TRANSFORMASI GENETIK TANAMAN KENTANG (Solanumtuberosum L.) KULTIVAR JALA IPAM DENGAN GEN Hd3a

WIWIN WIDIARTI

SEKOLAH PASCASARJANAINSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Transformasi GenetikTanaman Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Jala Ipam dengan Gen Hd3aadalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum diajukandalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yangberasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan daripenulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka dibagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepadaInstitut Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2016

Wiwin Widiarti NIM P051124011

RINGKASAN

WIWIN WIDIARTI. Transformasi Genetik Tanaman Kentang (Solanumtuberosum L.) Kultivar Jala Ipam dengan Gen Hd3a. Dibimbing olehSUHARSONO dan GUSTAAF ADOLF WATTIMENA.

Kentang merupakan salah satu bahan pangan yang dapat dimanfaatkansebagai pangan tanpa diproses dan pangan olahan. Kentang French fries bekumerupakan kentang olahan yang sangat penting. Produksi kentang untuk Frenchfries beku masih sedikit, sehingga peningkatan produksi bibit dan perakitankultivar baru menjadi penting untuk dilakukan. Jala Ipam merupakan kultivarkentang yang cocok untuk produksi French fries beku. Rekayasa genetik dengangen Hd3a dapat memperbaiki produktivitas kultivar ini. Hd3a merupakan mobileflorigen pada tanaman padi yang mempunyai homologi dengan FT (floweringlocus T) dari Arabidopsis. Ekspresi berlebih gen Hd3a menginduksi pembungaandan pengumbian pada kentang cv. Andigena transgenik. Penelitian ini bertujuanuntuk melakukan transformasi genetik kentang Jala Ipam dengan gen Hd3a.

Transformasi genetik dilakukan dengan perantara Agrobacteriumtumefaciens strain LBA4404 yang membawa plasmid p2K1-Hd3a yangmengandung gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC dan A. tumefaciens yangmembawa plasmid pCambia1300-Hd3a yang mengandung gen Hd3a di bawahkendali promoter 35S CaMV. Ruas batang (internode) digunakan sebagai eksplanyang ditransformasi. Eksplan mulai membentuk kalus 2 minggu setelahkokultivasi. Efisiensi transformasi pada penelitian ini adalah sebesar 18% untuktanaman yang ditransformasi dengan p2K1-Hd3a dan 7% untuk tanaman yangditransformasi dengan pC1300-Hd3a.

Analisis molekuler dengan PCR dilakukan untuk mengetahui integrasi genHd3a di dalam tanaman transgenik. PCR dilakukan dengan menggunakanpasangan primer rolC-F dan Hd3a-FP-R untuk tanaman transgenik putatif yangdihasilkan dari transformasi menggunakan plasmid p2K1-Hd3a dan pasanganprimer 35S-F dan Hd-R untuk tanaman transgenik putatif yang dihasilkan daritransformasi menggunakan plasmid pC1300-Hd3a. Analisis PCR menunjukkanbahwa dua dari tiga tanaman transgenik putatif adalah tanaman transgenik yangmengandung gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC dan keempat tanamantransgenik putatif semuanya adalah tanaman transgenik yang mengandung genHd3a di bawah kendali promoter 35S CaMV. Hasil ini menunjukkan bahwaproses transformasi genetik kentang kultivar Jala Ipam dengan gen Hd3a telahberhasil dengan baik.

Kata kunci: Kentang kultivar Jala Ipam, gen Hd3a, Agrobacterium tumefaciens,promoter rolC, promoter 35S CaMV

SUMMARY

WIWIN WIDIARTI. Genetic transformation of potato (Solanum tuberosum L.) cvJala Ipam by using Hd3a gene. Supervised by SUHARSONO and GUSTAAFADOLF WATTIMENA.

Potato is one important food that can be used as unprocessed food andprocessed food. Frozen French fries are very important processed potatoes.Production of potatoes for frozen French fries are still low, so increasing seedproduction and creating new cultivars are very important. Jala Ipam is a potatocultivar suitable for the production of frozen French fries. Genetic engineering byusing Hd3a gene can improve the productivity of this cultivar. Hd3a is mobileflorigen in rice plants that have homology to the FT (flowering locus T) fromArabidopsis. Overexpression of Hd3a gene induces flowering and tubering intransgenic potato cv. Andigena. This research has an objectic to transformgenetically potato cv. Jala Ipam by using Hd3a gene.

Genetic transformation was done by using Agrobacterium tumefaciensstrain LBA4404 harbouring p2K1-Hd3a plasmid that contains Hd3a gene underthe control of rolC promoter and A. tumefaciens carrying pCambia1300-Hd3a thatcontains Hd3a gene under the control of CaMV 35S promoter. Internodes of stemwere used as explants to be genetically transformed. Explant started to form calli2 weeks after co-cultivation. The efficiency of transformation in this study is 18%for plants transformed with p2K1-Hd3a and 7 % for the plants transformed withpC1300-Hd3a.

Molecular analysis by PCR was carried out to determine Hd3a geneintegration in transgenic plants. PCR was performed using primer pairs of rolC-Fand Hd3a-FP-R for putative transgenic plants produced from the transformationusing plasmid p2K1-Hd3a and primer pair of 35S-F and Hd-R for putativetransgenic plants resulted from the transformation using a plasmid pC1300-Hd3a.PCR analysis showed that two of three putative transgenic plants are transgenicplants containing Hd3a gene under the control of rolC promoter and all fourputative transgenic plants are transgenic plants containing Hd3a gene under thecontrol of 35S CaMV promoter. These results indicate that the genetictransformation of potato cultivars Jala Ipam with Hd3a gene has been successful.

Keywords: Potato cv Jala Ipam, Hd3a gene, Agrobacterium tumefaciens, rolCpromoter, 35S CaMV promoter

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkanatau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atautinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentinganIPB.

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

TANSFORMASI GENETIK TANAMAN KENTANG (Solanumtuberosum L.) KULTIVAR JALA IPAM DENGAN GEN Hd3a

WIWIN WIDIARTI

Tesissebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANAINSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Agus Purwito, MScAgr

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atassegala karunia-Nya sehingga penulis berhasil menyelesaikan penelitian dan tesisyang berjudul Transformasi Genetik Tanaman Ketang (Solanum tuberosum L.)Kultivar Jala Ipam dengan Gen Hd3a.

Ucapan terimakasih sebesar-besarnya dari hati yang paling dalam penulissampaikan kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA dan Prof Dr Ir Gustaaf AdolfWattimena, MSc sebagai komisi pembimbing atas ilmu, perhatian, nasehat,masukan, kesabaran, dan waktu yang diberikan selama membimbing penulis.Riset Andalan Perguruan Tinggi dan Industri atas nama Prof Dr Ir Suharsono,DEA dengan judul “Peningkatan Produksi Bibit Kentang dan Perakitan KultivarBaru Kentang untuk Membangun Industri Kentang Olahan” dengan kontrak no.079/SP2H/LT/DRPM/II/2016, yang telah membiayai penelitian ini. Penulismengucapkan terima kasih kepada penguji luar komisi Dr Ir Agus Purwito,MScAgr atas saran dan masukan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Ucapantrimakasih juga disampaikan kepada staf dan rekan-rekan di Lab. Kultur Jaringan(Mbak Nia, Teh Sarah, Pak Asep, Pak Sairi, Ari, Isni) dan Lab. BIORIN (MbakPepi, Pak Mulya, Pak Asri, Pak Ilyas, Bu idha, Bu Ida, Bu Ifa, Mbak Nurul,Nurul, Fajri, Seni, Yusdar, Fatah, Tiwi, Destik, Lutfi, Nadea, Farhana), sertateman-teman S1 (Bustomi, Ika, Ica, Lisa, Ina, Eka) atas segala bantuan, semangat,ilmu, kebersamaan, keceriaan dan persahabat selama proses penelitian danpenulisan. Kepada suami terkasih Dody Darsono MSi, ananda tercinta dantersayang Abrisam Nur Alam Syah dan Umi Titin, penulis mengucapkanterimakasih yang sebesar-besarnya atas segala bentuk pengorbanan, kesetiaan,kesabaran, pengertian, dukungan moril, dan doa sehingga penulis dapatmenyelesaikan pendidikan S2. Karya ilmiah ini penulis persembahkan kepadasuami, anak, dan orang tua tersayang. Bapak Askawi (alm.) dan Ibu Hartini atasdoa, dukungan, kesabaran dan kasih serta Bapak Kadori dan Ibu Wastiri (alm.)atas doa, dukungan, dan pengertiannya. Terimakasih juga disampaikan kepadateman-teman seperjuangan BTK’12 dan BTK’13 atas segala semangat belajar,doa, persahabatan, dan perhatian. Semoga persahabat ini dapat tetap terjalin.

Akhirnya penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan dapatmemberikan sumbangan bagi perkembangan bioteknologi tanaman terutama padatanaman kentang.

Bogor, Juni 2016

Wiwin Widiarti

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI ixDAFTAR TABEL xDAFTAR GAMBAR xiDAFTAR LAMPIRAN xiiPENDAHULUAN 1Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 2TINJAUAN PUSTAKA 3

Tanaman Kentang dan Manfaatnya 3Pembungaan dan Pengumbian Kentang 3

Pembungaan 3Pengumbian 5Jalur Lintasan Fotoperiode 5Jalur Lintasan Giberelin 6

Gen Hd3a 7Transformasi Genetik dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens 8Perakitan Tanaman Kentang Transgenik 9

METODE PENELITIAN 10Waktu dan Tempat 10Bahan Penelitian 10Metode 11

Perbanyakan Tanaman. 11Transformasi Kentang dengan Gen Hd3a 11Regenerasi Hasil Transformasi Tanaman Kentang 11Identifikasi Tanaman Transgenik dengan Polymerase Chain Reaction 12

HASIL DAN PEMBAHASAN 13Regenerasi Tanaman Kentang 13Identifikasi Tanaman Transgenik 17

SIMPULAN DAN SARAN 18Simpulan 18Saran 18

DAFTAR PUSTAKA 19LAMPIRAN 24

0

DAFTAR TABEL

1 Efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi gen Hd3a pada tanaman kentang kultivar Jala Ipam 15

DAFTAR GAMBAR

1 Jalur pengaturan induksi pembungaan melalui dugaan fotoperiode pada tanaman Arabidopsis thaliana 42 Jalur pengaturan pembungaan pada padi dibawah kondisi hari pendek 83 Posisi gen Hd3a di dalam daerah T-DNA dari vektor ekspresi 104 Kalus yang terbentuk pada media induksi kalus dan regenerasi 135 Tahapan transformasi genetik kentang Jala Ipam transgenik 146 Perkembangan kalus non-transgenik 147 Tanaman kentang kultivar Jala Ipam in vitro berumur 4 minggu 158 Hasil analisi PCR DNA tanaman kentang transgenik p2K1Hd3a 179 Hasil analisi PCR DNA tanaman kentang transgenik pC1300-Hd3a 18

DAFTAR LAMPIRAN

1 Karakteristik Kentang kultivar Jala Ipam 242 Komposisi Media Dasar MS (Murashige dan Skoog 1962) 263 Penentuan Efisiensi Regenerasi dan Efisiensi Transformasi 27

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Tanaman kentang merupakan tanaman pangan utama keempat duniasetelah jagung, padi, dan gandum. Produksi kentang di Indonesia tahun 2013adalah 1,124, 282 ton, naik menjadi 1,211,400 ton pada tahun 2014 (Kementan2015). Kenaikan produksi kentang tersebut masih kurang memenuhi permintaanpasar yang semakin bertambah. Pertambahan jumlah penduduk danberkembangnya gaya hidup modern berdampak pada peningkatan permintaankentang. Peningkatan permintaan kentang belum diimbangi dengan peningkatanjumlah produksi. Kebutuhan kentang yang semakin meningkat mengharuskanproduksi bibit kentang yang semakin meningkat. Beberapa kendala produksikentang antara lain adalah serangan hama dan penyakit tanaman, keterbatasanbibit kentang berkualitas (Wattimena 1992) serta keterbatasan lahan produktifyang sesuai bagi penanaman kentang.

Tanaman kentang membutuhkan lingkungan bersuhu rendah. Tanamankentang di Indonesia tumbuh baik pada daerah dataran tinggi yaitu 1300 meter diatas permukaan laut (Tantowijoyo dan Fliert 2006), serta menghendaki suhurendah antara 15.5 °C – 18.3 °C (BPTPY 2004). Masalah penanaman pada daerahdataran tinggi adalah adanya aliran permukaan dan erosi tanah (Handoko et al.2011) yang menyebabkan produksi rendah. Tanaman kentang mampu berbungadan menghasilkan umbi jika ditanam pada daerah dataran tinggi. Pembentukanumbi pada beberapa varietas kentang seperti kentang Andigena sangat dipengaruhioleh hari pendek (Jackson 1999; Navarro et al. 2011; Abelenda et al. 2014).

Rekayasa genetik merupakan salah satu cara untuk memperbaiki sifat-sifattanaman. Perbaikan tanaman melalui rekayasa genetik didasarkan pada manipulasigen yang relevan dan tersedianya bahan genetik untuk transformasi ke dalam seltanaman (Nasir 2002). Rekayasa genetik pada tanaman kentang telah banyakdilakukan seperti untuk mendapatkan ketahanan terhadap penyakit bakteri(Nurhasanah et al. 2003), ketahanan terhadap jamur dan herbisida (Khan et al.2008), serta ketahanan terhadap virus (Mikschofsky et al. 2011). Rekayasagenetik yang belum banyak dilakukan adalah merakit tanaman kentang varietaskomersial yang mampu berbunga dan berproduksi tinggi.

Bunga mempunyai peranan yang sangat penting dalam perakitan kultivarbaru melalui persilangan. Kentang kultivar Jala Ipam relatif sulit berbunga,sehingga induksi pembungaan pada kultivar ini sangat penting dalam rangkapersilangan dengan kultivar kentang lainnya. Kentang kultivar Jala Ipam sangatcocok untuk diolah menjadi kentang goreng beku (frozen french fries). Kentangini mempunyai umbi yang berukuran besar dan berbentuk lonjong. Kandunganpati umbi kentang kultivar Jala Ipam tinggi.

Pembungaan merupakan rangkaian proses yang diawali dengan perubahanpucuk vegetatif menjadi pucuk generatif. Induksi pembungaan dipengaruhi olehfaktor eksternal yang meliputi panjang hari (fotoperiode) dan suhu (Imaizumi danKay 2006; Yuan-li dan Wei-jiang 2012), dan faktor internal seperti umur tanamandan jumlah hormon giberelic acid (GA) (Song et al. 2013). Respon tanamanterhadap fotoperiode diatur oleh beberapa gen pengatur waktu pembungaan

2

seperti gen FT (Imaizumi dan Kay 2006; Navarro et al. 2011; Abelenda et al.2014; Song et al. 2013) dan gen kelas E MADS-box (Wang et al. 2013).

Heading date 3a (Hd3a) merupakan protein penginduksi pembentukanbunga pada padi. Gen Hd3a mempunyai homologi dengan gen FT (floweringlocus T) dari Arabidopsis dan merupakan sinyal pembungaan yang dapatberpindah tempat (Tamaki et al. 2007). Ekspresi berlebih Hd3a yang dikendalikanoleh promoter konstitutif 35S CaMV (Kojima et al. 2002) dan promoter spesifikrolC (Tamaki et al. 2007) pada padi transgenik menyebabkan pembungaan lebihcepat. Keberadaan gen Hd3a yang dikendalikan baik oleh promoter konstitutif35S CaMV maupun oleh promoter rolC mengakibatkan munculnya bunga lebihcepat pada tunas jarak pagar (Jatropha curcas) transgenik yang mengandung genHd3a secara in vitro (Sulistyaningsih 2012). Promoter rolC merupakan promoterspesifik floem yang mampu mengeskpresikan Hd3a dengan aktivitas tinggi,terbukti dari percepatan waktu pembungaan pada padi transgenik rata-rata 19.5hari (Tamaki et al. 2007).

Ekspresi berlebih gen Hd3a mampu menyebabkan pembungaan lebihcepat pada beberapa tanaman seperti Oryza sativa L. (Kojima et al. 2002; Tamakiet al. 2007; Wang et al. 2013), Saussurea involucrata (Li et al. 2011), Jatrophacurcas (Sulistyaningsih 2012), Nicotiana benthamiana (Syafitri 2012; Senjaya2013), serta mampu mengaktifkan dua proses perkembangan sekaligus yaitupembungaan dan pembentukan umbi pada kentang Andigena (Navarro et al.2011). Pengaruh ekspresi berlebih gen Hd3a di dalam kentang Andigena trangenikterhadap pembungaan dan pengumbian menjadi fenomena yang menarik untukdilakukan pada kentang yang ada di Indonesia.

Introduksi gen ke dalam genom tanaman merupakan suatu upayaperbaikan yang langsung mengenai karakter yang diinginkan. Introduksi genmelalui transformasi genetik dengan bantuan A. tumefaciens merupakan metodeyang banyak digunakan. Respon beberapa kultivar kentang in vitro terhadapinfeksi A. tumefaciens pernah dilakukan oleh Churiyah et al. (1994). Keberhasilantransformasi genetik pada kentang telah banyak dilakukan diantaranya padavarietas Cardinal dan Heera (Khatun et al. 2012), kultivar Desiree, Agria, danMarfona (Khasani et al. 2012), kultivar Baraka (Bustomi 2014), kultivar Diamant(Mardiyyah 2015; Nurrizky 2015), kultivar Agria (Salsabila 2015), dan kultivarKennebec (Maulani 2015).

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan transformasi genetik tanamankentang kultivar Jala Ipam dengan gen Hd3a melalui perantara A. tumefaciens.

3

TINJAUAN PUSTAKA

Tanaman Kentang dan Manfaatnya

Tanaman kentang merupakan tanaman yang dipanen umbinya dandigunakan sebagai makanan pokok bagi sebagian penduduk dunia. Kentangmerupakan tanaman pangan dunia setelah padi, gandum dan jagung (Wattimena1992). Kentang diproduksi dalam jumlah besar di negara-negara maju. DiIndonesia kentang menjadi salah satu komoditas sayuran yang mendapat prioritaspengembangan, karena mempunyai potensi sebagai tanaman penunjang programdiversifikasi pangan untuk memenuhi kebutuhan gizi masyarakat (Prabaningrumet al. 2014). Kentang dijadikan pengganti pangan yang ideal karena mengandungprotein, karbohidrat, lemak, mineral dan vitamin yang seimbang bagi tubuhmanusia (Wattimena 1992; McGregor 2007).

Kentang dikelompokkan dalam dua jenis yaitu kentang sayur dan kentangbahan baku industri (processing). Kentang sayur tidak terlalu membutuhkankarakter khusus seperti halnya pada kentang bahan baku industri. Sebagai bahanbaku industri, kentang banyak digunakan untuk membuat keripik, tepung kentang,atau sebagai french fries. Kentang french fries memerlukan umbi kentang dengankandungan gula rendah, bahan kering rendah, dan bentuk umbi yang panjang.Kentang olahan yang banyak dibudidayakan di Indonesia adalah kentang Atlantik,sementara kentang yang digunakan sebagai kentang french fries masih belumbanyak. Saat ini Indonesia masih seratus persen mengimpor kentang french friesdari luar negeri (Suharsono 2015).

Kentang Jala Ipam merupakan klon hasil seleksi positif dari variasisomaklonal Russet Burbank. Karakteristik kentang kultivar Jala Ipam disajikanpada Lampiran 1.

Pembungaan dan Pengumbian Kentang

Salah satu ciri makhluk hidup adalah tumbuh dan berkembang.Petumbuhan dan perkembangan merupakan proses yang saling berhubungan.Perkembangan merupakan suatu proses kombinasi dari sejumlah proses yangkompleks, yaitu pertumbuhan dan diferensiasi yang mengarah pada akumulasiberat kering tanaman. Ada banyak faktor yang mempengaruhi perkembangantanaman. Faktor-faktor tersebut dikelompokkan menjadi dua, yaitu faktor internaldan faktor eksternal. Faktor internal meliputi faktor genetik dan fitohormon,sedangkan faktor eksternal atau faktor lingkungan diantaranya adalah fotoperiode,suhu, dan intensitas cahaya (Song et al. 2013).

PembungaanPembungaan merupakan salah satu perkembangan tanaman dimana

terjadinya perubahan pucuk vegetatif menjadi pucuk reproduktif. Pembungaandikontrol oleh kondisi lingkungan dan pengaturan perkembangan yang kompleks.Pengaturan tersebut dibuat oleh jaringan yang rumit dari beberapa jalur sinyal.Jalur sinyal yang berperan diantaranya adalah fotoperiode. Fotoperiode atau

4

panjang hari mempengaruhi induksi pembungaan pada berbagai tumbuhan. Padatanaman A. thaliana, respon tumbuhan terhadap fotoperiode dipengaruhi oleh jamsirkadian yang mengarah pada ekspresi Gigantea (GI), diikuti oleh pengaktifanekspresi gen Constans (CO) (Coelho et al. 2013). CO menginduksi traskripsiFLOWERING LOCUS T (FT) dan TWIN SISTER OF FT (TSF). Prosestranskripsi terjadi di dalam floem dan selanjutnya disampaikan ke meristem tunasapikal (SAM). Gen FT dan TSF bersama dengan FLOWERING LOCUS Dmengaktifkan ekspresi gen identitas meristem bunga (Matsoukas 2015). InteraksiFT-FD secara langsung ataupun tidak langsung mengaktifkan gen tipe bungaseperti gen SOC1 dan APETALA1 (AP1) (Abe et al. 2005) (Gambar 1). AP1mengaktifkan ekspresi gen LEAFY (LFY) yang pada gilirannya bertanggungjawab untuk mengikat promoter AP1 dan mengontrol ekspresi SEPALLATA3(SEP3) baik langsung maupun tidak langsung yang terlibat dalam pembentukanorgan bunga (Kaufmann et al. 2010).

Gambar 1 Jalur pengaturan induksi pembungaan melalui dugaan fotoperiode padatanaman Arabidopsis thaliana. Penggalan gambar dari Bouche et al.(2016).

Pembungaan juga dipengaruhi oleh jalur sinyal giberelin (GAs). Giberelindiketahui memacu pembungaan pada berbagai tumbuhan. Jalur sinyal GAmerupakan jalur regulasi yang padat sebagai isyarat perkembangan. Pada tanamanA. thaliana, sinyal GA memiliki pengaruh relatif lebih kecil terhadap pembungaanpada kondisi hari panjang, sedangkan pada kondisi hari pendek, dengan tidakadanya jalur sinyal fotoperiode, keberadaan jalur sinyal GA menjadi wajib(Mutasa-Gottgens dan Hedden 2009). Mekanisme GA dalam pengaturan

5

pertumbuhan tergantung pada protein DELLA, yang teridentifikasi sebagaiinhibitor pertumbuhan melalui dua cara: pertama dengan mengganggu aktifitasfaktor transkripsi dalam memacu pertumbuhan dan kedua melalui pengaktifanpromoter dari beberapa gen yang mengatur peningkatan aktifitas jalur asamabsisat (ABA) yang aktifitasnya bertentangan dengan GA. Ketika ABA hadir,molekul GA mengikat reseptor sel, GID1, yang memfasilitasi perubahan bentukyang memungkinkan pengikatan wilayah terminal-N dari DELLA (Goldberg-Moller et al. 2013). Giberelin mendorong pembungaan melalui pengaktifanbeberapa gen yang menyandi beberapa protein seperti SUPRESSOR OFOVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1), LEAFY (LFY), danFLOWERING LOCUS T (FT) pada daun dan meristem bunga (Mutasa-Gottegensdan Hedden 2009).

PengumbianUmbi kentang terbentuk dari cabang yang tumbuh di dalam tanah yang

disebut stolon. Proses pembentukan umbi ditandai dengan terhentinyapertumbuhan dari stolon yang diikuti pembesaran stolon di bagian ujung dan diisioleh sebagian berat kering hasil fotosintesis. Proses pengumbian pada kentangterdiri dari beberapa tahap: pembentukan dan pemanjangan stolon, induksi umbi,inisiasi umbi, dan pertumbuhan umbi (Aksenova et al. 2012).

Terdapat enam faktor kunci yang mendorong proses pembentukan umbikentang. Faktor tersebut adalah antara lain: fotoperiode, fitokrom, cahaya yangoptimal, sukrosa tinggi, suhu rendah dan nitrogen rendah. Faktor tersebutmempengaruhi beberapa jalur sinyal gen (Jackson 1999). Sama halnya denganinduksi pembungaan, paling sedikit ada dua jalur yang mengontrol pembentukanumbi pada kentang, yaitu jalur lintasan fotoperiode dan jalur lintasan giberelin(Martinez-Garcia et al. 2002).

Jalur Lintasan FotoperiodePanjang hari (fotoperiode) mempengaruhi induksi pengumbian pada

kentang. Perbedaan kultivar (varietas) kentang terkadang mempengaruhikebutuhan akan penyinaran. Kentang tipe liar dan beberapa kentang budidayamembutuhkan fotoperiode hari pendek (SD) untuk menginduksi pengumbian(Bou-Torrent et al. 2011). Adanya pengaruh night break (NB) dapat menghambatproses pembentukan umbi. Fitokrom diketahui terlibat dalam respon fotoperiodeterhadap night break tersebut. Pengaruh cahaya merah (R) dapat menghambatproses pengumbian, namun jika dilanjutkan dengan perlakuan pemberian cahayamerah jauh (FR) proses pembentukan umbi akan tetap terjadi (Jackson 1999).Sementara lamanya siang hari (LD) dapat mengakibatkan proses pengumbianmenjadi lambat dan terhambat (Haverkort 2007; Suarez-Lopez 2013).

Respon terhadap fotoperiode ditentukan oleh peran gen CO. PenelitianMartinez-Garcia et al. (2012) menjelaskan bahwa sebuah gen CO-like padakentang (StCO) telah ditemukan dan diindentifikasi sangat mirip dengan genkentang yang telah dilaporkan sebelumnya. Ekspresi berlebih gen StCOmenyebabkan pengumbian lambat pada tanaman kentang tipe liar dibawah induksipenyinaran yang lemah. StCO menghambat proses pembentukan umbi denganmenekan dan melemahkan induksi dari fotoperiode. Ekspresi berlebihArabidopsis CO (pACo) menyebabkan penundaan pengumbian pada kentang di

6

bawah pengaruh hari pendek (SD) dan SD+NB (Martinez-Garcia et al 2002,Gonzalez-Schain dan Suarez-Lopez 2008).

Pengaruh StCo pada induksi pengumbian juga dapat ditransmisikanmelalui cangkok. StCO mempengaruhi StFT/StSP6A yang merupakan proteinyang sangat mirip dengan protein FT. FT-like protein (StSP6A) berperanmenginduksi pembentukan umbi. Pengaruh StSP6A dalam pembentukan umbiditularkan melalui proses penyambungan (Navarro et al. 2011). StSP6A secaranegatif diatur oleh StCO, yang menahan pembentukan umbi dibawah non-induksiLDs (Navarro et al. 2011; Gonzalez-Schain et al. 2012).

Jalur Lintasan GiberelinHormon tanaman giberelin (GAs) hadir di dalam jaringan floem dan

berperan sebagai molekul florigen pada beberapa spesies. Giberelin (GAs) terlibatjuga dalam pengaturan pengumbian (Prat 2010). Kadar GA di daun menurundibawah kondisi hari pendek dan meningkat pada kondisi hari panjang. Tingginyakadar GA pada ujung stolon ditemukan pada perpanjangan maristem stolon,sedangkan penurunan kadar GA berpengaruh pada inisisi pembentukan umbi(Bou-Torrent et al. 2011).

Percobaan pada tanaman kentang Andigena, sintesis GA menghambatpembentukan umbi pada kondisi hari panjang. Secara keseluruhan, kadar GAlebih besar terjadi pada kondisi yang menghambat pembentukan umbi. GA 20-oksidase dan GA 3-oksidase mengkatalisasi dua tahap terakhir dari pengaktifanbiosintesis GA, dan hasil konversi GA 2-oksidase ke katabolisme menjadi tidakaktif. Ketiga jenis enzim disandikan oleh keluarga kecil gen GA20ox, GA3ox, danGA2ox. Tiga langkah enzimatik dianggap sebagai situs utama pengaturanbiosintesis GA. Ekspresi GA20ox dan GA3ox dikendalikan oleh umpan balikGA1/GA3 (Carrera et al. 1999), sedangkan ekspresi GA2ox diatur oleh umpanmaju dari bioaktif GAs (Bou-Torrent et al. 2011). Pada tanaman kentang, tingkattranskripsi dari StGA20ox lebih kecil dalam daun di bawah kondisi non-induksi(SD+NB atau LD) dibandingkan kondisi tanaman dibawah kondisi SD (Bou-Torrent et al. 2011).

Pembungkaman potato GA20ox (StGA20ox1) dan manipulasi kadarGA3ox (StGA3ox) tidak dapat menginduksi pembentukan umbi pada hari panjang(Bou-Torrent 2011). Penambahan GA2ox, StGA2ox1, mengakibatkanpembentukan umbi in vitro, namun tidak pada penanaman di lapang (Kloostermanet al. 2007). StGA2ox1 lebih berperan sebagai gen identitas umbi dibandingkansebagai pengatur pada induksi umbi. Peningkatan pengaturan StGA2ox1 di stolondilakukan oleh StSP6A (Navarro et al. 2011).

Lebih dari itu, bentuk ekspresi dari beberapa biosintesis enzim GA danfenotipe tanaman dengan mengubah tingkat dari enzim tersebut tidak selalu sesuaidengan hipotesis bahwa GAs menghambat pembentukan umbi. Sebagai contoh,meskipun StGA3ox2 mengatur penurunan pada inisiasi perkembangan umbi,StGA20ox1 dan StGA20ox3 mengatur peningkatannya (Kloosterman et al. 2007).Kedua StGA20ox1-3 membungkam dan over-expresi StGA3ox2 pada tanamantersebut menyebabkan pengumbian lebih cepat dibandingkan pada tanaman tipeliar pada kondisi hari pendek meskipun memperlihatkan perbedaan perubahanpada tingkat GA1 (Bou-Torrent et al. 2011).

7

Aktivitas GA dipengaruhi juga oleh suhu. GA menanggapi suhu tinggidengan mencegah kondisi pembentukan umbi. Efek penghambatan terjadi padasuhu tinggi (suhu siang 32 oC dan malam 28 oC) dan efek mendorongpembentukan umbi terjadi pada suhu rendah (suhu siang 22 oC dan malam 18 oC).Suhu bepengaruh mengubah keseimbangan antara GA dan inhibitor lain yangbertindak secara langsung di ujung stolon (Menzel dalam Hannapel 2007).

Gen Hd3a

Hd3a merupakan salah satu florigen yang berperan dalam induksipembungaan. Hd3a adalah gen ortholog FT Arabidopsis yang terdapat di padi.Protein ini berfungsi sebagai pendorong pembungaan. Ekspresi tinggi gen Hd3aterjadi saat siang hari sebagai bentuk kontrol dari jalur fotoperiode hari pendek(Kojima et al. 2002). Sebagai penyandi florigen Hd3a dapat bergerak dari daunmenuju maristem tunas apikal (SAM) dan menyebabkan pembungaan (Tamaki etal. 2007). Bentuk ekspresi gen Hd3a sama dengan Rice FT- like 1 (RFT1) yangmemperlihatkan ekspresi tinggi saat siang hari, dan puncaknya terjadi saat fajar(Kojima et al. 2002).

Pada lintasan pembungaan jalur fotoperiode, ekspresi gen Hd3a diaktifkanoleh gen Hd1. Hd1 merupakan gen ortholog CO Arabidopsis. Berbeda denganCO, gen Hd1 diekspresikan pada hari pendek dan juga hari panjang. Akan tetapiHd1 mendorong pembungaan dibawah kondisi hari pendak, dan menghambatpembungaan pada kondisi hari panjang. Ekspresi yang tinggi dari gen Hd1 terjadisaat gelap (Yano et al. 2000). Transkripsi dari Hd3a ditekan kuat pada mutan hd1NILs dibawah kondisi hari pendek, sedangkan Hd1 mampu meningkatkanekspresi Hd3a dibawah kondisi hari pendek (Kojima et al. 2002).

Jalur Hd1-Hd3a di padi sama dengan jalur CO-FT di Arabidopsis.Ekspresi dari Hd1 didorong oleh keberadaan gen OsGI (sebuah gen orthologGIGANTEA di Arabidopsis). Gen OsGI menyandi protein GI sebagai akibat dariinduksi jam sirkadian dibawah kondisi hari pendek dan hari panjang. OsGI akanmengaktifkan ekspresi Hd1 dan selanjutnya mendorong ekspresi dari gen Hd3a.OsGI mampu mengirimkan sinyal akibat fotoperiod hari pendek ke OsMADS51,kemudian akan mengaktifkan ekspresi Ehd1, Hd3a dan RTF1. Hd1 dan Ehd1dapat diaktifkan oleh RID1, Ehd2, dan OsId1. Di sisi lain Ehd3 mampumengaktifkan ekspresi Ehd1. Sementara daerah hilir dari gen Hd3a/RTF1 adalahgen-gen MADS-box seperti gen OsMADS14 dan OsMADS15 yang berfungsisebagai gen penentu indentitas bunga (Gambar 2). Gen OsMADS14 danOsMADS15 merupakan ortholog gen AP1 di Arabidopsis yang berperan pentingdalam mendukung bentuk bunga (Komiya et al. 2008). Pembentukan bunga yangtidak normal dapat terjadi karena gen OsMADS14 dan OsMADS15 tidakdiekspresikan secara optimal (Yuan-Li dan Wei-Jiang 2012). Jalur pembungaanpadi dibawah kondisi hari pendek disajikan pada Gambar 2.

Peranan Hd3a sebagai florigen tidak hanya bekerja di padi, tetapi jugapada tanaman Saussurea involucrate (Li et al. 2011), Jatropha curcas(Sulistyaningsih 2012), dan Nicotiana benthamiana (Syafitri 2012), dimanatanaman-tanaman tersebut mampu berbunga dengan cepat. Hd3a juga mampumenginduksi pembentukan bunga dan umbi pada tanaman kentang Adigena

8

dibawah kondisi non-induksi hari panjang. Induksi pengumbian dapat terjadi padakondisi hari panjang di kentang ssp. Andigena disebabkan perlakuanpenyambungan tanaman tipe liar dengan galur kentang rolC::Hd3a-GFP. Galurkentang transgenik yang dijadikan batang atas (scion) ataupun batang bawah(stock), ternyata dapat menginduksi pengumbian pada kondisi hari panjang(Navarro et al. 2011). Hal ini membuktikan bahwa Hd3a merupakan penginduksipembentukan umbi yang dapat bergerak.

Gambar 2 Jalur pembungaan pada padi dibawah kondisi hari pendek. Tanda menunjukkan mendorong. Tanda menunjukkan penghambatan (Yuan-Li dan Wei-Jiang 2012).

Penelitian terbaru menunjukkan bahwa selain sebagai aktivator pembungaan,protein Hd3a mampu mendorong percabangan pada tanaman padi. Tsuji et al.(2015) menjelaskan bahwa protein Hd3a mungkin terakumulasi dalam meristemaksilar sehingga mampu mempromosikan percabangan dan diperlukan bagipromosi pembentukan Florigen Activation Complex (FAC). FAC diperlukanuntuk proses selain pembentukan bunga. Sebagai sinyal percabangan yangbergerak di padi, aktivitas Hd3a tergantung pada pembentukan FAC.

Transformasi Genetik dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri gram negatif tanah yangmenyebabkan penyakit tumor pada tanaman dikotil. Tumor terbentuk karenaekspresi gen yang terdapat di daerah T-DNA yang ditransfer dari plasmid Ti(tumor inducing plasmid) ke dalam genom tanaman. Plasmid Ti yang terdapat didalam A. tumefaciens memiliki beberapa bagian yaitu, daerah T-DNA (transfer

9

DNA), daerah vir (virulensi), daerah inisiasi replikasi plasmid (ORI-Origin ofReplication), dan daerah katabolisme opin. Daerah tersebut memiliki fungsi yangberbeda. Daerah T-DNA dan daerah vir merupakan daerah yang paling berperandalam proses transformasi genetik.

Proses transformasi genetik dari A.tumefaciens ke dalam sel tanamandiawali dengan pengenalan luka. Luka pada jaringan tanaman berfungsi sebagaijalur masuk bakteri menuju tempat yang dikenali pada permukaan sel tanaman,sehingga sel tanaman menjadi kompeten untuk ditransformasi. Lukamenyebabkan tanaman menghasilkan senyawa fenolik (Asetosiringone) yangmenarik A. tumefaciens dan menginduksi gen-gen vir yang diperlukan dalamproses transfer T-DNA (Galvin 2003).

Gen vir berperan secara langsung dalam transfer gen. Gen virA mendeteksisenyawa fenolik yang terbentuk diikuti dengan autofosforilasi protein virA danmengaktifkan gen virG. Protein VirG akan menginduksi ekspresi gen VirD1 yangakan memotong daerah T-DNA pada Agrobacterium sehingga diperoleh utastunggal T-DNA. Protein VirD2 yang terfosforilasi oleh protein VirD1 akanmengarahkan daerah T-DNA ke dalam nukleus, sedangkan gen virC1 akanmelindungi daerah T-DNA dan meningkatkan aktivitas protein VirD. Gen virDmenempel pada ujung 5’ T-DNA kemudian membawa DNA ke sitosol sel inang,dan T-DNA akan terinsersi ke dalam genom tumbuhan (Galvin 2003).

Perakitan Tanaman Kentang Transgenik

Kentang merupakan salah satu tanaman budidaya yang suksesditransformasi. Transformasi tanaman kentang dilakukan untuk tujuan tertentuseperti ketahanan terhadap penyakit, ketahanan terhadap virus, dan juga untukmeningkatkan nutrisi umbi. Kultivar kentang yang pernah ditransformasi salahsatunya adalah kentang kultivar Atlantik. Kentang kultivar Atlantik pernahditransformasi menggunakan gen hordothionin yaitu gen penyandi thionin yangterdapat pada endosperma tanamanan barley sebagai anti bakteri yang dapatmeningkatkan resistensi tanaman terhadap serangan bakteri (Nurhasanah et al.2003). Kentang kultivar Atlantik juga pernah ditransformasi dengan gen penyandilisozim. Hasil transformasi kentang dengan gen penyandi lisozim menghasilkantanaman yang tahan terhadap penyakit layu dan busuk lunak (Manguntungi 2014).Penyakit layu merupakan penyakit yang banyak menyerang tanaman kentangsehingga dapat menurunkan produksi hingga 80% (Wattimena 2000).

Perakitan tanaman kentang bukan hanya bertujuan untuk menghasilkantanaman yang tahan terhadap penyakit bakteri, namun juga untuk meningkatkankomposisi nutrisi. Kashani et al. (2012) melakukan transformasi genetik kentangdengan gen proinsulin manusia. Insulin merupakan senyawa metabolik yangdibutuhkan bagi penderita diabetes.

Protein farmasi pada hewan yang dihasilkan melalui perakitan tanamankentang dengan mengintroduksikan gen vp60 pernah dilakukan oleh Mikschofskyet al. (2011). Ekpresi dari antigen virus vp60 pada tanaman kentang transgenikberakibat pada perubahan komposisi nutrisi umbi. Adanya protein VP60ditunjukkan oleh adanya respon kekebalan yang melindungi kelinci dari penyakithemoragik virus.

10

METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan September 2014 – Oktober 2015 diLaboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman, dan LaboratoriumBiotechnology Research Indonesia – The Netherland (BIORIN), Pusat PenelitianSumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Lembaga Penelitian danPengabdian Kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor.

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian ruas batang(internode) tanaman kentang in vitro kultivar Jala Ipam. Bakteri A.tumefaciensstrain LBA4404 yang membawa plasmid p2K1-Hd3a (Tamaki et al. 2007) danplasmid pCAMBIA1300-Hd3a (Sulistyaningsih 2012) digunakan untuk prosestransformasi genetik tanaman kentang. Di daerah T-DNA pada plasmid p2K1-Hd3a, gen Hd3a dikendalikan oleh promoter rolC, sedangkan pada plasmidpCambia1300-Hd3a, gen Hd3a di bawah kendali promoter 35S CaMV. Peta fisikgen Hd3a di daerah T-DNA disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3 Posisi gen Hd3a di dalam daerah T-DNA dari vektor ekspresi. (A)Daerah T-DNA dari p2K1-Hd3a (Tamaki et al. 2007), (B) Daerah T-DNA dari pC1300-Hd3a (Sulistyningsih 2012). LB: left border, RB:right border, rolC: promoter rolC dari A. rhizogenes, Hd3a: gen daripadi, GFP: gen penanda Green Fluorecent Protein, hpt: genresistensi terhadap higromisin, 35S P: promoter 35S dari cauliflowermosaic virus (CaMV), CA: sekuen polyA dari 35S CaMV.

Primer spesifik yang digunakan untuk analisis integrasi gen Hd3a di dalamgenom tanaman transgenik putatif yang ditransformasi dengan p2K1-Hd3a adalahpasangan primer rolC-F (5’-AAGCTTAAAGTTGGCCCG-3’) dan Hd3a-FP-R(5’-TCTAGAGGGGTAGACCCTCCTGCCGC-3’). Tanaman transgenik putatifyang berhasil ditransformasi dengan pC1300-Hd3a dianalisis dengan pasangan

11

primer 35S-F (5’-CCAAGCTCTATCTGTCACTTCATC-3’) dan Hd-R (5’-CTAGGGGTAGACCCTCCTGCC-3’). Gen aktin yang didasarkan pada aktin darikedelai digunakan untuk menguji kualitas DNA tanaman melalui PCR denganprimer Act-F (5’-ATGGCAGATGCCGAGGATAT-3’) yang terdapat pada ekson 1dan Act-R (5’-CAGTTGTGCGACCACTTGCA-3’) yang terdapat pada ekson 2.

Media MS (Murashige dan Skoog 1962) digunakan sebagai media dasaruntuk kultur tanaman kentang secara in vitro (Lampiran 2). Media MS2 makrodigunakan untuk perbanyakan tanaman secara in vitro. Media kokultivasi tersusundari media MS yang mengandung BA 0.5 g/L, IAA 0.1 g/L, dan acetocyringone20 mg/L. Media regenerasi merupakan media MS yang mengandung IAA 2 mg/L,BAP 3 mg/L, GA3 1 mg/L, cefotaxime 100 mg/L dan higromisin 40 mg/L. MediaLB (bacto tripton 5 g/L, yeast extract 10 g/L, dan NaCl 10 g/L) digunakan untukkultur bakteri.

Metode

Perbanyakan TanamanTanaman kentang kultivar Jala Ipam in vitro diperbanyak pada media MS2

makro selama satu bulan. Ruas batang yang mengandung satu mata tunas denganpanjang 0.5 cm – 1 cm digunakan sebagai eksplan untuk perbanyakan tanaman.

Transformasi Kentang dengan Gen Hd3aBakteri A. tumefaciens dari stok gliserol yang membawa gen Hd3a

ditumbuhkan pada media LB cair yang mengandung 50 mg/L antibiotik kanamisindan 25 mg/L rifampisin pada suhu ruang pada kondisi gelap selama 48 jamdengan penggoyangan 100 rpm. Selanjutnya 100 μl bakteri dikulturkan kembali didalam 10 ml media LB cair dengan penggoyangan 100 rpm di ruang gelapsehingga mencapai nilai absorbansi 0.5 pada panjang gelombang 600 nm (OD600).Sel bakteri selanjutnya dipisahkan dari medium LB cair dengan disentrifugasidengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Sel bakteri yang mengendapdilarutkan pada medium kokultivasi cair.

Eksplan yang berupa ruas batang (internode) yang tidak mengandung matatunas direndam dalam larutan bakteri A. tumefaciens selama 10 menit pada suhuruang dengan penggoyangan. Eksplan tersebut selanjutnya dikeringkan di ataskertas tisu steril selama 10 menit dan ditanam pada media kokultivasi padat didalam cawan petri, kemudian kokultivasi dilakukan pada ruang gelap pada suhu23°C selama tiga hari. Tahapan ini bertujuan agar bakteri dapat menginfeksieksplan. Setelah tiga hari, eksplan dicuci dengan air steril sebanyak 3 kali,kemudian direndam pada larutan 100 mg/L cefotaxime selama 10 menit untukmematikan bakteri A. tumefaciens. Eksplan selanjutnya ditanam pada mediapenginduksi kalus/regenerasi. Efisiensi transformasi ditentukan berdasarkanrumus yang disajikan pada Lampiran 3.

Regenerasi Hasil Transformasi Tanaman Kentang Tahap regenerasi bertujuan untuk menginduksi pembentukan tunas dari

kalus. Eksplan tanaman yang telah dikokultivasi selanjutnya ditanam pada mediapembentukan kalus dan regenerasi yang berupa media regenerasi dengan

12

penambahan 100 mg/L cefotaxime dan 40 mg/L higromisin. Subkultur dilakukansetiap 2 minggu hingga kalus membentuk tunas. Tunas yang tumbuh dari kaluspada media regenerasi selanjutnya dipindahkan ke medium MS2 makro selamaempat minggu. Setelah empat minggu tanaman disubkultur pada media seleksiyang berupa media MS2 makro yang mengandung higromisin 40 mg/L.Pertumbuhan tanaman diamati selama empat minggu. Tanaman yang tumbuhdianggap sebagai tanaman transgenik putatif yang kemudian dianalisismenggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Efisiensi regenerasidihitung berdasarkan rumus yang disajikan pada Lampiran 3.

Identifikasi Tanaman Transgenik dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)DNA genom tanaman kentang Jala Ipam diisolasi dari daun dengan

metode CTAB (cetyl-trymethyl ammonium bromide) (Doyle dan Doyle 1987).Daun tanaman kentang sebanyak 100 gram digerus dengan nitrogen cairkemudian dimasukkan pada tabung eppendorf ukuran 1.5 ml dan ditambah larutanpengekstraksi yaitu 600 μl buffer CTAB 2% (20 g/L CTAB, 150 ml/L 1 M Tris-ClPh 8.0, 60 ml/L 0.5 M EDTA Ph 8.0) dan β-merkaptoetanol (0.2%). Tabungdibolak-balik beberapa kali lalu diinkubasi pada suhu 65 °C selama 30 menit.Setelah itu tabung disimpan di dalam es, kemudian ditambah kloroform-isoamilalcohol 24:1 (v/v) sebanyak 1 kali volume larutan, dan disentrifugasi dengankecepatan 10000 rpm (Jouan BR 4i) selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh,diambil dan dipindahkan pada tabung eppendorf baru, kemudian ditambah PCI(phenol-cloroform-isoamil alcohol) 25:24:1 (v/v/v) sebanyak 1 kali volumelarutan, dibolak-balik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10000 rpmselama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabungeppendorf baru, dan ditambah sodium asetat 0.2 M sebanyak 0.1 kali volumesupernatan yang diperoleh, dan ditambah etanol absolute sebanyak 2 kali volumelarutan. Tabung dibolak-balik beberapa kali, kemudian disimpan dalam freezer (-20 °C) selama semalam. Kemudian, tabung disentrifugasi lagi dengan kecepatan10000 rpm selama 20 menit. Supernatant dibuang, dan endapan yang terbentukditambah dengan larutan etanol 70% (v/v) dan disentrifugasi dengan kecepatan10000 rpm selama 10 menit, kemudian endapan dikeringkan menggunakan mesinvakum dan diberi 20 μl ddH2O dan 4 μl RNAse (1 mg/ml).

DNA yang telah diisolasi kemudian dianalisis dengan PCR menggunakanpasangan primer rolC-F dan Hd3a-FP-R untuk tanaman transgenik yangdiperkirakan mengandung gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC dan primer35S-F dan Hd-R untuk tanaman transgenik yang diperkirakan mengandung genHd3a di bawah kendali promoter 35S CaMV. Kondisi PCR terdiri dari pra PCRsuhu 95 °C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 95 °C selama 1 menit,annealing pada suhu 58 °C selama 1 menit, extension pada suhu 72 °C selama 1menit, post extension pada suhu 72 °C selama 5 menit, pendinginan pada suhu25°C selama 10 menit. PCR dilakukan sebanyak 35 siklus. Hasil PCR selanjutnyadielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 1% (b/v) pada voltase 100 voltselama 30 menit. Setelah itu gel agarosa direndam dalam larutan EthidiumBromide (0.5 mg/L) selama 10 menit dan dibilas dengan air. Hasil elektroforesisdiamati dan diambil gambarnya dengan gel-doc transiluminator UV.

13

HASIL DAN PEMBAHASAN

Regenerasi Tanaman Kentang

Transformasi genetik tanaman kentang kultivar Jala Ipam dilakukandengan menggunakan eksplan ruas batang (internode) tanpa mata tunas yangberumur 4 minggu. Penggunaan ruas batang tanpa mata tunas bertujuan untukmenghindari kemungkinan tumbuhnya tunas transgenik palsu dari mata tunasyang muncul pada bagian buku. Disamping itu pemilihan penggunaan ruas batangsebagai eksplan disebabkan karena ruas batang lebih cepat membentuk kalus danlebih tinggi frekuensi regenerasi tunas dan jumlah tunas per eksplan dibandingkaneksplan lain seperti daun dan tangkai daun. Kecepatan induksi kalus dari eksplanruas batang telah dibuktikan pada penelitian Dhital et al. (2010) dan Bustomi(2014). Hasil yang berbeda diperoleh Manguntungi (2014) yang menunjukkanbahwa potongan daun lebih cepat membentuk kalus dan kalusnya lebih banyakberegenerasi menjadi tunas daripada eksplan yang berupa ruas batang.

Gambar 4 Kalus yang terbentuk pada media induksi kalus dan regenerasi pada 2minggu setelah tanam. (A) kalus dari eksplan yang ditransformasidengan p2K1-Hd3a, (B) kalus dari eksplan yang ditransformasidengan pCambia1300-Hd3a, (C) kalus dari eksplan kontrol.

Eksplan internode yang telah ditransformasi dengan gen Hd3a ditanampada media induksi kalus dan regenerasi. Media induksi kalus dan mediaregenerasi menggunakan media yang sama yaitu media MS yang mengandung 2mg/L IAA, 3 mg/L BAP, 1 mg/L GA3, 100 mg/L cefotaxime, seperti yangdigunakan oleh Bustomi (2014) dan Manguntungi (2014). Eksplan tanamankentang kultivar Jala Ipam yang telah ditransformasi dan juga eksplan kontrolmulai membentuk kalus dua minggu setelah ko-kultivasi (Gambar 4).Pembentukan kalus mulai terlihat dari ujung potongan buku kemudian meratapada semua bagian eksplan.

Eksplan disubkultur setiap dua minggu pada media yang sama dengantujuan menyediakan ketersediaan hara mineral dan hormon tanaman yang cukupuntuk memacu pembentukan tunas lebih cepat. Pembentukan tunas dimulai sekitarempat sampai enam minggu setelah pembentukan kalus yang ditanam di mediaregenerasi (Gambar 5). Tunas yang tumbuh selanjutnya dipindahkan pada mediaMS2 makro agar dapat beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Tanaman yangtelah tumbuh menjadi tanaman lengkap diperbanyak pada media seleksi MS2makro yang mengandung 40 mg/L antibiotik higromisin. Tanaman transgenikputatif ditumbuhkan menjadi besar untuk diaklimatisasi di rumah kaca.

14

Gambar 5 Tahapan regenerasi tanaman kentang Jala Ipam transgenik. (A) Kalusbertunas, (B) tunas tumbuh menjadi tanaman utuh pada media MS2makro yang mengandung antibiotik higromisin, (C) tanamantransgenik untuk diaklimatisasi.

Sebagian besar eksplan yang ditransformasi secara perlahan mengalamiperubahan warna menjadi coklat (browning) dan kemudian mati (Gambar 8).Kematian kultur ini dapat diakibatkan karena gen Hd3a yang dipautkan dengangen hpt tidak masuk, tidak terintegrasi kedalam genom dan tidak terekspresikan didalam eksplan, sehingga tidak mampu bertahan dalam media yang mengandungantibiotik higromisin. Semua kalus dari eksplan yang tidak ditransformasi(kontrol) berubah warna menjadi hitam dan mati (Gambar 6). Kondisi ini terjadikarena pengaruh penambahan antibiotik pada media regenerasi. Konsentrasi 40mg/L higromisin pada pembentukan kalus termasuk tinggi. Pada penelitianSalsabila (2015) penggunaan dosis 10 mg/L higromisin sudah dapat menyeleksikalus yang resisten terhadap higromisin, dan dosis dinaikkan menjadi 20 mg/Luntuk menyeleksi tunas kentang Agria transgenik. Penggunaan dosis yang lebihrendah pada seleksi kalus transgenik putatif dikarenakan kalus yang berupakumpulan sel dan belum terdiferensiasi memiliki sifat yang lebih sensitif daripadatunas.

Gambar 6 Perkembangan kalus non-transgenik. (A) kalus yang ditransformasimengalami browning, (B) kalus kontrol yang tidak ditransformasimengalami browning.

Tunas transgenik putatif yang mengandung gen Hd3a dengan promoterrolC serupa dengan tunas transgenik putatif Hd3a dengan promoter 35S. Tunastersebut tumbuh dengan normal dan beberapa terlihat mampu membentuk umbilebih cepat (Gambar 7). Pada umur 4 minggu, satu tanaman transgenik yangmengandung gen Hd3a dibawah kendali promoter rolC menghasilkan umbi.Tanaman non transgenik pada umur yang sama tidak menghasilkan umbi. Hal ini

15

menunjukkan bahwa gen Hd3a mampu menginduksi pembentukan umbi padatanaman kentang kultivar Jala Ipam transgenik secara in vitro.

Gambar 7 Tanaman kentang kultivar Jala Ipam in vitro berumur 4 minggu.(A) Tanaman transgenik, (B) tanaman non-transgenik

Baik tanaman transgenik maupun tanaman non transgenik secara in vitrotidak menghasilkan bunga. Umur 4 minggu tidak cukup untuk berbunga baik padatanaman transgenik maupun non-transgenik. Dalam kondisi di lapang di Indonesiakultivar Jala Ipam sulit berbunga. Untuk mengetahui pengaruh gen Hd3a terhadappembungaan, tanaman kentang transgenik harus ditanam di lapang. Umbi G0sangat baik digunakan sebagai bibit untuk mengetahui ekspresi gen Hd3a dilapang karena efek zat pengatur tumbuh di media kultur in vitro sudah tidak adalagi.

Pada penelitian ini transformasi genetik pada kentang kultivar Jala Ipammemiliki efisiensi transformasi sebesar 18% pada tanaman yang ditransformasimenggunakan p2K1-Hd3a dan 7% pada tanaman tanaman yang ditransformasidengan pC1300-Hd3a (Tabel 1). Efisiensi transformasi kentang kultivar Jala Ipamlebih rendah dibandingkan dengan efisiensi transformasi yang dilakukan padapenelitian sebelumnya yang juga menggunakan gen Hd3a, seperti pada Jatropacurcas sebesar 26.67% (Sulistyaninngsih 2012), pada Nicotiana benthamianasebesar 86% (Syafitri 2012), dan kentang kultivar Diamant sebesar 21.21%(Mardiyyah 2014). Namun jika dibandingkan dengan kentang kultivar Agria, nilaiefisiensi transformasi Jala Ipam lebih besar. Kentang kultivar Agria yangditransformasi dengan gen Hd3a dibawah kendali promoter rolC yang terdapatpada plasmid p2K1-Hd3a memiliki efisiensi transformasi sebesar 5.01%.

Tabel 1 Efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi gen Hd3a pada tanamankentang kultivar Jala Ipam

16

Perbedaan nilai efisiensi transformasi dapat dipengaruhi oleh spesies dankultivar yang digunakan. Rendahnya efisiensi transformasi pada penelitian iniantara lain disebabkan karena genotipe tanaman Jala Ipam merupakan kentanghasil seleksi positif dari variasi somaklonal Russet Burbank sehingga memilikikesamaan ciri dan sifat dengan kentang varietas Russet Burbank. Penelitan Newellet al. (1991) melaporkan dari 225 eksplan kentang varietas Russet Burbank yangditransformasi, efisiensi transformasi pada penelitian tersebut rata-rata sebesar2%. Penelitian Chang et al. (2002) menginformasikan bahwa pembentukan tunaspada tanaman kentang varietas Russet Burbank dimulai dua bulan setelahkokultivasi dan pembentukan akar dua minggu setelahnya, dengan efesiensitransformasi sekitar 6.5% dari total semua perlakuannya. Jika dibandingkandengan kedua penelitian tersebut, efisiensi transformasi kentang kultivar JalaIpam pada penelitian ini relatif sama bahkan lebih besar.

Varietas Russet Burbank merupakan salah satu varietas kentang yangmemiliki sifat rekalsitran (sulit) untuk ditransformasi dan memiliki kemampuanberegenerasi rendah jika dibandingkan dengan varietas lain dari Solanumtuberosum lainnya (Newell et al. 1991). Namun, penelitian ini membuktikanbahwa kultivar Jala Ipam termasuk kultivar yang cukup mudah untukditransformasi serta memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi.

Efisiensi regenerasi kentang kultivar Jala Ipam sebesar 100% baik untukeksplan yang ditransformasi dengan p2K1-Hd3a, maupun eksplan yangditransformasi dengan pC1300-Hd3a (Tabel 1). Efisiensi regenerasi kultivar JalaIpam sama dengan efisiensi regenerasi kentang kultivar Baraka (Bustomi 2014),kentang kultivar Diamant (Mardiyyah 2014), dan kentang kultivar Agria(Salsabila 2015), yang masing-masing memiliki efisiensi transformasi sebesar100%. Namun jika dibandingkan dengan penelitian Newell et al. (1999) yangmenyatakan bahwa efisiensi regenerasi dari hasil transformasi kentang varietasRusset Burbank sebesar 8%, efisiensi regenerasi kentang kultivar Jala Ipam jauhlebih besar.

Persentase regenerasi dipengaruhi oleh varietas, waktu infeksi, dan periodekokultivasi (Molla et al. 2012). Pada penelitian Molla et al. (2012) regenerasi100% didapatkan dari waktu infeksi 30 menit dan waktu kokultivasi 3 hari. Waktu40 menit akan menyebabkan penurunan persentase regenerasi, karena bakteri akantumbuh secara berlebih pada permukaan eksplan sehingga viabilitas jaringantanaman menurun. Pada penelitian ini walaupun menggunakan waktu infeksinyahanya 10 menit, tetapi bakteri A. tumefaciens yang digunakan sebagai perantaramasih tumbuh secara berlebihan.

Penghambatan pertumbuhan bakteri dilakukan dengan menambahkanantibiotik cefotaxime. Penambahan antibiotik cefotaxime bertujuan untukmematikan A. tumefaciens yang digunakan sebagai perantara transformasi.Namun, penambahan cefotaxime sebanyak 100 mg/L dapat menghambatperkembangan eksplan. Semakin tinggi penambahan cefotaxime pada mediamenyebabkan penurunan efisiensi regenerasi (Kazemi et al. 2014). Pemakaianantibiotik pada konsentrasi tinggi selain dapat membunuh sel tanaman yang tidaktertransformasi, juga dapat menghambat pertumbuhan sel tanaman yang ditransformasi, sehingga menyebabkan penundaan regenerasi (Tran dan Mishra2015). Jadi, pertumbuhan A. tumefaciens yang berlebihan pada saat ko-kultivasidan seleksi secara tidak langsung menghambat pertumbuhan eksplan dan kalus.

17

Identifikasi Tanaman Transgenik

Identifikasi tanaman transgenik melalui deteksi keberadaan transgen Hd3apada tanaman hasil transformasi dilakukan dengan PCR. Pasangan primer yangdigunakan adalah rolC-F dan Hd3a-FP-R untuk tanaman yang ditransformasidengan p2K1-Hd3a. Pasangan primer tersebut merupakan sekuen yang digunakanoleh Tamaki et al. (2007) saat mengkonstruksi vektor. Primer rolC-F terletak padapromoter rolC dari plasmid p2K1-Hd3a. Primer rolC-F digunakan untukmengetahui keberhasilan sisipan dan membuktikan bahwa sisipan tersebut benaradalah rolC, karena kentang tidak mempunyai rolC. Primer Hd3a-FP-R adalahsekuen yang terletak pada Hd3a dari p2K1.

Hasil PCR dua tanaman dari tiga tanaman transgenik putatif yang diambilsecara acak menunjukkan bahwa tanaman tersebut adalah transgenik. Hasil PCRmenunjukkan bahwa dua tanaman tersebut memiliki fragmen DNA berukuran 821pasang basa (pb) yang sama dengan fragmen DNA yang terdapat pada plasmidp2K1-Hd3a yang mengandung gen Hd3a dibawah kendali promoter rolC(Gambar 8A). Hasil ini menunjukkan bahwa transgen Hd3a terintegrasi padagenom tanaman kentang kultivar Jala Ipam transgenik. PCR pada tanaman non-transgenik dengan primer yang sama tidak menghasilkan pita.

Gambar 8 Hasil analisis PCR DNA tanaman kentang Jala Ipam transgenik yangditrasformasi dengan p2K1-Hd3a. Hasil PCR genom dengan primerrolC-F dan Hd3a-FP-R (A) dan primer aktin (B). M= penanda 1kb, P= plasmid p2K1-Hd3a, NT = tanaman non transgenik, 1-3 = tanamaJala Ipam transgenik putatif.

Pada penelitian ini aktin digunakan sebagai kontrol keberadaan DNAtanaman. Semua tanaman, baik transgenik putatif maupun non-transgenikmengandung gen aktin, sedangkan p2K1-Hd3a tidak mengandung aktin (Gambar8B). Hal ini menunjukkan bahwa DNA dari semua tanaman adalah dalam keadaanbaik. Gen aktin merupakan housekeeping gene dan bersifat konservatif sehinggadipakai sebagai kontrol internal dalam analisis DNA dan RNA

Integrasi T-DNA ke genom tanaman kentang kultivar Jala Ipam denganpC1300-Hd3a dikonfirmasi dengan PCR menggunakan pasangan primer 35S-Fdan Hd-R. Primer 35S-F adalah sekuen pada promoter 35S, sedangkan primer Hd-R merupakan sekuen pada posisi 3’ dari gen Hd3a yang berujung pada kodonakhir (Sulistyaningsih 2012). Primer 35S-F digunakan untuk mengetahuikeberhasilan sisipan dan agar dapat mengontrol ekspresi gen Hd3a yangdimasukkan.

18

Gambar 9 Hasil analisis PCR DNA tanaman kentang transgenik yangditransformasi dengan plasmid pC1300-Hd3a. Hasil PCR genomtanaman transgenik putatif dengan primer spesifik 35S-F dan Hd-R(A) dan primer aktin (B). M = Penanda 1 kb, P = plasmid pC1300-Hd3a, NT = tanaman non-transgenik, 1-4 = tanaman Jala Ipamtransgenik putatif.

Hasil PCR terhadap empat tanaman transgenik putatif yang ditransformasimenggunakan pC1300-Hd3a menunjukkan bahwa empat tanaman tersebutmengandung gen Hd3a dan promoter 35S CaMV dengan ukuran fragmen DNAsebesar 914 pb, sedangkan tanaman non-transgenik tidak mengandung gentersebut (Gambar 9A). Hal ini menunjukkan bahwa keempat tanaman transgenikmengandung transgen Hd3a dengan promoter 35S CaMV, sedangkan tanamannon-transgenik tidak mengandung gen tersebut. PCR menggunakan primer aktinpada tanaman transgenik dan non-transgenik menghasilkan pita berukuran 550 pb(Gambar 9B), yang menunjukkan bahwa kualitas DNA dari semua tanaman baiktransgenik putatif maupun non-transgenik adalah baik.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Transformasi genetik tanaman kentang kultivar Jala Ipam dengan plasmidp2K1-Hd3a dan plasmid pC1300-Hd3a secara terpisah telah berhasil dilakukan.Gen Hd3a dibawah kendali promoter rolC dan Hd3a dibawah kendali promoter35S CaMV telah berhasil diintegrasikan ke dalam genom tanaman kentang JalaIpam transgenik.

Saran

Analisis lebih lanjut untuk mengetahui ekspresi gen Hd3a denganmelakukan analisis quantitative PCR (qPCR), dan pengamatan morfologi padatanaman kentang Jala Ipam transgenik perlu dilakukan pada dataran tinggi dandataran rendah.

19

DAFTAR PUSTAKA

Abe M, Kobayasi Y, Yamamoto S, Daimon Y, Yamaguchi A, Ikeda Y, Ichinoki H,Notaguchi M, Goto K, Araki T. 2005. FD, a Bzip protein mediatingsignals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex. Science.309:1052-1056.

Abelenda JA, Navarro C, Prat S. 2014. Flowering and tuberization: a tale of twonightshades. Trends Plant Sci. 19(2):115-122

Aksenova NP, Konstantinova TN, Golyanovskaya SA, Sergeeva LI, RomanovGA. 2012. Hormonal regulation of tuber formation in potato plants. Rus JPhysiol. 59(4):491-508.

Bouche F, D’Aloia M, Tocquin P, Lobet G, Detry N, Périlleux C. 2006.Integrating roots into a whole plant network of flowering time genes inArabidopsis thailiana. bioRxiv. doi: http://dx.doi.org/10.1101/036244.

Bou-Torrent J, Martinez-Garcia JF, Garcia-Martinez JL, Prat S. 2011. GibberellinA1 metabolism contributes to the control of photoperiod-mediatedtuberization in potato. Plos One. 6(9):e24458. 10p

BPTPY (Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Yogyakarta). 2004. Teknologibudidaya kentang industry di lahan sawah dataran medium KabupatenSleman D.I. Yogyakarta. Rekomendasi Teknologi Pertanian.

Bustomi. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivarBaraka dengan gen pembungaan Hd3a [Skripsi]. Bogor (ID): InstitutPertanian Bogor.

Carrera E, Jackson SD, Prat S. 1999. Feedback control and diurnal regulation ofgibberellins 20-oxidase transcript levels in potato. Plant Physiol.199:765-774.

Chang M, Culley D, Choi JJ, Hadwiger LA. 2002. Agrobacterium-mediated co-transformation of a pea β-1,3-glucanase and chitinase genes in potato(Solanum tuberosum L. c.v. Russet Burbank) using a single selectablemarker. Plant Sci. 163:83-89.

Churiyah, Wattimena GA, Gunawan LW, Sudarsono. 1994. Respon beberapakultivar kentang in vitro terhadap infeksi Agrobacterium. ProsidingSimposium Hortikultura Nasional.

Coelho CP, Costa Netto AP, Colasanti J, Chalfun-Junior A. 2013. A proposedmodel for flowering signaling pathway of sugarcane under photoperiodiccontrol. Gen Mol Res. 12(2):1347-1359.

Dhital SP, Lim HT, Manandhar HK. 2010. Direct and efficient plant regenerationfrom different explants sources of potato cultivars as influenced by plantgrowth regulators. Nepal J Sci Tech. 12:1-6

Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities offresh leaf tissue. Phytochem Bull. 19: 11-15. [internet]. [diunduh 2014Januari 30]. Tersedia dari:http://www.Mendeley.co/research-papers/.

Gelvin SB. 2003. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biologybehind the “gene-jockeying” tool. Microb Mol Biol Rev. 1:16-37.

Goldberg-Moeller R, Shalom L, Shlizerman L, Samuel S, Zur N, Ophir R,Blumwald E, Sadka A. 2013. Effects of gibberellins treatment duringflowering induction period on global gene expression and the

20

transcription of flowering-control genes in citrus buds. Plant Sci. 198:46-57.

Gonzalez-Schain ND, Suarez-Lopez P. 2008. CONSTANS delay flowering andaffects tuber yield in potato. Biol Plant. 52(2):251-258.

Gonzalez-Schain ND, Diaz-Mendoza M, Zurczak M, Suarez-Lopez P. 2012.Potato CONSTANS is involved in photoperiodic tuberization in graft-transmissible manner. Plant J. (70):678-690.

Hannapel DJ. 2007. Signalling the Induction of Tuber Formation. Di dalam :Vreugdenhil D, Bradshaw J, Gebharrdt C, Govers F, MacKorren DKL,Taylor MA, Ross HA, editor. Potato Biology and BiotechnologyAdvances and Perspectives. UK: Elsavier. Hlm 237-256.

Handoko, Irsal L, Salwati. 2011. Pengembangan teknologi adaptasi perubahaniklim pada tanaman kentang melalui perakitan model simulasi hubunganintersepsi radiasi surya dan curah hujan pada tajuk tanaman dalammenentukan hasil umbi. Ringkasan Eksekutif Hasil-hasil Penelitian.Kerjasama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi(KKP3T). [internet]. [diunduh 2014 April 14]. Tersedia darihttp://www.litbang.deptan.go.id/ks/one/749/file/PENGEMBANGAN-TEKNOLOGI-ADA.pdf.

Haverkort AJ. 2007. Potato Crop Respons to Radiation and Daylenght. Di dalam :Vreugdenhil D, Bradshaw J, Gebharrdt C, Govers F, MacKorren DKL,Taylor MA, Ross HA, editor. Potato Biology and BiotechnologyAdvances and Perspectives. UK: Elsavier. Hlm 353-363.

Imaizumi T, Kay S. 2006. Photoperiodic control of flowering, not only bycoincidence. Trends Plant Sci. 11: 550-558.

Jackson SD. 1999. Multiple signaling pathways control tuber induction in potato.Plant Physiol. 199:1-8.

Kashani K, Javaran MJ, Mohebondini M, Moieni A, Abadi MSD. 2012.Regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of three potatocultivars (Solanum tuberosum cv, Desiree, Agria and Marfona) by humanproinsulin gene. AJCS. 6(7):1212-1220.

Kaufmann K, Wellmer F, Muiño JM, Ferrier T, Wuest SE, Kumar V, Serrano-Mislata A, Mudueño F, Krajewski P, Meyerowitz EW et al. 2010.Orchestration of floral initiation by APETALA1. Science. 328:85-89.

Kazemi EM, Jonoubi P, Majd A, Pazhouhandeh M. 2014. Restriction of negativeeffects of cefotaxime in tomato transformation by using FeEDDHA. IntiJ Farm Alli Sci. 3(5):538-542.

[KEMENTAN] Kementrian pertanian. 2015. Berita resmi PVT. [internet]. [diunduh2015 September 3]. Tersedia pada http://ppvt.setjen.pertanian.go.id.

[KEMENTAN] Kementrian pertanian. 2015. Rencana strategis kementrianpertanian tahun 2015-2019. [internet]. [diunduh 2015 Desember 30].Tersedia pada http://www.pertanian.go.id/file/RENSTRA_2015-2019.pdf

Khan SK, Sjahril R, Nakamura I, Mii M. 2008. Production of transgeneic potatoexhibiting enhanced resistance to fungal in fections and herbicideapplication. Plant Biotechnol Rep. 2:13-20.

Khatun A, Hasan MM, Bachchu MAA, Moniruzzaman M, Nasiruddin KM.2012.Agrobacterium-mediated genetic transformation of Potato (Solanumtuberosum L.) var Cardinal and Heera. The Agriculturist. 10(1):81-86.

21

Kloosterman B, Abelenda JA, Gomez MC, Oortwijn M, Boer JM, KowitwanichK, Horvath BH, Eck HJ, Smaczniak C, Prat S, et al. 2013. Naturallyoccurring allele diversity allows potato cultivation in northern latitudes.Nature. 495:246-250.

Kojima S, Takahashi Y, Kobayashi Y, Monna L, Sasaki T, Araki T, Yano M, 2002.Hd3a a rice ortholog of Arabidopsis FT gene, promotes transition toflowering downstream of Hd1 under short-day conditions. Plant CellPhysiol. 43:1096-1105.

Komiya R, Ikegami A, Tamaki S, Yokoi S. Shimamoto K. 2008. Hd3a and RFT1are essential for flowering in rice. Development. 135:767-774.

Li M, Li H, Hu X, Pan X, Wu. 2011. Genetic transformation and overexpressionof a rice Hd3a induces early flowering in Saussurea involucrate Kar. EtKir. Ex Maxim. Plant Cell Tiss Organ Cult. 106:363-371.

Manguntungi B. 2014. Transformasi genetic kentang (Solanum tuberosum L.)kultivar Atlantik dengan gen penyandi lisozim melalui perantaraAgrobacterium tumefaciens [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor

Mardiyyah IM. 2015. Introduksi gen pembungaan Hd3a ke dalam tanamankentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Diamant [skripsi]. Bogor (ID):Institut Pertanian Bogor.

Martinez-Garcia JF, Virgos-Soler A, Prat S. 2002. Control of photoperiod-regulated tuberization in potato by the Arabidopsis flowering-time geneCONSTANTS. Proc Natl Acad Sci. 99(23):15211-15216.

Matsoukas IG. 2015. Florigens and antiflorigens: a molecular geneticunderstanding. Essays Biochem. 58:133-149

Maulani E. 2015. Transformasi genetic kentang (Solanum tuberosum L.) kultivarKennebec dengan gen Hd3a [skripsi]. Bogor (ID): Institut PertanianBogor.

McGregor I. 2007. The fresh potato market. Di dalam : Vreugdenhil D, BradshawJ, Gebharrdt C, Govers F, MacKorren DKL, Taylor MA, Ross HA, editor.Potato Biology and Biotechnology Advances and Perspectives. UK:Elsavier. Hlm 3-25.

Mikschofsky H, Hartmann A, Janezyk P, Keil GM, KÖnig P, Schirrmeier H,Hammer M, Junghans H, Schmidt K, Schmidtke J, et al. 2011.Expression of the viral antigen VP60 in transgenic potatoes and its effecton the nutritional composition of tuber. Food Nut Sci. (2):74-86.Doi:10.4236/fns.2011.22010

Molla MMH, Nasiruddin KM, Al Amin M, Haque MS, Maniruzzaman. 2012.Standarization of protocol for Agrobacterium-mediated transformation inpotato (Solanum tuberosum L.). Bangladesh J Agril Res. 37(2):185-194.

Mutasa-Gottgens E, Hedden P. 2009. Gibberellin as a factor in floral regulatorynetwork. J Exp Bot. 60(7):1979-1989.

Nasir M. 2002. Bioteknologi, Potensi dan Keberhasilannya dalam BidangPertanian. Jakarta (ID): PT Raja Grafindo Persada.

Navarro C, Abelenda JA, Oro EC, Ceullar CA, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K,Prat S. 2011. Control of flowering and storage organ formation in potatoby FLOWERING LOCUS T. Nature. 478:199-123.

Newell CA, Rozman R, Hinchee MA. Lawson EC, Haley L, Sanders P, KaniewskiW, Tumer NE, Horsch RB, Fraley RT. 1991. Agrobacterium-mediated

22

transformation of Solanum tuberosum L. cv. Russet Burbank. Plant CellRep. 10:30-34.

Nurhasanah, Wattimena GA, Purwito A, Armini NMA, Suharsono. 2003.Transformasi genetic tanaman kentang cv. Atlantik denganmengintroduksikan gen hordothionin untuk mendapatkan ketahananterhadap penyakit bakteri. Bul. Argon. 31(2):63-67.

Nurrizky A. 2015. Rekayasa genetic pada tanaman kentang (Solanum tuberosumL.) kultivar Diamant dengan gen Hd3a dibawah kendali promoter 35SCaMV [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Prabaningrum L, Moekasan TK, Sulastrini I, Handayani T, Sahat JP, Sofiari E,Gunadi N. 2014. Teknologi Budidaya Kentang di Dataran Medium. BalaiPenelitian Tanaman Sayuran Pusat Penelitian dan PengembanganHortikultura. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. KementrianPertanian.

Prat, S. 2010. Hormonal and daylength control of potato tuberization. Di dalam:Davis, editor. Plant Hormones, Biosynthesis, Signal Transduction,Action!. Netherlands (NL): Springer. Hal 574-596.

Salsabila L. 2015. Transformasi genetic kentang (Solanum tuberosum L.) kultivarAgria dengan gen pembungaan Hd3a [skripsi]. Bogor (ID): InstitutPertanian Bogor.

Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotianabenthamiana transgenik [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Song YH, Ito S, Imaizumi T. 2013. Flowering time regulation: photoperiod andtemperature sensing in leaves. Trends Plant Sci. 18 (10):575-584.

Suarez-Lopez P. 2013. A critical appraisal of phloem-mobile signals involved intuber induction. [perspective article]. Front Plant Sci. 4(253):1-7.

Suharsono. 2015. Modifikasi Genetik Tanaman untuk meningkatkan produksipertanian. Bogor (ID). Orasi Ilmiah Guru Besar IPB. FakultasMatematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB, Bogor 28 Februari 2015.

Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a padatanaman jarak pagar (Jatropa curcas L.) [disertasi]. Bogor (ID): InstitutPertanian Bogor.

Syafitri LN. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan genpembungaan Hd3a dari padi [skripsi]. Bogor (ID): Institut PertanianBogor.

Tamaki S, Matsuo W, Wong HL, Yokoi S, Shimamoto K. 2007. Hd3a protein is amobile flowering signal in rice. Science. 316:1033-1036.

Tantowijoyo W, Fliert EV. 2006. All Abaout Potatoes, An Ecological Guide toPotato Integrated Crop Management. CIP-ESEAP Region and FAORegional Vegetable IPM program in South and Southeast Asia.82 hal.

Tran TN, Mishra NS. 2015. Effect of antibiotics on callus regeneration duringtransformation or IR 64 rice. Biotech Rep. 7:143-149.

Tsuji H, Tachibana C, Tamaki S, Taoka K, Kyozuka J, Shimamoto K. 2015. Hd3aPromotes lateral brancing in rice. Plant J. 2:256-266.

Wang JD, Lo SF, Li YS, Chen PJ, Lin SY, Ho TH, Lin JH, Chen LJ. 2013. Extopicexpression of OsMADS45 activates the upstream genes Hd3a and RFT1at an early development stage causing early flowering in rice. Bot Stud.54:12.

23

Wattimena GA. 1992. Bioteknologi Tanaman. Jakarta (ID): Dirjen Dikti. 185 hal.Wattimena GA. 2000. Pengembangan propagul kentang bermutu dan kultivar

kentang unggul dalam mendukung peningkatan produksi kentang diIndonesia. Bogor (ID). Orasi Ilmiah Guru Besar Tetap Ilmu Hortikultura.Fakultas Pertanian IPB, Bogor 2 September 2000.

Yano M, Katayose Y, Ashikari M, Yamanouchi U, Mona L, Fuse T, Baba T,Yamamoto K, Umehara Y, Nagamura Y, et al. 2000. Hd1, a majorphotoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice, is closely related tothe Arabidopsis flowering time gene CONSTANS. Plant Cell. 12:2473-2483.

Yuan-Li S, Wei-Jiang L. 2012. Molecular regulatory network of flowering byphotoperiod and temperature in rice. Rice Sci. 19(3):169-176.

24

LAMPIRAN

Lampiran 1 Karakteristik Kentang kultivar Jala Ipam (Kementan 2015)

Asal : Variasi somaklonal IPB 73Silsilah : Seleksi klon unggul IPB 73Bentuk penambapng batang : Bersegi tigaDiameter batang : 1.0 - 1.1 cmWarna batang : HijauWarna daun : HijauBentuk daun : Oval memanjangUkuran daun : Panjang 6.5 - 9.3 cm, Lebar 4.4 - 4.8 cmBentuk bunga : Seperti bintang Warna kelopak bunga : HijauWarna mahkota bunga : PutihWarna kepala putik : Kuning keputihanWarna benangsari : KuningUmur mulai berbunga : 40 - 60 hari setelah tanamUmur mulai panen : 90 - 105 hari setelah tanamBentuk umbi : LonjongUkuran umbi : Panjang 6.5-9.3cm,

Diameter 5.2 - 5.3cmBerat per umbi : 157.1 - 190.8 gramWarna kulit umbi : KuningWarna daging umbi : PutihRasa umbi : EnakKandungan gula pereduksi : 0.13 %Total gula : 0.29 %Sukrosa : 0.16 %Kandungan pati : 16.75 %Jumlah umbi per tanaman : 11 - 12 umbiDaya simpan umbi pada suhu 24 oC : 30 - 90 hari setelah tanamHasil umbi per hektar : 21.7 - 24.2 tonPopulasi per hektar : 30000 - 33000 tanamanKebutuhan benih per hektar : 1400 - 1800 kgPenciri utama : Bentuk daun oval memanjang, bentuk

umbi lonjong, warna daging umbi putih,kulit umbi berwarna kuning danbercorak menjala.

Keunggulan : Kualitas umbi baik, daging umbi putih,bentuk umbi lonjong, kandungan patitinggi, kandungan gula rendah, cocokuntuk konsumsi kentang olahan ataufrench fries dan potensi produksi cukuptinggi.

25

Wilayah adaptasi : Tumbuh baik pada daerah dataran tinggidengan ketinggian 1200 – 1400 m dplpada musim kemarau.

26

Lampiran 2 Komposisi Media Dasar MS (Murashige dan Skoog 1962)

Nama stock BahanKonsentrasi senyawa dalam media

(mg/L)

A NH4NO3 1650B KNO3 1900C KH2PO4 170

H3BO3 6.2NaMoO4

.2H2O 0.25CoCl2

.6H2O 0.025KI 0.83

D CaCl2.2H2O 440

E MgSO4.7H2O 370

MnSO4.4H2O 22.3

ZnSO4.7H2O 8.6

CuSO4.5H2O 0.025

F Na2EDTA 37.3 FeSO4

.7H2O 27.8Vitamin Thiamine-HCl 0.1

Niacin (asam

nikotinat)0.5

Pyridoxine-HCl 0.5 Glycine 2

Myo Myo inositol 100Sukrosa Sukrosa 30

Agar Agar 8a dibutuhkan 2x konsentrasi stock A, B, dan D untuk membuat MS2 makro

27

Lampiran 3 Penentuan Efisiensi Transformasi dan Efisiensi Regenerasi

Efisiensi transformasi (%) = x 100%

Efisiensi regenerasi (%) = x 100%

28

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Cirebon pada tanggal 23 Januari 1982, merupakananak ke empat dari empat bersaudara pasangan Bapak Askawi (alm.) dan IbuHartini. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD Karang Anyar IVIndramayu pada tahun 1994, menyelesaikan pendidikan menengah pertama diSMP Negeri 2 Sindang pada tahun 1997, dan pendidikan menengah atas di SMANegeri 1 Sindang Kabupaten Indramayu pada tahun 2000. Penulis melanjutkanpendidikan Sarjana di Institut Pertanian Bogor (IPB), Jurusan Budidaya Pertanian,Program Studi Hortikultura melalui jalus USMI, dan lulus pada tahun 2004.Tahun 2013, penulis melanjutkan pendidikan di Sekolah Pascasarjana InstitutPertanian Bogor (IPB) di Program Studi Bioteknologi.

Penulis pernah bekerja di Sekolah Alam Bogor dari tahun 2005 hinggatahun 2015. Penulis telah menikah dengan Dody Darsono ST MT dan memilikiseorang anak laki-laki bernama Abrisam Nur Alam Syah.

Sebagian penulisan dari karya ini telah dimasukkan ke dalam jurnalAGRIVITA dan dalam proses review.