UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA -...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI, SELEKSI, DAN UJI AKTIVITAS

ANTIMIKROBA KAPANG ENDOFIT DARI DAUN

TANAMAN JAMBLANG (Syzygium cumini L.)

TERHADAP Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans,

dan Aspergillus niger

SKRIPSI

PUTRI NUR HANDAYANI

NIM. 1111102000104

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA

JULI 2015

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI, SELEKSI, DAN UJI AKTIVITAS

ANTIMIKROBA KAPANG ENDOFIT DARI DAUN

TANAMAN JAMBLANG (Syzygium cumini L.)

TERHADAP Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans

dan Aspergillus niger

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

PUTRI NUR HANDAYANI

NIM. 1111102000104

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA

JULI 2015

vi

ABSTRAK

Nama : Putri Nur Handayani

Program Studi : Farmasi

Judul : Isolasi, Seleksi, dan Uji Aktivitas Antimikroba Kapang Endofit

dari Daun Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.) terhadap

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Candida albicans dan Aspergillus niger.

Kapang endofit adalah kapang yang hidup pada jaringan tanaman dan tidak

membahayakan inangnya. Kapang endofit dapat menghasilkan senyawa bioaktif

sebagai senyawa metabolit sekunder yang memiliki daya antimikroba,

antimalaria, antikanker, anti-HIV, antioksidan dan sebagainya. Penelitian ini

bertujuan untuk mengisolasi, menyeleksi dan menguji aktivitas antimikroba isolat

kapang endofit yang diisolasi dari daun tanaman Syzygium cumini L. terhadap

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus

aureus, Candida albicans dan Aspergillus niger. Kapang endofit berhasil diisolasi

dari daun jamblang (Syzygium cumini L), sebanyak 14 isolat, yaitu terdiri dari 6

isolat kapang endofit dari daun tuan (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, dan DT6) dan 8

isolat kapang endofit dari daun muda (DM1, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6,

DM7, dan DM8). Keempat belas isolat ini diseleksi lebih lanjut potensi

antimikrobanya dengan menggunakan metode difusi agar untuk aktivitas

antibakteri dan antikhamir dan metode uji antagonis untuk aktivitas antifungi.

Hasil seleksi isolat kapang endofit yang berpotensi antimikroba sebanyak 11 isolat

(DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, dan DM8).

Kesebelas isolat tersebut difermentasi pada media Potato Dextrose Yeast Broth

selama 14 hari dengan kondisi statis dan diuji aktivitas antimikrobanya. Metode

yang digunakan untuk uji antimikroba adalah metode Kirby-Bauer atau yang lebih

dikenal dengan sebutan metode cakram kertas. Aktivitas antimikroba isolat

kapang endofit dapat dilihat dari zona hambat yang terbentuk pada koloni isolat.

Hasil uji aktivitas antimikroba dari supernatan hasil fermentasi isolat kapang

endofit selama 14 hari didapatkan 10 isolat yang aktif terhadap Escherichia coli

(DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5, dan DM6), 5 isolat yang

aktif terhadap Staphylococcus aureus (DT1, DT2, DT3, DM2, dan DM5). 5 isolat

yang aktif terhadap Bacillus subtillis (DT1, DT2, DT3, DT4, dan DT5), 2 isolat

yang aktif terhadap Aspergillus niger (DM6 dan DM8), dan tidak ada isolat yang

aktif terhadap Pseudomonas aeruginosa maupun Candida albicans.

Kata kunci : Jamblang, Syzygium cumini L, kapang endofit, aktivitas antimikroba,

metode difusi agar, metode uji antagonis, metode Kirby-Bauer.

vii

ABSTRACT

Name : Putri Nur Handayani

Study Program: Pharmacy

Title : Isolation, Selection, and Antimicrobial Activity of Endophytic

Fungus from Jamblang Leaf Plants (Syzygium cumini L.) Against

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Candida albicans dan Aspergillus niger.

Endophytic fungi are fungi that live on plant tissue and does not harm its host.

Endophytic fungi can produce bioactive compounds as secondary metabolites that

have antimicrobial, anti-malarial, anti-cancer, anti-HIV, antioxidants and etc. This

study aims to isolate, select and test the antimicrobial activity of endophytic fungi

isolates that isolated from leaves of Syzygium cumini L. against Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida

albicans and Aspergillus niger. The result of endophytic fungi isolation in these

experiments showed a total of 14 isolates, which consists of 6 isolates of

endophytic fungi of dark green leaves (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, and DT6) and

8 isolates of endophytic fungi of light green leaves (DM1, DM2, DM3, DM4,

DM5, DM6, DM7 and DM8). Furthermore, that fourteenth isolates were selected

antimicrobial potential with using the agar diffusion method for antibacterial

activity and antikhamir activity and using antagonist test method for antifungal

activity. The selection results of antimicrobial potential of endophytic fungi

isolates were 11 isolates (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5,

DM6, and DM8). The eleven isolates were fermented in medium Potato Dextrose

Yeast Broth for 14 days with a static condition and tested antimicrobial activity.

The method used to test the antimicrobial is Kirby-Bauer method, or better known

as paper disc method. The antimicrobial activity of endophytic fungi isolates can

be seen from the inhibition zone formed in the colony isolates. The results on the

antimicrobial activity of the supernatant of endophytic fungi isolates fermented

for 14 days showed 10 isolates were active against Escherichia coli (DT1, DT2,

DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5, dan DM6), 5 isolates were active

against Staphylococcus aureus (DT1, DT2, DT3, DM2, dan DM5), 5 isolates were

active against Bacillus subtillis (DT1, DT2, DT3, DT4, dan DT5), 2 isolates were

active against Aspergillus niger (DM6 dan DM8), none of the isolates active

against Pseudomonas saeruginosa and Candida albicans.

Keywords: Jamblang, Syzygium cumini L, endophytic fungi, antimicrobial

activity, agar diffusion method, antagonist test method, Kirby-Bauer method

viii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmannirrahim

Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala

rahmat dan anugrah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi

yang berjudul “Isolasi, Seleksi, dan Uji Aktivitas Antimikroba Kapang Endofit

dari Daun Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.) terhadap Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida

albicans dan Aspergillus niger”. Shalawat serta salam semoga senantiasa

tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW beserta para keluarga dan sahabatnya.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk mencapai

gelar sarjana farmasi di Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai

pihak, penyusunan skripsi ini akan terasa sulit. Oleh karena itu, penulis

mengucapkan terima kasih kepada :

1. Ibu Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Sc., Apt selaku pembimbing pertama dan Ibu

Eka Putri, M.Si., Apt selaku pembimbing kedua, yang senantiasa memberi

arahan, dukungan, semangat, saran, dan solusi dalam proses penelitian dan

penyelesaian skripsi ini. Semoga segala bantuan dan bimbingannya mendapat

imbalan yang lebih baik di sisi-Nya.

2. Ibu Puteri Amelia, M.Farm., Apt. dan Ibu Ismiarni Komala, Ph.D., Apt selaku

dosen penguji yang telah memberikan sumbangan pikiran, saran, dan masukan

kepada penulis.

3. Bapak Dr. H. Arif Sumantri, SKM., M. Kes, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak Yardi, Ph.D., Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

5. Bapak Saiful Bahri, M.Si atas diskusi dan masukan selama penelitian ini.

6. Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akademika Program Studi Farmasi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan ilmunya kepada penulis.

ix

7. Ayahanda Saman dan Ibunda Nuraidah yang tiada hentinya memberikan doa,

dukungan dan kasih sayang yang tiada terhingga kepada penulis untuk

menyelesaikan skripsi ini.

8. Kakak-kakakku tercinta yang telah memberi motivasi dan dukungannya

kepada penulis.

9. Para laboran di FKIK (Kak Rani, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Tiwi, dan Kak

Rachmadi) yang telah banyak membantu selama proses penelitian.

10. Teman-teman seperjuangan mikrobiologi (Arini, Ambar, Ati, Brasti, Rahma,

Karimah, Sumiati, Dila, Meri, Bachtiar, Adit, Mozer, Fitri, dan Syaima) yang

menemani dan mengisi hari-hari waktu penelitian menjadi menyenangkan.

11. Sahabat-sahabat tercinta (Arini, Sheila, Meryza, dan Athiyah) yang senantiasa

menjadi penyemangat, motivator, dan tempat berbagi suka dan duka kepada

penulis.

12. Pihak-pihak lain yang tidak dapat ditulis satu persatu yang turut membantu

menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh

karena itu saran, kritik, dan masukan sangat diharapkan demi penyempurnaan

skripsi ini. Semoga skripsi ini bermanfaat dan dapat menjadi sumbangan

pengetahuan bagi para pembacanya.

Jakarta, 6 Juli 2015

Penulis

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ……………………………………………………….. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS…………………..……... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ………………...……….. iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI…….……………...……………... v

ABSTRAK …………………….……………...…………………...………... vi

ABSTRACT …………………….……………...……………...……..……... vii

KATA PENGANTAR ………………………...………………………….... viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSTUJUAN PUBLIKASI ....………... x

DAFTAR ISI ……………………………………………………………….. xi

DAFTAR GAMBAR……………………………………………………….. xiii

DAFTAR TABEL…………………………………………………………... xv

DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………….. xvi

BAB 1. PENDAHULUAN ………………………………………………..... 1

1.1 Latar Belakang …………..………..…..………………………… 1

1.2 Rumusan Masalah ……………………………………..……..…. 3

1.3 Tujuan Penelitian ……………………………………………...… 3

1.4 Manfaat Penelitian …………………….………………………... 4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA …………………………………………... 5

2.1 Kapang Endofit ……………………………………………….... 5

2.1.1 Interaksi Kapang Endofit dengan Tanaman …………….... 6

2.1.2 Kapang Endofit Penghasil Antimikroba ….……………..... 6

2.1.3 Isolasi Kapang Endofit ……………………….…………... 7

2.2 Antimikroba …………………………………………………….. 7

2.2.1 Mekanisme Antimikroba ….…………………………….... 8

2.2.2 Penentuan Aktivitas Antimikroba ……………...…………. 9

2.3 Mikroba Uji ……..……………………………………………..... 11

2.3.1 Aspergillus niger .………….…………………………….... 11

2.3.2 Pseudomonas aeruginosa …………………………….....… 11

2.3.3 Staphylococcus aureus …………………………………..,,. 12

2.3.4 Escherichia coli.. .………………………………………... 13

2.3.5 Bacillus subtilis ………………………………………….... 14

2.3.6 Candida albicans .……………………………………….... 15

2.4 Tanaman Jamblang……..………………………….……………. 16

2.4.1 Klasifikasi …………………………...……………………. 17

2.4.2 Penggunaan Tradisional Tanaman Jamblang ..…………..... 17

2.4.3 Kandungan Kimia dan Aktivitas Biologi ………….…….... 18

BAB 3. METODE PENELITIAN ………………………………………..... 20

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian …………………/……………….. 20

3.2 Alat dan Bahan …………………..…………………..…………. 20

3.2.1 Alat …………………..…………………….……………... 20

3.2.2 Sampel Tumbuhan..……………………………………….. 20

3.3.3 Media Pertumbuhan Mikroba ………………….…………. 21

3.3.4 Bahan untuk Sterilisasi Permukaan …………..…………... 21

xii

3.3.5 Bahan untuk Karakterisasi Kapang Endofit dan Identifikasi

Kemurnian Mikroba Uji………………...………………..... 21

3.3.6 Kontrol Uji Aktivitas Antimikroba …………….…..……... 21

3.3.7 Mikroba Uji ………………….……………………..……... 21

3.3 Prosedur Penelitian ……………………………………………... 22

3.3.1 Sterilisasi Alat …………………………………………..... 22

3.3.2 Pembuatan Media ……………………….……………….... 22

3.3.2.1 Pembuatan Media Malt Extract Agar……............... 22

3.3.2.2 Pembuatan Media Potato Dextrose Agar................. 22

3.3.2.3 Pembuatan Media Agar Miring PDA……………... 22

3.3.2.4 Pembuatan Media Nutrient Agar ……..................... 23

3.3.2.5 Pembuatan Media Agar Miring NA………………. 23

3.3.2.6 Pembuatan Media Potato Dextrose Yeast Broth....... 23

3.3.2.7 Pembuatan Media Nutrient Broth …….................... 23

3.3.3 Isolasi Kapang Endofit ……………………………..…….. 24

3.3.4 Pemurnian Kapang Endofit ………..…………………....... 24

3.3.5 Karakterisasi Kapang Endofit ……………………………. 25

3.3.5.1 Karakterisasi Makroskopik …………………..…... 25

3.3.5.2 Karakterisasi Mikroskopik ……………………….. 25

3.3.6 Identifikasi Kemurnian Mikroba Uji ………..……………. 25

3.3.6.1 Identifikasi Kemurnian Bakteri Uji …………..…... 25

3.3.6.2 Identifikasi Kemurnian Jamur Uji ………….…….. 26

3.3.7 Peremajaan Mikroba Uji ………………….....……………. 27

3.3.8 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji …………….……………. 27

3.3.9 Pembuatan Inokulum Mikroba Uji …………….…………. 27

3.3.10 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai

Antimikroba ……………………………………………..... 29

3.3.10.1 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai

Antibakteri dan Antikhamir……………………… 28

3.3.10.2 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai

Antifungi ……………………………………….... 29

3.3.11 Fermentasi Kapang Endofit ………………………….….. 30

3.3.12 Uji Aktivitas Antimikroba dari Supernatan Hasil Fermentasi

Kapang Endofit ….……………………………………... 30

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………….... 32 4.1 Isolasi Kapang Endofit ………………………………………..... 32

4.2 Karakterisasi Kapang Endofit ………………………………….. 36

4.3 Kemurnian Mikroba Uji ………..……………………………..... 51

4.4 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji …………….………………….. 54

4.5 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antimikroba... 57

4.6 Fermentasi Kapang Endofit ………………………..………….... 66

4.7 Uji Aktivitas Antimikroba dari Supernatan Hasil Fermentasi

Kapang Endofit ….………………………………....…............... 68

BAB 5. PENUTUP ……………………..................................……………... 77

5.1 Kesimpulan ……………………………...…………………….... 77

5.2 Saran ………………………………………………………….…. 77

DAFTAR PUSTAKA …..………..……………………….……………..….. 78

LAMPIRAN……………….. …..………………………….……………..…. 83

xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Syzygium cumini L. ………………………………………….... 16

Gambar 4.1 Isolasi kapang endofit pada daun hijau tua. ..…....………........ 34

Gambar 4.2 Isolasi kapang endofit pada daun hijau muda. ......…………… 35

Gambar 4.3 Hasil stocking dan working culture isolat kapang endofit ….... 36

Gambar 4.4 Isolat DT1. …………………….…………………....………… 37

Gambar 4.5 Pengamatan mikroskopik isolat DT1 perbesaran 1000x……… 37

Gambar 4.6 Isolat DT2. …………………….…………………………....… 38


Gambar 4.8 Isolat DT3. …………………….…………………………....… 39


Gambar 4.10 Isolat DT4. …………………….……………………………… 40

Gambar 4.11 Pengamatan mikroskopik isolat DT4 perbesaran 1000x…..….. 40

Gambar 4.12 Isolat DT5. …………………….…………………………..….. 41

Gambar 4.13 Pengamatan mikroskopik isolat DT5 perbesaran 1000x…….... 41

Gambar 4.14 Isolat DT6. …………………….…………………………........ 42

Gambar 4.15 Pengamatan mikroskopik isolat DT6 perbesaran 1000x…..….. 42

Gambar 4.16 Isolat DM1. …………………….………………………..…...., 43

Gambar 4.17 Pengamatan mikroskopik isolat DM1 perbesaran 1000x..…….. 43

Gambar 4.18 Isolat DM2. …………………….……………………..………. 44

Gambar 4.19 Pengamatan mikroskopik isolat DM2 perbesaran 1000x..……. 44

Gambar 4.20 Isolat DM3. …………………….……………………………... 45


Gambar 4.22 Isolat DM4. …………………….……………………………... 46


Gambar 4.24 Isolat DM5. …………………….……………………………... 47


Gambar 4.26 Isolat DM6. …………………….……………………………... 48


Gambar 4.28 Isolat DM7. …………………….……………………………... 49


Gambar 4.30 Isolat DM8. …………………….……………………………... 50


Gambar 4.32 Hasil pengamatan mikroskopik bakteri uji dengan

mikroskop perbesaran 1000x………….……………………..... 52

Gambar 4.33 Hasil pengamatan mikroskopik Candida albicans dengan

mikroskop perbesaran 1000x………….……………………..... 53

Gambar 4.34 Hasil pengamatan mikroskopik Aspergillus niger dengan

mikroskop perbesaran 1000x. ………….……………………... 53 Gambat 4.35 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji………….……………………. 56

Gambar 4.36 Seleksi kapang endofit terhadap Escherichia coli.…………….. 59

Gambar 4.37 Seleksi kapang endofit terhadap Staphylococcus aureus…….... 60

Gambar 4.38 Seleksi kapang endofit terhadap Pseudomonas aeruginosa…… . 61

Gambar 4.39 Seleksi kapang endofit terhadap Bacillus subtillis……………... 62

xiv

Gambar 4.40 Seleksi kapang endofit terhadap Candida albicans……..……... 63

Gambar 4.41 Hasil uji antagonis isolat kapang endofit DM8 (B)

terhadap Aspergillus niger (A).………….................................. 64

Gambar 4.42 Histogram persentase penghambatan kapang endofit

terhadap Aspergillus niger………….................………………. 65

Gambar 4.43 Hasil fermentasi isolat kapang endofit …………………...……... 67

Gambar 4.44 Hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil

fermentasi kapang endofit terhadap Escherichia coli…………. 71


fermentasi kapang endofit terhadap Staphylococcus aureus ..... 72


fermentasi kapang endofit terhadap Bacillus subtillis ………..... 73


fermentasi kapang endofit terhadap Aspergillus niger………... 74


fermentasi kapang endofit terhadap Pseudomonas aeruginosa 75

Gambar 4.49 Hasil uji aktivitas antikhamir dari supernatan hasil

fermentasi kapang endofit terhadap Candida albicans……….. 75

xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 4.1 Hasil pengamatan makroskopik dan mikroskopik bakteri uji umur

24 jam pada medium NA dengan suhu 37oC……….…………….. 51

Tabel 4.2 Hasil pengamatan makroskopik dan mikroskopik Candida albicans

umur 2 hari pada medium PDA pada suhu 29oC.…………………. 52

Tabel 4.3 Hasil pengamatan makroskopik dan mikroskopik

Aspergillus niger umur 5 hari pada medium PDA suhu 29oC…….. 53

Tabel 4.4 Hasil pengukuran absorbansi bakteri uji pada pembuatan

kurva pertumbuhan………….……………….………..….………... 55

Tabel 4.5 Hasil pengukuran zona hambat kapang endofit terhadap

bakteri uji dan khamir uji……………….……………….………… 58

Tabel 4.6 Data perhitungan presentase penghambatan isolat kapang

endofit terhadap Aspergillus niger………….……………….…….. 65

Tabel 4.7 Hasil pengukuran zona hambat dari supernatan hasil fermentasi

isolat kapang endofit. …………….……………….………………. 70

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.).. 83

Lampiran 2. Alur Penelitian. …………………………………..………….. 84

Lampiran 3. Skema Kerja Isolasi Kapang Endofit. ………………………. 85

Lampiran 4. Skema Kerja Pemurnian Kapang Endofit. …….……………. 86

Lampiran 5. Bagan Kerja Karakterisasi Kapang Endofit. …..……………. 87

Lampiran 6. Identifikasi Kemurnian Mikroba Uji.……………..………….. 88

Lampiran 7. Skema Kerja Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji………..……… 89

Lampiran 8. Pembuatan Suspensi Mikroba Uji……..………….……..….... 90

Lampiran 9. Skema Kerja Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi

Sebagai Antimikroba…..………….……...…..………….….... 92

Lampiran 10. Skema Kerja Fermentasi Kapang Endofit..…...…………….... 93

Lampiran 11. Skema Kerja Pengujian Aktivitas Antimikroba dari

Hasil Fermentasi Isolat Kapang Endofit………….……..….... 94

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tanaman merupakan salah satu sumber daya yang sangat potensial yang

dijadikan bahan baku dalam pembuatan obat maupun pengobatan. Menurut Deus

et al., (1982) dan Stafford et al., (1986) dalam Radji (2005) sebagian besar

komponen kimia yang berasal dari tanaman yang digunakan sebagai obat atau

bahan obat merupakan metabolit sekunder. Metabolit sekunder seperti alkaloid,

terpen, steroid, flavonoid, kuinon, fenol dan lain sebagainya dapat diproduksi oleh

mikroorganisme endofit yang dalam habitat aslinya dapat membentuk koloni

dalam jaringan tanaman (Bills dan Polyshook, 1992).

Mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif sebagai

senyawa metabolit sekunder yang memiliki daya antimikroba, antimalaria,

antikanker, anti HIV, antioksidan dan sebagainya (Strobel, 2003; Prihatiningtias

dan Wahyuningsih, 2006). Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa

metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang

sangat besar dan dapat diandalkan dalam pencarian sumber obat baru. Hal ini

dikarenakan mikroba merupakan organisme yang mudah ditumbuhkan, memiliki

siklus hidup yang pendek dan dapat menghasilkan jumlah senyawa bioaktif dalam

jumlah besar dengan metode fermentasi (Prihatiningtias dan Wahyuningsih,

2006).

Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup pada jaringan tanaman dan

tidak membahayakan inangnya. Mikroba endofit dapat ditemukan pada berbagai

jaringan tanaman diantaranya biji, ovula, buah, batang, akar, umbi akar, dan daun

tetapi tidak menyebabkan penyakit pada tanaman tersebut (Zinneal, 2002; Vega,

2005; Altahi, 2009). Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka

bumi, masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang

terdiri dari bakteri atau fungi. Namun, yang paling umum ditemukan adalah dari

jenis fungi (Strobel, 2003). Dreyfuss dan Chapela (1994) dalam Strobel (2002)

mengestimasikan terdapat sekitar 1.000.000 spesies fungi endofit di bumi. Kapang

adalah bentuk organisme yang paling sering ditemukan sebagai endofit dan

1

2


dilaporkan memiliki potensi yang lebih besar untuk menghasilkan metabolit

sekunder yang bermanfaat sebagai senyawa obat dibandingkan bentuk organisme

endofit lainnya (Wahyudi, 1998).

Pemanfaatan kapang endofit dalam memproduksi senyawa aktif memiliki

beberapa kelebihan, antara lain lebih cepat menghasilkan dengan mutu yang

seragam, dapat diproduksi dalam skala besar dan kemungkinan diperoleh

komponen bioaktif baru dengan memberikan kondisi yang berbeda (Rante et al.,

2013). Selain itu, apabila kapang endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat

dapat menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau

bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu memanen tanaman

aslinya untuk diambil sebagai simplisia yang kemungkinan besar memerlukan

waktu puluhan tahun untuk menanamnya (Radji, 2005). Dengan demikian

penggunaan kapang endofit sebagai sumber bahan baku obat secara ekonomis

diperkirakan lebih efisien dibandingkan dengan menggunakan tumbuhan obat

(Sinaga et al., 2009).

Tanaman obat yang berpotensi menghasilkan kapang endofit salah satunya

yaitu tanaman jamblang (Syzygium cumini L), family Myrtaceae. Seluruh bagian

tanaman seperti biji, buah, daun, bunga, dan kulit kayu digunakan dalam obat

tradisional di negara-negara di mana jamblang dilaporkan tumbuh. Bagian daun

telah digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai obat untuk diabetes

mellitus di banyak negara. Selain itu, daun juga digunakan untuk memperkuat gigi

dan gusi, mengobati keputihan, sakit perut, demam, gastropati, stranguria,

dermopati, sembelit dan untuk menghambat keluarnya darah dalam tinja (Soni et

al., 2011). Di India, jus dari daun digunakan sebagai obat diabetes dan untuk

mengatasi sakit perut, sedangkan rebusan buahnya digunakan secara eksternal

sebagai astringent dan untuk mengurangi sakit maag. Di Thailand, abu daun

digunakan secara eksternal untuk mengurangi rasa gatal yang disebabkan oleh

gigitan serangga (Ross, 2003).

Tanaman jamblang diketahui memiliki fitokimia yang beragam dan

sebagian besar telah diamati manfaat kesehatannya. Daun diketahui mengandung

β-sitosterol, betulinic acid, mycaminose, crategolic acid, n-hepatcosane,

n-nonacosane, n-hentriacontane, noctacosanol, n-triakontanol, n-dotricontanol,

3


quercetin, myricetin, myricitrin, dan glikosida flavonol myricetin 3-O-(4"-acetyl)-

α-L-rhamnopyranosides, terasilasi glikosida flavonol. Kulit batang dilaporkan

mengandung friedelin, friedelan-3-α-ol, asam betulinic, β-sitosterol, kaempferol,

β-sitosterol-D-glukosida, galat acid, ellagic acid, tanin galat, ellagitannin, dan

myricetin. Bunganya diamati mengandung oleanolic acid, ellagic acid,

Isoquercetin, quercetin, kaempferol, dan myricetin (Baliga et al, 2011).

Menurut penelitian Rossama (2002), Shafi et al (2002), dan Reddy (2013),

menyatakan bahwa minyak atsiri dari daun jamblang dilaporkan memiliki

aktivitas antibakteri dan antijamur. Minyak atsiri dari tanaman family Myrtaceae

terkenal akan aktivitas biologisnya dikarenakan keberadaan 1,8-cineole.

Monoterpen dan seskuiterpen yang terkandung dalam minyak ini seperti linalool,

kamper, geraniol, a-terpineol, P-caryophyllene, nerolidol dan cadinene derivative,

memiliki sifat bakterisida (Rossama, 2002). Selain itu, pada penelitian lain

menyatakan bahwa ekstrak etanol daun dan ekstrak air biji Syzygium cumini L

ditemukan memiliki aktivitas antimikroba yang sangat tinggi terhadap bakteri

Gram positif dan Gram negatif (Prabhakaran et al., 2011). Dengan adanya

kenyataan ini, isolat kapang endofit dari tanaman jamblang memiliki potensi yang

besar dalam usaha penemuan jenis antimikroba baru ataupun jenis obat baru yang

lain. Selain itu, penelitian yang dilakukan terhadap kapang endofit tersebut masih

sedikit, sehingga perlu untuk diteliti lebih lanjut.

1.2 Rumusan Masalah

Apakah daun tanaman Syzygium cumini L. memiliki isolat kapang endofit

yang mempunyai aktivitas antimikroba terhadap Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans dan

Aspergillus niger ?

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Untuk mengisolasi dan menyeleksi isolat kapang endofit yang berpotensi

sebagai antimikroba yang diisolasi dari daun tanaman Syzygium cumini L.

4


2. Untuk menguji aktivitas antimikroba dari isolat kapang endofit hasil

isolasi terhadap Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus

subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, dan Aspergillus niger.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini diharapkan :

1. Memberikan informasi bahwa daun tanaman Syzygium cumini L memiliki

isolat kapang endofit yang mempunyai aktivitas antimikroba.

2. Memberikan kontribusi bagi perkembangan ilmu pengetahuan terkait

penemuan sumber penghasil antimikroba dari isolat kapang endofit pada

tanaman.

3. Menambah atau memperkaya koleksi kapang endofit yang di isolasi dari

tanaman.

5


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kapang Endofit

Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup didalam jaringan tanaman

pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan

tanaman tanpa membahayakan inangnya. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat

mengandung beberapa mikroba endofit yang mampu menghasilkan senyawa

biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat koevolusi atau

transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikroba

endofit (Radji, 2005).

Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi,

masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri

dari bakteri atau fungi. Namun, yang paling umum ditemukan adalah dari jenis

fungi (Strobel, 2003). Dreyfuss dan Chapela (1994) dalam Strobel (2002).

mengestimasikan terdapat sekitar 1.000.000 spesies fungi endofit di bumi Kapang

adalah bentuk organisme yang paling sering ditemukan sebagai endofit dan

dilaporkan memiliki potensi yang lebih besar untuk menghasilkan metabolit

sekunder yang bermanfaat sebagai senyawa obat dibandingkan bentuk organisme

endofit lainnya (Wahyudi, 1998).

Kapang endofit merupakan kombinasi antara kapang dan tumbuhan

dimana kapang hidup secara sistematik dan umumnya berada didalam tumbuhan

(Labeda, 1990). Awalnya keberadaan kapang endofit diduga bersifat netral,

maksudnya tidak memberikan pengaruh, baik manfaat maupun kerusakan yang

ditimbulkan terhadap tanaman. Ternyata setelah para peneliti mulai mempelajari

lebih dalam, ada hubungan simbiosis mutualisme antara kapang endofit dengan

tanaman inang terutama peranannya yang sangat penting dalam melindungi

tanaman inang terhadap predator dan patogen (Prasetyoputri dan Atmosukarto,

2006).

Dalam simbiosis antara kapang endofit dengan tanaman obat, kapang

endofit dapat membantu proses penyerapan unsur hara yang dibutuhkan oleh

tumbuhan untuk proses fotosintesis serta melindungi tumbuhan inang dari

5

6


serangan penyakit, dan hasil dari fotosintesis dapat digunakan oleh kapang untuk

mempertahankan kelangsungan hidupnya (Bacon dan Siegel, 1990; Petrini et al.,

1992).

2.1.1 Interaksi Kapang Endofit dengan Tanaman

Interaksi kapang endofit dengan inangnya yang ditemukan pada bagian

organ tumbuhan tertentu, berhubungan erat dengan siklus hidup yang dilaluinya.

Masuknya kapang endofit pada jaringan tanaman inang tergantung pada

keberhasilan endofit tersebut menembus lapisan eksternal inangnya. Proses

masuknya endofit ini dicapai melalui mekanisme pemecahan atau degradasi

jaringan pelindung pada lapisan kutikula dan epidermis (Bacon dan Siegel, 1990).

Proses masuknya endofit ke dalam jaringan tanaman inang terjadi secara

langsung dan secara tidak langsung. Secara langsung ditandai dengan masuknya

endofit ke dalam bagian internal jaringan pembuluh tanaman dan diturunkan

melalui biji, sedangkan secara tidak langsung endofit hanya menginfeksi bagian

eksternal yaitu pada bagian pembungaan (Bacon, 1985).

Pada organ atau jaringan tanaman tertentu, ternyata dapat ditempati oleh

beberapa jenis mikroorganisme endofit yang berbeda satu sama lainnya. Hal ini

merupakan adaptasi dari mikroorganisme endofit terhadap mikroekologi dan

kondisi fisiologi yang spesifik dari masing-masing tanaman (Petrini et al., 1992).

2.1.2 Kapang Endofit Penghasil Antimikroba

Fisher (1989) menyatakan bahwa lebih dari 30% kapang endofit yang

berhasil diisolasinya memiliki aktivitas terhadap bakteri dan jamur patogen.

Banyak kelompok kapang endofit yang mampu memproduksi senyawa antibiotika

yang aktif melawan bakteri maupun jamur patogen terhadap manusia, hewan dan

tumbuhan, terutama dari genus Coniothirum dan Microsphaeropsis (Petrini et al.,

1992).

Pestalotiopsis micrispora merupakan kapang endofit yang paling sering

ditemukan di tanaman hutan lindung di seluruh dunia. Kapang endofit ini

menghasilkan metabolit sekunder ambuic acid yang berhasiat sebagai antifungi.

Cryptocandin adalah antifungi yang dihasilkan oleh kapang endofit

7


Cryptosporiopsis quercina yang berhasil diisolasi dari tanaman obat Tripterigeum

wilfordii, dan berkhasiat sebagai antijamur yang patogen terhadap manusia yaitu

Candida albicans dan Trichopyton spp (Radji, 2005).

2.1.3 Isolasi Kapang Endofit

Pemilihan bagian tanaman yang tepat menjadi hal yang penting untuk

diperhatikan agar didapat isolat kapang endofit yang tepat pula. Bagian tanaman

yang dipilih harus sehat dan segar. Sampel tanaman dapat disimpan dalam plastik

bersegel dan kering, serta dapat disimpan pada suhu 4°C (Strobel dan Daisy,

2003). Sterilisasi permukaan sampel tanaman perlu dilakukan untuk

mengeliminasi mikroba yang berada pada permukaan tanaman. Sterilisasi

permukaan dapat dilakukan dengan etanol 75%, NaOCl 2-10%, HgCl, Cu(NO3)2

dan formalin 30-50% (Stone et al., 2004).

Isolasi kapang endofit dapat dilakukan dengan teknik direct seed planting

dari bagian tanaman yang sudah disterilisasi terlebih dahulu permukaannya.

Kemudian jaringan bagian luar tanaman dihilangkan dengan pisau steril dan

bagian dalam tanaman diletakkan hati-hati pada permukaan media isolasi (Strobel,

2003).

Media isolasi yang biasa digunakan adalah MEA (Malt Extract Agar)

(1-2%) dan dapat dikombinasi dengan yeast extract (0,1-0,2%). Penggunaan

media water agar terkadang lebih disukai karena dapat mengurangi kontaminasi

mikroba lainnya (Stone et al., 2004). Selain itu, media PDA (Potato Dextrose

Agar) juga sering digunakan dalam mengisolasi kapang endofit. Antibiotik seperti

kloramfenikol (0,005% b/v) dan antijamur seperti nistatin (0,01% b/v) sering

ditambahkan untuk menghindari kontaminasi mikroba asing (Kumala et al.,

2006).

2.2 Antimikroba

Zat antimikroba adalah senyawa biologis atau kimia yang dapat

menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba. Menurut Fardiaz (1989), zat

antimikroba dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik

(menghambat pertumbuhan bakteri), fungisidal, fungistatik atau menghambat

8


germinasi spora bakteri. Kemampuan suatu zat antimikroba dalam menghambat

pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh berbagai faktor, yaitu : konsentrasi zat

antimikroba, suhu lingkungan, waktu penyimpanan, sifat-sifat mikroba (meliputi

jenis, jumlah, umur, dan keadaan mikroba), serta sifat fisik dan kimia makanan

termasuk kadar air, pH, jenis, dan jumlah senyawa di dalamnya (Frazier dan

Westhoff, 1988).

2.2.1 Mekanisme Kerja Antimikroba

Antimikroba berdasarkan struktur kimia dan mekanisme aksi,

dikelompokkan menjadi (Brunton et al., 2006; Pratiwi, 2008) :

a) Agen yang menghambat sintesis dinding sel bakteri. Antimikroba ini merusak

lapisan peptidoglikan yang menyusun dinding sel bakteri Gram positif

maupun Gram negatif. Mekanisme kerjanya adalah dengan mencegah ikatan

silang peptidoglikan pada tahap akhir sintesis dinding sel, yaitu dengan cara

menghambat protein pengikat penisilin (penicillin binding protein), protein ini

merupakan enzim dalam membran plasma sel bakteri yang secara normal

terlibat dalam penambahan asam amino yang berikatan silang dengan

peptidoglikan dinding sel bakteri, dan memblok aktivitas enzim transpeptidase

yang membungkus ikatan silang polimer-polimer gula panjang yang

membentuk dinding sel bakteri sehingga dinding sel menjadi rapuh dan mudah

lisis. Termasuk didalamnya golongan β-laktam (misalnya, penisilin,

cephalosporins, dan carbapenems) dan agen lainnya seperti cycloserine,

vankomisin, dan bacitracin.

b) Agen yang bekerja secara langsung pada membran sel mikroorganisme,

meningkatkan permeabilitas dan menyebabkan kebocoran senyawa

intraselular. Membran plasma bersifat semipermeabel dan mengendalikan

transport berbagai metabolit kedalam dan luar sel. Adanya gangguan atau

kerusakan struktur pada membran plasma dapat menghambat atau merusak

kemampuan membran plasma sebagai penghalang (barrier) osmosis dan

mengganggu sejumlah proses biosintesis yang diperlukan dalam membran.

Termasuk didalamnya deterjen seperti polymyxin, polyene agen antijamur

9


(misalnya, nistatin dan amfoterisin B) yang mengikat dinding sel-sterol, dan

lipopeptide daptomycin.

c) Agen yang mengganggu fungsi ribosom subunit 30S atau 50S secara

reversibel menghambat sintesis protein, yang umumnya adalah bakteriostatik

(misalnya, kloramfenikol, tetrasiklin, eritromisin, klindamisin, streptogramins,

dan linezolid) dan bakterisidal (misalnya aminoglikosida).

d) Agen yang mempengaruhi metabolisme asam nukleat bakteri.

Penghambatannya pada sintesis asam nukleat berupa penghambatan terhadap

transkripsi dan replikasi mikroorganisme, seperti rifamycins (misalnya,

rifampisin dan rifabutin) yang menghambat RNA polimerase, dan quinolon

yang menghambat topoisomerase.

e) Antimetabolit, yaitu substansi yang secara kompetitif menghambat metabolit

mikroorganisme, karena memiliki struktur yang mirip dengan substrat normal

bagi enzim metabolisme. Termasuk didalamnya trimetoprimdan sulfonamid,

yang menghambat enzim penting metabolisme folat.

2.2.2 Penentuan Aktivitas Antimikroba

Penentuan aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu

metode difusi dan metode dilusi. Pada metode difusi termasuk didalamnya metode

disk diffusion (tes Kirby & Bauer), E-test, ditch-plate technique, dan cup-plate

technique. Sedangkan pada metode dilusi termasuk didalamnya metode dilusi cair

dan dilusi padat (Pratiwi, 2008).

a. Metode difusi diantaranya:

1) Metode disk diffusion (tes Kirby & Bauer) menggunakan piringan yang

berisi agen antimikroba, kemudian diletakan pada media agar yang

sebelumnya telah ditanami mikroorganisme sehingga agen antimikroba

dapat berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan

adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba

pada permukaan media agar.

2) Metode E-test digunakan untuk mengestimasi Kadar Hambat Minimum

(KHM), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat

menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan

10


strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah

sampai tertinggi dan diletakkan pada permukaan media agar yang telah

ditanami mikroorganisme sebelumnya. Pengamatan dilakukan pada area

jernih yang ditimbulkannya yang menunjukan kadar agen antimikroba

yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.

3) Ditch-plate technique. Pada metode ini sampel uji berupa agen

antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara

memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara

membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam) digoreskan kearah parit

yang berisi agen antimikroba tersebut.

4) Cup-plate technique. Metode ini serupa dengan disk diffusion, dimana

dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan

mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang

akan diuji.

b. Metode dilusi diantaranya:

1) Metode dilusi cair/broth dilution test (serial dilution). Metode ini digunakan

untuk mengukur Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh

Minimum (KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri

pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan

dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang

terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai

KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur

ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen

antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap

terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM.

2) Metode dilusi padat (solid dilution test). Metode ini serupa dengan metode

dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode

ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan

untuk menguji beberapa mikroba uji

11


2.3 Mikroba Uji

Mikroba uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Aspergillus niger,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus

subtilis dan Candida albicans. Berikut ini adalah penjelasannya.

2.3.1 Aspergillus niger

Klasifikasi Aspergillus niger adalah sebagai berikut :

Kingdom : Mycetae

Divisio : Amastigomycota

Class : Ascomycotina

Ordo : Eurotiales

Famili : Eurotiaceae

Genus : Aspergillus

Spesies : Aspergillus niger

Aspergillus adalah sejenis fungi yang mempunyai bentuk seperti tepung,

permukaan berwarna hitam dengan dasar putih sampai kuning. Secara

mikroskopis mempunyai konidia yang panjang, lembut dan tidak berwarna.

Aspergillus sering ditemukan di alam bebas sebagai saprofit dan bersifat patogen

(Gandahusada et al., 1998).

Aspergilosis ialah penyakit jamur yang disebabkan oleh berbagai spesies

Aspergillus dan dapat mengenai kulit, kuku dan organ dalam terutama paru-paru

dan otak (Gandahusada et al, 1998). Aspergilosis jarang sekali mengenai individu

yang normal dan sehat. Penyakit ini selalu mengenai orang-orang yang sudah

sakit parah dan lama. Aspergilosis ini dapat di obati dengan vorikonazol, obat ini

merupakan antifungi triazol yang bekerja dengan menghambat cytochrome

P-450–mediated 14 alpha-lanosterol demethylation yang sangat esensial dalam

biosintesis ergosterol jamur (Andra, 2007).

2.3.2 Pseudomonas aeruginosa

Klasifikasi Pseudomonas aeruginosa adalah sebagai berikut :

Kingdom : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Class : Gamma proteobacteria

12


Ordo : Pseudomonadales

Famili : Pseudomonadaceae

Genus : Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa termasuk ke dalam kelompok bakteri Gram

negatif, berbentuk tangkai, berflagel, dapat tumbuh pada suhu antara 35-42oC dan

merupakan salah satu spesies dari genus Pseudomonas yang dapat menimbulkan

penyakit pada manusia. Dinding selnya tersusun dari lipopolisakarida (LPS) yang

terdiri atas 2-keto-3-deoksi-asam oktanat (KDO) dan lipid (Tim Mikrobiologi,

2003).

Infeksi oleh bakteri tersebut terjadi pada seseorang yang mengalami

gangguan pada sistem pertahanan tubuh. Oleh karena itu P. aeruginosa disebut

patogen oportunistik yaitu memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan

inang untuk memulai suatu infeksi. Kelainan klinis yang ditimbulkan antara lain:

infeksi pada luka bakar, infeksi saluran kemih, endokarditis, gastroenteritis,

pneumonia dan lain-lain (Tim Mikrobiologi, 2003).

Umumnya, Pseudomonas aeruginosa resisten terhadap bermacam-macam

antimikroba, tetapi masih ada beberapa antimikroba yang efektif untuk mengatasi

infeksi oleh bakteri tersebut, antara lain : amikasin, sefotaksim, piperasilin dan

vaksin heptavalen (Tim Mikrobiologi, 2003).

2.3.3 Staphylococcus aureus

Klasifikasi Staphylococcus aureus adalah sebagai berikut :

Kingdom : Prokaryota

Divisio : Bacteria

Class : Schizomyces

Ordo : Eubacteriales

Famili : Micrococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus

Staphylococcus adalah bakteri Gram positif, berbentuk kokus, non motil,

dan mampu memfermentasi manitol, menghasilkan koagulase, dan mampu

13


menghasilkan enterotoksin dan Heat-Stable Endonuklease. Sebagian besar bakteri

S. aureus pada dinding selnya mengandung protein A yang berikatan dengan

peptidoglikan secara kovalen dan asam teikoat (Tim Mikrobiologi, 2003).

Bakteri S. aureus dapat menyerang seluruh tubuh. Bentuk klinisnya

tergantung dari bagian tubuh yang terkena infeksi. Di antara contohnya adalah

toxic shock syndrom (suatu keadaan yang ditandai dengan panas mendadak, diare

dan syok), keracunan makanan, ensefalitis, endokarditis dan septisemia. Bakteri

ini dapat di obati dengan penisilin, obat-obat yang tahan terhadap penisilinase dan

lain-lainnya. Pada umumnya, semua Staphylococcus sensitif terhadap vankomisin,

termasuk MRSA (Tim Mikrobiologi, 2003).

2.3.4 Escherichia coli

Klasifikasi Escherichia coli adalah sebagai berikut :


Divisio : Gracilicutes

Class : Scotobacteria

Ordo : Eubacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Escherichia coli adalah salah satu bakteri patogen yang dapat

menyebabkan gastroenteritis, dengan gejala mulai diare ringan sampai

hemolyticuremic syndrome, gagal ginjal dan kematian. E. coli merupakan

mikroflora alami yang terdapat pada saluran pencernaan manusia dan hewan.

Keberadaan flora normal dalam saluran pencernaan akan memberikan

keuntungan, di antaranya adalah menghambat pertumbuhan bakteri patogen,

menghasilkan vitamin B kompleks dan vitamin K (Tim Mikrobiologi, 2003).

Suatu contoh dari kelainan karena gangguan flora normal saluran

pencernaan adalah summer diarrhea. Pada musim panas, anak-anak yang

mengalami infeksi saluran nafas ringan akan mengalami penurunan nafsu makan,

sehingga pemasukan cairan menurun sedangkan jumlah makanan yang harus

dicerna oleh usus halus menjadi lebih besar. Hal itu menyebabkan jumlah E.coli

14


meningkat dan asam organik yang dibentuk oleh metabolisme basil kolon ini

mengakibatkan iritasi pada usus dan menimbulkan sindroma yang disebut summer

diarrhea (Tim Mikrobiologi, 2003).

2.3.5 Bacillus subtilis

Klasifikasi Bacillus subtilis adalah sebagai berikut :


Class : Shizomycetes

Ordo : Eubecteriales

Famili : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus subtilis.

Bacillus subtilis adalah bakteri aerobik Gram positif, mempunyai ciri-ciri

sel berbentuk batang pendek (rods), sendiri-sendiri, jarang membentuk rantai,

motil dengan flagella peritrich, membentuk endospora berukuran 0,8 x 1,5-1,8

μm; permukaan spora terwarnai pucat. Pada spora yang berkecambah, dinding

spora pecah secara melintang (Machmud et al., 2003).

Koloni bakteri pada medium agar berbentuk bundar, tepi tidak teratur,

permukaan tidak mengkilap, menjadi tebal dan keruh (opaque), kadang-kadang

mengkerut dan berwarna krem atau kecoklatan. Bentuk koloni agak bervariasi

pada media yang berbeda. Koloni meluas pesat pada medium yang berpermukaan

lembab (Machmud et al., 2003).

Biakan bakteri dari medium padat tidak mudah larut dalam air.

Pertumbuhan pada medium cair (broth) keruh, berkerut, dengan pelikel yang

koheren, tidak keruh atau hanya agak keruh. Secara anaerob, dalam medium

kompleks yang mengandung glukose, pertumbuhan dan fermentasi berlangsung

lambat atau lemah; tetapi dengan menambahkan O2 tumbuh cepat serta

menghasilkan 2,3-butanediol, asetoin, dan CO2. Bakteri ini mendekomposisi

pektin dan polisakarida dari jaringan tanaman, dan beberapa strain membusukkan

umbi kentang (Machmud et al., 2003).

15


2.3.6 Candida albicans

Klasifikasi Candida albicans adalah sebagai berikut :

Kingdom : Mycetae

Divisi : Amastigomycota

Phylum : Proteobacteria

Class : Deuteromycetes

Ordo : Cryptococcales

Famili : Cryptococcaceae

Genus : Candida

Spesies : Candida albicans

Candida albicans merupakan jamur dimorfik karena kemampuannya

untuk tumbuh dalam dua bentuk yang berbeda yaitu sebagai sel tunas yang akan

berkembang menjadi blastospora dan menghasilkan kecambah yang akan

membentuk hifa semu. Candida adalah mikroorganisme yang termasuk dalam

khamir, sering ditemukan pada manusia dan binatang sebagai saprofit. Bila

terdapat faktor predisposisi (keadaan yang menguntungkan pertumbuhan khamir

tersebut), maka Candida dapat menimbulkan penyakit primer atau sekunder.

Selain itu, Candida juga dapat menimbulkan penyakit yang mendadak atau

menahun (Gandahusada et al, 1998).

Candida juga dapat menginfeksi pada kuku. Kelainan ini dapat timbul

karena kurang menjaga kebersihan pada kuku, terutama di bawah kuku. Kuku

yang terinfeksi Candida dapat merubah warna kuku menjadi seperti susu atau

warna lain dan rapuh. Selain menginfeksi kuku, Candida juga dapat menginfeksi

kulit. Gejala yang ditimbulkan ialah rasa gatal dan timbul rasa sakit bila terjadi

infeksi sekunder. Pada wanita, Candida sering menimbulkan vaginitis dengan

gejala utama flour albus (keputihan) yang sering disertai rasa gatal. Kandidiasis

vagina dapat juga tanpa gatal, tetapi keluhan yang dikemukakan berupa

bertambahnya keputihan bila lelah atau sebelum datang haid (Gandahusada et al.,

1998).

16


2.4 Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.)

Syzygium cumini L. (Syn. Eugenia jambolana Lam.) umumnya dikenal

sebagai tanaman jamblang, family Myrtaceae. Tanaman ini berasal dari India atau

Hindia Timur, dan terdistribusi luas diberbagai negara diantarnya Thailand,

Filipina, Myanmar, Sri Lanka, Kepulauan Andaman, Madagaskar, Malaysia,

Indonesia, Florida, California, Algeria, Israel, dan berbagai negara lainnya (Lim,

2012; Ross, 2003).

Di Indonesia, tanaman jamblang dikenal dengan berbagai nama, antara

lain : Sumatera: jambe kleng (Aceh), jambu kling (Gayo), jambu kalang (Mink.).

Jawa: jamblang (Sunda), juwet, duwet, duwet manting (Jawa), dhalas, dhalas bato,

dhuwak (Madura). Nusa Tenggara: juwet, jujutan (Bali), klayu (Sasak), duwe

(Bima), jambulan (Flores), Sulawesi: raporapo jawa (Makasar), alicopeng (Bugis).

Maluku: jambula (Ternate). Melayu: jamlang, jambelang, duwet. Dalam bahasa

Inggris orang mengenalnya dengan nama java plum, black plum, jambolan,

jambul (Mudiana, 2006).

(a) (b)

Gambar 2.1. Syzygium cumini L. : (a) Pohon; (b) Daun.

(Sumber: Koleksi Pribadi, November 2014)

17


2.4.1 Klasifikasi

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Superdivision : Spermatophyta

Division : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida–Dicotyledons

Subclass : Rosidae

Ordo : Myrtales

Family : Myrtaceae

Genus : Syzygium

Species : Syzygium cumini (L.) Skeels

(http://plants.usda.gov, USA Departement Of Agriculture, Desember 2014)

2.4.2 Penggunaan Tradisional Tanaman Jamblang

Semua bagian dari pohon dan biji khususnya, memiliki sejarah panjang

penggunaan obat tradisional di negara-negara di mana jamblang dilaporkan

tumbuh. Jamblang digunakan secara luas dalam berbagai sistem tradisional obat

seperti di Ayurveda, Unani, Siddha, Srilankan, Tibet, dan dalam sistem

pengobatan alternatif homeopati dan komplementer. Sebelum penemuan insulin,

jamblang berguna dalam pengobatan diabetes dan digunakan baik sendiri atau

dalam kombinasi dengan tanaman hipoglikemik lain di Eropa (Baliga et al.,

2011).

Bagian daun telah digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai obat

untuk diabetes mellitus di banyak negara. Selain itu, daun juga digunakan untuk

memperkuat gigi dan gusi, mengobati keputihan, sakit perut, demam, gastropati,

stranguria, dermopati, sembelit dan untuk menghambat keluarnya darah dalam

tinja (Soni et al, 2011). Di India, jus dari daun digunakan sebagai obat diabetes

dan untuk mengatasi sakit perut, sedangkan rebusan buahnya digunakan secara

eksternal sebagai astringent dan untuk mengurangi sakit maag. Di Thailand, abu

daun digunakan secara eksternal untuk mengurangi rasa gatal yang disebabkan

oleh gigitan serangga (Ross, 2003).

http://plants.usda.gov/

18


Menurut Ayurveda, kulit kayu digunakan sebagai digestive dan astringent.

Selain itu, juga berguna untuk mengobati sakit tenggorokan, bronkitis, asma, rasa

haus, biliousness, disentri, dan bisul. Abu daun digunakan sebagai dentrificant

dan efektif untuk memperkuat gigi dan gusi. Kulit kayu juga dikenal memiliki

sifat penyembuhan luka. Dalam sistem obat Siddha, jamblang digunakan sebagai

antianemia, meningkatkan produksi sperma dan untuk mengurangi panas yang

berlebihan dari tubuh. Menurut sistem obat Unani, jamblang digunakan sebagai

obat penyakit hati, untuk memperkaya darah, memperkuat gigi dan gusi.

Rebusannya digunakan sebagain lotion yang baik untuk menghilangkan infeksi

kurap di kepala (Baliga et al, 2011).

2.4.3 Kandungan Kimia dan Aktivitas Biologi

Tanaman jamblang diketahui memiliki fitokimia yang beragam dan

sebagian besar telah diamati manfaat kesehatannya. Daun diketahui mengandung

β-sitosterol, asam betulinic, mycaminose, asam crategolic (maslinic),

n-hepatcosane, n-nonacosane, n-hentriacontane, noctacosanol, n-triakontanol,

n-dotricontanol, quercetin, myricetin, myricitrin dan glikosida flavonol myricetin

3-O-(4"-acetyl)-α-L-rhamnopyranosides, terasilasi glikosida flavonol. Minyak

esensial dari daun terbukti mengandung fitokimia pinocarveol, α-terpeneol,

myrtenol, eucarvone, murolol, α-myrtenal, cineole, geranyl aseton, α-cadinol dan

pinocarvone (Baliga et al, 2011).

Kulit batang dilaporkan mengandung friedelin, friedelan-3-α-ol, asam

betulinic, β-sitosterol, kaempferol, β-sitosterol-D-glukosida, asam galat, ellagic

asam, tanin galat, ellagitannin dan myricetin. Bunganya diamati mengandung

asam oleanolic, asam ellagic, Isoquercetin, quercetin, kaempferol dan myricetin

(Baliga et al, 2011).

Penelitian menunjukkan bahwa daging buah jamblang berisi antosianin,

delphinidin, petunidin, malvidin-diglucoside, dan senyawa ini bertanggung jawab

untuk warna ungu cerah. Biji adalah bagian tanaman yang paling banyak

dipelajari dan dilaporkan mengandung jambosine, asam galat, asam ellagic,

corilagin, diphenoylglucose 3,6-hexahydroxy, diphenoylglucose 4,6-hexahydroxy,

1-galloylglucose, 3-galloylglucose, quercetin, dan β- sitoterol (Baliga et al, 2011).

19


Tanaman ini memiliki kegunaan sebagai obat yang sangat potensial.

Seluruh bagian tanaman seperti biji, buah, daun bunga, kulit kayu memiliki

berbagai sifat obat seperti antimikroba, antivirus, antiinflamasi, antigenotoksik,

antiulcerogenic, kardioprotektif, antialergi, antikanker, kemoterapi preventif,

radio protektif, antioksidan, hepatoprotektif, antidiare, efek hipoglikemik dan

antidiabetes (Yadav et al., 2014).

Menurut penelitian Rossama (2002), Shafi et al (2002), dan Reddy (2013),

menyatakan bahwa minyak atsiri dari daun jamblang dilaporkan memiliki

aktivitas antibakteri dan antijamur. Minyak atsiri dari tanaman family Myrtaceae

terkenal akan aktivitas biologisnya dikarenakan keberadaan 1,8-cineole.

Monoterpen dan seskuiterpen yang terkandung dalam minyak ini seperti linalool,

kamper, geraniol, a-terpineol, P-caryophyllene, nerolidol dan cadinene derivative,

memiliki sifat bakterisida (Rossama, 2002).

Hasil penelitian Prabhakaran et al., (2011) menunjukkan bahwa ekstrak

jamblang mengandung karbohidrat, fenol, flavonoid dan tanin sebagai metabolit

sekunder. Selain itu, dalam penelitian tersebut menyatakan bahwa ekstrak etanol

daun dan ekstrak air biji Syzygium cumini L ditemukan memiliki aktivitas

antimikroba yang sangat tinggi terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif.

20


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari sampai Juni 2015 di

Laboratorium Farmakogosi Fitokimia, Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah, Jakarta.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Laminar Air Flow (Minihelix II), inkubator (France Etuves), oven

(Memmert), shaker incubator (Stuart Scientific), autoklaf (All American),

autoklaf otomatis (ALP), alat sentrifus (Hettich Zentrifugen), spektrofotometri

UV-Vis (Hitachi), tabung sentrifus, vortex (Thermolyne), hot plate (Thermo

Scientific), timbangan analitik (AND), mikroskop cahaya (Motic), cover glass,

kaca objek, ose bulat, bunsen, cawan petri (Normax), paper disc 6mm (Oxoid),

mikro pipet dan tip (Bio Rad), pH indikator, labu Erlenmeyer, beaker glass,

tabung reaksi (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), spatula, magnetik stirer, batang

pengaduk, kaca arloji, kuvet, batang L, batang drygalski, pinset, pipet tetes, tube,

pisau, silet, tisu steril, kapas, kasa, tali, alumunium foil, plastic wrap, kertas

saring, perkamen, jangka sorong (Tricle Brand), dan alat-alat gelas lain yang biasa

digunakan di laboratorium mikrobiologi.

3.2.2 Sampel Tumbuhan

Sampel tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun

tumbuhan jamblang (Syzygium cumini L.) yang diambil pada tanggal 4 Februari

2015 dari SDN Kampung Tengah 07 Pg. Jl. Trikora IV Rt. 05/ Rw 07 Kelurahan

Tengah, Pasar Rebo, Jakarta Timur. Tumbuhan ini telah dideterminasi di

Lembaga Ilmu pengetahuan Indonesia (LIPI), Herbarium Bogoriense, Cibinong,

Bogor.

Sampel daun yang digunakan sebanyak 6 helai yang terdiri dari 3 helai

daun hijau tua dan tiga helai daun hijau muda. Daun hijau tua memiliki ciri daun

20

21


berwarna hijau tua, tebal, dan kaku. Sedangkan daun hijau muda memiliki ciri

daun berwarna hijau muda, daun tipis dan lentur. Sampel daun yang digunakan

yaitu daun yang masih segar, tidak layu atau tidak menguning dan bebas dari

kontaminasi (tidak ada bercak hitam atau jamur yang menempel pada daun).

3.2.3 Media Pertumbuhan Mikroba

Malt Extract Agar (MEA, Oxoid), Potato Dextrose Agar (PDA, Merck),

Potato Dextrose Broth (Oxoid), Nutrient Agar (NA, Merck), Nutrient Broth (NB,

Merck), Yeast Extract (YE, Merck), dan kalsium karbonat (CaCO3).

3.2.4 Bahan untuk Sterilisasi Permukaan

Air mengalir, etanol 70 %, NaOCL 5.25% (Baycline), dan akuadest steril.

3.2.5 Bahan untuk Karakterisai Kapang Endofit dan Identifikasi

Kemurnian Mikroba Uji

NaCl 0.9%, standar Mc Farland III, larutan kristal violet, lugol, alkohol

70%, alkohol 96%, larutan safranin, dan methylene blue.

3.2.6 Kontrol Uji Aktivitas Antimikroba

Cakram kloramfenikol 30 µg/cakram (Oxoid), cakram nistatin 100

µg/cakram (Oxoid), dan cakram aquadest steril.

3.2.7 Mikroba Uji

Mikroba uji yang digunakan yaitu bakteri Gram positif (Bacillus subtillis

ATCC 6633 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923), bakteri Gram negatif

(Escherichia coli ATCC 25922 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853),

kapang (Aspergillus niger ATCC 16404), dan khamir (Candida albicans ATCC

10231). Mikroba tersebut diperoleh dari Labotarorium Mikrobiologi Farmasi

FMIPA UI.

22


3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Sterilisasi Alat

Untuk alat-alat yang tidak tahan pemanasan dengan suhu tinggi, sterilisiasi

dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit.

Untuk alat-alat yang terbuat dari gelas, disterilkan dengan menggunakan oven

suhu 160˚C selama 2 jam. Sedangkan alat-alat logam disterilkan dengan cara

dipijarkan menggunakan api spiritus (Kumar, 2012).

3.3.2 Pembuatan Media

3.3.2.1 Pembuatan Media Malt Extract Agar (MEA)

Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media MEA dibuat

dengan cara MEA sebanyak 50 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuades. Media

tersebut dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan

menggunakan hot plate dan stirrer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam

autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. Media dituang ke

dalam cawan petri steril masing-masing ±10 mL dan biarkan hingga memadat.

3.3.2.2 Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)

Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media PDA dibuat

dengan cara PDA sebanyak 39 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media




dalam cawan petri steril masing-masing ±10 mL dan biarkan hingga memadat.

3.3.2.3 Pembuatan Media Agar Miring PDA

Media agar miring PDA dibuat dengan cara PDA sebanyak 39 gram

dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur sampai merata

dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer.

Campuran media tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing

sebanyak 5 mL lalu disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm

23


selama 15 menit. Setelah disterilisasi, tabung reaksi tersebut diletakkan dalam

posisi miring ± 45o dan biarkan hingga memadat (Jauhari, 2010).

3.3.2.4 Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)

Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media NA dibuat

dengan cara NA sebanyak 20 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media


menggunakan hot plate and stirrer. Campuran media tersebut disterilisasi dalam


dalam cawan petri steril masing-masing 10 mL dan biarkan hingga memadat.

3.3.2.5 Pembuatan Media Agar Miring NA

Media NA miring dibuat dengan cara NA sebanyak 20 gram dilarutkan

dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur sampai merata dengan cara

pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate and stirrer. Campuran media

tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 mL lalu

disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit.

Setelah disterilisasi, tabung reaksi tersebut diletakkan dalam posisi miring ± 45o

dan biarkan hingga memadat (Jauhari, 2010)

3.3.2.6 Pembuatan Media Potato Dextrose Yeast (PDY) Broth

Potato Dextrose Broth dan Yeast Agar masing-masing sebanyak 24 gram

dan 2 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media tersebut dicampur

sampai merata dengan cara pengadukan dan pemanasan menggunakan hot plate

dan stirrer. Sambil diaduk, kalsium karbonat (CaCO3) ditambahkan kedalam

larutan hingga mencapai pH 6. Media tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada

suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit (Jauhari, 2010).

3.3.2.7 Pembuatan Media Nutrient Broth (NB)

Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media NB dibuat

dengan cara NB sebanyak 8 gram dilarutkan dengan 1000 mL akuadest. Media


24



autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit.

3.3.3 Isolasi Kapang Endofit

Kapang endofit diisolasi dari daun tanaman Syzygium cumini L. Daun

yang digunakan adalah daun hijau muda dan daun hijau tua. Isolasi kapang

endofit dilakukan mengikuti metode Fisher et al., (1993) yang dimodifikasi.

Sampel daun tanaman jamblang di cuci dengan air mengalir selama 10 menit.

Sampel daun yang telah dicuci kemudian disterilisasi permukaan dengan cara

daun direndam ke dalam etanol 70% selama 1 menit, kemudian direndam ke

dalam larutan NaOCl 5,25% selama 5 menit, lalu direndam kembali ke dalam

etanol 70% selama 30 detik, dan terakhir dibilas dengan akuadest steril selama 5

detik. Daun yang telah disterilisasi permukaannya diletakkan di atas kertas saring

steril dan dibiarkan hingga kering di udara. Setelah kering, daun dipotong menjadi

bagian kecil dengan ukuran 1x1 cm2

dengan pisau steril.

Potongan sampel diletakkan pada cawan petri yang berisi media MEA.

Inokulasi sampel dilakukan triplo dan tiap cawan berisi 2 potongan daun. Selain

itu pada akuadest bilasan terakhir diambil 1 mL dan diisolasi ke media MEA

lainnya, perlakuan ini berfungsi sebagai kontrol. Selama pekerjaan dilakukan di

dalam laminar air flow dan kemudian media yang telah diinokulasi potongan

sampel dan media kontrol diinkubasi pada suhu 29oC selama 5–21 hari tergantung

tingkat pertumbuhan kapang. Isolat endofit yang menunjukkan sifat morfologi

jamur dipindahkan ke media MEA yang baru sampai diperoleh isolat murni.

3.3.4 Pemurnian Kapang Endofit

Kapang endofit yang telah tumbuh pada media isolasi MEA, kemudian

secara bertahap dimurnikan satu persatu. Masing-masing isolat murni kapang

endofit yang diperoleh dipindahkan ke dalam media MEA plate lain. Pemurnian

ini bertujuan untuk memisahkan koloni endofit dengan morfologi yang berbeda

untuk dijadikan isolat tersendiri. Pengamatan morfologi dilakukan kembali setelah

inkubasi selama 5-7 hari, dan apabila masih ditemukan pertumbuhan koloni yang

berbeda secara makroskopik maka harus dipisahkan kembali sampai diperoleh

25


isolat murni. Setiap isolat murni dibuat duplo pada agar miring. Masing-masing

sebagai kultur stok (stock culture) dan kultur untuk penelitian (working culture)

dan diinkubasi pada suhu 29oC selama 5-7 hari sesuai dengan pertumbuhannya

(Noverita et al., 2009).

3.3.5 Karakterisasi Kapang Endofit

Karakterisasi kapang dilakukan dengan mengamati karakter morfologi

baik secara makroskopis maupun secara mikroskopis.

3.3.5.1 Karakterisasi Makroskopik

Karakterisasi makroskopik dilakukan dengan mengamati morfologi koloni

meliputi warna koloni, warna sebalik koloni (reverse color), tekstur (granular,

seperti tepung, seperti beludru, seperti kapas), zonasi, dan tetes eksudat (exudates

drops) (Gandjar, 2000).

3.3.5.2 Karakterisasi Mikroskopik

Karakterisasi mikroskopik dilakukan dengan melakukan pemeriksaan

preparat kapang melalui mikroskop. Caranya adalah, kaca objek dan kaca penutup

dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%, kemudian di atas kaca objek

diletakkan potongan media MEA berukuran 1x1 cm2 yang berisi bagian hifa

kapang lalu ditutup dengan cover glass. Preparat tersebut kemudian ditempatkan

pada cawan petri steril yang sebelumnya telah diberi alas kertas tissu yang

dibasahi dengan akuades steril. Selanjutnya diInkubasi selama 7 hari pada suhu

29oC. Setelah inkubasi selesai, cover glass dilepaskan, lalu ditetesi 1 tetes alkohol

70% dan 1 tetes methylene blue, kemudian ditutup dengan cover glass dan diamati

dengan mikroskop cahaya dari perbesaran terkecil hingga terbesar Pengamatan

yang dilakukan meliputi ada atau tidak adanya sekat pada hifa, pertumbuhan hifa,

bentuk dan warna konidia (Yulia 2005; Ramadhan, 2011; Sundari, 2012).

26


3.3.6 Identifikasi Kemurnian Mikroba Uji

3.3.6.1 Identifikasi Kemurnian Bakteri Uji

Identifikasi kemurnian bakteri uji dilakukan secara makroskopik dan

mikroskopik pada bakteri uji yang berusia 24 jam. Identifikasi makroskopik

dilakukan dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni meliputi warna

koloni, tepi koloni, permukaan koloni, bentuk koloni, dan diameter koloni.

Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan metode pewarnaan Gram.

Kaca objek dibersihkan dahulu dengan kain bersih yang sudah dibasahi dengan

alkohol 70%, kemudian dilewatkan di atas api untuk menghilangkan lemak dan

dibiarkan dingin sebelum dipakai. Selanjutnya dibuat suspensi bakteri dengan satu

sengkelit NaCl fisiologis di atas gelas objek lalu difiksasi dengan melewatkan

kaca objek pada api bunsen. Selanjutnya, preparat dipaparkan oleh larutan kristal

violet selama 1 menit. Kaca objek dicuci dengan air yang mengalir selama 5 detik.

Kemudian dicuci dengan pereaksi poliiodida (lugol), dibiarkan selama 1 menit.

Kaca objek dicuci dengan air mengalir. Preparat kemudian dicuci dengan alkohol

96% sampai tidak ada lagi pewarna yang terbawa oleh etanol selama 30 detik.

Preparat ditetesi larutan Safranin selama 1 menit. Dicuci kembali dengan air

mengalir. Preparat dikeringkan dengan cara diletakkan di atas tisu steril dan

selanjutnya diamati dengan mikroskop cahaya dari perbesaran terkecil hingga

terbesar (Rustanti, 2007).

3.3.6.2 Identifikasi Kemurnian Jamur Uji

Identifikasi kemurnian jamur uji dilakukan secara makroskopik dan

mikroskopik pada jamur uji yang berusia 3-5 hari. Identifikasi makroskopik jamur

uji dilakukan dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni. Pengamatan

morfologi kapang secara makroskopik meliputi warna koloni, warna sebalik

koloni (reverse colony), tekstur koloni, ada tidaknya tetes eksudat (exudate

drops), zonasi dan sporulasi (Gandjar, 2000). Sedangkan pengamatan morfologi

khamir secara makroskopik meliputi warna koloni, tekstur koloni, permukaan

koloni, profil koloni, dan tepi koloni (Kurtzman dan Fell, 1998).

Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan cara kaca objek dan kaca

penutup dibersihkan dengan alkohol 70%. Methylene blue diteteskan di atas kaca

27


objek yang telah dibersihkan dengan alkohol. Miselium diambil yang sudah

bersporulasi, atau sesuai yang diperlukan, dan diurai hati-hati dengan jarum

preparat. Kaca penutup diletakkan secara hati-hati di atas permukaan preparat dan

kelebihan methylene blue diserap dengan kertas saring. Preparat diamati di bawah

mikroskop cahaya dari perbesaran terkecil hingga terbesar (Gandjar, 2000).

3.3.7 Peremajaan Mikroba Uji

Peremajaan Candida albicans dan Aspergillus niger diinokulasikan

masing-masing sebanyak satu ose ke medium agar miring PDA, Aspergillus niger

pada agar miring PDA diinkubasi selama 5 hari pada suhu 29ºC, sedangkan

Candida albicans pada agar miring PDA dieramkan selama 3 hari pada suhu

29ºC. Sedangkan peremajaan Bacillus subtillis, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa dan Staphylococcus aureus diinokulasikan masing-masing satu ose ke

dalam medium NA miring, kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu

37oC. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi steril di dalam laminar air flow

(Jauhari, 2010).

3.3.8 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Bakteri uji pada media agar miring NA yang telah diinkubasi selama 24

jam ditambahkan 5 mL NaCl 0,9% steril. Sebanyak 0,2 mL suspensi bakteri

masing-masing diinokulasikan ke dalam labu Erlenmeyer 250 ml yang berisi

media NB 200 mL. Selanjutnya media diinkubasi dalam shaker incubator dengan

kecepatan 120 rpm pada suhu 37oC. Pertumbuhan bakteri uji diamati dengan

mencuplik 1 mL suspensi bakteri setiap interval 1 jam dan mengukur

absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm dengan menggunakan

spektrofotometer UV-VIS. Dari hasil pengukuran tersebut dibuat kurva

pertumbuhan bakteri uji. Kurva pertumbuhan diakhiri setelah melewati fase

stasioner (Jauhari, 2010; Khotimah, 2010).

3.3.9 Pembuatan Inokulum Mikroba Uji

Suspensi bakteri dibuat dengan cara, masing-masing bakteri uji pada agar

miring NA yang telah diinkubasi selama 24 jam ditambahkan 5 mL NaCl 0.9%.

28


Kemudian 0,1 mL suspensi bakteri tersebut dimasukkan kedalam 10 mL media

NB dan diinkubasi dengan shaker incubator (120 rpm, suhu 37oC) sesuai dengan

fase log masing-masing bakteri. Selanjutnya, masing-masing suspensi bakteri uji

pada fase log diambil 0,1 mL lalu diratakan diatas medium NA yang telah

memadat (Xu, 2010). Media NA ini selanjutnya digunakan untuk seleksi dan

pengujian antimikroba.

Suspensi Candida albicans dibuat dengan cara, sebanyak satu ose biakan

Candida albicans yang berumur 3 hari dimasukkan kedalam 2 mL larutan NaCl

fisiologis 0,9% steril, kemudian dihomogenkan dengan vortex. Kekeruhannya

diseragamkan dengan menggunakan standar Mc Farland III yang setara dengan

9x108

CFU/mL. Selanjutnya, suspensi Candida albicans 109 diencerkan hingga

pengenceran 10000 kali sehingga diperoleh suspensi 105. Pengenceran dilakukan

dengan cara suspensi 109 dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi berisi 9 mL NaCl

0,9% sehingga diperoleh suspensi mikroba 108. Suspensi mikroba 10

8 dipipet 1

mL ke dalam tabung reaksi berisi 9 mL NaCl 0,9% sehingga diperoleh suspensi

mikroba 107. Demikian seterusnya hingga diperoleh suspensi Candida albicans

105 (Rachmayani, 2008). Suspensi Candida albicans 10

5 diambil 0,1 mL lalu

diratakan diatas medium PDA yang telah memadat (Xu, 2010). Media PDA ini

selanjutnya digunakan untuk seleksi dan pengujian antimikroba.

Untuk kapang Aspergillus niger suspensi dibuat dengan cara biakan

kapang pada medium PDA miring yang telah diinkubasi selama 7 hari pada suhu

29oC dimasukkan 1 mL akuadest steril, spora dikerik dengan ose dan dimasukkan

secara aseptis kedalam tabung reaksi yang berisi 9 mL akuadest streril, lalu

dihomogenkan dengan menggunakan vortex sehingga diperoleh suspensi spora

pengenceran 10-1

. Kemudian dlakukan pengenceran secara bertingkat sehingga

diperoleh pengenceran sampai 10-6

. Pengenceran dilakukan dengan cara suspensi

10-1

dipipet 1 mL ke dalam tabung reaksi berisi 9 mL akuadest streril sehingga

diperoleh suspensi mikroba 10-2

. Suspensi mikroba 10-2

dipipet 1 mL ke dalam

tabung reaksi berisi 9 mL akuadest streril sehingga diperoleh suspensi mikroba

10-3

. Demikian seterusnya hingga diperoleh suspensi mikroba 10-6

(Atika, 2007;

Handayani, 2007). Media PDA ini selanjutnya digunakan untuk seleksi dan

pengujian antimikroba.

29


3.3.10 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antimikroba

3.3.10.1 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antibakteri dan

Antikhamir

Seleksi kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri dan antikhamir

dilakukan dengan metode difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Methode). Isolat

murni kapang endofit yang telah dimurnikan pada media MEA diambil dengan

sedotan steril berdiameter 6 mm dan dipindahkan ke media NA yang telah

ditanami bakteri uji dan ke media PDA yang telah ditanami khamir uji. Satu

cawan petri media NA yang berisi bakteri uji dan media PDA yang berisi khamir

uji dapat ditanami potongan isolat murni kapang endofit sebanyak 6 isolat. Kultur

diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2 hari untuk kultur yang berisi bakteri uji dan

inkubasi pada suhu 29oC selama 2-3 hari untuk kultur yang berisi khamir uji.

Aktivitas antibakteri kapang endofit dilihat dari zona hambat yang terbentuk

(Elfina et al., 2014). Isolat yang menunjukkan zona hambat dipilih sebagai isolat

untuk pengujian selanjutnya yaitu fermentasi dan uji aktivitas antimikroba.

3.3.10.2 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antifungi

Seleksi kapang endofit yang berpotensi sebagai antifungi dilakukan

menggunakan uji antagonis kapang endofit terhadap Aspergillus niger dengan

metode oposisi langsung, yaitu dengan cara isolat murni kapang endofit yang

telah dimurnikan pada media MEA dan kultur kapang Aspergillus niger, masing-

masing diambil dengan sedotan steril berdiameter 6 mm, lalu dipindahkan ke

media PDA. Posisi isolat kapang endofit dan kapang Aspergillus niger diletakkan

secara yang berhadapan dengan jarak satu sama lain 3 cm pada cawan petri

berdiameter 9 cm. Selanjutnya media diinkubasi pada suhu 29oC sampai 7 hari

(Wulandari et al., 2014). Pengamatan daya hambat kapang endofit dilakukan

sejak 1 hari setelah inokulasi sampai 7 hari. Daya hambat kapang antagonis

diketahui dengan menghitung pertumbuhan koloni dengan menggunakan rumus :

30


Keterangan :

I = Persentase penghambatan.

R1 = Jari-jari koloni patogen yang arah pertumbuhannya menjauhi

koloni kapang endofit.

R2 = Jari-jari koloni patogen yang pertumbuhannya mendekati koloni

kapang endofit.

3.3.11 Fermentasi Kapang Endofit

Fermentasi kapang endofit dilakukan dengan fermentasi cair

menggunakan media Potato Dextrose Yeast (PDY) Broth. Koloni murni isolat

kapang endofit yang terseleksi diambil sebanyak 5 potongan biakan kapang

menggunakan sedotan steril lalu diinokulasikan ke dalam media fermentasi cair

PDY sebanyak 200 mL dalam labu Erlenmeyer ukuran 250 mL. Selanjutnya

media diinkubasi secara statis pada suhu kamar 29oC selama 14 hari (Noverita et

al., 2009).

3.3.12 Uji Aktivitas Antimikroba dari Supernatan Hasil Fermentasi Kapang

Endofit

Pengujian aktivitas antimikroba dari supernatan hasil fermentasi kapang

endofit dilakukan dengan metode Kirby-Bauer yang dikenal dengan sebutan

metode cakram kertas. Tiap-tiap cakram kertas steril berdiamter 6 mm ditetesi

dengan supernatan hasil fermentasi sebanyak 20 µL Cakram yang telah berisi

supernatan, kemudian didiamkan hingga kering sebelum diletakkan pada media

uji. Selanjutnya secara aseptik, setelah kertas cakram menyerap supernatan

tersebut, masing-masing kertas cakram diletakkan pada permukaan medium yang

telah berisi mikroba uji. Jumlah cakram kertas yang diletakkan dalam satu cawan

petri berisi 6-7 buah, dan masing-masing jarak antara cakram diatur supaya tidak

terlalu dekat (Noverita et al., 2009).

31


Sebagai kontrol positif untuk uji aktivitas antibakteri digunakan cakram

kloramfenikol dan sebagai kontrol positif untuk uji aktivitas antifungi digunakan

cakram nistatin. Sedangkan sebagai kontrol negatif digunakan cakram yang berisi

akuadest steril. Pengujian dilakukan dengan tiga kali pengulangan.

Media biakan uji diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.untuk uji

aktivitas antibakteri dan inkubasi selama 3-5 hari pada suhu 29oC untuk uji

aktivitas antifungi. Setelah diinkubasi, dilakukan pengukuran zona hambat yang

terbentuk menggunakan jangka sorong (Noverita et al., 2009).

32


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi Kapang Endofit

Pada penelitian ini berhasil diisolasi empat belas koloni kapang endofit

dari daun tanaman jamblang (Syzygium cumini L.). Keempat belas isolat kapang

endofit ini terdiri dari enam isolat kapang endofit dari daun hijau tua (DT1, DT2,

DT3, DT4, DT5, dan DT6) dan delapan isolat kapang endofit dari daun hijau

muda (DM1, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, DM7, dan DM8). Keempat belas

isolat kapang endofit ini dianggap sebagai kapang endofit bila memiliki ciri-ciri,

waktu tumbuh lebih dari 5 hari, tumbuh disekitar sampel daun yang ditanam dan

memiliki morfologi yang berbeda dari kapang yang tumbuh pada cawan petri

kontrol. Selain itu, untuk menentukan keempat belas endofit ini berbeda juga

dapat dilihat dari waktu pertumbuhannya. Hasil isolasi kapang endofit dapat

dilihat pada gambar 4.1 dan gambar 4.2.

Proses isolasi dilakukan menggunakan media MEA (Malt Extract Agar).

Media MEA merupakan media yang umum digunakan untuk isolasi, deteksi,

kultivasi dan enumerasi kapang maupun khamir (Galloway dan Burgess, 1952).

Media ini mengandung malt extract yang digunakan sebagai sumber nutrisi yang

menguntungkan untuk pertumbuhan dan metabolisme kapang maupun khamir,

serta memberikan lingkungan asam yang baik untuk menekan pertumbuhan

bakteri. Selain itu, media ini juga mengandung pepton mikologi yang berfungsi

sebagai sumber nitrogen sehingga memberikan pertumbuhan yang cepat pada

kapang maupun khamir serta memberikan morfologi dan pigmentasi yang khas.

Proses isolasi dimulai dengan melakukan sterilisasi permukaan terhadap

sampel daun yang akan digunakan. Sterilisasi permukaan bertujuan

mengeliminasi mikroorganisme epifit yang ada pada permukaan tanaman dengan

cairan desinfektan. Pada proses sterilisasi ini digunakan alkohol 70% dan NaOCl

5,25%. Mekanisme kerja dari alkohol adalah mendenaturasi protein dan

melarutkan lemak pada membran protein mikroba sehingga merusak membran sel

mikroba. Proses denaturasi tersebut memerlukan air sehingga alkohol 70% lebih

32

33


tinggi aktivitasnya daripada alkohol absolut (Siswandono, 1995). Kemampuan

alkohol untuk mensterilkan permukaan organ tanaman mempunyai spektrum yang

sempit. Oleh karena itu, biasanya dikombinaskan dengan desinfektan lain yaitu

NaOCl. NaOCl 5,25% merupakan desinfektan umum yang juga digunakan pada

proses sterilisasi permukaan (Stone et al., 2004). NaOCl bekerja mengoksidasi sel

mikroorganisme sehingga mengganggu reaksi enzimatis pada metabolisme

mikroorganisme (Volk dan Wheeler, 1988).

Kapang endofit yang telah tumbuh pada media isolasi MEA, kemudian

secara bertahap dimurnikan satu persatu ke dalam media MEA plate baru

sehingga didapat isolat murni kapang endofit. Pemurnian ini bertujuan untuk

memisahkan koloni endofit dengan morfologi yang berbeda untuk dijadikan isolat

tersendiri. Hal ini dilakukan terus-menerus sampai diperoleh koloni murni. Koloni

murni adalah koloni yang memiliki morfologi yang sama karena berasal dari

pembelahan satu sel (Waluyo, 2005).

Selanjutnya setiap isolat murni yang didapat dibuat duplo pada agar miring

dengan memindahkan miselium isolat kapang endofit ke medium agar miring

MEA dengan menggunakan ose. Masing-masing sebagai kultur stok (stock

culture) dan kultur untuk penelitian (working culture) dan diinkubasi pada suhu

29oC selama 5-7 hari sesuai dengan pertumbuhannya. Hasil stocking dan working

culture dapat dilihat pada gambar 4.3.

34


Isolasi Kapang Endofit pada Daun Hijau Tua

Hari ke-5

Cawan 1

Cawan 2

Cawan 3

Hari ke-7

Cawan 1

Cawan 2

Cawan 3

Hari ke-14

Cawan 1

Cawan 2

Cawan 3

Kontrol

Gambar 4.1 Isolasi kapang endofit pada daun hijau tua

35


Isolasi Kapang Endofit pada Daun Hijau Muda

Hari ke-5

Cawan 1

Cawan 2

Cawan 3

Hari ke-7

Cawan 1

Cawan 2

Cawan 3

Hari ke-14

Cawan 1

Cawan 2

Cawan 3

Kontrol

Gambar 4.2 Isolasi kapang endofit pada daun hijau muda

36


Gambar 4.3 Hasil stocking dan working culture isolat kapang endofit

4.2 Karakterisasi Kapang Endofit

Setelah didapat isolat murni kapang endofit selanjutnya masing-masing

isolat dikarakterisasi. Karakterisasi isolat kapang endofit dilakukan secara

makroskopik dan mikroskopik. Pengamatan makroskopik meliputi warna koloni,

warna sebalik koloni, tekstur, tepi koloni, zonasi, dan tetes eksudat (exudates

drops). Sedangkan pengamatan mikroskopik dilakukan dengan mewarnai hifa

kapang dengan methylene blue. Penggunaan methylene blue untuk memperjelas

bentuk morfologi kapang yang akan diamati dibawah mikroskop. Selain itu,

pewarna ini mengandung fenol sehingga dapat mengdeaktivasi enzim litik seluler

sehingga sel tidak mengalami lisis. Pengamatan mikroskopik ini meliputi ada atau

tidak adanya sekat pada hifa, pertumbuhan hifa, bentuk dan warna konidia.

Hasil karakterisasi kapang endofit berdasarkan ciri makroskopis dan

mikroskopis selanjutnya dibandingkan dengan petunjuk klasifikasi menurut

Barnet (1972) untuk diketahui genusnya. Namun, dikarenakan data yang

diperoleh tidak mencukupi, hal tersebut tidak dilakukan. Hasil karakterisasi isolat

kapang endofit adalah sebagai berikut.

37


1. Isolat DT1

Isolat DT1 memiliki warna hifa hijau gelap dengan hifa putih keabuan

dibagian tengah, warna sebalik hijau kehitaman, tekstur granular, tepi koloni tidak

rata seperti serabut, dan tidak mempunyai zonasi maupun tetes eksudat (Gambar

4.4). Pada pengamatan mikroskopik memperlihatkan hifa berseptat dengan

pertumbuhan hifa bercabang, konidia berbentuk batang pendek dan berwarna

hijau cerah (Gambar 4.5)

Tampak depan Tampak belakang

Mikroskop perbesaran 1000x

Gambar 4.4 Isolat DT1

Gambar 4.5 Pengamatan mikroskopik isolat DT1 perbesaran 1000x

38


2. Isolat DT2

Isolat DT2 memiliki warna hifa hijau kecoklatan, warna sebalik hijau

kehitaman, tekstur granular, tepi koloni tidak rata, dan tidak mempunyai zonasi

maupun tetes eksudat (Gambar 4.6). Pada pengamatan mikroskopik

memperlihatkan hifa tidak berseptat dengan pertumbuhan hifa bercabang dan

konidia berbentuk elips (Gambar 4.7).




39


3. Isolat DT3

Isolat DT3 memiliki warna hifa hitam, warna sebalik hijau kehitaman,

tekstur granular, tepi koloni tidak rata, mempunyai zonasi dan tidak terdapat tetes

eksudat (Gambar 4.8). Pada pengamatan mikroskopik memperlihatkan hifa

berseptat dengan pertumbuhan hifa bercabang (Gambar 4.9).




40


4. Isolat DT4

Isolat DT4 memiliki warna hifa hijau pudar dengan growing zone

berwarna putih kekuning, warna sebalik kuning kehijauan, tekstur granular, tepi

koloni tidak rata, tidak mempunyai zonasi dan tetes eksudat (Gambar 4.10). Pada

pengamatan mikroskopik memperlihatkan hifa berseptat dengan pertumbuhan

hifa bercabang (Gambar 4.11).

Tampak belakangTampak depanGambar 4.10 Isolat DT4


41


5. Isolat DT5

Isolat DT5 memiliki warna hifa putih kelabu, warna sebalik putih

kecoklatan pada bagian luar sedangkan ditengah hijau kecoklatan, tekstur seperti

beludru, tepi koloni bergelombang, tidak mempunyai zonasi dan tetes eksudat

(Gambar 4.12). Pada pengamatan mikroskopik memperlihatkan hifa berseptat

dengan pertumbuhan hifa bercabang (Gambar 4.13)

Tampak depan Tampak belakangGambar 4.12 Isolat DT5


42


6. Isolat DT6

Isolat DT6 memiliki warna hifa hijau tua kelabu, warna sebalik hijau

kehitaman dengan pingir putih kecoklatan, tekstur seperti beludru, tepi koloni

rata, tidak mempunyai zonasi dan tetes eksudat (Gambar 4.14). Pada pengamatan

mikroskopik memperlihatkan hifa tidak berseptat dengan pertumbuhan hifa

bercabang (Gambar 4.15). Isolat DT6 tumbuh pada hari ke-20 dari proses isolasi

kapang endofit.

Tampak depan Tampak belakangGambar 4.14 Isolat DT6


43


7. Isolat DM1

Isolat DM1 memiliki warna hifa hijau tua kehitaman, warna sebalik hijau

kehitaman dengan pingir putih, tekstur granular, tepi koloni tidak rata, tidak

mempunyai zonasi dan tetes eksudat (Gambar 4.16). Pada pengamatan

mikroskopik memperlihatkan hifa tidak berseptat dengan pertumbuhan hifa

bercabang (Gambar 4.17).

Tampak depan Tampak belakangGambar 4.16 Isolat DM1

Gambar 4.17 Pengamatan mikroskopik isolat DM1 perbesaran 1000x

44


8. Isolat DM2

Isolat DM2 memiliki warna hifa hijau tua kehitaman dengan pinggir

berwarna putih, warna sebalik hijau kehitaman dengan pingir kecoklatan, tekstur

granular, tepi koloni tidak rata, mempunyai zonasi dan terdapat tetes eksudat

berwana coklat (Gambar 4.18). Pada pengamatan mikroskopik memperlihatkan

hifa berseptat dengan pertumbuhan hifa bercabang (Gambar 4.19).



45


9. Isolat DM3

Isolat DM3 memiliki warna hifa kecoklatan, warna sebalik coklat

kehitaman, tekstur seperti beludru, tepi koloni rata, tidak mempunyai zonasi dan

tidak terdapat tetes eksudat (Gambar 4.20). Pada pengamatan mikroskopik

memperlihatkan hifa berseptat dengan pertumbuhan hifa bercabang dan konidia

berbentuk elips (Gambar 4.21).



46


10. Isolat DM4

Isolat DM4 memiliki warna hifa putih susu, warna sebalik putih keruh,

tekstur seperti kapas, tepi koloni rata, tidak mempunyai zonasi dan terdapat tetes

eksudat tidak berwarna atau bening (Gambar 4.22). Pada pengamatan

mikroskopik memperlihatkan hifa berseptat dengan pertumbuhan hifa bercabang

(Gambar 4.23).



47


11. Isolat DM5

Isolat DM5 memiliki warna hifa hijau kehitaman, warna sebalik hijau

kehitaman, tekstur granular, tepi koloni tidak rata, tidak mempunyai zonasi dan

tidak terdapat tetes eksudat (Gambar 4.24). Pada pengamatan mikroskopik

memperlihatkan hifa berseptat dengan pertumbuhan hifa bercabang (Gambar

4.25).



48


12. Isolat DM6

Isolat DM6 memiliki warna hifa hijau kelabu dan kecoklatan, warna

sebalik hijau kecoklatan dengan lingkar konsentris yang beraturan, tekstur seperti

kapas, tepi koloni rata, mempunyai zonasi dan terdapat tetes eksudat tidak

berwarna atau bening (Gambar 4.26). Pada pengamatan mikroskopik

memperlihatkan hifa berseptat dengan pertumbuhan hifa bercabang (Gambar

4.27).


Tampak depan Tampak belakangGambar 426 Isolat DM6

49


13. Isolat DM7

Isolat DM7 memiliki warna hifa hijau kehitaman, warna sebalik hijau

kehitaman, tekstur granular dan berserabut, tepi koloni tidak rata, tidak

mempunyai zonasi dan tidak terdapat tetes eksudat (Gambar 4.28). Pada

pengamatan mikroskopik memperlihatkan hifa berseptat dengan pertumbuhan hifa

bercabang (Gambar 4.29).


Gambar 4.29 Pengamatan mikroskopik isolat DTM7perbesaran 1000x

50


14. Isolat DM8

Isolat DM8 memiliki warna hifa abu kecoklatan, warna sebalik hitam

pekat, tekstur seperti wool, tepi koloni tidak rata, tidak mempunyai zonasi dan

terdapat tetes eksudat (Gambar 4.30). Pada pengamatan mikroskopik

memperlihatkan hifa berseptat dengan pertumbuhan hifa bercaban dan bentuk

konidia batang (Gambar 4.31).



51


4.3 Kemurnian Mikroba Uji

Mikroba uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri Gram

positif (Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Staphylococcus aureus ATCC 14028),

bakteri Gram negatif (Escherichia coli ATCC 35218 dan Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853), kapang (Aspergillus niger ATCC 16404), dan khamir

(Candida albicans ATCC 10231). Pengamatan kemurnian mikroba uji dilakukan

untuk memastikan bahwa mikroba uji yang digunakan merupakan mikroba uji

yang murni tanpa adanya kontaminasi. Pengamatan kemurnian mikroba uji ini

dilakukan dengan mengamati karakteristik secara makroskopis dan mikroskopis

mikroba uji. Hasil dari pengamatan kemurnian mikroba uji dapat dilihat pada

tabel 4.1, tabel 4.2, dan tabel 4.3.

Tabel 4.1 Hasil pengamatan makroskopik dan mikroskopik bakteri uji umur 24

jam pada medium NA dengan suhu 37oC

Bakteri Uji E. coli S. aureus P. aeruginosa B. subtillis

Makroskopik Keterangan

Warna koloni Putih Kuning

keemasan

Putih

kehijauan Putih keruh

Tepi koloni Utuh Utuh Utuh Berombak

Permukaan Halus buram Mengkilat halus Halus Halus

buram

Bentuk koloni Bulat Bulat Titik-titik titik-titik

Mikroskopik Keterangan

Bentuk sel Basil pendek Stafilokokus Basil Basil

panjang

Pewarnaan

Gram

Merah

Gram negatif

Ungu

Gram positif

Merah

Gram negatif

Ungu

Gram positif

52


Gambar 4.32 Hasil pengamatan mikroskopik bakteri uji dengan mikroskop

perbesaran 1000x : (a) E. coli; (b) S. aureus; (c) P. aeruginosa; (d) B. subtillis.

Tabel 4.2 Hasil pengamatan makroskopik dan mikroskopik Candida albicans

umur 2 hari pada medium PDA pada suhu 29oC.

Khamir uji Candida albicans

Makroskopik Keterangan Mikroskopik Keterangan

Warna koloni Putih Bentuk sel Oval

Permukaan Mengkilat Miselium Tidak ada

Tekstur Mentega

Tepi koloni Utuh

Profil koloni Mencembung

(b)(a)

(c) (d)

53


Gambar 4.33 Hasil pengamatan mikroskopik Candida albicans dengan mikroskop

perbesaran 1000x

Tabel 4.3 Hasil pengamatan makroskopik dan mikroskopik Aspergillus niger

umur 5 hari pada medium PDA suhu 29oC

Aspergillus niger

Makroskopik Keterangan Mikroskopik Keterangan

Warna koloni Hijau kehitaman Hifa Berseptat

Warna sebalik koloni Kuning kecoklatan Bentuk konidia Bulat

Tekstur Glanular

Exudate drops Ada

Zonasi Ada

Sporulasi Ada

Gambar 4.34 Hasil pengamatan mikroskopik Aspergillus niger dengan mikroskop

perbesaran 1000x.

54


4.4 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Pertumbuhan sel-sel bakteri dapat dihitung berdasarkan pertumbuhan

koloni bakteri. Hubungan antara jumlah sel bakteri dengan waktu pertumbuhan

bakteri dapat dinyatakan dalam kurva pertumbuhan bakteri. Kurva pertumbuhan

tersebut terbagi dalam beberapa fase, yaitu fase permulaan (fase lag), fase

pembiakan cepat (fase log), fase diperlambat (fase stasioner), dan fase kematian

(fase penurunan).

Fase lag merupakan masa adaptasi bakteri terhadap lingkungan yang baru

sehingga pertumbuhannya belum maksimal. Fase log atau fase logaritmik

merupakan masa pertumbuhan bakteri mencapai maksimum. Fase stasioner

merupakan masa pertumbuhan bakteri menjadi konstan atau horisontal karena

terjadinya keseimbangan antara jumlah sel bakteri yang membelah dengan jumlah

sel bakteri yang mati. Sedangkan fase kematian adalah fase yang ditandai dengan

kematian sel-sel bakteri karena sel-sel bakteri berhenti memperbanyak diri

(Spellman, 1999). Keempat fase pertumbuhan tersebut dapat diketahui dari

pengukuran turbiditas populasi bakteri pada kultur cair dengan menggunakan

spektrofotometer UV pada panjang gelombang 600 nm dengan melihat nilai

absorbansi yang dihasilkan (Sholikah, 2014). Data selengkapnya dapat dilihat

pada tabel 4.4.

Pembuatan kurva pertumbuhan ini bertujuan untuk mengetahui fase

logaritmik dari masing-masing bakteri uji. Fase logaritmik ini merupakan fase

yang cocok untuk pengujian antimikroba. Suatu zat antimikroba ketika akan diuji

aktivitas antimikrobanya, maka bakteri uji yang digunakan harus dalam keadaan

fase aktif pembelahan sel dengan laju yang konstan (Jauhari, 2010).

55


Tabel 4.4 Hasil pengukuran absorbansi bakteri uji pada pembuatan kurva

pertumbuhan

Waktu

(jam)

Absorbansi

E.coli P. aeruginosa S. aureus B.subtilis

0 0.007 0.006 0.001 0.002

1 0.012 0.009 0.005 0.002

2 0.055 0.011 0.014 0.006

3 0.203 0.016 0.066 0.009

4 0.402 0.038 0.198 0.021

5 0.542 0.086 0.404 0.065

6 0.624 0.222 0.821 0.163

7 0.689 0.341 1.022 0.294

8 0.806 0.446 1.142 0.434

9 0.884 0.732 1.191 0.633

10 1.056 0.750 1.485 0.474

11 1.160 0.763 1.479 0.621

12 1.470 0.167 1.769 0.830

13 1.647 0.132 2.122 0.855

14 1.895 0.092 1.946 1.132

15 1.973 0.087 2.083 0.156

16 2.053

1.839 1.776

17 2.086

1.911 1.893

18 2.072

1.956

19 2.058

1.978

20 2.057

1.946

21 2.033

1.981

22 2.033

1.958

23

1.944

56


Gambat 4.35 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Berdasarkan pada hasil kurva yang terbentuk, dapat diketahui bahwa

bakteri Escherichia coli mengalami fase lag pada jam ke-1 hingga jam ke-2, lalu

diikuti fase log pada jam ke-4 hingga jam ke-15 dan mulai mengalami fase

stasioner pada jam ke-17 hingga jam ke-22. Oleh karena itu untuk melakukan uji

antimikroba, maka bakteri Escherichia coli tersebut ditumbuhkan sampai jam ke-

15 (fase log).


bakteri Pseudomonas aeruginosa mengalami fase lag pada jam ke-1 hingga jam

ke-3, lalu diikuti fase log pada jam ke-5 hingga jam ke-9 dan mulai mengalami

fase stasioner pada jam ke-10 hingga jam ke-11. Oleh karena itu untuk melakukan

uji antimikroba, maka bakteri Pseudomonas aeruginosa tersebut ditumbuhkan

sampai jam ke-9 (fase log).


bakteri Staphylococcus aureus mengalami fase lag pada jam ke-1 hingga jam ke-

2, lalu diikuti fase log pada jam ke-3 hingga jam ke-9 dan mulai mengalami fase


antimikroba, maka bakteri Staphylococcus aureus tersebut ditumbuhkan sampai

jam ke-9 (fase log).


bakteri Bacillus subtilis mengalami fase lag pada jam ke-1 hingga jam ke-12, lalu

diikuti fase log pada jam ke-13 hingga jam ke-16 dan mulai mengalami fase

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Abs

orba

nsi

Waktu (jam)

E. coli P. aeruginosa S. aureus B. subtillis

57



antimikroba, maka bakteri Bacillus subtilis tersebut ditumbuhkan sampai jam ke-

16 (fase log).

Bakteri uji siap digunakan untuk uji antibakteri apabila OD (Optical

Density) telah mencapai 0,08-0,1 (setara 10 CFU/mL). Jika OD lebih besar dari

0,1 maka dilakukan pengenceran dengan menggunakan larutan NaCl fisiologis 0,9

% (Fitriyah et al., 2013).

Jadi, bakteri E. coli ditumbuhkan sampai jam ke-15, P. aeruginosa

ditumbuhkan sampai jam ke-9, S. aureus ditumbuhkan sampai jam ke-9, dan B.

subtilis ditumbuhkan sampai jam ke-16 (fase log) karena pada jam tersebut

masing-masing bakteri uji sedang aktif melakukan pembelahan sel dengan laju

yang konstan, aktivitas metabolik konstan serta keadaan pertumbuhan seimbang.

Kondisi tersebut merupakan kondisi yang tepat ketika bakteri uji tersebut akan

diuji dengan pengujian antimikroba.

4.5 Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antimikroba

Seleksi kapang endofit yang berpotensi sebagai antimikroba bertujuan

untuk menentukan kapang endofit yang akan dilanjutkan pada proses fermentasi

dan uji aktivitas antimikroba dari supernatan hasil fermentasi. Seleksi kapang

endofit yang berpotensi sebagai antimikroba dilakukan dengan metode difusi agar

padat untuk antibakteri dan antikhamir dan metode uji antagonis untuk antifungi.

Metode difusi agar didasarkan pada kemampuan senyawa antimikroba

pada isolat kapang endofit yang diuji untuk menghasilkan zona penghambatan

disekeliling potongan agar terhadap bakteri dan khamir uji (Nurainy et al, 2008).

Aktivitas antibakteri dan antikhamir dari kapang endofit dapat dilihat dari zona

hambat yang terbentuk. Data hasil pengukuran zona hambat kapang endofit

terhadap bakteri uji dan khamir uji dapat dilihat pada tabel 4.5.

58


Tabel 4.5 Hasil pengukuran zona hambat kapang endofit terhadap bakteri uji dan

khamir uji

Isolat

Zona Hambat Isolat Kapang Endofit (mm)

Escherichia

coli

Staphylococcus

aureus

Pseudomonas

aeruginosa

Bacillus

subtillis

Candida

albicans

DT1 6,2 7,2 - 6,35 -

DT2 7,0 7,9 6,57 6,9 -

DT3 6,2 7,25 - 6,2 -

DT4 6,55 6,7 6,3 6,2 -

DT5 6,9 7,7 6,33 6,8 -

DT6 - - - - -

DM1 - - - - -

DM2 - 6,2 - - -

DM3 7,0 - - - -

DM4 6,35 - - 6,26 -

DM5 6,2 6,5 6,2 6,3 -

DM6 6,65 - 6,32 - -

DM7 - - - - -

DM8 6,24 6,5 6,2 6,2 -

59


Gambar 4.36 Seleksi kapang endofit terhadap Escherichia coli

DT11

DT21

DT3

DT41

DT51

DT61

DT1

DT2

DT3

DT4

DT5

DM11

DM21

DM31

DM41

DM51

DM61

DM71

DM81

DM3

DM4

DM5

DM6

DM8

61


Gambar 4.38 Seleksi kapang endofit terhadap Pseudomonas aeruginosa

DT2

DT5

DT4

DT6

DT1

DT3

DT2

DT4

DT5

DM1

DM2

DM8

DM7

DM6

DM5DM4

DM3DM5

DM6

DM8

62


Gambar 4.39 Seleksi kapang endofit terhadap Bacillus subtillis

DT6

DT5

DT1

DT2

DT3

DT4

DT1

DT2

DT4

DT5

DT3

DM8

DM7

DM6

DM5 DM4

DM3

DM1

DM2 DM4

DM5

DM8

63


Gambar 4.40 Seleksi kapang endofit terhadap Candida albicans

DM8

DM6DM7

DM5

DT1

DT2

DT3

DT4

DT5

DT6

DM1

DM2DM3

64


Uji antagonis adalah uji untuk melihat aktifitas langsung terhadap

organisme uji dan menyeleksi isolat-isolat kapang endofit yang memiliki aktivitas

antimikroba terhadap jamur uji. Mekanisme antagonis pada mikroorganisme dapat

terjadi dalam tiga cara: parasitisme langsung, antibiosis dengan memproduksi

metabolit sekunder dan persainagan ruang serta nutrisi (Pradana et al., 2013).

Aktivitas antifungi dapat dilihat dari presentase penghambatan yang dihitung

berdasarkan rumus yang sebelumya telah disebutkan pada prosedur kerja.

Seleksi kapang endofit terhadap Aspergillus niger dilakukan terhadap

keempat belas isolat. Data presentase penghambatan kapang endofit terhadap

Aspergillus niger dapat dilihat pada tabel 4.6. Sebagai contoh gambar 4.40

merupakan hasil uji antagonis isolat kapang endofit DM8 terhadap Aspergillus

niger.

Gambar 4.41 Hasil uji antagonis isolat kapang endofit DM8 (B) terhadap Aspergillus niger (A).

Tampak depan Tampak depan

A AB B

65


Tabel 4.6 Data perhitugan presentase penghambatan isolat kapang endofit terhadap Aspergillus niger

Isolat R1 (mm) R2 (mm) I (%)DT1 10.20 9.20 9.80DT2 9.10 8.80 3.30DT3 9.70 7.80 19.59DT4 20.50 19.60 4.39DT5 29.20 29.00 0.68DT6 42.38 40.00 5.62DM1 30.60 25.40 16.99DM2 29.00 21.40 26.21DM3 12.20 11.20 8.20DM4 14.00 10.00 28.57DM5 31.00 30.00 3.23DM6 20.50 12.30 40.00DM7 22.25 21.60 2.92DM8 31.55 17.45 44.69

Gambar 4.42 Histogram persentase penghambatan kapang endofit

terhadap Aspergillus niger

66


Berdasarkan histogram (Gambar 4.41) menunjukkan persentase

pengahambatan oleh isolat kapang endofit terhadap Aspergillus niger sangat

bervariasi yaitu antara 0,68-44,69%. Penghambatan tertinggi terhadap

pertumbuhan koloni Aspergillus niger terdapat pada isolat kapang endofit DM8

yaitu sebesar 44,69% dan penghambatan terendah terjadi pada isolat DT5 yaitu

sebesar 0,68%.

Berdasarkan hasil seleksi, dari keempat belas isolat kapang endofit yang

menunjukan potensi sebagai antimikroba yaitu sebanyak 11 isolat kapang endofit.

Kesebelas isolat kapang endofit tersebut yaitu isolat DT1, DT2, DT3, DT4, DT5,

DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, dan DM8.

4.6 Fermentasi Kapang Endofit

Fermentasi merupakan suatu proses yang berkaitan dengan pembentukan

energi serta pembentukan metabolit yang berguna oleh biomassa mikroorganisme

(Stanbury, 1994). Fermentasi kapang endofit betujuan untuk menghasilkan sel

kapang endofit dalam jumlah banyak sehingga mengoptimalkan senyawa

metabolit yang dihasilkan. Pada penelitian ini proses fermentasi dilakukan pada

isolat kapang endofit terpilih yaitu isolat DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2,

DM3, DM4, DM5, DM6, dan DM8. Fermentasi dilakukan selama 14 hari dengan

metode statis. Pemilihan waktu panen setelah 14 hari dikarenakan beberapa

penelitian telah menunjukkan hari ke-14 merupakan waktu fermentasi yang

menghasilkan pertumbuhan dan produksi metabolit maksimum (Atika, 2007;

Mabrouk et al, 2008).

Media fermentasi yang digunakan adalah media PDY yang berupa media

cair. PDY mengandung potato dextrose broth sebagai sumber karbon dan yeast

extract sebagai sumber nitrogen. Proses fermentasi kapang endofit menggunakan

media cair karena fermentasi dengan media cair lebih efektif untuk memproduksi

biomassa (Pokhrel and Ohga, 2007) dan senyawa bioaktif dibandingkan

fermentasi dalam media padat (Yan et al., 2010).

Hasil yang didapatkan dari fermentasi isolat kapang endofit adalah

terbentuknya miselium isolat kapang endofit dan terjadinya perubahan warna

medium. Perubahan warna yang terjadi karena adanya proses fermentasi yang

68


4.6 Uji Aktivitas Antimikroba dari Supernatan Hasil Fermentasi Kapang

Endofit

Pengujian aktivitas antimikroba dari supernatan hasil fermentasi kapang

endofit dilakukan pada isolat DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4,

DM5, DM6, dan DM8 yang telah difermentasi selama 14 hari. Pengujian aktivitas

antimikroba dari supernatan hasil fermentasi kapang endofit dilakukan dengan

metode Kirby-Bauer atau yang lebih dikenal dengan sebutan metode cakram

kertas. Metode ini adalah metode yang paling sering digunakan karena

mempunyai keuntungan yaitu ekonomis, sederhana (mudah dibuat) dan

reproduksibel. Selain itu, metode ini juga merupakan prosedur yang paling sering

digunakan dan dianjurkan oleh WHO (World Health Organitation) dan NCCLS

(Nation Committee for Clinical Laboratory Standards) (Depkes RI, 1999).

Pada metode ini, larutan uji yaitu supernatan hasil fermentasi yang telah

diresapkan ke dalam kertas cakram ditempelkan pada media NA dan PDA yang

telah diinokulasikan suspensi mikroba uji. Setelah inkubasi, diameter zona

hambatan sekitar cakram dipergunakan untuk mengukur kekuatan hambatan isolat

kapang endofit terhadap mikroba uji. (Lay, 1994). Parameter yang digunakan

adalah zona bening. Zona bening adalah area bening disekeliling cakram kertas

sebagai indikasi tidak adanya atau terhambatnya pertumbuhan mikroorganisme

akibat ekskresi zat antimikroba oleh kompetitornya (Byod, 1995; Atlas and

Bartha, 1998). Diameter zona yang terbentuk termasuk cakram diukur dengan

menggunakan jangka sorong.

Kontrol positif yang digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri pada

penelitian ini adalah cakram kloramfenikol konsentrasi 30 µg/cakram dan kontrol

positif yang digunakan dalam pengujian aktivitas antifungi adalah cakram nistatin

konsentrasi 100 µg/cakram. Sedangkan kontrol negatif yang digunakan yaitu

akuadest steril yang diresapkan pada cakram dan dikeringkan.

Kloramfenikol adalah salah satu jenis antibiotika yang secara alami

diproduksi oleh Streptomyces venezuelae. Dipilihnya kloramfenikol karena

kloramfenikol bekerja pada spektrum luas, efektif baik terhadap Gram positif

maupun Gram negatif. Mekanisme kerja kloramfenikol melalui penghambatan

terhadap biosintesis protein pada siklus pemanjangan rantai asam amino, yaitu

69


dengan menghambat pembentukan ikatan peptida. Antibiotika ini mampu

mengikat subunit ribosom 50S sel mikroba target secara terpulihkan, akibatnya

terjadi hambatan pembentukan ikatan peptida dan biosintesis protein.

Kloramfenikol umumnya bersifat bakteriostatik, namun pada konsentrasi tinggi

dapat bersifat bakterisid terhadap bakteri-bakteri tertentu (Ganiswarna, 1995).

Kontrol positif yang menjadi pembanding dalam uji aktivitas antifungi ini

adalah nistatin. Nistatin merupakan suatu antibiotika yang dihasilkan oleh

Streptomyces noursei, berbau khas dan murah terurai dalam air atau plasma

(Bahry, B dan R. Setiabudy, 1995). Penggunaan nistatin sebagai kontrol positif

antifungi karena sifatnya yang dapat menghambat pertumbuhan kapang dan

khamir. Nistatin hanya akan diikat oleh kapang atau khamir yang sensitif.

Aktivitas antifungi tergantung dari adanya ikatan dengan sterol pada membran sel

kapang atau khamir, terutama ergosterol. Akibat terbentuk ikatan antara sterol dan

antibiotik ini terjadi perubahan permeabilitas membran sel sehingga sel akan

kehilangan berbagai molekul (Bahry, B dan R. Setiabudy, 1995).

Berdasarkan hasil uji aktivitas antimikroba dari supernatan hasil

fermentasi isolat kapang endofit selama 14 hari didapatkan 10 isolat yang aktif

terhadap Escherichia coli (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5,

dan DM6), 5 isolat yang aktif terhadap Staphylococcus aureus (DT1, DT2, DT3,

DM2, dan DM5). 5 isolat yang aktif terhadap Bacillus subtillis (DT1, DT2, DT3,

DT4, dan DT5), 2 isolat yang aktif terhadap Aspergillus niger (DM6 dan DM8),

dan tidak ada isolat yang aktif terhadap Pseudomonas aeruginosa maupun

Candida albicans. Data selengkapnya dapat dilihat pada tabel 4.7.

70


Tabel 4.7 Hasil pengukuran zona hambat dari supernatan hasil fermentasi isolat

kapang endofit.

Isolat

Zona Hambat dari Supernatan Hasil Fermentasi Isolat Kapang

Endofit (mm)

E.coli S.aureus P.aeruginosa B.subtillis C.albicans A.niger

DT1 6,43 6,3 - 6,5 - -

DT2 6,4 6,4 - 6,3 - -

DT3 6,5 6,33 - 6,35 - -

DT4 6,43 - - 6,45 - -

DT5 6,4 - - 6,75 - -

DM2 6,25 6,4 - - - -

DM3 6,5 - - - - -

DM4 6,3 - - - - -

DM5 6,3 6,4 - - - -

DM6 6,53 - - - - 9.3

DM8 - - - - - 8.4

K (-) - - - - - -

K (+) 8,9 24,5 11,6 19 30,7 22,65

Supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif terhadap Escherichia coli

yaitu DT1 (6,43 mm), DT2 (6,4 mm), DT3 (6,5 mm), DT4 (6,43 mm), DT5 (6,4

mm), DM2 (6,25 mm), DM3 (6,5 mm), DM4 (6,3 mm), DM5 (6,3 mm), dan DM6

(6,53 mm) (Gambar 4.44). Supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif

terhadap Staphylococcus aureus yaitu DT1 (6,3 mm), DT2 (6,4 mm), DT3 (6,33

mm), DM2 (6,4 mm), dan DM5 (6,4 mm) (Gambar 4.45). Supernatan dari isolat

kapang endofit yang aktif terhadap Bacillus subtillis yaitu DT1 (6,5 mm), DT2

(6,3 mm), DT3 (6,35 mm), DT4 (6,45 mm), dan DT5 (6,75 mm) (Gambar 4.46).

Supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif terhadap Aspergillus niger yaitu

DM6 (9,3 mm) dan DM (8,4 mm) (Gambar 4.47). Tidak ada supernatan dari isolat

kapang endofit yang aktif terhadap Pseudomonas aeruginosa (Gambar 4.48).

maupun Candida albicans (Gambar 4.49).

71


Gambar 4.43 Hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil fermentasi

kapang endofit terhadap Escherichia coli

DM2 DM3 DM4 DM5 DM6 Kontrol (+)Kloramfenikol

DT1 DT2 DT3 DT4 DT5 Kontrol (-)

72



kapang endofit terhadap Staphylococcus aureus

DT1 DT2 DT3 DM2

DM5 Kontrol (+)Kloramfenikol

Kontrol (-)

73



kapang endofit terhadap Bacillus subtillis

DT1 DT2 DT3 DT4

DT5 Kontrol (+)Kloramfenikol

Kontrol (-)

74


Gambar 4.46 Hasil uji aktivitas antifungi dari supernatan hasil fermentasi kapang

endofit terhadap Aspergillus niger

DM6 DM8 Kontrol (+)Nistatin

Kontrol (-)

75



kapang endofit terhadap Pseudomonas aeruginosa

Gambar 4.48 Hasil uji aktivitas antikhamir dari supernatan hasil fermentasi

kapang endofit terhadap Candida albicans

76


Adanya perbedaan hasil dimana isolat kapang endofit tidak menghasilkan

zona hambat pada uji aktivitas antimikroba dari supernatan hasil fermentasi

sementara menghasilkan zona hambat pada seleksi dapat disebabkan karena

senyawa metabolit sekunder yang terkandung didalam isolat kapang endofit tidak

tersari dalam pelarut air sehingga tidak mampu menghambat pertumbuhan

mikroba uji. Metabolit sekunder yang diduga mempunyai aktivitas antimikroba

yang terdapat dalam supernatan hasil fermentasi (filtrat ekstraseluler) seperti

flavonoid, terpenoid, alkaloid, tannin, saponin, dan glikosida (Govindappa et al.,

2011, Dhankat et al., 2012, dan Bahgat et al., 2014). Oleh karena itu, perlu

dilakukan ekstraksi dengan menggunakan pelarut organik dengan tingkat

kepolaran tertentu.

77


BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, diperoleh kesimpulan

sebagai berikut :

1. Kapang endofit berhasil diisolasi dari daun jamblang (Syzygium cumini L),

sebanyak 14 isolat, yaitu terdiri dari 6 isolat kapang endofit dari daun hijau tua

(DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, dan DT6) dan 8 isolat kapang endofit dari daun

hijau muda (DM1, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, DM7, dan DM8).

2. Hasil seleksi kapang endofit yang berpotensi sebagai antimikroba sebanyak 11

isolat, yaitu isolat DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5,

DM6, dan DM8.

3. Hasil uji aktivitas antimikroba dari supernatan hasil fermentasi isolat kapang

endofit selama 14 hari didapatkan 10 isolat yang aktif terhadap Escherichia

coli (DT1, DT2, DT3, DT4, DT5, DM2, DM3, DM4, DM5, dan DM6), 5

isolat yang aktif terhadap Staphylococcus aureus (DT1, DT2, DT3, DM2, dan

DM5). 5 isolat yang aktif terhadap Bacillus subtillis (DT1, DT2, DT3, DT4,

dan DT5), 2 isolat yang aktif terhadap Aspergillus niger (DM6 dan DM8), dan

tidak ada isolat yang aktif terhadap Pseudomonas aeruginosa maupun

Candida albicans.

5.2 Saran

Berdasarkan dari hasil penelitian dapat dikemukakan bebera saran, yaitu :

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi jenis kapang

endofit yang berhasil diisolasi dari daun Syzygium cumini L

2. Diperlukan penelitian lanjutan untuk mengetahui senyawa yang terdapat

dalam isolat kapang endofit yang berhasil diisolasi dari daun Syzygium cumini

L , khusunya isolat yang memiliki aktivitas antimikroba.

77

78


DAFTAR PUSTAKA

Altahi, Abdulla D. 2009. Plasmid Profiles, Antibiotic, and Heavy Metal

Resistance Incidence of Endophytic Bacteria Isolated from Grapevine

(Vitis vinivera L.). African Journal of Biotechnolog, 8:5873-5882.

Andra. 2007. Aspergilosis: Medikamentosa. http://www.majalahfarmacia.

com/rubrik/one_news_print.asp?IDNews=431. 19 Desember 2014, pk.

14.33 WIB.

Arifin et al. 2006. Standarisasi Ekstrak Etanol Daun Eugenia cumini Merr. J.

Sains Tek Farmasi.

Atika, Dian. 2007. “Uji Aktivitas Antimikroba Hasil Fermentasi Kapng Endofit

yang Diisolasi dai Akar, Batang, Daun Tanaman Garcinia fructiosa

Lauterb dan Garcinia lateriflora Blume Serta Akar dan Daun Tanaman

Garcinia cowa Roxb”. Skripsi Sarjana Farmasi. Depok : FMIPA

Universitas Indonesia.

Atlas, R.M. dan R. Bartha. 1998. Microbial Ecology Fundamentals and

Applications. California : Benjamin Cummings Publishing Company Inc.

Bacon, C.W. 1985. A Chemically Defined Medium for The Growth and Synthetis

of Ergot Alkaloids by the spesies of Balansia. Mycologia. 77:418-423.

Bacon, C.W. dan M.R. Siegel. 1990. Isolation of Biotechnological Organism from

Nature. USA : McGraw-Hill.. Hlm.259-279.

Bahgat. MagdyMohsen Mohammed et al. 2014. Characterization of Endophytic

Bacteria Isolated from the Medicinal Plant Capparissinaica Veill. And

Analyze its Bioactive Flavonoid. Botany Research Paper. Vol.4.11.

Baliga, Manjeshwar Shrinathet et al. 2011. Phytochemistry, Traditional Uses and

Pharmacology of Eugenia jambolana Lam. (Black Plum): A Review.

Elsevier Ltd. Food Research International. 44:1776–1789.

Bills, G.F. dan J.D. Polyshook. 1992. Recovery of Endophytic Fungi from

Chamaechyparis tyoides. Sydowia, 44:1-12.

Brunton, L.L., Lazo, J.S., dan Parker, K.L. 2006. Goodman & Gilman’s The

Pharmacological Basis of Therapeutics. Ed 11. New York : McGraw

Hill.

Byod, R.F. 1995. Basic Medical Microbiology. 5 Ed. Boston : Little Brown

Company Inc.

David dan Stout. 1971. Disc Plate Method of Microbiological Antibiotic Essay.

Journal of Microbioogy Vol.22, No.4.

Dep Kes RI. 1999. Good Laboratory Practices. Dep Kes RI. Jakarta.

Deus B., dan M.H. Zenk. 1982. Exploitation of Plant Cells for The Production

of Natural Compounds. Biotechnol Bioeng. 24:1965-1974.

Dhankar, Seema et al. 2012. Antioxidant Activity OF Fungal Endophhytes

Isolated from Salvadora Oleoides decne. International Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. Vol.4. Issue.2.

Elfina, Dewi, Atria Martina, dan Rodesia Mustika. 2014. Isolasi dan Karakterisasi

Fungi Endofit dari Kulit Buah Manggis (Garcinia Mangostana L.)

Sebagai Antimikroba Terhadap Candida albicans, Staphylococcus aureus,

dan Escherichia coli. FMIPA-UR.

http://www.majalahfarmacia/

79


Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta : PT Raja Grafindo

Persada.

Fisher, P.J., Anson, dan Petrini. 1989. Antibiotic Activity of Some Endophytic

Fungi From Ericaceous Plant. Bot. Helv. 94:249-253.

Frazier, Roza W. C. dan D. C. Westhoff. 1988. Food Microbiology. 4th ed. New

York :McGraw Hill Publ. Co. Ltd.

Galloway, L.D., dan Burgess R. 1952. Applied Mycology and Bacteriology 3rd

Edition. London : Leonard Hill. Hlm.54-57.

Gandahusada, S., Ilahude H.D., dan Pribadi W. 1998. Parasitologi Kedokteran.

Jakarta : Balai Penerbit FKUI.

Gandjar, I. 2000. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta: Yayasan Obor

Indonesia. Hlm.2-7.

Ganiswarna, S.G. et al. 1995. Farmakologi dan Terapi. Ed.IV. Jakarta : Gaya

Baru.

Govindappa, M. et al. 2011. Phytochemical Screening, Antimicrobial and in vitro

Anti-inflammatory Activity of Endophytic Extracts from Loranthus sp.

Pharmacognosy Journal. Vol.3.25:82-90.

Handayani, 2007. “Skrining Kapang Endofit Sebagai Penghasil Antimikroba dari

Batang Tanaman Garcinia tetrandra Pierre. Terhadap Beberapa Mikroba

Patogen”. Skripsi. Sarjana Farmasi. Depok : FMIPA Universitas

Indonesia.

Jauhari, Lendra Tantowi. 2010. “Seleksi dan Identifikasi Kapang Endofit

Penghasil Antimikroba Penghambat Pertumbuhan Mikroba Patogen”.

Skripsi. Jakarta: Program Studi Sarjana Biologi. Fakultas Sains dan

Teknologi. Universitas Islam Syarif Hidayatullah.

Kumala, S., Syarmalina dan A. R. Handayani. 2006. Isolasi dan Uji Antimikroba

Substansi Bioaktif Mikroba Endofit Ranting Tanaman Johar (Cassia

siamea Lamk.). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 4:.8-14.

Kumar, Surinder, 2012. Textbook of Microbiology. New Delhi : Jaypee Brothers

Medical Publishers (P) Ltd.

Kurtzman, C. P dan J. W. Fell. 1998. The Yeast, a Taxonomic Study. 4th

Ed.

Elsevier, Amsterdam.

Labeda, D.P. 1990. Isolation Biotechnologic Organisme from Nature. New York :

McGraw-Hill Publishing Company.

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada:

Jakarta.

Lim. T. K. 2012. Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants, Vol. 3, Fruits.

London, New York : Springer Dordrecht Heidelberg.

Mabrouk et al. 2008. Production of Some Biologically Active Secondary

Metabolites from Marine Derived Fungus Varicosporina ramulosa.

Malaysian Journal of Microbiology. Vol 4(1):14-24

Mudiana, Deden. 2006. Perkecambahan Syzygium cumini (L.) Skeels.

Biodiversitas Vol.8, No.1, LIPI. Bogor.

National Communittee for Clinical Laboratory Standar. 1990. Method for Dilution

Antimicrobial Susceptibility Test for Bacteria that Grow Aerobically.

Noverita, Dinah Fitria, dan Ernawati Sinaga. 2009. Isolasi dan Uji Aktivitas

Antibakteri Jamur Endofit dari Daun dan Rimpang Zingiber ottensii.

Jurnal Farmasi Indonesia Vol. 4 No. 4:171 -176.

80


Nurainy et al. 2008. Pengaruh Konsentrasi Kitosan terhadap Aktivitas Antibakteri

dengan Metode Difusi Agar (Sumur). Jurnal Teknologi Industri dan Hasil

Pertanian. Volume 13, No. 2.

Prabhakaran, Shylaja et al. 2011. Phytochemical and antimicrobial properties of

Syzygium cumini an ethanomedicinal plant of Javadhu hills. Research in

Pharmacy. 1(1):22-32.

Pradana, G. S et al. 2013. Exploration of Antagonistic and Pathogenic Fungi on

Apple Tree in Apple Trial Field in Poncokusumo. Biotropika. 1(1): 14-18.

Prasetyoputri, A dan I. Atmosukarto. 2006. Mikroba Endofit Sumber Acuan Baru

yang Berpotensi. BioTrends. Vol.I No. 2. Cibinong : Pusat Penelitian

Bioteknologi-LIPI,.

Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.

Prihatiningtias, W. 2005. “Senyawa Bioaktif Fungi Endofit Akar Kuning

(Fibraurea chloroleuca Miers) Sebagai Senyawa Antimikroba” Tesis.

Sekolah Pascasarjana UGM.

Prihatiningtiyas, W dan M.S.H. Wahyuningsih. 2006. Prospek Mikroba Endofit

Sebagai Sumber Senyawa Bioaktif. Artikel.

Rachmayani, Renita. 2008. “Skrining Kapang Endofit Penghasil Antimikroba dan

Antioksidan dari Ranting dan Daun Tanaman Garcinia mangostana”.

Skripsi. Depok: Program Studi Farmasi. Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam. Universitas Indonesia.

Radji, Maksum. 2005 Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit Dalam

Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. 11:113-126.

Ramadhan, M. Gama. 2011. “Skrining dan Uji Aktivitas Penghambatan α

Glukosidase dari Kapang Endofit Daun Johar (Cassia siamea Lamk.)”.

Skripsi. Depok: Program Studi Sarjana Farmasi. Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Indonesia.

Rante, Herlina, Burhanuddin Taebe dan Soendaria Intan. 2013. Isolasi Fungi

Endofit Penghasil Senyawa Antimikroba dari Daun Cabai Kotokkon

(Capsicum annum L var. chinensis) dan Profil KLT Bioautografi.

Majalah Farmasi dan Farmakologi. Vol. 17, No.2. Hlm. 39-46.

Reddy, L.J., dan Beena Jose. 2013. Evaluation of Antibacterial and DPPH Radical

Scavenging Activities of the Leaf Extracts and Leaf Essential oil of

Syzygium cumini L. from South India. International Journal of Pharmacy

and Pharmaceutical Sciences. Vol 5, Suppl 3. 358-361.

Rosamma M.K. 2002. “Studies on biological activity and constituents of essential

oils”. Tesis. Department of Chemistry, University of Calicut.

Ross, Ivan. A. 2003. Medicinal Plants of the World. Vol. 1: Chemical

Constituents, Traditional and Modern Medicinal Uses 2nd ed. Totowa,

NJ : Humana Press Inc.

Rustanti, Mirna. 2007. “Isolasi dan Seleksi Kapang Endofit Penghasil

Antimikroba pada Akar Tanaman Sesoot (Garcinia picrorrhiza Miq.)”.

Skripsi. Depok : Program Studi Sarjana Farmasi. Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Indonesia.

Shafi, P.M et al. 2002. Antibacterial Activity of Syzygium cumini and Syzygium

travancoricum leaf essential oils. Fitoterapia 73(5): 414–416.

81


Sinaga E, Noverita, Fitria D. Daya Antibakteri Jamur Endofit yang Diisolasi dari

Daun dan Rimpang Lengkuas (Alpinia galanga Sw.). Jurnal Farmasi

Indonesia. 2009;4:161-162.

Siswandono, Soekardjo B. 1995. Kimia Medisinal. Surabaya : Airlangga

University Press. Hlm.351-406.

Soni, Himesh et al. Pharmacognostic Studies of the Leaves of Syzygium cumini

Linn. International Journal of Research in Pharmaceutical and

Biomedical Sciences. India. 4:507-509.

Spellman, Frank R. 1999. Microbiology for Water/Wastewater Operators. USA :

Technomic Publishing Company Inc.

Stanbury, P. F., A. Whitaker dan S. J. Hall. 1994. Principles of Fermentation

Technology. Burlington : Elsevier Science Ltd.

Stafford A., P. Morris, dan M. W. Fowler. 1986. Plant Cell Biotchnology: A

Perspective. Enzyme Microbial Tech. 8: 578-597.

Stone, J. K., J. D. Polishook dan J. F. White Jr. 2004. Endophytic Fungi. Dalam

M. S. Foster, G. F.

Strobel, G. A. 2002. Microbial Gift from Rain Forest. Can J Plant Pathol.

24:14-20.

Strobel, G.A. 2003. Endophytes as Sources of Bioactive Products. Microbes

Infect. pp.11.

Strobel, Gary dan Bryn Daisy. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes

and Their Natural Product, Microbiology and Molecular Biology Review.

67:491-502.

Sudantha, I. M. dan Abadi, A. L. 2007. Identification of Endophytic Fungi and

Their Anatgonistic Mechanism Against Fusarium oxysporum sp.

Vanillae in Vanilla Tree. Jurnal Agroteksos. 17(1):23-38.

Sundari, 2012. Suatu Model Pengembangan Media Pembelajaran Slide Culture

Untuk Pengamatan Struktur Mikroskopik Kapang Pada Matakuliah

Mycologi. Jurnal Bioedukasi Vol 1 No.1. FKIP Universitas Khairun

Volk, W. A., dan Wheeler, M.F.. 1988. Mikrobiologi Dasar. Terjemahan

Soenarto. Jakarta : Erlangga.

Wahyudi, P. 1998. Mikroba Endofitik Sebagai Penghasil Materi yang

Bermanfaat. Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi. 98:1-9.

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Lingkungan. Malang : Universitas

Muhammadiyah Malang Press..

Xu, J. 2010. Secondary Metabolites from the Endophytic Fungus Pestalotiopsis

sp. JCM2A4 and Its Microbe Host Relationship with The Mangrove Plant

Rhizophora mucronat.

Tim Mikrobiologi. 2003. Bakteriologi Medik. Malang : Bayumedia Publishing.

Vega, et al. 2005. Endophytic Bacteria in Coffea Arabica L. J. Basic Microbiol.

45:371-380.

Wulandari. D, Liliek Sulistyowati, dan Anton Muhibuddin. 2014.

Keanekaragaman Jamur Endofit Pada Tanaman Tomat. Jurnal HPT.

Volume 2 No.1,

Yadav, et al. 2014. Evaluation of In Vitro Antimicrobial Potential of Endophytic

Fungi Isolated From Eugenia jambolana Lam. International Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. Vol 6:208-211.

82


Yulia, P.R. 2005. “Isolasi dan Seleksi Kapang Endofit Penghasil Antimikroba

pada Beberapa Tanaman Obat Tradisional Indoneisa”. Skripsi. Depok:

Universitas Indonesia.

Zinnieal, et al. 2002. Isolation and Characterization of Endophytic Colonizing

Bacteria from Agronomic Crops and Prairie Plants. Applied and

Enviromental Microbiology. 68:2198-2208.

83


LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.)

84


Lampiran 2. Alur Penelitian

Sampling TanamanDaun Jamblang (Syzygium cumini L.)

Isolasi Kapang Endofit

Pemurnian Kapang Endofit

Karakterisasi Kapang Endofit

Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antimikroba

Fermentasi Kapang Endofit

Uji Aktivitas Antimikroba dari Supernatan Hasil Fermentasi Kapang Endofit

85


Lampiran 3. Skema Kerja Isolasi Kapang Endofit

Bilas dengan akuadest steril selama 5 detik

Keringkan diatas kertas saing

Dipotong 1x1 cm2

Triplo Berisi bilasan akuadest

Di kerjakan di LAF

(Laminar air flow)kondisi aseptik

Rendam dalam etanol 70% selama 1 menit

Rendam dalam NaOCl 5,25% selama 5 menit

Rendam dalam etanol 70% selama 30 detik

Inkubasi suhu 29oCselama 5-21 hari

Pemurnian Kapang Endofit

10 menit

86


Lampiran 4. Skema Kerja Pemurnian Kapang Endofit

Dimurnikan satu persatu

Kapang endofit yang telah tumbuh pada

media isolasi MEA,

Diamati morfologinya dan diinkubasi selama 5-7hari. Apabila masih ditemukan pertumbuhan koloni

yang berbeda secara makroskopik maka harus dipisahkan kembali sampai diperoleh isolat murni.

Working culture Stock culture

Diinkubasi selama 5-7 hari pada suhu kamar 29oC

88


Lampiran 6. Identifikasi Kemurnian Mikroba Uji

1. Identifikasi Kemurnian Bakteri Uji Pengamatan Makroskopik

Pengamatan Mikroskopik


Pengamatan Warna koloni Tepi koloni Permukaan koloni Bentuk koloni

Bakteri uji yang berusia 24 jam

FiksasiCristal violet

selama 1 menit

Bilas air mengalir

Keringkan

Bilas air mengalir

Bilas air mengalir

Bilas air mengalir

Alkoholselama 1 menit

Lugol selama 1 menit

Safranin selama 1 menit

1 ose bakteri + NaCL fisiologis

89


Lampiran 6. Identifikasi Kemurnian Mikroba Uji (Lanjutan)

2. Identifikasi Kemurnian Jamur Uji

Pengamatan Makroskopik


Lampiran 7. Skema Kerja Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Jamur uji yang berusia 3-5 hari

Pengamatan A.niger :Warna permukaan koloni, warna sebalik koloni, tekstur koloni, zonasi, sporulasi, dan tetes eksudat.

Pengamatan C.albicans :warna koloni, tekstur koloni, permukaan koloni, profil koloni, dan tepi koloni

Inkubasi dalam shaker incubator dengan

kecepatan 120 rpm pada suhu 37oC

Bakteri uji + 5 mL NaCL 0,9% steril

0,2 mL

Bakteri uji + 5 mL Media NB 200 mL

Ukur absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm.

Setiap interval 1 jam

Diakhiri setelah melewati fase stasioner

90


Lampiran 8. Pembuatan Suspensi Mikroba Uji

1. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

2. Pembuatan Suspensi Candida albicans

1 mL

Biakan C.albicans yang berumur 3 hari

Mc Farland III109

108 107

100 µL

Masukkan beberapa sengkelit ke dalam 2 mL NaCl-fisiologis

Pipet 1ml ke 9 ml

NaCl-fisiologis

Media PDA

Samakan Kekeruhan

1 mL

Di ratakan dengan batang Drigalski

106 105

1 mL

Bakteri uji + 5 mL NaCL 0,9% steril

0,1 mL

Media NB10 mL

Inkubasi dalam shaker incubator dengan

kecepatan 120 rpm pada suhu 37oC, sesuai fase

log masing-masing bakteri uji

100 µL

Media NA

91


Lampiran 8. Pembuatan Suspensi Mikroba Uji (Lanjutan)

3. Pembuatan Suspensi Aspergillus niger

100 µL

10-3 10-4 10-5 10-6

1 mL

1 mL 1 mL

1 mL

1 mL 1 mL

1 mL

Pipet 1 ml ke 9 ml akuadest steril

Biakan A.nigeryang berumur 5

hari + 1 mL akuadest steril

10-1 10-2

Media PDA

92


Lampiran 9. Skema Kerja Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antimikroba

1. Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antibakteri dan Antikhamir

2. Seleksi Kapang Endofit yang Berpotensi Sebagai Antifungi

Diinokulasikan ke dalam medium PDA

pada waktu bersamaan

Isolat murnikapang endofit

Aspergillus niger

Inkubasi suhu 29oC. sampai dengan patogen tumbuh memenuhi cawan Petri

Keterangan :I = Persentase penghambatan. R1 = Jari-jari koloni patogen yang

arah pertumbuhannya menjauhi koloni kapang endofit.

R2 = Jari-jari koloni patogen yang pertumbuhannya mendekati koloni kapang endofit.

Isolat murni kapang endofit

dalam MEA

Diambil dengan sedotan steril berdiameter 6 mm

Dipindahkan ke media NA yang telah ditanami

bakteri uji.

Diinkubasi pada suhu 29oC. selama 4hari. Aktivitas antibakteri kapang

endofit dilihat dari zona hambat yang terbentuk

93


Lampiran 10. Skema Kerja Fermentasi Kapang Endofit

Diambil 5 potongan agar dengan sedotan steril Dimasukkan ke dalam

media PDY cair 200 mL

Isolat kapang endofit yang terseleksi

Inkubasi pada suhu 29oC selama 14 hari

Sentrifuse 3000 rpm selama 20 menit

SupernatanLarutan Uji

10 mL

Biomasa

94


Lampiran 11. Skema Kerja Pengujian Aktivitas Antimikroba dari Hasil Fermentasi Isolat Kapang Endofit

amoksisilin. Sebanyak 20 µl larutan amoksisilin konsentrasi 2 mg/ml

SupernatanLarutan Uji

Resapkan masing-masing 20 µL pada kertas cakram steril

Setiap cawan berisi cakram larutan uji, cakram kontrol positif dan cakram kontrol negatif.

cakram larutan ujicakram kontrol positif (kloramfenikol untuk uji antibakteri) (nistatin

untuk uji antifungi)cakram kontrol negatif (akuadest steril)

Media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.untuk uji aktivitas antibakteri dan inkubasi selama 3-5 hari pada suhu 29oC untuk uji aktivitas antifungi.Zona hambatan yang terbentuk diukur diameternya dengan jangka sorong

Cakram diletakkan pada media NA dan PDA yang sudah berisi mikroba uji

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA -...

Documents

Transcript of UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA -...