UJI BANDING METODE EKSTRAKSI KAROTENOID DAN … · metode Harborne menggunakan tahap saponifikasi...

UJI BANDING METODE EKSTRAKSI KAROTENOID DAN TOKOFEROL

SARI BUAH MERAH

UUN SUNDARI

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2008

2

ABSTRAK

UUN SUNDARI. Uji Banding Metode Ekstraksi Karotenoid dan Tokoferol Sari Buah Merah. Dibimbing oleh LATIFAH K. DARUSMAN dan MOHAMAD RAFI.

Buah merah (Pandanus conoideus Lam.) merupakan tanaman pandan yang mengandung berbagai senyawa aktif, terutama karotenoid dan tokoferol. Karotenoid dan tokoferol diekstraksi dengan tiga metode yang berbeda, yang dikembangkan berdasarkan metode Harborne, Qian & Sheng, dan Hegazi. Ekstraksi karotenoid dan tokoferol pada metode Harborne menggunakan tahap saponifikasi dan diikuti dengan ekstraksi pelarut eter. Sementara metode Qian & Sheng dan Hegazi dilakukan dengan ekstraksi satu tahap, yaitu masing-masing dengan pelarut campuran aseton dan kloroform (metode Qian & Sheng) dan aseton (metode Hegazi).

Evaluasi terhadap ketiga metode dilakukan dengan melihat presisi dan akurasinya. Metode Harborne menghasilkan presisi yang tidak teliti dalam mengekstraksi β-karoten (% SBR = 6,97 %), tetapi sangat teliti dalam mengekstraksi tokoferol (% SBR = 0,47 %). Metode Qian & Sheng mempunyai presisi yang sedang dalam mengekstraksi β-karoten dan tokoferol, dengan % SBR berturut-turut sebesar 2,18 % dan 3,58 %, sedangkan metode Hegazi menghasilkan presisi yang sedang dalam mengekstraksi β-karoten (% SBR = 4,72 %), dan tidak dapat digunakan untuk analisis tokoferol. Berdasarkan akurasinya, metode Harborne tidak memberikan hasil yang tepat dalam mengekstraksi tokoferol dengan % perolehan kembali sebesar 86,71-180,17 %, dan tidak dapat dievaluasi untuk mengekstraksi β-karoten. Metode Qian & Sheng tidak memberikan hasil yang tepat dalam mengekstraksi tokoferol (% perolehan kembali = 74,31-109,55 %), tetapi memberikan hasil yang tepat dalam mengekstraksi β-karoten (% perolehan kembali = 91,14-99,18 %), sedangkan metode Hegazi tidak memberikan hasil yang tepat dalam mengekstraksi β-karoten (% perolehan kembali = 61,10-88,59 %). Uji-F dan uji-t dilakukan berdasarkan data uji presisi. Uji-F menunjukkan bahwa hanya metode Hegazi dan Qian & Sheng yang memiliki simpangan baku yang tidak berbeda nyata dalam mengekstraksi β-karoten, sementara dalam mengeksraksi tokoferol metode Harborne dan Qian & Sheng memiliki simpangan baku yang berbeda. Uji-t yang dilakukan dengan nilai kepercayaan 95 % menunjukkan bahwa ketiga metode ekstraksi ini memiliki hasil analisis yang berbeda nyata dalam mengekstrasi β-karoten, sementara dalam mengeksraksi tokoferol metode Harborne dan Qian & Sheng juga memiliki hasil analisis yang berbeda.

3

ABSTRACT

UUN SUNDARI. Comparison of Extraction Methods for Red Fruit Oil’s Carotenoids and Tocopherol Tests. Supervised by LATIFAH K. DARUSMAN and MOHAMAD RAFI. Red fruit (Pandanus conoideus Lam.) is screw pine crop which consist of many active compounds, especially carotenoids and tocopherol. Carotenoids and tocopherol were extracted using 3 different methods developed by Harborne, Qian & Sheng, and Hegazi. Carotenoids and tocopherol extraction in Harborne method using a saponification step followed by liquid extraction with ether. While in Qian & Sheng and Hegazi method was done in one step extraction using a mixture of acetone and chloroform (Qian & Sheng method) and acetone (Hegazi method), respectively. The three methods was evaluated for their precisions and accurations. Harborne method gave inaccurate precision on extracting β-carotene (% RSD = 6,97 %), but very accurate on extracting tocopherol (% RSD = 0,47 %). Qian & Sheng method gave moderate precision on extracting β-carotene and tocopherol, with % RSD 2,18 % and 3,58 %, respectively, whereas Hegazi method gave moderate precision on extracting β-carotene (% RSD = 4,72 %), but cannot be used to analyze tocopherol. Based on the accuracy, Harborne method did not give precise result on extracting tocopherol with % recovery 86,71-180,17 %, but cannot be evaluated to extracting β-carotene. Qian & Sheng method did not give precise result on extracting tocopherol (% recovery = 74,31-109,55 %), but it gave precise result on extracting β-carotene (% recovery = 91,14-99,18 %), whereas Hegazi method did not give precise result on extracting β-carotene (% recovery = 61,10-88,59 %). F-test and t-test were done based on precision test data. F-test showed that Hegazi and Qian & Sheng methods which gave similar standard deviation on extracting β-carotene, while on extracting tocopherol, Harborne method and Qian & Sheng gave a significant difference on standard deviation. T-test which is done with 95 % confidence level showed that three methods gave a significant difference on the result on extracting β-carotene, while on extracting tocopherol, Harborne method and Qian & Sheng gave a significant difference on the result.

4

UJI BANDING METODE EKSTRAKSI KAROTENOID DAN TOKOFEROL

SARI BUAH MERAH

UUN SUNDARI

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2008

5

Judul Skripsi : Uji Banding Metode Ekstraksi Karotenoid dan Tokoferol Sari Buah

Merah

Nama : Uun Sundari

NIM : G44202060

Menyetujui:

Pembimbing I Pembimbing II

Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS NIP 130 536 681

Mohamad Rafi, S.Si NIP 132 321 454

Mengetahui:

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor

Dr. Drh. Hasim, DEA NIP 131 578 806

Tanggal Lulus:

6

PRAKATA

Bismillahirrohmannirrohiim, Alhamdulillah, segala puja dan puji hanya milik Allah SWT; atas limpahan rahmat

dan petunjuk-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah. Shalawat dan salam semoga tercurah kepada teladan umat, Rasulullah Muhammad SAW. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan Juli 2007. Judul skripsi ini ialah Uji Banding Metode Ekstraksi Karotenoid dan Tokoferol Sari Buah Merah.

Penulis menyadari bahwa keberhasilan penulisan karya ilmiah ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS dan Bapak Mohamad Rafi, S.Si, selaku pembimbing. Terima kasih juga disampaikan kepada Bagian Kimia Analitik dan Pusat Studi Biofarmaka yang telah mendanai sebagian besar penelitian ini. Di samping itu, penghargaan penulis juga sampaikan kepada Ibu Irmanida Batubara, Ibu Nunuk, Bapak Eman, Mbak Ina, Mas Zaim, beserta seluruh staf Laboratorium Kimia Analitik IPB dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Bapak, Emih, Ceuceu, dan Teteh atas segala doa dan kasih sayangnya, serta Teh Mila, Ka Titis, Intan, Indah, Susan, Nindira, seluruh syabab kampus dan teman Kimia 39 atas doa, bantuan, dan dukungannya. Hanya Allah-lah sebaik-baiknya Pembalas.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2008

Uun Sundari

7

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Subang, 2 Februari 1985 sebagai anak ketiga dari 3 bersaudara dari pasangan Saepudin dan Temi.

Tahun 1996 penulis menyelesaikan sekolah di SDN 3 Sukamandi dan pada tahun 1999 penulis menyelesaikan sekolah di SLTPN 2 Sukamandi. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan sekolah ke SMUN 1 Ciasem dan lulus pada tahun 2002. Pada tahun tersebut penulis diterima di Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) IPB melalui jalur SPMB (Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru).

Selama perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia Dasar TPB tahun ajaran 2003/2004, Kimia Analitik I dan II S1 Kimia tahun ajaran 2004/2005, Kimia Analitik III S1 Kimia tahun ajaran 2005/2006, Kimia Lingkungan D3 Analisis Kimia tahun ajaran 2006/2007, Kimia Dasar D3 tahun ajaran 2007/2008, dan Kimia Fisik D3 Analisis Kimia tahun ajaran 2007/2008. Penulis juga pernah mengikuti Praktik Kerja Lapangan (PKL) di Laboratorium Kimia, Balai Penelitian Tanaman Padi Sukamandi selama periode bulan Juli sampai dengan Agustus 2005, dan menulis laporan ilmiah berjudul ”Karakterisasi Mutu Gabah dan Beras Galur Harapan dan Varietas Padi Unggul”.

8

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL........................................................................................................... viii

DAFTAR GAMBAR...................................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN................................................................................................... viii

PENDAHULUAN ........................................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.) ............................................................... 1 Tokoferol .................................................................................................................. 1

Karotenoid ................................................................................................................ 2 Metode Ekstraksi.. .................................................................................................... 2 Spektrofotometri UV-Vis ......................................................................................... 3

Evaluasi Hasil Analisis............................................................................ ................. 3 BAHAN DAN PROSEDUR Bahan dan Alat ......................................................................................................... 4 Prosedur .................................................................................................................... 4

HASIL DAN PEMBAHASAN Panjang Gelombang Maksimum .............................................................................. 5 Ekstraksi Karotenoid dan Tokoferol......................................................................... 5 Evaluasi Hasil Analisis ............................................................................................ 6 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ................................................................................................................... 8 Saran ......................................................................................................................... 8

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................................... 8

LAMPIRAN..................................................................................................................... 11

9

DAFTAR TABEL Halaman

1 Panjang gelombang maksimum β-karoten dan tokoferol ............................................ 5 2 Kadar β-karoten dan tokoferol .................................................................................... 5 3 Presisi β-karoten dan tokoferol pada penggunaan beberapa metode ekstraksi ........... 6 4 Perolehan kembali β-karoten dan tokoferol pada beberapa metode ekstraksi ............ 7

DAFTAR GAMBAR Halaman

1 Buah Merah ................................................................................................................. 1 2 Struktur kimia α-tokoferol ........................................................................................... 2 3 Struktur kimia β-karoten .............................................................................................. 2

DAFTAR LAMPIRAN Halaman

1 Bagan alir penelitian .................................................................................................... 12 2. Kurva serapan β-karoten dan tokoferol pada beberapa pelarut.................................... 13 3 Presisi metode ekstraksi Harborne............................................................................... 14 4 Akurasi metode ekstraksi Harborne............................................................................. 16 5 Presisi metode ekstraksi Qian dan Sheng .................................................................... 18 6 Akurasi metode ekstraksi Qian dan Sheng .................................................................. 20 7 Presisi metode ekstraksi Hegazi................................................................................... 22 8 Akurasi metode ekstraksi Hegazi................................................................................. 23 9 Uji-F dan uji-t............................................................................................................... 24

PENDAHULUAN

Buah merah (Pandanus conoideus Lam.) merupakan jenis tanaman pandan yang mengandung berbagai komponen aktif, diantaranya karotenoid, tokoferol, dan asam lemak, seperti asam laurat, miristat, palmitat, oleat, linoleat, dan linolenat (Pohan et al. 2006). Buah ini dipercaya dapat menyembuhkan berbagai macam penyakit, seperti HIV/AIDS, kanker otak, kanker payudara, kanker rahim, sakit mata, kebutaan, sakit jantung, dan paru-paru (Budi 2007). Kemampuan buah ini dalam menyembuhkan berbagai macam penyakit, dikaitkan dengan kandungan komponen aktifnya, terutama karotenoid dan tokoferol. Karotenoid dan tokoferol dikenal sebagai senyawa antioksidan. Di dalam tubuh, senyawa antioksidan dapat memutus reaksi berantai dari radikal bebas sebagai pemicu berbagai macam penyakit (Kumalaningsih 2006). Karotenoid dan tokoferol merupakan senyawa yang relatif tidak stabil terhadap panas dan cahaya (Gloria et al. 1993, diacu dalam Jia et al. 2007), sehingga dibutuhkan penanganan khusus dalam proses analisisnya. Salah satu tahapan terpenting suatu analisis adalah proses ekstraksi. Pada penelitian yang sudah dilakukan, karotenoid dan tokoferol diekstraksi dengan melalui tahap saponifikasi terlebih dahulu (Oliver 1998; Prates et al. 2006) sebelum diikuti dengan ekstraksi pelarut organik, baik pelarut tunggal maupun campuran. Ekstraksi karotenoid dan tokoferol dilakukan dengan menggunakan pelarut n-heksana (Prates et al. 2006), kloroform (Burns et al. 2003), dan asetonitril (Lee et al. 2004). Umumnya teknik ekstraksi dikembangkan untuk mengurangi jumlah penggunaan pelarut, mengurangi waktu analisis, meningkatkan presisi analisis, dan mengurangi biaya preparasi (Shen 2005).

Penelitian bertujuan membandingkan 3 metode ekstraksi karotenoid dan tokoferol sehingga diperoleh metode terbaik dalam mengekstraksi kedua golongan senyawa antioksidan ini dari kandungan warna yang pekat dalam sari buah merah. Ketiga metode yang dibandingkan, yaitu metode Harborne (1987), Qian & Sheng (1998), dan Hegazi (1998). Perbandingan ketiga metode dilakukan dengan menggunakan beberapa parameter, yaitu presisi dan akurasi. Selain itu, perbandingan dua metode juga dilakukan melalui uji-F dan uji-t.

TINJAUAN PUSTAKA

Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.)

Buah merah (Pandanus conoideus Lam.) termasuk salah satu keluarga tanaman pandan-pandanan dengan klasifikasi Kingdom : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Ordo : Pandanales Familia : Pandanaceae Genus : Pandanus Spesies : Pandanus conoideus Lam.

Buah merah (Gambar 1) merupakan tumbuhan endemik Papua. Tumbuhan ini secara alami tumbuh tersebar di seluruh wilayah Papua, terutama daerah-daerah yang lembab (Tokede et al. 2004). Tinggi tanaman dapat mencapai 15 meter yang diperkokoh akar-akar tunjang pada batang sampai ketinggian 1 meter dari pangkal batang. Umumnya buah ini berbentuk lonjong dengan kuncup tertutup daun buah. Buah merah sendiri panjang buahnya mencapai 30-120 cm dengan diameter 10-25 cm (Wiryanta 2005).

Gambar 1 Buah merah.

Buah merah mengandung berbagai komponen aktif, diantaranya karotenoid, tokoferol, dan asam lemak, seperti asam laurat, miristat, palmitat, oleat, linoleat dan linolenat (Pohan et al. 2006). Buah ini dipercaya dapat menyembuhkan berbagai macam penyakit, seperti HIV/AIDS, kanker otak, kanker payudara, kanker rahim, sakit mata, kebutaan, sakit jantung, dan paru-paru (Budi 2007). Berbagai penelitian telah dilakukan terkait buah merah ini, diantaranya uji toksisitas akut dan sub kronis sari buah merah oleh Widowati (2007) dan uji hambat tumoregenesis (Mun’im et al. 2006).

Tokoferol

Tokoferol dikenal sebagai vitamin E. Golongan senyawa ini mempunyai peranan penting terutama dikaitkan dengan sifatnya sebagai antioksidan. Dengan menerima oksigen,

2

tokoferol dapat membantu mencegah oksidasi terhadap vitamin A dalam sistem percernaan dan menekan oksidasi asam lemak tidak jenuh dalam jaringan (Winarno 1992). Dalam proses melumpuhkan radikal bebas, tokoferol menjadi pelopor, diikuti oleh asam askorbat (Kumalaningsih 2006). Tokoferol biasanya terdapat dalam bentuk α-tokoferol, γ-tokoferol, dan sejumlah kecil δ-tokoferol (Burri et al. 2003). α-Tokoferol (Gambar 2) menunjukkan aktivitas vitamin E paling tinggi (Winarno et al. 1992) sehingga biasanya dianggap paling penting. Tokoferol banyak terdapat dalam minyak tumbuhan seperti gandum, kacang, jagung dan kedelai (Gliszczynska-Swiglo et al. 2004). Sumber tokoferol lainnya adalah daging, hati, ikan, telur, dan ayam (Girindra 1993). Selain itu tokoferol juga banyak terdapat dalam alpukat dan tauge (Kumalaningsih 2006).

Gambar 2 Struktur kimia α-tokoferol.

Tokoferol dapat dianalisis dengan menggunakan metode elektroforesis kapiler (Delgado-zamarreno 2002). Selain itu juga dapat dianalisis dengan metode HPLC, baik secara fase terbalik (Ake et al. 1998) maupun fase normal (Prates et al. 2006) dengan detektor fluoresensi.

Karotenoid

Karotenoid secara umum merupakan tetraterpenoid C40 yang terbentuk dari 8 unit isoprena yang berikatan kepala-ekor, kecuali pada bagian tengah dengan ikatan ekor-ekor, sehingga membentuk molekul yang simetris (Rodriguez-Amaya & Kimura 2004). Karotenoid merupakan sumber warna kuning, jingga, dan merah pada hewan maupun tumbuhan. Pigmen warna golongan senyawa ini larut dalam lipid dan tersebar luas mulai dari bakteri sampai tumbuhan tingkat tinggi (Harborne 1987). Karotenoid dapat berupa hidrokarbon tak jenuh maupun turunannya yang teroksigenasi, yang disebut xantofil (Rodriguez-Amaya & Kimura 2004). β-karoten (Gambar 3) merupakan karotenoid golongan hidrokarbon tak jenuh yang sangat penting, terutama dikaitkan dengan kemampuannya sebagai salah satu

antioksidan larut lemak (Johnson & Schroder 1995, diacu dalam Xu et al. 2007). Selain itu, senyawa ini juga merupakan karotenoid yang paling umum ditemukan pada tumbuhan tingkat tinggi.

Gambar 3 Struktur kimia β-karoten.

β-Karoten dapat diperoleh dari buah dan sayur yang berwarna kuning, seperti wortel, tomat, pepaya, semangka, dan pisang raja (Kumalaningsih 2006). Karotenoid dianalisis dengan menggunakan metode elektroforesis kapiler (Delgado-zamarreno 2002). HPLC juga dapat digunakan, baik secara fase terbalik (Hegazi 1998; Oliver 1998) maupun fase normal (Prates et al. 2006) dengan menggunakan detektor diode array UV-Vis.

Metode Ekstraksi

Salah satu tahapan terpenting suatu analisis adalah proses ekstraksi. Dalam proses ekstraksi, suatu komponen kimia dilarutkan dalam suatu fase cair A untuk kemudian diinteraksikan dengan fase kedua, B, dengan fase A dan B tidak saling bercampur sehingga terjadi distribusi komponen antara dua fase tersebut. Fase B ini dapat berupa suatu padatan, cairan, gas, atau fluida superkritis (Mitra 2003). Teknik ekstraksi yang tepat tergantung kepada tekstur dan kandungan air bahan yang akan diekstrak, serta pada jenis senyawa yang diisolasi (Harborne 1987). Pada penelitian yang sudah dilakukan, karotenoid diekstraksi dengan melalui tahap saponifikasi terlebih dahulu (Oliver 1998; Prates et al. 2006) sebelum diikuti dengan ekstraksi pelarut organik, baik pelarut tunggal (Prates et al. 2006) maupun campuran (Oliver 1998). Tokoferol diekstraksi dengan menggunakan ekstraksi pelarut, baik dengan pelarut tunggal (Prates et al. 2006) maupun campuran (Taibi & Nicotra 2002). Selain itu sudah dilakukan pula ekstraksi tokoferol dengan ekstraksi CO2 superkritis (Sarmento et al. 2006; Vagi et al. 2007; Zacchi et al. 2006). Beberapa penelitian untuk analisis simultan karotenoid dan tokoferol dilakukan dengan menggunakan pelarut n-heksana (Prates et al. 2006), kloroform (Burns et al. 2003), dan asetonitril (Lee et al. 2004).

3

Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang mempelajari interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Spektrofotometer UV-Vis terdiri dari sumber sinar, monokromator, dan detektor (Pavia et al. 2001). Pengukuran absorpsi radiasi UV-Vis oleh spesi larutan secara luas dapat digunakan sebagai metode analisis kuantitatif (Denney & Sinclair 1987). Dasar penentuan kuantitatif metode spektrofotometri adalah Hukum Beer:

A = log Po/P = abc A merupakan absorbansi sampel; Po adalah berkas sinar yang melewati pelarut; P adalah berkas sinar yang keluar melalui larutan sampel; a adalah absorbtivitas; b adalah ketebalan lapisan larutan sampel; dan c adalah konsentrasi analat (Skoog et al. 2004). Senyawa-senyawa yang mempunyai gugus kromofor dapat menyerap radiasi elektromagnetik (Sudjadi 1983). Hal ini menyebabkan senyawa-senyawa antioksidan seperti karotenoid dan tokoferol dapat dianalisis dengan metode spektrofotometri. Pemilihan pelarut merupakan bagian yang penting dalam penggunaan spektrofotometri, karena setiap pelarut mempunyai serapan minimum pengukuran (Sudjadi 1983). Pelarut yang banyak digunakan untuk spektrofotometri UV-Vis ialah etanol 95%. Pelarut lain yang biasa digunakan ialah air, metanol, n-heksana, PE, dan eter. Pelarut seperti kloroform umumnya dihindari karena menyerap radiasi pada daerah 200-280 nm, tetapi sangat cocok untuk mengukur pigmen warna seperti karotenoid di daerah sinar tampak (Harborne 1987).

Evaluasi Hasil Analisis

Setiap hasil analisis pasti mempunyai galat, baik galat acak maupun galat sistemik. Galat acak terjadi karena adanya variasi langkah analisis yang tidak dapat diatasi, yang dapat mempengaruhi rerata nilai setiap pengukuran. Galat ini antara lain disebabkan oleh keterampilan dan kondisi pelaksana, serta fluktuasi listrik selama analisis. Galat acak dapat dikurangi dengan memperbanyak jumlah pengukuran (Otto 1999). Galat sistemik terjadi karena faktor yang tetap, sehingga menimbulkan penyimpangan tertentu dari rerata hasil analisis terhadap nilai yang sebenarnya (Otto 1999). Galat ini diantaranya disebabkan oleh kelemahan

metode dan kesalahan alat. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu evaluasi hasil analisis untuk mengukur sejauh mana suatu metode analisis dapat dipercaya. Tingkat kepercayaan ini umumnya dilihat dari nilai akurasi dan presisi metode (Christian 2004).

Akurasi merupakan derajat keakuratan antara hasil analisis terhadap nilai yang sebenarnya (Christian 2004). Nilai sebenarnya untuk uji akurasi dapat diperoleh dengan dua cara, membandingkan hasil metode dengan hasil metode pembanding dan dengan membubuhkan senyawa pembanding ke dalam matriks sampel. Uji akurasi pada penelitian ini ditunjukkan melalui persen perolehan kembali.

% Perolehan kembali = %100×

−

s

ut

CCC

Ct merupakan konsentrasi β-karoten atau tokoferol total setelah penambahan standar; Cu adalah konsentrasi β-karoten atau tokoferol dalam larutan uji; dan Cs adalah konsentrasi β-karoten atau tokoferol standar. Berdasarkan AOAC (1993) % perolehan kembali yang masih dapat dikatakan akurat adalah sebesar 80-110 %. Presisi merupakan derajat kedekatan di antara beberapa individu hasil pengukuran (Christian 2004). Setiap pengukuran mempunyai kesalahan acak, sehingga hasil dari pengukuran tunggal tidak bisa diterima sebagai nilai yang sebenarnya. Oleh karena itu diperlukan perkiraan kisaran kebenaran nilai dengan melakukan pengukuran berulang terhadap sampel (Mitra 2003). Pendekatan presisi umumnya ditentukan berdasarkan % SBR.

SB = 1

)( 2

−

−∑n

xx

% SBR = %100×

xSB

Kriteria % SBR berdasarkan AOAC (2003) adalah Sangat tepat : % SBR < 1 Tepat : % SBR 1-2 Sedang : % SBR 2-5 Tidak tepat : % SBR > 5 Evaluasi untuk membandingkan dua metode juga dilakukan melalui uji- F dan uji-t. Uji-F dilakukan untuk menunjukkan perbedaan antara 2 metode berdasarkan simpangan bakunya, sedangkan uji-t dilakukan untuk mem-

4

bandingkan rerata dari 2 metode (Christian 2004).

BAHAN DAN PROSEDUR

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan adalah sari buah merah (Redpapua®), standar tokoferol, standar β-karoten, etanol, KOH 60%, n-heksana, dietil eter, aseton, kloroform, dan n-butanol. Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat kaca, neraca analitik, vakum, vortex, sentrifuse, tabung sentrifuse, kuvet, dan spektrofotometer UV Hitachi model U-2800.

Prosedur

Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Larutan standar β-karoten dan tokoferol dipindai pada kisaran panjang gelombang 400-500 nm untuk β-karoten, dan 250-350 nm untuk tokoferol. Pengukuran β-karoten dan tokoferol selanjutnya dilakukan pada panjang gelombang yang menghasilkan absorbans maksimum berdasarkan kurva serapan yang terbentuk. Pembuatan kurva serapan dibuat 3 kali, sesuai pelarut yang digunakan, yaitu n-heksana, aseton, dan n-butanol.

Ekstraksi Karotenoid dan Tokoferol Sari Buah Merah

Harborne (1987)

Sebanyak 0,1 ml sari buah merah dilarutkan dengan 10 ml metanol dan 1 ml KOH 60%. Kemudian tabung yang berisi larutan tersebut disimpan dalam tempat gelap selama 12 jam. Setelah itu, larutan diencerkan dengan 10 ml air destilasi dan diekstraksi dengan dietil eter. Ekstrak eter dipekatkan menggunakan vakum.

Qian & Sheng (1998)

Sebanyak 1 ml sari buah merah ditambah dengan 4 ml aseton:kloroform (3:7). Kemudian tabung yang berisi larutan ini dikocok dengan vortex selama 1 menit. Setelah didiamkan selama 5 menit, larutan dikocok dengan vortex kembali selama 1 menit dan disentrifugasi pada 4000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan, dipekatkan menggunakan vakum.

Hegazi et al. (1998)

Sebanyak 0,1 ml sari buah merah ditambah dengan 10 ml aseton. Larutan dikocok dan penambahan aseton diulangi sampai sampel tak berwarna. Ekstrak berwarna ditambahkan dengan 5 ml eter kemudian disaring. Setelah itu, larutan dipekatkan menggunakan vakum. Penentuan Kadar Karotenoid dan Tokoferol Harborne (1987)

Ekstrak pekat dilarutkan dalam 10 ml n-heksana dan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum β-karoten dan tokoferol hasil penentuan.

Hegazi et al. (1998)

Ekstrak pekat dilarutkan dalam 10 ml aseton dan diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang yang sesuai.

Qian & Sheng (1998)

Ekstrak pekat dilarutkan dalam 10 ml n-butanol. Larutan diukur dengan spektro-fotemeter UV-Vis pada panjang gelombang maksimum β-karoten dan tokoferol yang sesuai.


Presisi

Presisi ditentukan dengan melakukan pengukuran sampel pada hari yang sama dengan kondisi yang sama. Ulangan dilakukan sebanyak 6 kali ulangan. Akurasi

Akurasi metode dilakukan melalui metode panambahan standar. Larutan sari buah merah sebelum diekstraksi, ditambahkan standar β-karoten 1 ppm dan tokoferol 5 ppm. Hasil ekstraksi diukur pada panjang gelombang yang sesuai. Percobaan diulangi untuk penambahan standar β-karoten 2 dan 3 ppm, dan tokoferol 10 dan 20 ppm. Persen perolehan kembali ditentukan dengan menentukan berapa persen analat yang ditambahkan tadi dapat ditemukan. Uji-F

Uji-F dilakukan pada nilai kepercayaan 95% (Ftabel = 5.05). Uji-F ini dilakukan dengan hipotesis sebagai berikut : H0: kedua metode memiliki simpangan baku yang sama H1: kedua metode memiliki simpangan baku yang berbeda

5

Simpulan ditarik sesuai dengan hipotesis berdasarkan nilai Fhitung. Jika nilai Fhitung<Ftabel maka hipotesis 0 (H0) diterima, tetapi jika nilai Fhitung>Ftabel maka H0 ditolak dan H1 diterima. Uji-t

Uji-t dilakukan pada nilai kepercayaan 95 % (ttabel = 1.812). Uji-t ini dilakukan dengan hipotesis sebagai berikut: H0: kedua metode memiliki hasil analisis yang sama H1: kedua metode memiliki hasil analisis yang berbeda. Simpulan ditarik sesuai dengan hipotesis berdasarkan nilai thitung. Jika nilai thitung<ttabel maka hipotesis 0 (H0) diterima, tetapi jika nilai thitung>ttabel maka H0 ditolak dan H1 diterima.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Panjang Gelombang Maksimum

Panjang gelombang maksimum penyerapan setiap senyawa akan sangat dipengaruhi oleh pelarut yang digunakan. Setiap pelarut akan ikut menyerap radiasi dan pengaruh penyerapan ini tidak dapat dihilangkan. Hal ini akan menyebabkan amplifier menghasilkan latar belakang yang kuat pada spektrum (Sudjadi 1983). Kurva serapan β-karoten dan tokoferol dalam 3 pelarut yang digunakan ditunjukkan pada Lampiran 2 dan panjang gelombang maksimumnya ditunjukkan pada Tabel 1.

Tabel 1 Panjang gelombang maksimum β-

karoten dan tokoferol Λmaks senyawa (nm) Pelarut β-karoten tokoferol

n-heksana 449 297 n-butanol 455 292

aseton 466,6 289,2

Panjang gelombang maksimum β-karoten pada n-heksana (449 nm) paling rendah dibandingkan dengan Panjang gelombang maksimum pada n-butanol (455 nm) dan aseton (466,6 nm). β-Karoten dapat diukur pada daerah sinar tampak antara lain dikarenakan struktur β-karoten mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi. Ikatan rangkap terkonjugasi dapat menyebabkan tingkat energi elektronik dari kromofor menjadi lebih rendah, sehingga akan menyerap radiasi pada panjang gelombang yang makin

tinggi. Kenaikan panjang gelombang maksimum terkait dengan kepolaran pelarut. Kenaikan kepolaran pelarut berturut-turut n-heksana < n-butanol < aseton. Dalam pelarut yang lebih polar transisi π→π* pada ikatan rangkap β-karoten memerlukan energi yang lebih rendah sehingga akan menyerap radiasi pada panjang gelombang yang lebih tinggi (Creswell et al. 1982). Panjang gelombang maksimum tokoferol pada n-heksana (297 nm) paling tinggi dibandingkan panjang gelombang maksimum pada n-butanol ( 292 nm) dan aseton (289,2 nm). Hal ini disebabkan struktur tokoferol yang mempunyai gugus –OH dan -O- yang dapat membentuk ikatan hidrogen dengan gugus –OH pada n-butanol dan gugus C=O pada aseton. Ikatan hidrogen menyebabkan absorpsi transisi n→π* dari pasangan elektron bebas pada oksigen bergerak ke panjang gelombang yang lebih kecil (Creswell et al. 1982). .

Ekstraksi Karotenoid dan Tokoferol

Bagan alir ketiga metode ekstraksi yang dibandingkan dapat dilihat pada Lampiran 1. Kadar karotenoid dan tokoferol yang dapat terekstrak oleh masing-masing metode ditunjukkan pada Tabel 2.

Tabel 2 Kadar β-karoten dan tokoferol

Metode Rerata kadar

(% b/v) β-karoten 2,14 ± 0,15

Harborne Tokoferol 6,64 ± 0,03 β-karoten 0,74 ± 0,02 Qian &

Sheng Tokoferol 2,94 ± 0,11 β-karoten 0,62 ± 0,03

Hegazi Tokoferol -

Metode ekstraksi Harborne dilakukan dengan melalui tahap saponifikasi bahan yang diikuti oleh ekstraksi pelarut organik tunggal, yaitu eter. Saponifikasi bahan dilakukan dikarenakan karotenoid dan tokoferol ada yang terdapat dalam bentuk ester (Harborne 1996; Maraschiello & Regueiro 1998; Chun et al. 2006). Selain itu, tahap saponifikasi juga dilakukan untuk menghilangkan klorofil dan lipid-lipid lain yang tidak diinginkan (Maraschiello & Regueiro 1998). Penambahan air pada metode ini dilakukan untuk menghilangkan sabun atau alkali dari sampel (Pintea et al. 2003) serta untuk meningkatkan polaritas dari fase berair dan meningkatkan partisi senyawa nonpolar ke dalam fase organik (Prates et. al. 2006). Kadar β-karoten dan

6

Tabel 3 Presisi β-karoten dan tokoferol pada penggunaan beberapa metode ekstraksi

β-karoten Tokoferol Metode Ulangan A Kadar

(%b/v) A Kadar

(%b/v) Harborne 1 0,360 2,21 1,026 6,63

2 0,378 2,33 1,024 6,61 3 0,360 2,21 1,025 6,62 4 0,349 2,13 1,025 6,62 5 0,322 1,95 1,029 6,65 6 0,327 1,98 1,036 6,69 Rerata 2,14 6,64 SB 0,15 0,03 SBR (%) 6,97 0,47

Qian & Sheng 1 0,683 0,74 0,390 2,85 2 0,684 0,74 0,389 2,84 3 0,694 0,75 0,404 3,07 4 0,697 0,76 0,402 3,04 5 0,659 0,71 0,389 2,84 6 0,691 0,75 0,399 2,99 Rerata 0,74 2,94 SB 0,02 0,11 SBR (%) 2,18 3,58

Hegazi 1 0,843 0,57 - - 2 0,937 0,64 - - 3 0,968 0,66 - - 4 0,906 0,62 - - 5 0,923 0,63 - - 6 0,923 0,63 - -

tokoferol yang terekstraksi oleh metode ini berturut-turut sebesar 2,14 ± 0,15 % b/v dan 6,64 ± 0,03 % b/v.

Metode Qian & Sheng merupakan metode ekstraksi dengan menggunakan campuran dua pelarut organik, yaitu aseton dan kloroform Metode ini juga merupakan pengembangan metode ekstraksi satu tahap, tanpa saponifikasi bahan Kadar β-karoten dan tokoferol yang terekstraksi oleh metode ini berturut-turut sebesar 0,74 ± 0,02 % b/v dan 2,94 ± 0,11 % b/v.

Metode Hegazi merupakan metode ekstraksi satu tahap dengan pelarut organik tunggal, yaitu aseton. Kadar β-karoten yang terekstraksi oleh metode ini adalah sebesar 0,62 ± 0,03 % b/v. Metode Hegazi tidak dapat digunakan untuk menganalisis tokoferol. Hal ini dikarenakan metode Hegazi menggunakan aseton sebagai pelarutnya. Menurut Lide (1999), aseton mempunyai serapan minimum pengukuran pada panjang gelombang 330 nm, sehingga aseton tidak dapat digunakan untuk pengukuran tokoferol yang menyerap radiasi UV di bawah panjang gelombang serapan aseton. Pengukuran di bawah panjang gelombang minimum pelarut akan

menyebabkan amplifier menghasilkan latar belakang yang kuat pada spektrum karena pelarut menyerap radiasi ultraviolet pada daerah pengukuran. Serapan minimum pelarut pada metode Harborne dan Qian & Sheng, yaitu n-heksana dan n-butanol berturut-turut adalah pada panjang gelombang 195 nm dan 215 nm (Lide 1999). Berdasarkan data ini dapat diketahui bahwa metode Harborne merupakan metode yang dapat mengekstraksi β-karoten dan tokoferol paling banyak dibandingkan dengan kedua metode lainnya. Hal ini berarti saponifikasi bahan yang dilakukan pada metode Harborne dapat meningkatkan kadar β-karoten dan tokoferol yang terekstraksi.


Pendekatan presisi yang dilakukan adalah dengan melakukan pengukuran berulang pada sampel yang sama dan pada waktu yang sama. Perbandingan presisi ketiga metode dilakukan dengan membandingkan % SBR. Penentuan presisi ketiga metode ditunjukkan pada Lampiran 3, 5, dan 7. % SBR yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 3.

7

Lanjutan Tabel 3 Rerata 0,62 - SB 0,03 - SBR (%) 4,72 -

Ketiga metode yaitu Harborne, Qian & Sheng, dan Hegazi berturut-turut meng-hasilkan % SBR untuk β-karoten sebesar 6,97, 2,18, dan 4,72 %. Berdasarkan AOAC (1993) dapat diketahui bahwa metode Qian & Sheng dan Hegazi memiliki presisi sedang, sedangkan metode Harborne menghasilkan presisi yang tidak teliti dalam mengekstraksi β-karoten.

Tokoferol yang terekstraksi oleh metode Harborne dan Qian & Sheng menghasilkan % SBR berturut-turut sebesar 0,47 % dan 3,58 %. Berdasarkan data ini dapat diketahui bahwa metode Harborne menghasilkan presisi yang sangat teliti, sedangkan metode Qian & Sheng menghasilkan presisi yang sedang dalam mengekstraksi tokoferol.

Akurasi ditunjukkan melalui persentase perolehan kembali. Penentuan akurasi ketiga metode ditunjukkan pada Lampiran 4, 6, dan 8. Rerata % perolehan kembali masing-masing metode dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4 Perolehan kembali β-karoten dan tokoferol pada beberapa metode ekstraksi

Rerata % perolehan kembali

Metode

β-karoten Tokoferol - 180,17 - 86,71

Harborne

- 130,27 91,14 74,31 96,96 86,46

Qian dan Sheng

99,18 109,55 61,10 - 87,85 -

Hezagi

88,59 -

Metode Qian & Sheng, dan Hegazi berturut-turut menghasilkan % perolehan kembali untuk β-karoten sebesar 91,14-99,18 %, dan 61,10-88,59 %. Berdasarkan AOAC (1993) dapat diketahui bahwa metode Qian & Sheng memberikan hasil analisis yang akurat, sedangkan metode Hegazi tidak memberikan hasil yang akurat karena berada di luar kisaran keakuratan yaitu 80-110%. Akurasi metode Harborne tidak dapat dievaluasi karena dalam 3 kali ulangan yang dilakukan (Lampiran 4), deret standar yang dihasilkan tidak dapat dibandingkan. Perbedaan yang jauh di antara

ketiga ulangan pengukuran deret standar dapat dikarenakan kelemahan metode atau terkait dengan keterampilan pelaksana.

Tokoferol yang terekstraksi oleh metode Harborne dan Qian & Sheng menghasilkan % perolehan kembali berturut-turut sebesar 86,71-180,17 % dan 74,31-109,55 %, sedangkan % perolehan kembali tokoferol dengan metode Hegazi tidak dapat ditentukan. Berdasarkan AOAC (1993) dapat diketahui bahwa metode Harborne dan Qian & Sheng tidak memberikan hasil yang akurat dalam mengekstraksi tokoferol.

Nilai perolehan kembali yang relatif kecil, di bawah 100 %, dapat diakibatkan karena sifat β-karoten dan tokoferol itu sendiri yang relatif tidak stabil terhadap panas dan cahaya. Hal ini dapat mengakibatkan terdegradasinya kedua senyawa ini selama proses analisis. Pada penentuan tokoferol dan β-karoten biasanya ditambahkan suatu antioksidan tambahan seperti BHT (Burri et. al. 2003; Singh et. al 2007), BHA (Oliver et.al. 1998), dan asam askorbat (Prates et.al. 2006; Vagi et.al. 2007). Penentuan uji-F dan uji-t dilakukan berdasarkan data uji presisi dan dapat dilihat pada Lampiran 9. Uji-F dilakukan untuk membandingkan standar deviasi dari dua metode. Tingkat kepercayaan yang digunakan adalah 95%, memiliki Ftabel sebesar 5,05. Nilai Fhitung dari perbandingan ekstraksi tokoferol metode Harborne dan Qian & Sheng adalah sebesar 13,44. Perbandingan dua metode ekstraksi β-karoten memiliki nilai Fhitung sebesar 56,25 untuk metode Harborne dan Qian & Sheng, 2,25 untuk metode Hegazi dan Qian & Sheng, serta 25,00 untuk metode Harborne dan Hegazi. Dengan membandingkan nilai Fhitung ini terhadap Ftabel, maka dapat dikatakan bahwa hanya metode ekstraksi Hegazi dan Qian & Sheng yang memiliki simpangan baku yang tidak berbeda nyata dalam mengekstraksi β-karoten dalam sari buah merah. Hal ini berarti bahwa kedua metode memiliki presisi yang sama dengan simpangan baku hanya berasal dari galat acak. Uji-t dilakukan untuk membandingkan hasil anlisis dua metode berdasarkan reratanya. Tingkat kepercayaan yang digunakan adalah 95 %, dengan derajat bebas 10 memiliki ttabel 1,812. Nilai thitung dari perbandingan ekstrasi tokoferol metode Harborne dan Qian & Sheng adalah

8

sebesar 81,45, sehingga dapat dikatakan bahwa kedua metode ini mempunyai hasil analisis yang berbeda dalam mengekstraksi tokoferol. Perbandingan hasil analisis ekstraksi β-karoten memiliki nilai thitung sebesar 23,53 untuk metode Harborne dan Qian & Sheng, 24,83 untuk metode Harborne dan Hegazi, serta 83,51 untuk metode Harborne dan Hegazi. Dengan nilai ttabel sebesar 1,812, maka dapat disimpulan bahwa thitung ketiga metode dalam mengekstraksi β-karoten lebih besar dari ttabel sehingga ketiga metode ekstraksi ini akan menghasilkan rerata hasil analisis yang berbeda.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Evaluasi yang dilakukan terhadap ketiga metode menunjukkan bahwa ketiga metode tidak memuaskan untuk mengekstraksi tokoferol, sedangkan untuk mengekstraksi β-karoten, metode Qian & Sheng cukup memuaskan dan paling baik di antara ketiga metode yang dibandingkan.

Kadar β-karoten paling tinggi ter-ekstraksi dengan metode Harborne (62,14 % b/v), metode ini memiliki % SBR sebesar 6,97 %, dan tidak dapat dievaluasi akurasi-nya. Metode Qian & Sheng mengekstraksi β-karoten dengan kadar 0,74 % b/v, memiliki % SBR sebesar 2,18 %, dan mem-berikan akurasi yang tepat. Metode Hegazi mengekstraksi β-karoten dengan kadar 0,62 % b/v, memiliki % SBR sebesar 4,72 %, dan memberikan akurasi yang tidak tepat.

Kadar tokoferol paling tinggi ter-ekstraksi dengan metode Harborne (6,64 % b/v), metode ini memiliki % SBR sebesar 0,47 %, dan memberikan akurasi yang tidak tepat. Metode Qian & Sheng mengekstraksi tokoferol dengan kadar 2,94 % b/v, memiliki % SBR sebesar 3,58 %, dan memberikan akurasi yang tidak tepat. Metode Hegazi tidak dapat digunakan untuk analisis tokoferol.

Uji-F dan uji-t dilakukan berdasarkan data uji presisi. Uji-F menunjukkan bahwa hanya metode Hegazi dan Qian & Sheng yang memiliki simpangan baku yang tidak berbeda nyata dalam mengekstraksi β-karoten, sementara dalam mengeksraksi tokoferol metode Harborne dan Qian & Sheng memiliki simpangan baku yang berbeda.

Uji-t yang dilakukan dengan nilai kepercayaan 95 % menunjukkan bahwa ketiga metode ekstraksi ini memiliki hasil analisis yang berbeda nyata dalam mengekstrasi β-karoten, sementara dalam mengeksraksi tokoferol metode Harborne dan Qian & Sheng juga memiliki hasil analisis yang berbeda.

Saran

Diperlukan suatu tambahan antioksidan untuk mengurangi hilangnya β-karoten dan tokoferol selama proses analisis. Perlu juga dipelajari dan dikembangkan metode ekstraksi lainnya yang dapat digunakan untuk mengekstrak tokoferol agar dapat dianalisis dengan baik menggunakan spektrofotometri UV-Vis.

DAFTAR PUSTAKA

Ake M et al. 1998. Coloum Liquid Chromatography Determination of Vitamin A and E in Powdered Milk and Lokal Flour: Validation Procedure. J Chromatogr A 826: 183-189.

[AOAC] Association Official of Analytical Chemistry. 1993. AOAC Peer-Verified Methods Program. Maryland: AOAC Internasional.

Budi IM. 2007. Penelitian buah merah papua oleh Drs.I made Budi, MSc. [terhubung berkala].www.buahmerahoil.com/penelitian-buah-merah-papua.htm.[27 November 2007]

Burns J, Fraser PD, Bramley PM. 2003. Identification and Quantification of Carotenoids, Tocopherols, and Chlorophyll in Commomly Comsume Fruits and Vegetables. Phytochem 62: 939-947.

Burry BJ, Dopler-Nelosn M, Neidllinger TR. 2003. Measurument of the Mayor Isoforms of Vitamin A and E and Carotenoids in the Blood of People with Spinal-Cord Injures. J Chromatogr A 987: 359-366.

Christian GD. 2004. Analytical Chemistry. Ed ke-6. Washington DC: John Wiley & Sons.

Chun J, Lee J, Ye L, Exler J, Eitenmiller RR. 2006. Tocopherol and Tocotrienol

9

Contens of Raw and Processed Fruits and Vegetables in the United States Diet. J Food Comp and Anal 19: 196-204.

Creswell CJ, Ruaquist DA, Campbell MM. 1982. Analisis Spektrum Senyawa Organik. Bandung : ITB.

Delgado-Zamarreno MM, Gonzalez-Maza I, Sanchez-Perez A, Carebias-Martines R. 2002. Separation and Simultaneous Determination of Water-Soluble and Fat-Soluble Vitamins by Electrokinetic Capillary Chromato-graphy. J Chromatogr A 953: 257-262.

Denney RC, Sinclair R. 1987. Visible and Ultraviolet Spectroscopy. Mowhorpe, editor. London: John Wiley & Sons.

Girindra A.1993. Biokimia. Jakarta: Gramedia.

Gliszczynska-Zwiglo A, Sikorska E. 2004. Simple Reversed-Phase Liquid Chromatography Method for Determination of Tocopherols an Edible Plant Oil. J Chromatogr A 1048: 195-198.

Gloria MBA, Glurke EA, Gray JI. 1993. Efect of Type of Oxidation on β-carotene Loss and Voletile Products Formation in Models System. Food Chem 46: 401-406.

Harborne. 1987. Metode Fitikimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung: Penerbit ITB.

Hegazi MM, Ruzafa AP, Almela L, Candela ME. 1998. Separation and Identification of Chlorophyll, and Carotenoids from Caulerpa prolifera, Jania rubens, and Padina pavonica by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromato-graphy. J Chromatogr A 829: 153-159.

Jia M, Kim HJ, Min DB. 2007. Effects of Soybean Oil on the Stability of β-carotene. Food Chem, in press.

Johnson EA, Schroeder WA. 1995. Microbila Carotenoids. Adv Biochem Eng 53: 119-78.

Kumalaningsih S. 2006. Antioksidan Alami. Penangkal Radikal Bebas. Surabaya: Trubus Agrisarana.

Lee BL, Su J, Ong CN. 2004. Monomeric C18 Chromatographic Method for the Liquid Chromatographic Determina-tion of Lipophilic Antioxidant in Plant. J Chromatogr A 1048: 263-267.

Lide DR. 1999. CRC Handbook of Chemistry and Physics. Ed ke-80. London: CRC.

Maraschiello C, Regueiro JAG. 1998. Procedure for the Determination of Retinol and α-Tocopherol in Poultry Tissues using Capillary Gas Chromatography with Solvent Venting Injection. J Chromatogr A 818: 109-121.

Mitra S, editor. 2003. Sample Preparation Techniques in Anal Chem. New Jersey: John Willey & Sons.

Mun’im A, Andrajati R, Susilowati H. 2006. Uji hambatan tumorigenesis sari buah merah (Pandanus conoideus Lam.) terhadap tikus putih betina yang diinduksi 7,12 dimetilbenz(a)antrasen (DMBA). [terhubung berkala]. jurnal.farmasi. ui.ac.id/pdf/2006/v03n03/munim.pdf. [27 November 2007].

Oliver J, Palou A, Pons A. 1998. Semi-quantification of Carotenoids by High-Performance Liquid Chromatography : Saponification-induced Losses in Fatty Foods. J Chromatogr A 829: 393-399.

Otto M. 1999. Chemometrics. Statistics and Computer Aplication in Analytical Chemistry. New York: Wiley-VCH.

Pavia DL, Lampman GM, Kris GS. 2001. Introduction to Spectroscopy. Ed. ke-3. Washington DC: Thomson Learning Brooks/Cole.

Pintea A, Bale C, Andrei S, Socaciv C. 2003. HPLC Analysis of Carotenoids in Foor Varieties of Calendola officinalis L. Flowers. Acta Biol Scege 47: 37-40.

Pohan HG, Arie NJ, Suherman AH, Kosasih. 2006 Teknologi ekstraksi dan karakterisasi minyak buah merah (Pandanus conoideus LAM). [terhubung

10

berkala]. bbia.go.id-.ringkasan.pdf. [27 November 2007].

Prates JAM et al. 2006. Simultaneous High-Performance Liquid Chromato-graphy Quantification of Total Cholesterol, Tocopherols, and β-Carotene in Barrosa-PBO Veal. J Food Chem 94: 469-477.

Qian H, Sheng M. 1998. Simultaneous Determination of Fat Soluble Vitamins A, and E, and Pro-vit D2 in Animal Feedsby One-Step Extraction and High-Performance Liquid Chromatography Analysis. J Chromatogr A 825: 127-133.

Rodriguez-Amaya DB, Kimura M. 2004. HarvestPlus Handbook for Carotenoids Analysis. Washington DC: International Food Policy Research Institute.

Sarmento CMP, Ferreira SRS, Hense H. 2006 Supercritical Fluid Extraction (SFE) of Rice Bran Oil to Obtain Fractions Enriched with Tocopherols and Tocotrienols. J Chem Eng 23: 243-249.

Shen J, Shao X. 2005. A Comparison of Accelerated Solvent Extraction, Soxhlet Extraction, and Ultrasonic-assisted Extraction for Analysis of Terpenoids and Sterol in Tobacco. Anal Bioanal Chem. 383: 1003-1008.

Singh J, Upadhyay Ak, Prasad K, Bahadur A, Rai M. 2007. Variability of Carotenes, Vitamin C, E, and Phenolicsin Brassica Vegetables. J Food Comp and Anal 20: 106-112.

Skoog DA, West PM, Holler FJ, Crouch SR. 2004. Fundamentals of Analytical Chemistry. Ed. ke-8. Belmont: Thomson Learning Brooks/Cole.

Sudjadi. 1983. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Yogyakarta: Ghalia Indonesia.

Taibi G, Nicotra CMA. 2002. Development and Validation of a Fast and SensitiveChromatographic Assay for All-trans-Retinol and Tocopherol in Human Serum and Plasma Using

Liquid-Liquid Extraction. J Chromatogr B. 780: 261-267.

Tokede MJ, Hadi P, Widodo. 2006. Potensi tumbuhan dan hewan local untuk rehabilitasi areal bekas tebangan KOPERMAS dan peningkatan kesejahteraan masyarakat adat. [terhubung berkala]. http://www.ci-for.cgiar.org/publications/pdf_files/Books/BTokede0601.pdf. [27 Novem-ber 2007].

Vagi E et al. 2007. Supercritical Carbon dioxide Extraction of Carotenoids, Tocopherols, and Sitisterol from Industrial Tomato by-Product. J Supercritical Fluids 40: 218-226.

Widowati L. 2006. Uji keamanan minyak buah merah (Pandanus conoideus Lam.) tanaman endemik papua. [terhubung berkala]. http://bmf.-litbang.depkesgo.id-/index2.php?option=content&do_pdf=1&id=86.[27 November 2007].

Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.

Wiryanta BTW. 2005. Keajaiban Buah Merah. Kesaksian dari Mereka yang Tersembuhkan. Jakarta: Agromedia Pustaka.

Xu F, Yuan Q, Zhu Y. 2007. Improved Production of Lycopene and β-Carotene by Blakeslea trispora with Oxygen-Vectors. Process Biochem 42: 289-293.

Zacchi P, Daghero J, Jaeger P, Eggers R. 2006. Extraction/Fractionation and Deacidifica-tion of Wheat Germ Oil Using Supercritical Carbon dioxide. J Chem Eng 23: 105-110.

.

LAMPIRAN

12

Lampiran 1 Bagan alir penelitian

Ekstraksi

1 ml sari buah merah 0.1 ml sari buah merah

Analisis spektrofotometri, pada λ : tokoferol 292 nm β-karoten 455 nm Larutkan dengan

n-heksana

Ekstrak eter

0.1 ml sari buah merah

Pekatkan dengan vakum

Ekstrak pekat

* Vortex 1 menit * Diamkan 5menit * Vortex 1 menit * Sentrifugasi 4000rpm, 5menit

Ekstrak pekat

Analisis spektrofotometri, pada λ : tokoferol 297 nm β-karoten 449 nm

Larutkan dengan aseton

Larutan

Supernatan


Ekstrak pekat

Larutkan dengan butanol

Analisis spektrofotometri, pada λ : β-karoten 466,6 nm

Harborne 1987 (1 pereaksi+saponifikasi)

Hegazi et al. 1998 (1 pereaksi, tanpa saponifikasi)

Qian & Sheng 1998 (pereaksi campuran)

+ 10 ml etanol + 1ml KOH 60%

+ 10ml aseton + 5ml eter

+ 10ml butanol


Larutan

* simpan dalam gelap 12 jam * encerkan dengan 10 ml air * ekstraksi dengan eter

Larutan berwarna + 4 ml aseton:kloroform (3:7)

Larutan

13

Lampiran 2 Kurva serapan β-karoten dan tokoferol pada beberapa pelarut (a) pelarut n-heksana

(i) β-karoten (ii) tokoferol (b) pelarut n-butanol

(i) β-karoten (ii) tokoferol (c) pelarut aseton

(i) β-karoten (ii) tokoferol

14

Lampiran 3 Presisi metode ekstraksi Harborne Absorbansi standar tokoferol Konsentrasi

(ppm) A 5 0.132 10 0.193 20 0.368 50 0.815 100 1.506

Kurva standar tokoferol

y = 0.0145x + 0.0653

R2 = 0.99910

0.5

1

1.5

2

0 20 40 60 80 100 120

Konse nt r a si ( ppm)

Ulangan A KonsentrasiKadar

(% b/v) 1 1.026 66.2552 6.63 2 1.024 66.1172 6.61 3 1.025 66.1862 6.62 4 1.025 66.1862 6.62 5 1.029 66.4621 6.65 6 1.036 66.9448 6.69 Rerata 6.64 SB 0.03 % SBR 0.47

Contoh perhitungan : Bobot tokoferol = 66.2552mg/L x 0.1ml x fp = 66.2552mg/L x 0.1ml x (1L/ 1000ml) x 1000

= 6.63mg Kadar (%b/v) = (6.63mg / 0.1ml) x (1g / 1000mg) x 100 % = 6.63 %b/v Absorbansi standar β-karoten Konsentrasi

(ppm) A 0.5 0.085 1 0.110 2 0.169 4 0.313 8 0.592

15

Lanjutan Lampiran 3 Kurva standar β-karoten

y = 0.0684x + 0.0418

R2 = 0.99890

0.10.20.30.40.50.60.7

0 2 4 6 8 10



(% b/v) 1 0.360 4.6520 2.21 2 0.378 4.9152 2.33 3 0.360 4.6520 2.21 4 0.349 4.4912 2.13 5 0.322 4.0965 1.95 6 0.327 4.1696 1.98 Rerata 2.14 SB 0.15 % SBR 6.97

Contoh perhitungan : Bobot β-karoten = 4.6520mg/L x 0.1ml x fp = 4.6520mg/L x 0.1ml x (1L/ 1000ml) x 5000

= 2.33mg Kadar (%b/v) = (2.33mg / 0.1ml) x (1g / 1000mg) x 95 % = 2.21 % b/v

16

Lampiran 4 Akurasi metode ekstraksi Harborne Ulangan 1 Absorbansi standar β-karoten Konssentrasi

(ppm) A 0.5 0.227 1 0.376 2 0.671 4 1.327 8 2.357

Kurva standar β-karoten

y = 0.2856x + 0.1061

R2 = 0.9973

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

0 2 4 6 8 10

k onse nt r a si ( ppm)

Ulangan 2 Absorbansi standar β-karoten Konssentrasi

(ppm) A 0.5 0.230 1 0.283 2 0.580 4 1.041 8 2.143


y = 0.2583x + 0.0548R2 = 0.9977

0.0000.5001.0001.5002.0002.500

0 2 4 6 8 10

konsentrasi (ppm)

Abs

orba

ns

Ulangan 3 Absorbansi standar β-karoten Konssentrasi

(ppm) A 0.5 0.088 1 0.119 2 0.210 4 0.379 8 0.727

17

Lanjutan lampiran 4 Kurva standar β-karoten

y = 0.0859x + 0.0385

R2 = 0.9997

0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.800

0 2 4 6 8 10

K onse nt r a si ( ppm)

Absorbansi standar tokoferol Konsentrasi

(ppm) A 5 0.133 10 0.147 20 0.224 50 0.476 100 0.872


y = 0.0079x + 0.0765

R2 = 0.9987

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

0 20 40 60 80 100 120


Uji akurasi tokoferol

Standar yang ditambahkan

(ppm) A Konsentrasi

(ppm)

% perolehan kembali


5 0.168 11.5823 31.65 5 0.223 18.5443 170.89 180.17 5 0.289 26.8987 337.97 10 0.190 14.3671 43.67 10 0.292 27.2785 172.78 86.71 10 0.190 14.3671 43.67 20 0.386 39.1772 145.89 20 0.324 31.3291 106.65 130.27 20 0.374 37.6582 138.29

Contoh perhitungan : % perolehan kembali = [(Ctotal – C sampel)/Cstandar] x 100 % = [(11.5823– 10.0000)/5] x 100 % = 31.65 %

18

Lampiran 5 Presisi metode Qian & Sheng Absorbansi standar tokoferol Konsentrasi

(ppm) A 5 0.242 10 0.261 20 0.332 50 0.535 100 0.864


y = 0.0066x + 0.2016

R2 = 0.9996

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

0 20 40 60 80 100 120



(% b/v) 1 0.390 28.5455 2.85 2 0.389 28.3939 2.84 3 0.404 30.6667 3.07 4 0.402 30.3636 3.04 5 0.389 28.3939 2.84 6 0.399 29.9091 2.99 Rerata 2.94 SB 0.11 % SBR 3.58

Contoh perhitungan : Bobot tokoferol = 28.5455mg/L x 0.1ml x fp = 28.5455mg/L x 0.1ml x (1L/ 1000ml) x 1000

= 2.85mg Kadar (%b/v) = (2.85mg / 0.1ml) x (1g / 1000mg) x 100 % = 2.85 % b/v

19

Lanjutan lampiran 5 Absorbansi standar β-karoten Konsentrasi

(ppm) A 0.5 0.090 1 0.139 2 0.218 4 0.382 8 0.696


y = 0.0803x + 0.056

R2 = 0.9997

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 2 4 6 8 10

k onse nt r a si ( ppm)


(% b/v) 1 0.683 7.8082 0.74 2 0.684 7.8207 0.74 3 0.694 7.9452 0.75 4 0.697 7.9826 0.76 5 0.659 7.5093 0.71 6 0.691 7.9078 0.75 Rerata 0.74 SB 0.02 % SBR 2.18


= 0.78mg Kadar (%b/v) = (0.78mg / 0.1ml) x (1g / 1000mg) x 95 % = 0.74 %b/v

20

Lampiran 6 Akurasi metode ekstraksi Qian & Sheng Absorbansi standar β-karoten Konssentrasi

(ppm) A 0.5 0.100 1 0.129 2 0.222 4 0.389 8 0.732


y = 0.085x + 0.0509

R2 = 0.9996

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0 2 4 6 8 10


Uji akurasi β-karoten


(ppm) A Konsentrasi

(ppm)

% perolehan kembali


1 0.349 3.5071 88.66 1 0.351 3.5306 91.14 91.14 1 0.353 3.5541 93.61 2 0.431 4.4718 95.10 2 0.432 4.4835 95.72 96.96 2 0.439 4.5659 100.06 3 0.499 5.2718 91.47 3 0.522 5.5424 100.97 99.18 3 0.532 5.6600 105.09

Contoh perhitungan : % perolehan kembali = [(Ctotal – C sampel)/Cstandar] x 100 %

= [(3.5071 – 2.6648)/(1 x 95%)] x 100 % = 80.01 % Absorbansi standar tokoferol Konsentrasi

(ppm) A 5 0.267 10 0.313 20 0.411 50 0.686 100 1.183

21

Lanjutan Lampiran 6 Kurva standar tokoferol

y = 0.0096x + 0.216

R2 = 0.9997

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 20 40 60 80 100 120


Uji akurasi tokoferol


(ppm) A Konsentrasi

(ppm)

% perolehan kembali


5 0.339 12.8125 56.25 5 0.344 13.3333 66.67 74.31 5 0.360 15.0000 100.00 10 0.369 15.9375 59.38 10 0.405 19.6875 96.88 86.46 10 0.411 20.3125 103.13 20 0.516 31.2500 106.25 20 0.521 31.7708 108.85 109.55 20 0.530 32.7083 113.54

Contoh perhitungan : % perolehan kembali = [(Ctotal – C sampel)/Cstandar] x 100 %

= [(12.8125 – 10.0000)/5] x 100 % = 56.23 %

22

Lampiran 7 Presisi metode ekstraksi Hegazi Absorbansi standar β-karoten Konsentrasi

(ppm) A 0.5 0.098 1 0.184 2 0.288 4 0.574 8 1.108


y = 0.1341x + 0.0348

R2 = 0.9993

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 2 4 6 8 10



(% b/v) 1 0.843 6.0268 0.57 2 0.937 6.7278 0.64 3 0.968 6.9590 0.66 4 0.906 6.4966 0.62 5 0.923 6.6234 0.63 6 0.923 6.6234 0.63 Rerata 0.62 SB 0.03 % SBR 4.72


= 0.60mg Kadar (% b/v) = (0.60mg / 0.1ml) x (1g / 1000mg) x 95 % = 0.57 %b/v

23

Lampiran 8 Akurasi metode ekstraksi Hegazi Absorbansi standar β-karoten Konssentrasi

(ppm) A 0.5 0.111 1 0.200 2 0.361 4 0.691 8 1.338


y = 0.1632x + 0.0342

R2 = 1

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

0 2 4 6 8 10


Uji akurasi β-karoten


(ppm) A Konsentrasi

(ppm)

% perolehan kembali


1 0.458 2.5968 62.82 1 0.436 2.4620 48.63 61.10 1 0.472 2.6826 71.85 2 0.659 3.8284 96.23 2 0.644 3.7365 91.40 87.85 2 0.596 3.4424 75.92 3 0.753 4.4044 84.37 3 0.784 4.5944 91.03 88.59 3 0.781 4.5760 90.39

Contoh perhitungan : % perolehan kembali = [(Ctotal – C sampel)/Cstandar] x 100 % = [(2.5968 – 2.0000)/(1 x 95%)] x 100 % = 62.82 %

24

Lampiran 9 Uji-F dan Uji-t β-karoten Parameter Metode Harborne Hegazi Qian & Sheng Rerata (% b/v) 2.14 0.62 0.74 SB 0.15 0.03 0.02 Metode

Harborne HegaziQian & Sheng Hegazi Harborne

Qian & Sheng

Fhitung 25.00 2.25 56.25 thitung 24.83 83.51 23.53

Tokoferol Parameter Metode Harborne Hegazi Qian & Sheng Rerata (% b/v) 6.64 - 2.94 SB 0.03 - 0.11 Metode

Harborne HegaziQian & Sheng Hegazi Harborne

Qian & Sheng

Fhitung - - 13.44 thitung - - 81.45

Contoh perhitungan : (untuk β-karoten, metode Hegazi dan Qian & Sheng) Fhitung = sb1

2/sb22

= (0.03)2/(0.02)2 = 2.25 dengan Ftabel pada tingkat kepercayaan 95% = 5.05, maka Fhitung<Ftabel sehingga dapat disimpulkan bahwa metode Harborne dan Qian & Sheng memiliki simpangan baku yang tidak berbeda nyata dalam mengekstrak β-karoten.

Sp = 2

)()(

21

222

211

−+

−−− ∑∑NN

xxxx ii

= 0.00249

thitung = 21

2121

NNNN

Sxx

p +−

= 83,51 dengan ttabel pada tingkat kepercayaan 95% = 1.812, maka thitung>ttabel sehingga dapat disimpulkan bahwa metode Harborne dan Qian & Sheng memiliki hasil analisis yang berbeda nyata dalam mengekstraksi β-karoten.

UJI BANDING METODE EKSTRAKSI KAROTENOID DAN … · metode Harborne menggunakan tahap saponifikasi...

Documents

Transcript of UJI BANDING METODE EKSTRAKSI KAROTENOID DAN … · metode Harborne menggunakan tahap saponifikasi...