadi bakteri.

3. Kapas dan kertas saring.

4. Minyak emersi dan xylene.

5. Air suling

PROSEDUR KERJA

A. PENANGANAN DAN PEMELIHARAAN MIKROSKOP

1. Mikroskop dibawa dalam posisi tegak dengan dua tangan, satu tangan

memegang tangkai dan tangan yang lain menyangga dasar mikroskop

2. Hindarkan mikroskop dari benturan tiba-tiba.

3. Jangan menyentuh lensa dengan tangan atau melepaskan lensa dari tempatnya.

4. Jangan memiringkan mikroskop, bila bekerja dengan lensa obyektif celup

minyak.

5. Jangan melakukan penyetelan mikroskop dengan paksa.

6. Jangan menukarkan lensa obyektif atau okular mikroskop.

7. Lensa okular harus dibersihkan setiap selesai penggunaan, dengan kertas saring

yang dibasahi air suling, lalu dikeringkan dengan kertas lain.

8. Bersihkan minyak emersi dari pentas dan penjepit kaca obyek dengan kapas.

9. Bersihkan lensa obyektif celup minyak dengan kertas saring atau kapas yang

dibasahi sedikit xylene (xylol), setiap selesai menggunakan mikroskop. Xylene

yang terlalu banyak akan menyebabkan perekat lensa menjadi larut.

10. Pasang lensa obyektif berkekuatan rendah pada posisi kerja, bila mikroskop

tidak digunakan

3

11. Simpan mikroskop di dalam kotak setelah diselubungi dengan plastik. Simpan

kotak tersebut di tempat yang kering atau mempunyai kelembaban yang

rendah.

B. PENGGUNAAN MIKROSKOP

1. Letakkan mikroskop pada jarak tertentu dari tepi meja sehingga mudah untuk

melakukan pengamatan.

2. Atur iluminasi dengan menjauhkan atau mendekatkan sumber cahaya.

3. Letakkan spesimen di atas pentas mikroskop.

4. Buka diafragma iris dengan penuh dan naikkan kondensor sampai sama tinggi

dengan pentas.

5. Bila diperlukan sumber cahaya dari luar; maka atur sisi datar cenninmikroskop

sehingga cahaya terlihat pada lensa kondensor.

6. Mulailah pengamatan dengan lensa obyektif berkekuatan rendah (10X). Dengan

bantuan tombol pengatur kasar, rendahkan lensa atau naikkan pentas sampai

lensa obyektif terletak 54 mm dari specimen.

7. Perbaiki letak cermin dan setel diafragma iris sampai area obyektif terletak di

tengah-tengah dan penuh cahaya. Jauhkan lensa obyektif secara perlahan-lahan

dengan tombol pengatur kasar sampai terlihat bayangan. Perjelas bayangan

dengan memutar tombol pengatur halus secara perlahan.

8. Untuk-mikroskop majemuk dengan sumber cahaya terpasang, putar pengatur

filter kerapatan netral (neutral density filter), sehingga lensa es (frosted lense)

terpasang pada tempatnya.

9. Jika ingin menggunakan lensa obyektifkering tinggi (40-45 X), putar lensa ke

posisi kerja, rendahkan lensa obyektif atau naikkan pentas dengan tombol

pengatur kasar, sampai hampir menyentuh kaca obyek. Jauhkanljensa obyektif

dari spesimen dengan menggunakan tombol pengatur kasar. Stel cahaya dan

fokus seperti pada lensa obyektif berkekuatan rendah.

10. Unfuk obyektif celup minyak, putar lensa obyektif kering tinggi menjauhi posisi

kerja, Taruhlah setetes minyak celup di atas spesimen. Putarlah obyektif celup

minyak pada posisi kerja, Lakukan penyetelan sepeti pada lensa obyektif

berkekuatan rendah.

11. Usahakan memulai pengamatan spesimen dengan lensa berkekuatan rendah,

lalu dilanjutkan dengan lensa berkekuatan tinggi.

12 Gambarkan sel-sel yang diamati dengan skala yang sesuai.

4

HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 2

PENYIAPAN PREPARAT MIKROORGANISME

TUJUAN

Mempelajari teknik lekapan basah dan tetes gantung untuk mengamati morfologi, pola

penataan dan motilitas mikroorganisme hidup di bawah mikroskop.

TEORI SINGKAT

Untuk mengamati mikroba dengan mikroskop cahaya dapat disiapkan dua

macam preparat, yaitu preparat basah (wel mount preparation) dan olesan yang

diwarnai. Cara kedua lebih sering digunakan, tetapi memiliki beberapa kelemahan.

Pada olesan yang diwamai, hanya dapat diamati mikroba yang mali, dengan ukuran dan

pola penataan yang sering berubah serta tidak dapat diamati pergerakannya (motilitas).

Untuk pengamatan mikroba hidup, maka mikroba tersebut harus tersuspensi

dalam lingkungan cair yang memadai. Ada dua teknik penyiapan preparat, yaitu

lekapan basah (wel mount) dan tetes gantung. Kedua teknik ini menggunakan setetes

cairan yang mengandung mikroba hidup. Pada preparat basah dapat diamati morfologi,

pola penataan khas dan gerak bakteri (motil) dalam keadaan alami yang tidak

terganggu.

Pada pengamatan motilitas, seringkali pergerakan mikroba dikelirukan dengan

gerak Brown. Beberapa macam alga dan protozoa dapat bergerak bebas karena

memiliki flagela. Sedangkan beberapa jenis protozoa dapat bergerak karena memiliki

silia atau pseudopodia (pergerakan amuboid). Pergerakan sejati umumnya lebih

progresif dan terarah. Sedang gerak Brown merupakan gerakan menggetar partikel-

partikel secara acak dan tidak terarah. Gerakan it tidak mengubah posisi mikroba

nonmotil terhadap benda-benda lain di sekelilingnya.

Pergerakan sejati juga sering dikelirukan dengan pergerakan oleh arus Cairan. Bila

preparat tersebut mengandung gelembung udara atau tidak tersegel baik, maka arus

udara dapat menyebabkan arus cairan.

Apabila preparat basah diperiksa dengan mikroskop medan terang, maka

diperlukan penyesuaian sumber cahaya. Intensitas cahaya dapat dikurangi dengan

menggunakan filter khusus.

Selain pengamatan mikroskopis yang menggunakan lekapan basah, motilitas

mikroba juga dapat diamati secara makroskopis. Bakteri ditanam dalam medium

setengah padat (mediun semi solid) dalam tabung reaksi. Penanaman dilakukan dengan

jarum penusuk yang ditusukkan secara tegak ke dalam medium tersebut. Biakan

diinkubasikan pada suhu yang sesuai selama 18-24 jam. Jika terdapat motilitas, maka

seluruh medium menjadi keruh, Tetapi jika bakteri hanya hidup pada daerah tusukan

saja, maka motilitas negatif

5

ALAT DAN BA HAN

l. Mikroskop majemuk

2. Suspensi bakteri Bacillus subtilis

3. Kaca obyek dan kaca obyek cekung

4. Kaca tutup

5. Vaselin

6. Air suling

7. Kapas dan kertas saring

PROSEDUR KERJA

A. PENYIAPAN LEKAPAN BASAH

1. Letakkan setetes suspensi bakteri di tengah-tengah kaca obyek.

2. Usapkan sedikit vaselin pada tepi telapak tangan kiri, lalu sentuhkan secara

bergantian pada ke empat sisi kaca tutup sehingga terlapisi vaselin.

3. Letakkan kaca tutup dengan bagian bervaselin ke arah kaca obyek, sehingga

mengelilingi suspensi bakteri, lalu tekan perlahan-lahan.

4. Amati di bawah mikroskop dengan lensa obyektif kering tinggi (40-45 X).

Gambarkan pengamatan morfologi, pola penataan sel dan motilitas dengan

skala yang sesuai.

B. PENYIAPAN PREPARAT TETES GANTUNG

1. Ambil sebuah kaca tutup yang bersih, lalu lapisi ke empat sisinya dengan

Vaselin.

2. Taruhlah setetes suspensi bakteri di tengah-tengah kaca tutup tersebut.

3. Pegang kaca obyek cekung dengan bagian cekung menghadap ke bawah.

Dekatkan kaca obyek pada kaca tutup, sehingga bagian cekung akan

mengelilingi suspensi bakteri. Tekan perlahan-lahan sampai vaselin menyebar

dan membentuk segel.

4. Balikkan kaca obyek tersebut dengan cepat, sehingga suspensi bakteri akan

menggantung di kaca tutup tanpa menyentuh kaca obyek.

5. Amati di bawah mikroskop dengan lensa obyektif kering tinggi (40-45 X).

Gambarkan pengamatan morfologi, pola penataan sel dan motilitas dengan

skala yang sesuai.

6

HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 3

PENYIAPAN OLESAN BAKTERI

TUJUAN

Mempelajari cara menyiapkan olesan bakteri yang baik, sebagai prasyarat untuk

berbagai pewarnaan.

TEORI SINGKAT

Olesan bakteri yang baik merupakan prasyarat bagi berhasilnya berbagai teknik

pewarnaan. Olesan yang baik adalah olesan tidak terlalu tebal alau terlalu tipis dan

tahan pencucian satu kali atau lebih, setelah difiksasi dengan panas. Bakteri tidak hilang

tercuci, dengan bentuk tetap dan tidak menyusut.

Kaca obyek yang digunakan harus bersih dari debu dan lemak serta tidak boleh

tergores. Partikel-partikel debu dan goresan pada kaca obyek dapat dikelirukan dengan

mikroorganisme. Di samping itu, olesan pada kaca obyek yang berlemak atau berdebu

akan cenderung mengumpul dan tidak menyebar dengan baik.

Hal penting lainnya ialah kemampuan menaruh sejumlah mikroorganisme yang

tepat pada kaca obyek, sehingga olesan tidak terlalu tebal atau terlalu tipis. Pada olesan

yang terlalu tebal, sel-sel bakteri akan bertumpuk sehingga sukar diamati secara

individu. Jumlah cahaya yang lewat melalui spesimen juga berkurang sehingga

menyulitkan pengamatan. Keadaan ini sering tejadi pada olesan-olesan dari biakan

yang diambil dari medium padat. Sedang pada olesan yang terlalu tipis, akan sulit

menemukan sel-sel tersebut. Keadaan tersebut cenderung terjadi pada olesan-olesan

yang dibuat dari biakan dalam medium cair.

Penyiapan olesan berbeda menurut jenis medium tempat tumbuh

mikoorganisme. yang bersangkutan. Bila medium berupa cairan (kaldu, susu, air liur,

air seni dan sebagainya), maka penyiapan olesan dimulai dengan menaruh satu atau dua

lup penuh biakan di atas kaca obyek.

Bila biakan berasal dari medium padat (agar miring, agar cawan atau bagian-

bagian tubuh), maka taruh satu atau dua lup penuh NaCl fisiologis steril di atas kaca

obyek, lalu campurkan sejumlah kecil biakan organisme. Sel-sel bakteri pada medium

padat cenderung saling melekat, sehingga harus disebarkan dengan baik. Untuk

mengambil biakan, gunakan jarum inokulasi yang lurus sehingga tidak terlalu banyak

biakan yang terambil.

Olesan bakteri harus betul-betul kering di udara terbuka sebelum difiksasi

dengan panas. Fiksasi pada olesan yang belunn kering akan menyebabkan sel-sel

bakteri seakan-akan terebus dan bentuknya menjadi tidak karuan. Fiksasi panas juga

dilakukan secukupnva untuk menghindarkan salah bentuk atau penyusutan sel.

Meskipun kaca obyek untuk penyiapan olesan tersebut tidak steril, namun tetap

digunakan teknik antiseptik. Hal tersebut untuk menghindari tercemarinya biakan yang

digunakan, juga untuk melindungi diri dari kontaminasi mikroorganisme.

7

ALAT DAN BAHAN

1. Suspensi bakteri pada medium cair.

2. Biakan bakteri pada medium padat.

3. Kaca obyek dan kapas

4. Alkohol 70 % dan NaCl fisiologis steril.

5. Pembakar spirtus dan spidol

6. Lup inokulasi (ose) dan jarum inokulasi.

PROSEDUR KERJA

1. Bersihkan kaca obyek dengan kapas yang dibasahi alkohol 70 %, lakukan pada

kedua permukaannya.

2. Setelah bersih, peganglah kaca obyek pada pinggir-pinggirnya dan buat

lingkaran di tengah-tengah permukaan bawah kaca obyek dengan spidol

3. Bila biakan dalam medium cair, kocok biakan tersebut dengan baik, tanpa

membasahi sumbat tabung. Taruhlah 1-2 lup penuh suspensi mikroorganisme

pada kaca obyek yang sudah diberi tanda lingkaran di bawahnya. Sebarkan

organisme hingga rata seluas area lingkaran.

4. Bila biakan dalam medium padat, taruhlah 1-2 lup penuh air suling pada kac

obyek yang sudah diberi tanda lingkaran di bawalmya. Dengan jarum inokulasi,

pindahkalah sedikit biakan ke tetesan air, campurkan dan sebarkan hingga rata

seluas area lingkaran.

5. Biarkan olesan tersebut kering di dekat hawa hangat api. Olesan yang

mengering akan tampak lapisan tipis berwarna putih.

6. Setelah olesan benar-benar kering, lalukan kaca obyek tersebut.tiga kali di atas

api. Proses ini disebut fiksasi panas untuk mematikan mikroorganisme yang

bersangkutan dan membuatnya menempel pada kaca obyek.

7. Gunakan olesan-olesan tersebut untuk pewarnaan pada kegiatan-kegiatan

berikutnya.

8

HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 4

PEWARNAAN SEDERHANA

Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri, dengan

menggunakan satu macam zat pewarna.

TEORI SINGKAT

Sel-sel mikroorganisme umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan)

bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa. Hal tersebut diakibatkan indeks bias

sitoplasma sel hampir sama dengan indeks bias lingkungan, yang berupa zat cair.

Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewamai sel-

sel tersebut dengan zat warna.

Ada dua golongan zat warna yang umum dipakai untuk pewarnaan

mikroorganisme, yaitu :

l. Zat warna yang bersifat asam, dimana komponen warnanya adalah anion,

biasanya dalam bentuk garam natrium.

2. Zat warn yang bersifat alkalis dengan komponen warna kation, biasanya dalam

bentuk klorida.

Pada pewarnaan bakteri, terjadi proses pertukaran ion-ion zat warna dengan ion-

ion protoplasma bakteri. Pada umumnya digunakan larutan-larutan zat warna yang

encer, jarang lebih dari 1 0%. Suatu larutan zat warna encer yang didiamkan agak lama

pada preparat, umumnya bekerja lebih baik daripada larutan zat warna pekat yang

didiamkan dalam waktu singkat.

Zat pemantek (mordant) sering ditambahkan pada waktu pewarnaan. Zat

tersebut berfungsi untuk menambah gaya gabung, dimana hasil reaksi antara sel dan zat

warna diendapkan oleh pemantek menjadi presipitat berbulir-bulir besar, sehingga tidak

mungkin keluar melalui pori-pori dinding sel.. Contoh zat pemantek adlah amonium

oksalat, fenol, iodium, asam tanat, garam-garam alumunium, besi, timah, sego,

tembaga, krom dan lain-lain. umumnya zat ini diberikan

- Sebelum penambahan zat warna

- Ke dalam larutan zat warna

- Antara pemakaian dua larutan zat warna

Teknik pewarnaan mikroorganisme dapat dibagi menjadi dua, yaitu .

1. Pewarnaan sederhana (tunggal)

2. Pewarnaan diferensial

Pewarnaan yang paling banyak digunakan ialah pewarnaan tungal, yang

mengunakan satu jenis zat warna. Zat-zat warna tersebut umumnya bersifat alkalin,

karena sitoplasma sel bakteri bersifat basofilik (suka akan basa).

Pewarnaan tunggal memungkinkan teramatinya ukuran dan bentuk/tipe

morfologi (kokus, basilus vibrio, spirilium, dsb.) dari bakteri. Selain itu, dapat pula

diamati struktur-struktur tertentu bakteri, seperti endospora. Berbeda dengan spesimen

hidup, sel-sel yang diwamai dan terfiksasi pada kaca obyek dapat dismpan sebagai

dokumentas untuk jangka waktu lama.

9

ALAT DAN BAIIAN

1. Sampel air liur

2. Suspensi campuran bakteri S. aureus dan B. subtilis.

3. Suspensi campuran bakteri E. coli dan B. sublilis.

4. Zat warna karbol fuksin, biru metilen dan karbol gentian violet.

5. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.

6. Alkohol 70 % dan air suling dalam botol semprot.

7. Ose dan pembakar spirtus.

8. Bak pewarna.

9. Mikroskop majemuk dan minyak celup.

PROSEDUR KERJA

1. Buat masing-masing olesan bakteri dari air liur dan suspensi campuran bakteri

di atas kaca obyek yang bersih serta bebas lemak.

2. Setelah dingin, letakkan preparat tersebut di atas bak wratna, Genangi olesan

tersebut dengan salah satu dari zat warna. Bila digunakan karbol fuksin, biarkan

olesan terwarnai selama 5 menit. Bila digunakan biru metilen, biarkan olesan

terwarnai selama 1-2 tnenit, Sedang bila digunakan karbol gentian violet,

biarkan olesan terwarnai selama 15-30 detik.

3. Tuangkan zat warna yang berlebih dari preparat lalu bilas dengan air sampai

air bilasan berwarna pucat.

4. Keringkan preparat dengan kertas saring.

5. Teteskn sedikit minyak emersi pada preparat, lalu periksa di bawah

mikroskop. Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X. lalu ganti

dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.

Pewarnaan dengan karbol fuksin, sel bakteri akan berwarn merah. Bila

diwarnai dengan karbol gentian violet, sel bakteri akan berwarna ungu, Sedang

pewarnaan dengan biru metilen, sel bakteri akan berwarna biru.

10

HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 5

PEWARNAAN GRAM

TUJUAN

Menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif, dengan

menggunakan prosedur pewarnaan Gram, Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi

kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

TEORI SINGKAT

Pewarnaan tunggal memungkinkan untuk mengamati ukuran dan bentuk bakteri

secara jelas. Tetapi bentuk bakteri-bakteri dengan morfologi yang sama dari jenis yang

berbeda, pewarnaan tersebut tidak dapat membedakannya. Untuk maksud tersebut,

maka dikembangkan teknik pewarnaan diferensial.

Pewarnaan diferensial bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat bakteri terhadap

dua jenis pewarnaan dan untuk mengidentifikasi bakter. Zat-zat warna yang dipakai

lebih dari satu warna, baik dipakai satu-persatu maupun dalam suatu campuran.

Pada tahun 1884, seorang ahli bakteriologi Denmark menemukan pewarnaan

Gram. Melalui metode ini bakteri-bakteri dipisahkan menjadi dua kelompok besar,

yaitu :

1) Bakteri Gram positif, yang dapat menahan kompleks pewarna primer karbol

gentian violet-iodium sampai akhir prosedur (sel benvarna biru gelap atau

ungu).

2) Bakteri Gram negatif, yang kehilangan kompleks warna karbol gentian violet-

iodium dengan pembilasan alkohol dan tenwarnai oleh pewarna tandingan air

fuksin (sel berwarna merah muda).

Sekalipun mekanisme pewarnaan Gram belum diketahui dengan tepat, tetapi

perbedaan komposisi dinding sel bakteri Gram positif dengan Gran negatif, diduga

berperan terhadap reaksi Gram. Dinding sel yang tebal pada bakteri Gram positif akan

menyusut oleh pembi-lasan alkohol (terdehidrasi), sehingga pori-pori dinding sel

menutup dan mencegah larutnya kmpleks pewarna primer pada saat pemucatan.

Sedangkan dinding sel Granm negatif mengandung banyak lipid, yang pada umumnya

larut dalam alkohol dan aseton. Larutnya lipid diduga memperbesar pori-pori dinding

sel dan menyebabkan proses penmucatan berlangsung lebih cepat. Dugaan tersebut

didukung percobaan dimana berubah menjadi Gram negatif.

Walaupun demikian, prrbedaan reaksi tetap didasarkan atas perbedaan laju

lepas kompleks karbol gentian violet-iodium pada langkah pemucatan. jika pemucatan

berlebih bakteri C positif dapat memperlihatkan reaksi Gram negative. Faktor-faktor

lain yang dapat, menimbulkan keragaman pada reaksi Gram ialah :

1) Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan

Olesan bakteri Yang dipanaskan secara berlebihan akan menyebabkan

pecahnya dinding sel. Akibatnya sel Granm positif akan melepaskan pewarna

primer dan menerima pewarna landingan.

11

2) Kerapatan sel pada olesan.

Olesan yangterlalu tebal akan memucat lebih lama dari olesan dengan

kerapatan sel normal.

3) Konsentrasi dan umur reagen yang digunakan.

4) Sifat, konsentrasi dan jumlah pemucat yang dipakai.

Sebagai pemucat, alkohol 95% bekrja paling lambat dan aseton paling cepat.

Umumnya digunakan campuran alkohol 95% dan aseton (l : 1).

5) Sejarah biakan.

Sejarah biakan meliputi umur biakan serta pH medium tempat bakteri tumbuh.

Umumnya reaksi Gram menggunakan biakan berumur 18-24 jam. Biakan Gram

positif yang lebih tua (terutama bila sudah autolisis) dalam medium asam,

seringkali memberikan reaksi Gram positif atau Gram variabel (campuran Gram

positif dan Gram negatif). Hal tersebut diakibatkan perubahan permeabilitas

dinding sel pada biakan tua. Tetapi bakteri Gram negatif tidak terpengaruh oleh

umur atau medium yang digunakan. Jangan dipersoalkan teramatinya beberapa

sel Gram negatif dalam suatu preparat sel Gram positif.

ALAT DAN BAHAN

1. Suspensi campuran bakteri E. coli dan S. aureus.

2. Suspensi campuran bakteri E. coli dan B. subfilis.

3. Zat warna karbol gentian violet, lugol (iodium : kalium iodium : air suling 1 :

2: 100) dan air fuksin.

4. Akohol 95 %

5. Kaca obyek; kapas dan kertas saring.

6. Alkohol 70% dan air suling dalam botol semprot.

7. Ose dan pembakar spirtus.

8. Bak pewarna.

9. Mikroskop majemuk dan minyak celup.

PROSEDUR KERJA

1. Sediakan kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari masing-masing campuran

bakteri.

2. Letakkan kaca-kaca obyek di atas rak kawat di atas bak pewarna. Genangi olsan

bakteri dengan pewarna karbol gentian violet selama 1 menit, buangt zat warna

yang berlebih, lalu bilas dengan air suling.

3. Genangi olesan dengan lugol selama 2 menit, buang lugol yang berlebih lalu

bilas dengan air suling.

4. Cuci olesan dengan pemucat alkohol 95% tetes demi tetes selama 30 detik atau

sampai zat warna larut, lalu bilas dengan air suling.

5. Genangi olesan dengan pewarna tandlingan air fuksin selama 30 detik, buang

warna yang berlebih bilas dengan air suling lalu keringkan dengan kertas saring.

6. Teleskan sedikit minyak emersi pada preparat, lal periksa di bawah mikroskop.

Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, Jalu ganti dengan lensa

12

obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.

Bakteri Gram positif akan benwarna ungu dan bakteri Gram negatif akan berwarna

merah.

13

HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 6

PEWARNAAN TAHAN ASAM

TUJUAN

Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan asam,

dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam pewarnaan (Ziehl-Neelsen).

Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur

tersebut.

TEORI SINGKAT

Bakteri-bakteri dari genus dan spesies-spesies tertentu dari genus Nocardia

mengandung sejumlah besar lipid dan asam lemak pada dinding- dinding selnya. Hal

tersebut menyebabkan dinding sel relatif tidak permiabel terhadap zat-zat warna,

sehingga sel-sel bakteri tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa. Beberapa spesies dari

kedua genus tersebut patogenik terhadap manusia, seperti M. tuberculosis (penyakit

TBC) dan M. leprae (penyakit lepra). Untuk menunjang diagnosis penyakit-penyakit

tersebut, bakteri-bakteri penyebabnya harus dapat diisolasi, mudah diamati dan

dibedakan dari jenis bakteri lainnya. Untuk tujuan tersebut, maka digunakan pewarnaan

khusus yang dapat menembus dinding sel.

Teknik pewarnaan khusus tersebut diberi nama pewarnaan lahan asam, yang

mula-mula dikembangkan oleh Paul Ehrlich pada tahun 1882. Prosedur pewarnaan

yang digunakan sekarang merupakan perbaikan dari teknik Ehrlich ini dikenal dengan

pewarnaan Ziehl Nielsen. Nama tersebut diambil dari nama dua peneliti yang

mengembangkan prosedur tersebut pada akhir 1800-an. Prosedur ini menggunakan

pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan biru metilen sebagai pewarna

tandingan. Pada modifikasi lain teknik ini perlakuan panas diganti dengan penggunaan

pembasah (suatu deterjen ntuk mengurangi tegangan permukaan lemak) untuk

menjamin penetrasi pewarna. Pewarna yang mengandung bahan pembasah disebut

pewarna Kinyoun.

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel bakteri, seperti mikrobakteria

menahan zat warna tersebut dan tidak terpucatkan sekalipun oleh zat bersifat keras,

seperti asam alkohol. Asam alkohol merupakan pcmucat yang sangat intensif. Pada

pewarnaan ini, mikroorganisme yang dapat menahan zat warna utama dikatakan tahan

asam dan berwarna merah. Sedang pada bakteri biasa senyawa karbol fuksin mudah

dipucatkan oleh alkohol-asam dan menyerapan biru metilen sehingga sel berwarna

biru. Hal yang harus diperhatlkan dalam pewarnaan ini adalah jangan sampai preparat

mongering, bila dilakukan pemanasan. Dindng sel harus utuh untuk mencegah lipid

yana telah terwarnai meninggalkan sel untuk melarut ke dalam pemucat. Bila dinding

ini pecah maka lipid meninggalkan sel dan sifal tahan asamnya akan hilang.

14

ALAT DAN BAHAN

1. Suspensi bakteri saprofit.

2. Zat warna karbol fuksin dan biru metilen.

3. Asam alkohol (3% HCL dalam alkohol 95%).

4. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.

5. Alkohol 70% dan air suling dalam botol semprot.

6. Ose dan pembakar spirtus.

7. Bak pewarna.

8. Mikroskop majemuk dan minyak celup.

PROSEDUR KERJA

1. Sediakan kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari suspensi bakteri, Genangi

olesan bakteri dengan pewama karbol fuksin selama 5 menit, sambil dipanaskan

di atas penangas air. Jaga jangan sampai terlalu panas, mendidih atau kering.

2. Buang zat wama yang berlebih, lalu bilas dengan air suling.

3. Bilas dengan zat pemucat alkohol-asam selama 15 detik atau sampai latar

belakang olesan berwarna merah muda pucat.

4. Genangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 2 menit, buang

zat warna yang berlebih, bilas dengan air suling, lalu keringkan dengan kertas

saring.

5. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu periksa di bawah

mikroskop. Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti

dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.

Bakteri tahan asam (ZN + ) akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam (ZN -)

akan berwarna biru.

15

HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 7

PEWARNAAN SPORA

TUJUAN

Mengamiati endospora bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan spora

(pewarnaan Klein). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi

daam prosedur tersebut.

TEORI SINGKAT

Jenis-jenis bakteri tertentu, khususnya famili Bacillaceae, membentuk suatu

struktur di daam sel pada tempat-tempat khas, disebut endospora. Famili ini terdiri dari

3 genus, yaitu Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina. Endospora tersebut dibentuk

daam lingkungan yang tidak menguntungkan. Hal ini

disebabkan endospora dapat bertahan hidup daam kekurangan nutrien, tahan terhadap

panas dan unsur-unsur fisik lain seperti pembekuan, kekeringan, radiasi utraviolet serta

tahan bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri. Bilamana keadaan lingkungan

cukup baik, dinding endospora akan pecah dan membentuk sel vegetative kembali.

Endospora merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten sehingga

mikroorganisme yang bersangkutan dapat bertahan hidup dalam debu dan tanah selama

bertahun-tahun. Adanya endospora dalam debu menjelaskan mengapa Bacillus

merupakan kontaminan umum di laboratorium.

Ketahanan endospora disebabkan adanya selubung spora yng keras dan tebal.

Sifat tersebut menyebabkan diperlukan perlakuan yang keras untuk mewarnainya.

Hanya dengan perakuan panas yang cukup, pewarna yag sesuai dapat menembus

endospore. Tetapi sekali pewarna tersebut memasuki maka sukar dihilangkan.

Ukuran dan letak endospora di dalann sel merupakan ciri-ciri untuk

membedakan spesies-spesies bakteri pembentuk spora. Letak spora ada tiga macam,

yaitu sentral (di tengah sel), terminal (di pinggir sel) dan subterminal (antara sentral

dan terminal). Bentuk endospora umumnya bulat atau lonjong. Adanya spora dapat

mengubah bentuk sel bakteri, dimana endospora menonjol keluar seperti pemukul

tambul, misalnya pada Clostridium tetani. Bila endospora

terletak sentral atau sub terminal, dengan diameter yang lebih besar dari diameter

bakteri, maka bentuknya seperti kumparan.

ALAT DAN BAHAN

1. Biakan padat bakteri Bacillus subtilis berumur 72 jam.

2. NaCl fisiologis.

3. Zat warna karbol fiuksin dan biru metilen.

4. H2S04 1%

5. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.

6. Alkohol 70 % dan air suling dalam botol semprot.

16

7. Ose dan penbakar spirtus.

8. Bak pewarna.

9. Mikroskop majemuk dan minyak celup.

PROSEDUR KERJA

1. Buat suspensi bakteri yang terdiri dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis di

tabung reaksi. tambahkan korbol fuksin sebanyak 1:1 ke dalam suspensi

tersebut.

2. Panaskan campuran tersebu dalam pemanas air bersuhu 800C selama 10 menit.

Jaga jangan sampai mendidih atau kering.

3. Sediakan kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari campuran tersebut.

4. Genangi olesan dengan H2S04 1% selama 2 detik, lalu cuci dengan air suling.

5. Genangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 5 menit, buang

zat warna yang berlebih, bilas dengan air suling, lalu keringkan dengan kertas

saring.

6. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu periksa di bawah mikroskop.

Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti dengan lensa

obyektif berkekuatan 100X. Amati dan gambarkan hasilnya. Endospora akan

berwarna merah dan badan vegetative akan berwarna biru.

17

HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 8

PEWARNAAN NEGATIF

TUJUAN

Mengamati morfologi bakteri yang sukar diwarnai oleh pewarna-pewarna sederhana,

dengan menggunakan prosedur pewarnaan negatif. Memahami setiap langkah dan

reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

TEORI SINGKAT

Metode ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakang

menjadi hitam gelap). Melode pewarnaan negatif meliputi pencampuran

mikroorganisme dengan setetes tinta Cina, lalu disebarkan pada kaca obyek yang

bersih. Mikroorganisme akan terlihat transparan (tembus pandang) di medan tidak

dapat menembus yang gelap, karena pewarna-pewarna tersebut menembus

mikroorganisme. Metode ini berguna untuk bakteri-bakeeri tertentu, seperti spiroketa,

yang sukar diwarnai.

Pewarnaan negatif berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel suatu

mikroorganisme. Pada pewarnaan ini, olesan dipanaskan maupun mendapatkan

perlakuan keras bahan-bahan kimia sehingga dapat menghindarkan terjadinya

penyusutan atau salah bentuk sel. Tetapi jika pewarna sudah mengering, sel-sel tersebut

dapat saja mengalami penyusutan atau salah bentuk.

Keberhasilan metode ini bergantung pada hal-hal berikut :

1. Kaca obyek harus betul-betul bersih (bila terdapat sisa-sisa lemak dan debu,

maka olesan mikroorganisme tidak akan rata).

2. Jumlah tinta Cina yang digunakan menentukan keberhasilan pewarnaan (tidak

boleh berlebih).

3. Campuran mikroorganismc dan pewarna harus diseret di atas kaca obyek bukan

sekedar didorong.

ALAT DAN BAHAN

1. Suspensi bakteri Klebsiela sp.

2. Tinta Cina.

3. Kaca obyek, kapas dan kertas saring.

4. Alkohol 70% dan air suling dalam botol semprot.

5. Ose dan pembakar spiritus.

6. Bak pewarna.

7. Mikroskop majemk dan minyak celup.

PROSEDUR KERJA

1. Sediakan 2 kaca obyek yang bersih. Lelakkan satu ose suspensi bakteri dan

18

satu tetes cina (1:1) di deka ujung kanan kaca obyek pertama.Campurkan

keduanya dengan menggunakan kaca (obvek kedua, sanpai homogen.

2. Letakkan kaca obyek kedua pada kaca obyek pertama dengan membentuk sudut

450, Tarik kaca obyek kedua sepanjano kaca obyek pertama dengan

menyeretnya ke arah kiri.

3. Biarkan preparat tersebut mengering dengan sendirinya.

4. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat lalu periksa di bawah mikroskop

Mulailah dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti dengan lensa

obyek tifbeckekuatan 100X. Amati dan gambarkan-hasilnya.

Sel bakteri akan tampak sebagai bagian yang kosong dengan latar belakang

yang gelap.

19

HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 9

PEWARNAAN KAPSUL

TUJUAN

Mengamati kapsul bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan kapsul

(pewarnaan Burri-Gins). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang

terjadi dalam prosedur tersebut.

TEORI SINGKAT

Beberapa jenis bakteri dan algae hijau-biru mengeluarkan bahan-bahan yang

amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya dan menyelubungi dinding sel. Bila

bahan berlendir tersebut kompak dan menampakkan bentuk yang pasti (bundar atau

lonjong) maka disebut kapsul. Tetapi bila bentuknya tidak teratur dan menempel

kuranng erat pada sel, maka disebut lapisan lendir.

Kapsul dan lendir tidak esensial bagi kehidupan sel, tetapi dapat berfungsi

sebagai makanan cadangan, perlindungan terhadap fagositosis (baik dalam tubuh inang

maupun di alam bebas) atau perlindungan terhadap dehidrasi. Kemampuan

menghasilkan kapsul merupakan sifal genetis, tetapi ukuran dan jumlahnya sangaat

dipengaruhi oleh komposisi medium tempat tumbuh sel-sel tersebut. Ukuran kapsul

berbeda-beda dalam setiap jenis bakteri maupun dalam galur-galur yang berbeda dalam

satu spesies. Pada bebeiapa jenis bakteri, keberadaan kapsul merupakan petunjuk

bahwa mikroorganisme tersebut bersifat virulen (misalnya Streptococcus pneumoniae

atau pneumokokus patogenik). Maka diagnosis pneumonia dan beberapa penyakit lain

dapat dipermudah oleh pewarnaan kapsul. Kapsul bakteri umumnya larut dalam air.

Komposisi kimiawi kapsul berbeda-beda menurut jenis mikroorganismenya.

Ada yang berupa polimer glukosa (misalnya, dekstran pada leuconostoc

mesenleroides), polimer gula-annino (misalnva, asan hialuronat pada

stafilokokuspiogenik), polipeptida (misalnya, polimer asam D-glutamat pada Bacillus

anthracis) atau kompleks polisakarida-protein (misalnva, basillus

disentri).

Bakteri berlendr dapat mengganggu perindustrian, misalnya pada pembuatan

gula tebu. Belacoccus dextranicus dapat membentuk lendir yang sangat banyak

sehingga memampatkan mesin pembuat gula. Bacillus subtillis kadang-kadang

mengganggu pembuatan roti. dengan membentuk lendir yang liat yang kenyal.

Kapsul bakteri sangat sukar diamati deng0\an nikroskop cahaya biasa karena tidak

berwarna dan mempunyai indeks bias yang rendah. Kapsul bakteri bersifat non-ionik,

maka tidak dapat diwarnai dengan prosedur pewarnaan sederhana. Masalah utama

dalam pewarnaan kapsul adalah bila olesan bakteri tersebut difiksasi dengan panas

dengan mtlode biasa maka kapsul tersebut akan meluncur pada waktu pencucian. Tetapi

kebuluhan bakteriologis biasanya hanya memerlukan deteksi ada atau tidaknya kapsul.

Tuuuan ini dapat dicapai dengan

menggabungkan prosedur pewarnaan negattf dengan pewarnaan sederhana.

20

ALAT DAN BAHAN

1. Suspensi bakteri Klebsiela sp.

2. Tinta Cina dan zat warna air fuksin

3. Kaca obyek, kapas dan kertas saring

4. Alkohol 70% dan air suling dalam botol seprot

5. Ose dan pembakar spirtus

6. Bak pewarna.

7. Mikroskop majemuk dan minyal celup/emersi

PROSEDUR KERJA

1. Sediakan 2 kaca obyek yang bersih. Letakkan satu ose suspensi bakteri dan stu

tetes Tinta Cina (1:1) pada dekat ujung kanan kaca obyek pertama. Campurkan

keduanya dengan menggunakan sudut kaca obyek kedua, sampai hornogen.

2. Letakkan kaca obyek kedua pada kaca obyek pertama dcngan membentuk

sudut450. Tarik kaca obyek kedua sepanjang kaca Obyek pertama dongan

menyeretnya ke arah kiri.

3. Fikssi preparat tersebut dengan melalukannya sebanyak 3 kali di atas api.

4. Genangi dengan pewarna air fuksin selama 5 menit, buang zat warna yang

berlebih, lalu keringkan dengan kertas saring.

5. Teteskan sedikit minyak imersi pada preparat, lalu periksa di bawah

mikroskop.Mulailah dengan obyektif berkekuatan rendah 10X, lalu ganti

dengan lensa obyektif berkekuatan. 100X. Amati dan gambarkan hasilnya.

Sel bakteri akan berwarna merah dan kapsul tampak sebagai bagian yang

kosong di Sekitar tubuh bakteri.

21

HASIL PENGAMATAN

KEGIATAN 10

PEMBIAKAN BAKTERI

10.1. Pcnyimpanan Media

Tujuan

Mempelajari prosedur umum untuk merekonstitusi medium berbentuk bubuk dan

menaruhnya dalam jumlah yang dikehendaki ke dalam wadah-wadah yang sesuai.

Teori Singkat

Medium adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkah mikroorganisme

di atas atau di dalamnya. Persyaratan unluk membuat medium itu amat beragam,

diantaranya yang utama adalah air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh. Air

merupakan komponen utama protoplasma (70-85% protoplasma terdiri dari air) serta

wahana bagi masuknya nutrien ke dalam sel dan keluarnya sekresi ataupun ekskresi

dari dalam sel. Selain itu air juga diperlukan untuk berlangsungnya reaksi-reaksi

enzimatik di dalam sel. Air yang digunakan adalah air suling. Air sadah tidak dapat

digunakan karena pada medium yang mengandung pepton dan ekstrak daging dapat

menyebabkan terbentuknya endapan fostal dan magnesium fosfat.

Berdasarkan pada sumber karbon yang digunakan, organisme dibagi menjadi

dua kelompok yaitu organisme autotrof (organisme yang dapat mensintesis semua

komponen selnya dari karbon diokside) dan organisme heterotrof (organisme yang

memerlukan satu atau lebih senyawa organik sebagai sumber karbonnya termasuk

karbondiokside).

Lebih jauh lagi, organisme dikelompokkan berdasarkan pada sumber energinya

yaitu adalah fotoautotrof (autotroph fotosintetik) adalah aututrof yang dapat

memancarkan energi cahaya matahari dengan bantuan pigmen fotosintetiknya,

sedangkan yang memperoleh energi dari oksidas senyawa-senyawa anorganik

sederhana (seperti nitrit, nitrat atau sulfide) disebut kemoaufotrof (autotrof

kemosintetik). Kemoheterotrof (heterotrof kemosintetik) adalah heterotrof yang

memerlukan sumber energi organik seperti glukose atau asam-asam amino. Sebagian

besar bakteri termasuk kelompok ini. Fotogeterotrof (heterotroph fotosintetik)adalah

organisme yang dapat memanfaatkan energi cahaya matahari (mempunyai pigmen

fotosintetik) dan memerlukan sumber karbon organik seperti alkohol.

Sumber nitrogen bagi organisme autotrofk adalah senyawa anorganik,

sedangkan bagi heterotrof dapat berupa asam amno atau senyawa-senyawa protein

intermediat seperti peptde, protease, dan pepton. Misalnya, pada kaldu nutrien (nutrient

broth), nitrogen diperoleh dari ekstrak daging dan pepton. Faktor tumbuh ialah

komponen selular esensial (yaitu asam-asam amino atau vitamin) yang tidak dapat

disintesis sendiri oleh organisme dari sumber dasar karbon dan nitrogennya. Bagi

banyak heterotrop, factor tumbuh dipenuhi dari ekstrak daging ataukaldu nutrient.

Namun bagi pathogen-patogen yang lebih rewel (fastidious),untuk penyediaan faktor

22

tumbuhnya memerlukan medium yang lebih rumit seperti agar darah.

Berdasarkan komposisi kimianya, dikenal medium sintetik yaitu medium yang

komposisi kimiawinya diketahui dengan pasti dan biasanya dibuat dari bahan-bahan

kimia yang kemurniannya tinggi dan ditentukan dengan tepat, sehingga medium ini

dapat diulangi pembuatannya, Medium nonspesifik atau kompleks adalah medium yang

komposisi kimiawinya tidak diketahui dengan pasti, misalnya ekstrak daging dan

pepton.

Kaldu nutrien disebut medium serbaguna karena merupakan medium yang

paling umum digunakan dalam bakteriologi. Sedangkan medium yang mengandung

zat-zat kimia tertentu yang dapat menghambat petumbuhan. satu kelompk bakteri atau

lebih tanpa menghambat pertumbuhan organisme yang diinginkan disebut medium

selektif. Selain itu dikenl pula medium diferensial yaitu medium yang mengandung

kimia tertentu yang memungkinkan si pengamat membedakan berbagai tipe bakteri.

Berdasarkan konsistensinya, medium dibagi menjadi medium cair seperti kaldu

Nutrient atau kaldu glukosa. Medium ini dapat digunakan untuk pembiakan organisme

dalam jumlah besar, penelaahan fermentasi, dan berbagai macam uji. Medium padat,

biasanya digunakan untuk mengamati penampilan atau morfologi koloni dan

mengisolasi biakan murni. Untuk membuat medium pdat, dapat ditambahkan agar-

agar, gelatin atau gel silica ke dalam medium kaldu. Agar-agar menjadi larut atau cair

bila dipanaskan pada suhu hampir 1000C dan tetap berbentuk cair bila didinginkan

sampai kurang lebih 430C. Hal ini berbeda dengan gelatin, sekali menjadi padat tidk

dapt dicairkan lgi. Oleh karena itu yang paling umum digunakan ialah agar-agar

namun tidak dianjurkan untuk mencairkan kembali medium padat agat lebih dari dua

kali karena dapat memberikan hasil yang kurang baik, Sedangkan medium dengan

konsistensi pertengahan disebut medium setengah padat, medium ini dapat digunakan

untuk menguji ada tidaknya motilitas dan kemampuan fernentasi.

Alat dan Bahan

Gelas ukur 200-250 ml

gelas piala 250 ml

neraca berlengan tiga

kertas timbang

spatula atau sendok

batang pengaduk kaca atau pemusing magnetik

pembakar Bunsen kaki tiga dan kasa

kertas pH atau pH meter

thermometer

pipet10 ml atau gelas ukur 25 ml

tabung reaksi (9 buah)

cawan petri (8 buah)

kapas untuk sumbat

papan miring

keranjang/rak tabung

23

nutrient agar (NA; agar nutrien) Difco

larutan penyangga baku (standard buffer) pH 7,0 dan pH 4,0

Prosedur Kerja

1. Penyiapan dan penempatan Medium untuk Disterilkan

Bacalah dengan teliti petunjuknya pada wadah berisi medium nutrient agar

(NA). Hitunglah jumlah yang sesuai untuk volume yang dibutuhkan yaitu dalam

percobaan ini akan disiapkan 110 ml medium.

Ukurlah 110 ml air suling menggunakan gelas ukur kemudian tuangkan dalam

gelas piala.

Siapkan neraca berlengan tiga. Letakkan wadah yang akan dipakai untuk

menimbang pada pinggan neraca. Ambilah medium agar nutrien dengan spatula

atau sendok dan timbanglah seberat 25 gr.

Taruhlah medium tersebut ke atas air suling dalam gelas Piala.

Didihkan medium agar selama beberapa menit untuk melarutkannya. Medium

harus terus tenerus diaduk dengan batang pengaduk kaca atau dengan alat

pemusing magnetik untuk mencegah hangusnya atau meluapnya medium Ingat,

medium seperti medium kaldu tidak memerlukan pemanasan untuk

melarutkannya.

Pada penyiapan medium seperti agar nutrien biasanva tidak perlu dilakukan

penyesuaian pH. Tetapi bila memerlukan penyesuaian pH, dapat dilakukan

langkah-langkah berikut :

a. Ambillah 10 ml medium tersebut dan ukur pH nya dengan kerlas pH atau pH

meter.

b. Sesuaikan pH 10 ml medium dengan cara menambahkan 0,1N HCL atau NaOH

sesuai dengan keperluan.

c. Berdasarkan hasil yang diperoleh di atas, hitunglah jumlah asam atau basa yang

perlu ditambahkan pada sisa medium untuk mencapai pH yang diinginkan.bila

ternyata diperlukan 10 ml atau lebih 0,1N HCL asam atau basa, gunakanlah

asam atau basa dengan konsentrasi lebih tinggi.

d. Satukan kembali Imediunn tersebut ke dalam wadah semula. Ambilah lagi 10

ml medium untuk memeriksa kembali pH nya. Berdasarkan dari pH yang

dikehendaki.

Dengan menggunakan pipet, tempatkanlah medium tersebut ke dalam 9 bua

tabung reaksi, 8 tabung diisi masing-masing 12 ml (untuk agar cawan)

sedangkan 1 tabung diisi 4 ml (untuk agar miring). Medium untuk penyiapan

agar cawan dapat juga disterilkan dalam labu erlenmeyer. sedangkan

penempatan medium ke dalam tabung dapat menggunakan salah satu dari alat

berikut : buretpembagi, pipet otomatis, gelas ukur, pipet serologis atau corong.

Tabung tidak boleh diisi lebih dari setengahnya sedangkan labu tidak boleh diisi

lebih dari sepertiganya agar tidak meluap ketika disterilkan.

Sumbatlah tabung-tabung tersebut dengan kapas.

Sterilkan media tersebut dalam sterilisator uap pada 1210C selama 15 menit.

24

2. Penuangan Agar Cawan dan Pembuatan Agar Miring.

Setelah dikeluarkan dari steriisator, letakkan kedelapan tabung tersebut ke

dalam penangas air bersuhu 500C dan biarkan selama 5 menit.

Sambil menunggu, ambilah tabung yang berisi 4 ml medium, letakkan pada

papan miring, biarkan menjadi dingin dan padat.

Sementara itu ambilah tabung medium yang berisi 12 ml medium yang suhunya

telah terekuilibrasi, dan tuangkanlah satu per satu ke dalam cawan petri steril

secara aseptik. Usahakan agar seluruh permukaan cawan petri tertutup oleh

medium.

Biarkan medium tersebut menjadi dingin dan padat. Setelah itu pada permukaan

luar dasar cawan tuliskan dengan pinsil lilin atau spidol nama, tanggal dan

singkatan nama medium (dalan hal ini NA). Setiap 10 cawan lalu ditumpuk dan

dimasukkan dalam kantung plastik kertas dan disimpan dalam lemari es sampai

diperlukan.

Lakukan hal yang sama seperti no.4 untuk agar miring, tempatkan pada

keranjang tabung.

10.2. Sterilisasi Bahan dan Peralatan

Tujuan

Untuk memahami berbagai macam prosedur sterilisasi.

Teori Singkat

Yang dimaksud sterilisasi dalam mikrobiologi ialah suatu proses untuk

mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Ada tiga

cara sterilisas yang umum dipakai yaitu :

1. Sterilisas menggunakan panas (yang umum digunakan di Laboratorium

Mikrobiologi) Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air disebut

sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah, bila tanpa kelembaban disebut

sterilisasi panas kering (sterilisasi kering).

2. Sterilisasi menggunakan bahan kimia dapat dilakukan dengan menggunakan

gas atau radiasi.

3. Sterilisasi dengan cara penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoklaf (presure cooker) atau

sterilisasi uap yang mudah diangkat (portable) dengan menggunakan uap air jenuh

bertekanan pada suhu 1210C selama 15 menit. Dapat pula dipakai kombinasi suhu dan

waktu lain yang memberikan hasil sama.

Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat

ditembus uap air karena uap air berkondensasi pada bahan-bahan yang disterilkan,

dilepaskan panas sebanyak 686 kalori per gram uap air pada suhu 1210C dan panas ini

mendenatutasikan atau mengkoagulasikan protein pada organisme hidup maka dengan

demikian mematikannya, 25

Contoh: mensterilkan media biakan yang umum, air suling, peralatan laboratorium,

biakan yang akan dibuang, media tercemar, bahan-bahan dari karet dan mensterilkan

barang-barang di rumah sakit seperti ramuan susu, sprei, dan berbagai macam

peralatan. Namun beberapa macam media seperti kaldu-kaldu fermentasi tertentu,

gelatin nutrienr dan susu litmus harus menggunakan suhu yang lebih rendah dan

tekanan yang lebih rendah pula karena bahan-bahan semacam ini akan rusak bila

dipanaskan sampai 1210C,

Syarat-syarat melakukan sterilisasi uap:

1. Udara harus dikosongkan betul-betul dari ruang sterilisaior.

2. Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkenai uap.

3. Bahan-bahan yang berpori atau yang berbentuk cair harus permiabel terhadap

uap.

4. Suhu sebagaimana yang teruku oleh termometer harus mencapai 1210C dan

dipertahankan setingi itu selama 15 menit.

Sterilisasi panas kering adalah sterilisasi yang dilakukan pada apa saja yang

tidak rusak, menyala, hangus, atau menguap pada suhu selama sekurang-kurangnya 10

menit. Contohnya mensterilkan alat-alat pecah belah (pipet, tabung reaksi, jarum suntik

dan bahan-bahan yang tidak tembus uap seperti gliserin, minyak, vaselin dan bahan-

bahan berupa bubuk. Bahan-bahan yang disterilkan harus dilindungi dengan cara

dibungkus, menyumbat dan menaruhnya dalam suatu wadah tertutup untuk mencegah

kontaminasi setelah dikeluakan dari oven. Pipet misalnya disterilkan dalam bumbung

pipet.

Bahan-bahan yang menjadi rusak bila disterilkan pada suhu tinggi, dapat

disterilkan pada suhu kamar secara kimiawi (menggunakan gas atau radiasi) misalnya

mensterilkanbahan-bahan dari plastic dan dengan menyaring misalnya larutan atau

suspensi (serum, larutan bikarbonat, enzim, toksin bakteri media sintetik terdentu dan

antibiotika). Sterilisasi kimiawi dilakukan pada suhu kamar selama 2 sampai 18 jam.

Beberapa baban kimia yang dapat digunaka untuk sterilisasi gas ialah etilen okside,

asam parasetat, formaldehide, dan glutaraldehide alkalin.

Sterilisasi dengan radiasi dapat diakukan dengan sinar gamma.

Alat dan Bahan

bahan dan peralatan yang akan disterilkan

sterilisator uap portable

Prosedur Kerja

1. Tuangkan air suling secukupnya ke dalam tubuh sterilisator (jumlah tertera pada

buku alat yang bersangkutan).

2. Tatalah labu atau tabung-tabung berisi media di dalam wadah aluminium bagian

dalam sedemikian sehingga tersedia ruangan untuk bergeraknya uap air secara

bebas diantara labu-labu atau tabung-tabung selama sterilisas, kemudian

letakkan dalam sterilisator. 26

3. Letkkn tutup sterilisator pada tubuh sterilisator dengan cara mempertemukan

tanda-tanda panah penunjuk dan memasukkan tabung pengeluaran gas ke dalam

saluran pengarah pada dinding bagian dalam wadah aluminium dan kencangkan

murnya.

4. Buklah pengatur klep pengaman, kemudian pasanglah pemanasnya.

5. Bila uap air mulai keluar dengan keras (mendidih) tutuplah klep pengaman.

Maka tekanan di dalam sterilisator pun akan naik dan dapat dibaca pada alat

pengukur tekarnan.

6. Sterilkan media yang akan digunakaa dengan cara tekanan 1 atm selama 15-20

menit. Untuk media seperti susu litmus, kaldu fermentasi dan gelatin nutrien

diperlukan suhu lebih rendah 1000C-1150C pada tekanan 0,5-0.7 atm selama 15-

20 menit.

7. Pada akhir proses matikanlah pemanasan, dan tungguah sampai tekanan

kembali nol.

8. Bila alat tolok tekanan telah menunjuk pada angka nol dan suhu telah turun

sampai jauh di bawah 1000C, bukalah pengatur klep pengaman dengan cara

meluruskanmra untuk mengeluarkan sisa uap yang tertinggal di dalam.

Kendurkan mur lepaskan baut-bautnya, pytar tutupnya dan angkatlah.

9. Bila anda selesai menggunakan alat sterilisator, buanglah sisa air didalamnya

dan keringkan semua bagiannya.

Perhatian : Pada waktu mencuci tutupnya, jagalah agar alat tekanan tidak

tercelup air. Jangan sekali-kali menuangkan air yang dingin sekali koe dalam

sterilisator yang masih panas.

10.3. Teknik Pemindahan Biakan Mikroba Secara Aseptik

Tujuan

Menguasai teknik pemindahan bakteri dari satu wadah ke wadah yang lain secara

aseptik.

Teori Singkat

Mikroorganisme luar yang tidak dikehendaki dapat masuk ke dalam biakan

murni melalui kontak langsung dengan permukaan atau tangan anda yang tercemar,

tersentuhnya media atau permukaan tabung bagian dalam oleh benda yang belum

disterilkan ataupun melalui aliran udara. Dengan teknik aseptik dapat mencegah

tercemarnya biakan murni sekaligus akan dapat pula melindungi anda dari infeksi diri

dan melindungi orang-orang di sekeliling anda dari pencemaran di laboratorium.

Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu spesies tunggal. Maka

dengan. melakukan teknik aseptik secara baik maka yang akan tumbuh dalam biakan

hasil pemindahan hanyalah organisme yang diinginkan (yang dipindahkan). dengan

perkataan lain tidak tercemar.

27

Alat dan Bahan

rak tabung

2 tabung reaksi kosong bersumbat

1 agar miring nutrient agar (NA)

3 tabung nutrient broth (NB)

biakan agar miring Serratia marcescens

lup inokulasi

Presedur Kerja

1. Siapkan lup inokulasi.

2. Peganglah kedua tabung nutrien broth (NB steril di tangan kiri anda) Tandaiah

tabung-tabung ini NB1 dan NB2.

3. Pijarkan lup Inokulasi di atas bunsen sampai seluruh kawatnya pijar.

Gerakkanah dengan ceaat lup tersebut ke arah bawah di atas api sehingga

sebagian dari tangkainya tersebut yang berbatasan dengan jarum ikut terpanasi.

Biasakanlah untuk mumulai memanaskan ujung lup di dalam kerucut api

sebelah dalam yang berwarna lebih biru (lebih dingin daripada kerucut api

sebelah luar yang berwarna lebih muda) selama 1-2 detik pertama untuk

mencegah terjadinya "percikan". Biarkan lup mendingin selama lebih kurang

30 detik sebelum dipakai, untuk mencegah matinya bakteri yang akan

dipindahkan ataupun terjadinya percikan.

4. Angkatlah sumbat kedua tabung satu demi satu. Mulailah dengan Sumbat

tabung yang terdekat dengan tangan kanan Anda (dalam hal ini tabung 2)

dengan melingkarkan jari kelingking tanpa membasahi sumbat tabung.

5. Angkatlah sumbat tabung yang lain (tabung l) dengan cara serupa namun

Dengan jari manis.

6. Panaskan mulut kedua tabung yang tidak tersumbat tersebut dengan cara

melalukannya bolak balik dua kali di atas api. Jagalah agar sudut kemiringan

tabung tidak melebihi 450 bila tidak tersumbat.

7. Inokulasikan sejumlah kecil bakteri dari tabung 2 ke dalam tabung 1.

8. Panaskan kembali mulut kedua tabung tersebut seperti cara ke-6.

9. Kembalikan sumbat tabung satu persatu dimulai dengan tabung yang terdekat

dengan tangan kanan Anda (yaitu tabung 2).

10. Pijarkan kembali lup untuk mematikan sisa bakteri yang masih melekat

padanya.

11. Ulangi pemindahan aseptik ini untuk memindahkan sejumlah kecil bakteri S.

Marcescens (dari biakan agar miring yang disediakan) ke dalam tabung

berisikan kaldu nutrien steril. Tandailah tabung ini NB3.

12. Ulangi pemindahan aseptik untuk memindahkan sejumlah kecil bakteri S.

Marcescens ke dalam tabung berisikan agar miring NA steril. Cara

menglsolasikan agar miring, dimulai dengan meletakkan lup yang mengandung

biakan pada dasar kemiringan agar lalu ditarik ke atas dengran gerakan zig-zag.

28

13. Kembalikanlah semua tabung dan lup inokulasi ke rak tabung.

14. Berilah etiket pada semua tabung Anda yang batru saja diinokulasikan (lihat

contoh) dan letakkanlah tabung-tabuag tersebut di tempat-tempat yang telah

disediakan untuk diinkubasikan pada suhu 300C selama 48 jam.

Contoh penulisan etiket :

15. Bila Anda melakukan teknik pemindahan tersebut dengan baik maka tabung

tabung akan tampak keruh sedangkan NBI dan NB2 harus tetap jernih, pada

agar miring NA akan tampak koloni berwarna merah dan seragam tidak

tercemar oleh koloni lain. Tunjukkanlah hasi anda pada asisten yang bertugas

untuk dinilai.

10.4. Isolasi Bakteri Dari Suatu Campran

Tujuan

Mempelajari cara-cara nengisolasi bakteri dari suatu campuran dengan teknik cawan

gores dan cawan tuang.

Teori Singkat

Di alam amat jarang dijumpai mikroba sebagai satu spesies tunggal umumnya terdapat

dalam populasi campuran. Sedangkan semua metode mikrobioogis yang digunakan

unuk nenelaah atau mengidentifikasi mikroorganisme, temasuk penelaahan ciri-ciri

kultural, morfologis, fisiologs, maupun serologis, memerlukan suatu populasi yang

terdiri dari satu macam mikroorganisme saja atau disebut biakan murni (yaitu biakan

yang sel-selnya berasal dari pembelahan salu sel tunggal).

Ada beberapa metode unluk memperoleh biakan murni dari suatu biakan

campuran. Metode yang paling umum digunakan adalah teknik cawan gores dan cawan

tuang. Kedua metode ini menggunakan prinsip yang sama yaitu mengencerkan

mikrooganisme sedemikian sehinga individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya,

dengan anggapan bahwa setiap koloni terpisah yang tampak pada cawan petri setelah

inkubasi berasal dari satu sel tunggal.

Dalam kegiatan ini, Anda akan memisahkan tiga spesies bakteri yang berlainan

dari suatu tabung berisi biakan campuran. Perbedaan utama antara ketiga spesies

tersebut ialah wama koloninya: Serratia marcescens, berwarna merah, Micrococcus

luteus berwarna kuning, dan Escherichia coli berwarna putih.

29

300c IVAN 6/5/96

Serratia marcescens

Aseptis Kegiatan3 NA

Metode Cawan Gores

Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu: menghemat bahan dan waktu.

Dua macam kesalahan yang umum dilakukan oleh mahasiswa yang baru

mempelajari mikrobiologi ialah: (1) tidak memanfaatkan permukaan medium dengan

sebaik-baiknya untuk digores sehingg pengenceran mikroorganisme menjadi kurang

lanjut, (2) cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga

menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan. Bila anda menggunakan teknik

menggores yang baik maka pada suatu arena tertentu pada permukaan medium yang

digores, sel-sel bakkeri akan terpisahkan satu dari yang lainnya. Se-sel tunggal yang

terpisahkan seperti ini disebut sel induk. Pada waktu inkubasi setiap sel induk berbagi

diri dengan membelah biner (reproduksi aseksual) dalam waktu 20-30 menit menjadi

dua sel anak, pada 20-30 menit berikutnya setiap sel anak membagi diri lagi sehingga

kini terdapat 4 sel anak. Sel-sel baru itu terus berbagi diri dalam eksponensial menjadi

bermilyar-milyar sel anak yang saling bertumpukan di atas dan disampingnya

membentuk satu koloni. Bila setelah masa inkubnsi koloni-koloni tersebut saling

terpisahkan cukup jauh sehingga tidak bersentuhan,maka diperoleh koloni murni. Satu

koloni murni terdiri dari bermilyar-milyar koloni anak, karena kebanyakan bakteri

setelah masa inkubasi selama 24 jam, satu koloni dapat terdiri dari 50-72 generasi sel

yang timbul dari satu se iduk tunggal. Dengan demikian dikatakan bahwa pertumbuhan

bakteri sesungguhnya merupakan pertumbuhan jumlah sel dan bukan ukuran sel. Pada

metode cawan gores ini, ada beberapa cara menggoreskan inokulum pada permukaan

medium agar, dalam kegiatan ini akan menggunakan

metode penggoresan kuadran.

Alat dan Bahan

1 suspensi Serratia marcescens, Escherichia coli, dan Micrococcus luteus.

2 cawan nutrienn agar (NA, agar nutrien)

lup inokulasi

jarum pindah

3 agar miring NA

Prosedur Kerja

1. Tuliskan nama anda, nomor kegiatan, dan tanggal pada tutup cawan petri Anda.

2. Baliklah cawan petri Anda dan dengan menggunakan pinsil lilin atau spido,

bagilah seluruh area cawan menjadi empat yaitu sektor 0 (lebih kecil daripada

sector-sektor lainnya)adalah tempat anda mula-mula meletakkan inokulum

dengan lup inokulasi, sector I adalah tempat meletakan inokulum pengenceran

pertama, sektor II merupakan usaha pengenceren kedua. dan sektor III

merupakan usaha pengencean terakhir.

3. Goreskanlah biakan campuran yang disediakan pada cawan petri Anda sebagai

berikut :

Letakkan cawan petri Anda di meja dengan tutupnya terletak di sebelah atas

30

dan sektor 0 di sebelah kiri anda (ubah posisi ini 1800 bila Anda kidal)

Kocoklah tabung berisi biakan campuran dengan gerakan ke samping (bakteri

cenderung mengendap di dasar tabung bila dibiarkan agak lama) sehingga

suspensi tampak rata). Jagalah agar sumbatnya tidak terbasahi.

Dengan menggunakan lup inokulasi, pindahkan secara aseptic satu lup penuh

biakan campuran bakteri pada sector 0 dan goreskanlah lup anda tanpa

ditekan bolak balik beberapakali di area permukaan agar. Lingkungan

pada ujung lup anda harus terletak datar dan horizontal mungkin terhadap

permukaan agar. Bila biakan campuran tersedia dalam media agar padat,

jagalah agar jumlah inoculum yang anda pindahkan tidak terlalu banyak

cukup menyentuh lup anda saja pada biakan yang akan digores.

Pijarkan lup anda dan biarkan mendingin. Suhu lup dapat diperiksa dengan

cara menyentuhkan pada bagian permukaan agar bagian tepi yang belum

diinokulasi. Bila mendesis artinya lup tersebut masih panas. Pemijaran

lup mematiakn sel-sel yang tersisa padanya dan dengan demikian

membantu pengenceran jumlah sel.

Goreskan lup Anda ke sektor 0 disusul gerakan ke tpi luar sektor I, lalu

kembali ke sektor 0 dan seterusnya, bolak-balik sebanyak 2-3 kali. Kemudian

selesaikan penggoresan tersebut di sektor I tanpa menyentuh lagi sektor 0

sampai sektor I penuh terisi goresan yang tidak bertumpang tindih.

Putarlah cawan petri sehingga sektor I terletak di sebelah kiri Anda.

Ulangi langkah 3e untuk mengencerkan biakan dari sektor I ke sektor II.

Putarlah cawan petri Anda sehingga sektor II terletak di sebelah kiri Anda.

Ulangi langkah 3e untuk mengencerkan biakan dari sektor II ke sektor III.

Perhatian : jangan lupa memijarkan kembali lup Anda setiap kali Anda berpindah

sektor.

Lakukan penggoresan yang sama (langkah 3a-3i) dengan menggunakan biakan

campuran yang sama pada cawan petri kedua.

Letakkan cawan-cawan petri Anda dalam posisi terbalik daam keranjang yang

telah disediakan untuk diinkubasikan pada suhu 300C selama 48 jam.

Metode Cawan Tuang

Adalah cara untuk memperoleh koloni murni dari populasi koloni campuran

mikroorganisme dengan pengenceran specimen dalam medium agar yang telah

dicairkan dan didinginkan (500) yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-

sel mikroba di dalam spesimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka

pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehinggra sekurag-kurangnya satu di

antara cawan-cawan tersebut mengandung koloni-koloni terpisah di atas permukaan

ataupun di dalam agar.

Metode ini memboroskan bahan dan waktu tetapi tidak memerlukan ketrampilan

yang terlampau tinggi.

31

Alat dan Bahan

Suspense campuran Serratia mercescens, Escherichia coli, dan Micrococcus

luteus.

3 cawan petri steril

3 tabung nutrien agar yang suhunya telah diinkubasikan dalam penangas air

bersuhu 500C

Lup inokulasi

Prosedur Kerja

1. Tuliskan nama anda, kelompok praktikum, nomor kegiatan dan tanggsl pada

permukaan luar dasar cawan petri Anda.

2. Beri cawan-cawan petri tersebut nomor 1, 2 dan 3

3. Ambillah 3 tabung agar nutria dari penangas air, keringkan bagian luar dengan

kain penyeka, berilah nomor 1, 2 dan 3, lalu letakan dalam rak tabung.

4. Kocoklah tabung berisi suspensi biakan campuran dengan gerakan kesamping

sehingga kekeruhannya tampak rata. Hati-hati jangan sampai sumbatnya

terbasahi.

5. Pijarkan lup inokulasi dan dengan menggunakan teknik aseptik pindahkan dua

lup penuh suspensi biakan campuran ke dalam tabung NA no. l. Campurkan

inokulum tersebut sampai dengan cara metmutarkan tabung tersebut di antara

ke dua telapak tangan (jangan dikocok untuk menghindari timbulnya

gelembnng-gelembung udara).

6. Dengan cara yang sama pindahkan dua lup penuh biakan dari tabung no. I ke

dalam tabung no 2. Campurkan pula hingga rata seperti pada langkah 5.

7. Dengan cara yang sama pindahkan dua lup penuh biakan dari tabung no. 2 ke

dalam no. 3. Campurkan pula hingga rata seperti langkah 5.

8. Secata aseptik luangkan agar dari tabung yang bernomor I, 2, dan 3 masing-

masing ke dalam cawan-cawan petri yang bernomo l, 2, dan 3. Biarkan agar

tersebut menjadi padat.

9. Letakkan cawan-cawan petri tersebut dalam posisi terbalik di dalam kerenjang

yang telah disediakan untuk diinkubasikan pada suhu 300C selama 48 jam.

10.5. Teknik Biakan Penyuburan

Tujuan

Mempelajari beberapa cara untuk menyediakan kondisi pembiakan yang

memungkinkan diisolasinya suatu spesies tertentu yang dikehendaki dari suatu

populasi campuran.

32

Teori Singkat

Untuk memperoleh spesies tertentu yang diminati dan jumlahnya amat sedikit, sangat

sulit jika hanya menggunakan teknik-teknik rutin seperti metode cawan gores atau

cawan tusng. Maka untuk itu dapat digunakan teknik penyuburan untuk memperbesar

kemungkinan terisolasinya organisme tersebut. Teknik ini pada hakekatnya suatu

lingkungan, yaitu komposisi medium atau kondisi fisik yang bersifat seleklif terhadap

spesies yang dikehendaki. Dalam kegiatan ini Anda akan mengisolasi dua jenis bakteri

yaitu bakteri koliform tinja dari air limbah dan khamir fermentatif dari sari buah.

1. Koliform Tinja

Organisme ini sesungguhnya penghuni usus manusia dan hewan. Bakteri Escherechia

Coli biasanya digunakan sebaaia indikator pencemaran persediaan air oleh Tinja. Ada

dua macam medium yang sangat selektif untuk mengisolasi koliform tinja yaitu :

(1) lauryl tryptose broth (LTB), betsifat selektif karena menghambat pertumbuhan

bakteri Gram positif dan mendorong pertumbuhan bakteri Gram negatif yang dapat

menggunakkan lactose. (2) mediun agar eosin methylene blue (EMB), bersifat selektif

dan diferensial. Selektif terhadap orgenisme Gram negatif karena zat warna yang

terkandung di dalamnya melancarkan efek bakteriostatik terhadap bakteri Gram positif.

Dan diferensial karena dapat membedakan antara bakteri peragi laktose (yaitu bakteri

Gram negatif akan mengambil sebagian dari zat warna yang terkandung di dalam

sehingga koloninya akan tampak ungu atau gelap di bagian tengahnya dan tidak

berwarna dibagian tepinya) dan bakteri yang bukan peragi lactose.

Koloni bakteri dari genus Escherichia dan Enterobakter seringkali menampilkan warna

hijau logam sedangkan koloni organisme yang tidak dapat menfermentasi laktose

tampak tidak berwarna.

Alat dan Bahan

contoh air selokan

pipet 1 ml

tabung Durham berisi lauryl tryptose broth (LTB)

cawan agar eosin methylene blue (EMB)

lup inokulasi

kaca obyek dan kaca tutup

vaselin

seperangkat pewarna Gram

kertas serap

mikroskop majemuk, minyak celup dan kertas lensa

Prosedur Kerja

1. Inokulasikan 0,5 ml air selokan ke dalam tabung Durham berisi LTB.

Inkubasikan pada suhu 440C selama 24-48 jam.

2. Bila terlihat adanya pembentukan gas, kocoklah balak-balik biakan tersebut dan

secara aseptic goreskanlah satu lup penuh biakan pada cawan agar EMB

33

dengan menggunakan metode kuadran. Inkubasikan cawan tersebut dalam

posisi terbalik pada suhu 370C selama 48 jam.

3. Amatilah cawan Anda dan pilihlah sebuah koloni yang terpisah baik vang

menampakkan kilauan logam pada permukaannya, Lakukanlah pewarnaan

Gram terhadap olesan yang dibuat dari koloni tersebut.

Perhatian: lakukan langkah ini secara aseptik sehingga koloni tersebut tidak

tercemar.

4. Bila preparat Gram Anda menunjukkan organisme Gram negatif berbetuk

batang secara aseptik inokulasikan koloni yang sama pada cawan tadi ke dalam

tabung Durham berisi medium LTB. Inkubasikan pada suhu 440C selama 24-48

jam.

5. Bila pada tabung tersebut terlihat adanva pembentukan gas, secara aseptic

goreskanlah satu lup penuh biakan tersebut pada cawan EMB. Inkubasikan pada

posisi terbalik pada suhu 440C selama 48 jam.

6. Serahkanlah pada asisten Anda. biakan murni dalaim cawan EMB dan preparat

Gram. Disamping itu tunjukkanlah pula preparat basah Anda di bawah

mikroskop agar dapat diperiksa dan dinilai oleh asisten Anda.

II. Khamir Fermentatif

Cendawan jenis ini paling banyak ditemukan pada buah-buahan dan hasil

fermentasinya yang bersifat asam.

Alat dan Bahan

nenas untuk diambil sarinya

tabung reaksi

paraffin

lup inokulasi

kaca obyek beserta kaca tutup

vaselin

Cawan agar dekstrose yang telah diasamkan dengan 0,15% asam tartarat

tabung Durham berisi nutrien broth (NB;kaldu nutrien) + 2% dekstrose

seperangkat pewarna gram

kertas serap

mikroskop majemuk minyak celup dan kertas lensa.

Prosedur kerja

1. Hancurkan nenas, ambil sarinya sebanyak 10 ml, masukkan ke dalam tabung

reaksi dan segel dengan parafin, lalu inkubasikan pada suhu kamar selama

beberapa hari.

2. Bila terlihat adanya pembentukan gas dalam tabung tersebut, ambillah sedikit

sampel dari dasar tbung untuk membuat lekapan basah dan amatilah ada

tidaknya sel-sel khamir di bawah mikroskop.

34

3. Bila teramati adanya sel-sel khamir pada siapan basah Anda, maka goreskanlah

satu lup penuh cairan sari buah tersebut (juga diambil dari dasar tabung) dengan

metode kuadran pada cawan agar dekstrose yang telah diasamkan dengan asam

tartarat. Inkubasikan cawan Anda dengatl posisi terbalik pada suhu kamar

selama 48 jam.

4. Amatilah cawan Anda. Koloni khamir akan tampak bundar dengan tepian licin

dan permukaan seperti berlendir. Pilihlah dua koloni semacam itu yang terpisah

baik dan masing-masing inokulasikan pada tabung Durham berisi kaldu nutrien

+ 2% Dekstrose. Inkubasikan pada suhu kamar selama 48 jam.

5. Amati tabung Durham Anda. Bila Anda melihat pembentukan gas, buatlah lagi

siapan basah dan amati apakah Anda memiliki sel-sel yang tampak seragam.

Bila demikian maka goreslah lagi satu cawan berisi medium baru yang

menunjukkan bahwa koloni-koloni khamir Anda memang hanya terdiri dari

satu macam (gunakan inokulum dari salah satu tabung Durham, pilih yang

terbaik).

6. Serahkan pada asisten Anda. biakan murni dalam agar cawan, biakan dalam

tabung Durham dan preparat Gram. Disamping itu tunjukkanlah pula preparat

basah Anda di bawah mikroskop agar dapat diperiksa dan dinilai oleh asisten

Anda.

35

HASIL PENGAMATAN

Kegiatan 11

Kuantitasi Mikroba : Hitungan Cawan

Tujuan

Melatih Anda melakukan pengenceran serial dan menentukan konsentrasi suspensi

bakteri dengan metode hitungan cawan.

Teori Singkat

Dasar metode hitungan cawan dengan anggapan bahwa setiap sel yang dapat

hidup akan berkembang menjadi satu koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada

cawan merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang

terkandung daam sampel. Cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni adalah yang

mengandung antara 30-300 koloni. Untuk memperoleh sekurng-kurangnya satu cawan

yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat maka harus dilakukan

sederetan pengenceran dan pencawanan. Organisme yang terdapat daam sampel asal

ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor

pengenceran pada cawan yang bersangkutan.

Dalam kegiatan ini Anda akan mencoba dua macam prosedur hitungan cawan

yaitu :

1. metode penyebaran

2. metode penuangan

Alat dan Bahan

biakan Escherichia coli dalam nutrien broth (NB,kaldu nutrien)

botol blanko pengencer @ 99 ml

botol blanko pengencer @ 90 ml

pipet 1ml yang steril

pipet 0,1 ml yang steril

batang kaca penyebar

alkohol 95% daam gelas piala

cawan nutrient agar (NA, agar nutrient)

tabung masing-masing berisi 12 ml NA cair bersuhu 500C

cawan petri kosong steril

alat penghitung koloni Quebec

penghitung mekanis

Prosedur Kerja

Metode Penyebaran

1. Siapkanlah pengenceran serial :

Siapkan keempat botol berisis blanko pengencer dan susunlah berderet (botol

36

pertama,kedua, dan keempat masing-masing berisi 99 ml larutan pengencer,

sedangkan botol ketiga berisi 90 ml larutan pengencer). Tuliskan pada dinding-

dinding botol tersebut sesuai dengan urutannya, 1:100, 1:10.000, 1:100.000,

1:1.000.000

Catatan : blanko pengencer ialah tabung atau botol berisi sejumlah tertentu

cairan pengencer steril (biasanya larutan garam fisiologis) dengan

sumbat ulir atau sumbat karet yang rapat. Tabung biasanya berisi 9 atau 9,9 ml

sedangkan botol berisi 90 atau 99 ml.

Kocoklah suspensi bakteri E. coli baik-baik sampai kekeruhannya rata. Lalu

secara aseptik pipetlah 1 ml sampel dan masukkan ke dalam blanko pengencer

1:100. Letakkan pipet dalam wadah berisi disinfektan. Dengan siku tangan anda

di atas meja, kocoklah tabung tersebut 25 kali, setiap kalinya melintasi jarak

kurang lebih 30 cm, sehingga bakteri tersebar rata di dalam larutan pengencer.

Setiap kali sebelum pengocokan periksalah terlebih dahulu apakah sumbat telah

terpasang rapat.

Secara aseptik pipetlah 1ml sampel dari botol pengencer 1:100 dan masukkan

ke dalam blanko pengencer 1:10.000. Letakkan pipet dalam wadah yang

disediakan dan kocoklah tabung pengenceran ini seperti di atas.

Secara aseptik pipetlah 10 ml sampel dari tabung pengencer 1:10.000 dan ke

dalam blanko pengencer 1:100.000. Letakkan pipet dalam wadah yang

disediakan dan kocoklah tabung pengencer ini seperti di atas.

Secara ascptik pipetlah 1 ml sampel dari tabung pengencer 1:10.000 dan

masukkan ke dalam blanko pengencer 1:1.000.000. Letakkn pipet dalam

wadah yang disediakan dan kocoklah tabung pcngencer ini seperti diatas.

2. Pada masing-masing permukaan luar dasar keempat cawan petri berisikan agar

itu tuliskanlah l:200.000, 1:1.000.000, 1:2.000.000 dan 1:10.000.000.

3. Secara aseptik, lakukanlah pemindahan sampel dari botol pengencer l:1.

000.000 ke dalam cawan-cawan agar nutrien sebagai berikut :

Dengan pipet 1 ml yang steril pindahkanlah 0,5 ml sampel ke dalam cawan

berfuliskan 1:2.000.000.

Dengan pipet 1 ml yang steril, pindahkanlah 0,1 ml sampel ke dalam cawan

Letakkan pipet dalam wadah yang disediakan.

4. Sterilkan batang kaca penyebar dengran cara mencelupkannya ke dalam gelas

piala berisi alkohol 95%, lalu bakarlah di atas api. Setelah alko