A. Ekstraksi Dihidrokalkon

1.1. Sifat Dihidrokalkon

Dhidrokalkon merupakan senyawa polifenol dan karena itu mempunyai sifat

kimia senyawa fenol, yaitu bersifat polar. Karena memiliki sifat polar tersebut, pada

umumnya ekstraksi dan isolasinya menggunakan pelarut polar seperti eranol,

metanol, butanol, air, dan lain-lain.

1.2. Memilih. Menyiapkan dan Mengekstraksi Bahan Tumbuhan

Tumbuhan segar merupakan bahan awal yang ideal untuk menganalisis

dihidrokalkon, tumbuhan tersebut kemudian dikeringkan dengan cepat (untuk

mencegah kerja enzim) dalam tanur bersuhu 100oC. Selanjutnya bahan tumbuhan

yang telah dikeringkan digiling menjadi serbuk halus untuk diekstraksi dengan

pelarut. Berikut merupakan merode ekstraksi yang digunakan :

+ air panas

+ eter, dikocok

+etil asetat, dikocok

+ dikocok dgn n-butanol

Bagan 1. Bagan Ekstraksi flavanoid dengan cara Charaux-Paris

Ekstrak Kering

Lapisan eter (aglikon)

Lapisan air

Lapisan air Lapisan etil asetat (glikosida dgn 1 atau

2 gula)

Lapisan air (senyawa sangat polar)

Lapisan n- butanol (glikosida polar, dgn >2

gula)

B. Metode Pemisahan, Pemurnian dan Penetapan Kadar Senyawa

Dihidrokalkon

2.1. Metode Pemisahan dan Pemurnian

2.1.1. Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas mungkin merupakan cara kromatografi yang

paling umum dan berguna yang tersedia pada saat ini. Untuk mengisolasi

flavonoid biasanya digunakan kromatografi kertas dua arah sampai

kapasitas maksimumnya dan melakukan kromatografi dalam jumlah besar

merupakan satu cara untuk memisahkan dihidrokalkon. Bercak yang

sesuai digunting dari setiap kromatogram, diggabungkan, dan setelah

digunting menjadi potongan kecil-kecil dimaserasi dengan metanol-air

(1:1). Setelah dibiarkan beberapa jam, sambil kadang-kadang dikocok,

cairan di enap-tuangkan. Agar ekstraksi efisien, cara ini harus diulangi

dua-tiga kali. Selanjutnya ekstrak digabung, disaring dan diuapkan sampai

kering. Fase diam yang biasanya digunakan adalah kertas Whatman atau

Sephadex LH-20 sedangkan eluen yang biasa digunakan adalah kombinasi

dari etil asetat-air-butanol atau etanol dengan perbandingan tertentu.

2.1.2. Kromatografi Kolom

Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoid

(berupa larutan) diatas kolom yang berisi serbuk penyerap (seperti

selulosa, silika, atau poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap

komponen memakai pelarut yang cocok.

Untuk proses pemisahan senyawa dihidrokalkon, biasanya

menggunakan fase diam dan pengembang berupa :

a. Selulosa

Pemakaian selulosa serupa dengan kertas, yaitu ideal untuk

memisahkan glikosida yang satu dengan glikosida yang lain,

atau memisahkan glikosida dari aglikon, serta untuk

memisahkan aglikon yang kurang polar. Kapasitasnya rendah,

contoh : selulosa mikrokristal dan Whatman CF-11 (berserabut

dan kurang memuaskan). Pengembang yang sering digunakan

untuk pemisahan dihidrokalkon adalah metanol 5% sampai air.

b. Silika

Bahan ini paling berguna untuk memisahkan aglikon yang

kurang polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon dan

flavonol. Sering kali lebih baik dicuci dulu dengan HCl kuat

untuk menghilangkan sesepora besi yang menyebabkan

flavonoid terikat kuat pada kemasan kolom. Kapasitas

pertengahan, contoh Kiselgel 60. Fase gerak yang biasa

digunakan diantaranya Benzena:CHCl3 (1:!) dilanjutkan

dengan CHCl3 kemudian etil asetat.

c. Gel Sephadex (LH-20)

Dirancang khusus untuk digunakan memakai pelarut organik.

Karena bahan ini menhasilkan eluat tanpa sisa, LH-20 sangat

cocok untuk pemurnian akhir aglikon flavonoid dan glikosida

yang telah diisolasi dari kertas, selulosa, silika atau poliamida.

Umumnya pelarut yang cocok adalah metanol, meski pada

mulanya diperlukan sedikit air untuk melarutkan flavonoid.

Untuk mengisolasi dihidrokalkon biasanya menggunakan

MeOH (kepolarnnya meningkat dengan air dan kepolarannya

menurun dengan BuOH

Jika diperlukan pemisahan yang baik, mengelusi dari kolomnya

harus dilakukan perlahan-lahan. Pita yang memisah dalam kolom mungkin

tampak kuning dan dapat dideteksi dengan sinar UV 366 nm. Dalam hal

ini, cara yang sederhana ialah dengan mengumpulkan setiap pita dalam

wadah yang terpisah. Tetapi, jika pita tak kelihatan, kita harus menampung

semua fraksi dalam selang waktu yang teratur kemudian setiap fraksi

dianalisis dengan KKt atau KLT untuk menentukkan fraksi mana yanng

akan digabung.

2.1.3. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

KCKT pada dasarnya adalahsuatu kromatografi kolom yang

menggunakan kolom yang terbuat dari bahan kemasan dengan partikel

berukuran kecil dan berbentuk teratur. Berbagai kombinasi telah

dilaporkan untuk memisahkan senyawa dihidrokalkon menggunakan cara

ini. Sudah jelas bahwa untuk sebagian besar, analisis yang cocok ialah

kolom fase balik jenis oktadesil seperti C-18, RP-18 atau ODS dengan

panjang kolom sekitar 100-300 mm dan diameter dalam 2-5 mm.

Pengembang yang biasanya digunakan adalah H2O-MeOH,

H2O-MeOH/HOAc, EtoAC-heksan dalam berbagai perbandingan. Untuk

pengukuran flavanoid biasanya menggunakan detektor spektrofotometri

UV-Vis (untuk pengukuran kuantitatif komponen) dan untuk

dihidrokalkon biasanya dilihat pada panjang gelombang 280 nm.

Gambar 3. Hasil isolasi senyawa flavonoid menggunakan detektor spektroskopi UV-Vis

Kekurangan cara ini adalah tingginya biaya yang dikeluarkan

untuk pompa detektor/perekam/kolom dan persyaratan yang harus

dipenuhi dalam penyuntikkan larutan, yaitu harus bebas partikel untuk

mencegah penyumbatan dan kerusakkan kolom. Jika campuran flavonoid

tersedia cukup, analisis komponen dapat dilakukan dengan baik dan murah

dengan menggabungkan KKt (untuk memisahkan komponen) dan

spektrofotoskopi UV-Vis (untuk pengukuran kuantitatif komponen).

2.2. Penetapan Kadar senyawa dihidrokalkon

Untuk penetapan kadar dihidrokalkon biasanya menggunakan spektroskopi UV-Vis,

hal ini dikarenakan rumus bangun dihidrokalkon banyak memiliki gugus kromofor

sehingga dapat dideteksi oleh spektroskopi UV-Vis. Sebelum dilihat serapan yang

dihasilkan biasanya dilakukan penambahan pereaksi geser (FeCl3 dan AlCl3) untuk

menggeser puncak serapan yang dihasilkan. Setelah itu ditambahkan pelarut asam

asetat glasial 5% kemudian biarkan selama 5 menit, kemudian serapan dihhitung pada

panjang gelombang 280 nm.

2.3. Hidrolisis Senyawa Dihidrokalkon

Bila senyawa dihidrokalkon telah diisolasi dengan cara kromatografi dan keberartian

warna bercak, Rf dan spektrum UV-Vis untuk menentukan struktur telah dinilai

sebagaimana mestinya, penentuan struktur glikosida lebih lanjut dilakukan dengan

memutuskan gula dari aglikon dengan cara hidrolisis. Dengan cara ini berbagai jenis

glikosida dapat saling dibedakan dan bila terjadi pemutusan gula, aglikon, asil dapat

dipisahkan dan diidentifikasi. Untuk dihidrokalkon biasanya menggunakan hidrolisis

asam dan hidrolisis enzim.

a. Hidrolisis asam

Isolat murni ditambahkan HCl 5% dalam metanol kemudian dipanaskan selama 5

jam kemudian didinginkan. Setelah dingin,tambahkan air lalu ekstraksi dengan

etil asetat (dengan mengocok kuat-kuat dalam tabung reaksi). Aglikon akan

berada dalam fraksi etil asetat dan gula dalam fraksi air

b. Hidrolisis enzim

Hidrolisis enzim merupakan cara yang berguna untuk menentukan sifat ikatan

antara gula dan flavonoid (yaitu α dan β). Yang paling banyak digunakan

diataranya adalah enzim β-glukosidase, β-galaktosidase, dan β-glukouronidase.

C. Karakterisasi Senyawa Dihidrokalkon

Suatu isolat yang diperoleh perlu dikarakterisasi untuk mengetahui rumus strukturnya.

Untuk karakterisasi awal dapat menggunakan organoleptis untuk menduga apakah

senyawa kita flavonoid atau tidak kemudian dapat dilakukan dengan penentuan titik

lebur. Untuk karakterisasi yang lebih spesifik senyawa dihidrokalkon dapat digunakan

spektroskopi UV-Vis, IR, NMR dan MS

a. Spektroskopi UV-Vis

Spektroskopi serapan ultraviolet dan tampak merupakan cara yang paling berguna

dalam menganalisis struktur flavonoid. Cara ini digunakan untuk membantu

mengidentifikasi jenis flavonoid dan menentukkan pola oksigenasi. Disamping itu,

gugus hidroksi fenol bebas pada inti flavonoid dapat ditentukan dengan penambahan

pereaksi geser kedalam cuplikan dan mengamati pergeseran puncak serapan yang

terjadi. Dengan demikian, secara tidak langsung cara ini berguna untuk menentukan

kedudukan gula atau metil yang terikat pada salah satu gugs hidroksi fenol.

Keuntungan utama cara ini ialah jumlah flavonoid yang digunakan sedikit.

Spektrum dihidrokalkon biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut

metanol atau etanol, meski perlu diingat bahwa spektrum yang dihasilkan dalam

etanol kurang memuaskan. Spektrum khas terdiri atas dua maksima pada rentang 240-

280 nm (pita II) dan 300-450 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi

maksima tersebut memberikan pola informasi yang berharga mengenai sifat flavonoid

dan pola oksigenasenya.

Nama Senyawa

dihidrokalkon

EtOH (panjang

gelombang maks. nm)

NaOEt (panjang

gelombang maks. nm)

2’,4’-Dihidroksikhalkon 267, 317, 345bh 279, 300, 394

4,4’-Dihidroksi khalkon 240,348 250,427

2’,4’-Dihidroksi-4-metoksi-

khalkon

327, 307 bh, 362 234 bh, 282, 400

Butein 4’-O-glukosida

(2’,4’,3,4 :koreopsin)

245,265, 305 bh, 385 450

Tabel1. Tabel Perbandingan panjang gelombang yang dihasilkan beberapa senyawa dihidrokalkon

dengan menggunakan pelarut yang berbeda

Untuk pereaksi geser yang biasa digunakan diantaranya adalah :

a. Natrium metoksida

Spektrum NaOMe merupakan spektrum flavonoid yang gugus hidroksi

fenolnya sampai batas tertentu terionisasi. Karena itu spektrum ini biasanya

merupakan petunjuk “sidik jari” pola hidroksilasi dan juga bermanfaat untuk

mendeteksi gugus hidroksil yang lebih asam dan tidak tersubtitusi. Pada

dihidrokalkon pergeseran yang tampak terjadi pada pita I dengan kenaikkan

60-100 nm tanpa kenaikkan kekuatan (hanya kenaikkan panjang gelombang

saja)

b. Natrium asetat/asam borat

Spektrum NaOAc/H3BO3 menjembatani kedua gugus hidroksil pada gugus o-

dihidroksi dan mendeteksinnya. Pada dihidrokalkon terjadi pergeseran pada

pita II sekitar 10-15 nm(nisbi terhadap spektrum MeOH).

c. AlCl3 dan AlCl3/HCl

Spektrum ini membentuk kompleks tahan asam antara gugus hidroksil dan

keton yang bertetangga dan membentuk kompleks tak tahan asam dengan

gugus orto-dihidroksil, pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi kedua

gugus tersebut. Jadi spektrum AlCl3 merupakan penjumlahan pengaruh semua

kompleks terhadap spektrum sedangkan spektrum AlCl3/HCl hanya

merupakan pengaruh kompleks hidroksi keto. Pergeseran yang terjadi pada

dihidrokalkon dapat dilihat pada pita I dengan kenaikkan 40-70 nm.

Gambar 3. Pergeseran Panjang Gelombang maksimum yang terjadi dengan penambahan

peraksi geser

b. Spektroskopi IR

Spektrum inframerah dari dihidrokalkon diukur dalam bentuk padat yang dicampur

dengan KBr yang sudah dikeringkan. Pengamatan dimulai dari bilangan gelombang

4000 cm-1 sampai 400 cm-1 dan dilihat intensitas berbagai pita secara subjektif yaitu

kuat (K), menengah (M), atau lemah (L). Pada dihidrokhalkon terdapat gugus –OH

yang berada pada bilangan gelombang 2800-3100 cm-1, gugus karbonil pada 1600-

1800 cm-1, aromatis pada 1200-1600 cm-1 dan subtitusi aromatis pada 600-900 cm-1.

Gambar 4. Hasil Spektrum Inframerah senyawa dihidrokalkon pada bilangan gelombang 4000 cm-1-

400 cm-1

c. Spektroskopi RMI

1. Spektroskopi resonansi magnet proton (RMI-1H)

Spektroskopi RMI-1H memiliki kegunaan yang penting dalam identifikasi struktur

suatu senyawa karena berguna untuk :

a. Penentuan pola oksigenasi (pada ketiga lingkar)

b. Penentuan jumlah gugus metoksil (dan kedudukannya)

c. Pembedaan isoflavon, flavanon dan dihidroflavonol

d. Penentuan jumlah gula yang ada (dan penentuan apakah ikatannya α atau β)

e. Pendeteksian rantai samping hidrokarbon

Spektrum RMI-1H terlihat terutama di daerah 0-10 ppm medan bawah dari

sinyal acuan tetrametilisilan. Hanya proton yang menghasilkan sinyal

(beresonansi) di daerah ini dan proton yang secara kimia sama memberikan sinyal

yang sama. Ukuran sinyal (integrasi) berbanding lurus dengan jumlah proton yang

menghasilkan sinyal.

Proton tunggal sering terlihat pada spektrum sebagai kelompok sinyal yang

keseluruhannya menunjukkan integrasi yang sesuai dengan satu proton. Hal ini

terjadi bila proton itu mempunyai satu atau lebih proton tetangga pada atom yang

berdekatan, gejala ini disebut penggadengan (coupling) atau pemecahan

(splitting). Tingkat serta ukuran penggadengan merupakan petunjuk mengenai

jumlah dan kedudukan nisbi proton tersebut dalam flavonoid.

Untuk mengidentifikasi dihidrokalkon biasanya menggunakan jumlah

cuplikan sekitar 5-25 mg dan menggunakan pelarut DMSO-d6 dan CDCl3 yang

sangat baik dalam pendeteksian aglikon dan glikosida flavonoid.

Gambar 5. Tabel hasil pengamatan spektrum RMI-1H dari senyawa dihidrokhalkon

2. Spektroskopi resonansi magnet inti karbon-13 (RMI-13C)

Spektroskopi RMI-13C ini memiliki beberapa kegunaan, diantaranya penentuan

jumlah atom karbon keseluruhan dari setiap molekul, jumlah atom yang

teroksigenasi dalam inti flavonoid, dan jumlah atom karbon dalam bagian gula.

Penggunaannya hampir sama dengan spektroskopi RMI-1H, tetapi perlu

diperhatikan jumlah cuplikan yang dipakai semakin banyak maka akan semakin

baik (sekitar 10-50 mg). Pelarut yang paling sering digunakan adalah d6-DMSO.

Gambar 6. Spektrum RMI-13C dari dihidrokalkon dalam DMSO-d6

Gambar 7. Tabel hasil pengamatn spektrum RMI-13C dari senyawa dihidrokalkon

d. Spektroskopi MS

Pada prinsipnya spektroskopi massa adalah penguraian sesepora senyawa organik

dan perekaman pola fragmentasi menurut massanya. Spektroskopi MS banyak

dimanfaatkan untuk menentukan bobot molekul, menetapkan penyebaran penyulih

pada lingkar A dan B, serta menentukan sifat dan titik ikatan gula pada C- dan O-

glikosida flavonoid. Kelebihannya dibanding dengan metode fisikokimia yang lain

adalah :

a. Jumlah cuplikan yang digunakan hanya sedikit

b. Mampu menentukan bobot molekul dengan tepat

c. Kemampuan menghasilkan fragmentasi yang rumit yang sering khas bagi

senyawa yang bersangkutan sehingga dapat diidentifikasi

Tujuan pertama pada penasfiran SM ialah mengidentifikasi molekul utuh atau ion

induk (M+) dan kemudian menghubungkan pecahan utama yang lain dengan ion

induk dengan menjelaskannya secara masuk akal.

Gambar 8. Spektrum massa dari isoorientin