TITRASI FORMAL ASAM AMINO

I. Tujuan 1. Menghidrolisis protein dengan enzim protease2. Membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva mg

nitrogen asam amino terhadap waktu titrasi formal asam aminoII. Dasar Teori

Protein adalah senyawa organik kompleks yang memiliki bobot molekul tinggi

yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan

satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon,

hydrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Suatu molekul

protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu dengan susunan yang sudah

tertentu pula dan bersifat turunan (Aisjah Girindra dalam Tika, 2010).

Asam amino merupakan ion dipolar yang pada umumnya mempunyai dua atau

lebih pKa. Asam amino yang menyusun suatu protein tertentu, kadar asam aminonya

tidak sama. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam

amino tidak larut di dalam eter karena merupakan senyawa dipolar dan dalam air

menunjukkan struktur kutub ganda (Zwitter ion) yaitu:

Gambar 1. Struktur dipolar asam amino

Dari gambar tersebut, gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion ammonium,

sedangkan gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai anion karboksilat.

Struktur ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki

titik leleh agak tinggi.

Asam amino bersifat amfoterik artinya berperilaku sebagai asam dan

mendonasikan proton pada basa kuat atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan

menerima proton dari asam kuat. Prilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut

untuk asam amino dengan gugus amino dan satu gugus karboksil:

Gambar 2. Kesetimbangan asam amino pada berbagai pH

Bila suatu protein dihidrolisis, akan didapatkan asam aminonya. Hidrolisis protein

dapat dilakukan dengan menggunakan enzim protease dari tripsin. Protein jika

dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam amino bebas ini bila

direaksikan dengan formaldehid berlebih akan membentuk derivate metilol. Reaksi

ini menyebabkan asam amino bebas bentuk isoelektrik kehilangan satu proton dari

gugus NH3+ (Tika, 2010).

NH3+CHRCOO- ↔ H2NCHRCOO- + H+

H2NCHRCOO- + 2HCHO ↔ (HOCH2)2NCHRCOO-

H+ yang dilepaskan pada reaksi ini dapat dititrasi langsung dengan NaOH sampai

dengan pH 8,0 (titik akhir indicator ekuivalen). Titrasi asam amino atau campuran

asam amino dalam keberadaan formaldehid disebut dengan titrasi formal asam amino.

Titrasi ini merupakan metode analisis untuk mengikuti pembentukan asam amino

bebas yang dihasilkan pada proses hidrolisis protein oleh enzim proteotik (Tika,

2010).

Pada percobaan ini dibuat kurva titrasi dari asam amino yang diperoleh dari hasil

hidrolisis protein dengan menggunakan enzim protease. Selama hidrolisis suatu

protein, sejumlah gugus karboksil dan gugus amino bertambah terus. Penentuan

secara kuantitatif salah stau gugus akan dapat memberikan indikasi untuk mengetahui

derajat hidrolisis protein. Menurut teori zwiiterion, kalau suatu asam amino dalam

larutan dititrasi dengan basa, berarti ion hydrogen dari ammonium yang dititrasi.

Gugus ammonium dari asam amino yang bersifat buffer pada daerah pH tinggi atau di

atas pH 11, sehingga tidak mungkin dititrasi sampai titik akhir. Hal yang sama juga

terjadi pada gugus karboksil yang bersifat buffer pada pH rendah sehingga tidak

mungkin juga dititrasi dengan basa (Tika, 2010).

Untuk mengatasi hal tersebut, maka formaldehid ditambahkan ke dalam larutan

asam amino agar bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga

memungkinkan gugus ammonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan

dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan indicator (Tika, 2010).

Reaksi yang terjadi selama titrasi formal asam amino adalah :

Gambar 3. Reaksi selama Proses Titrasi Formal Asam Amino

Penambahan formalin ke dalam larutan asam amino akan membentuk dimetilol.

Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus amino dari protein sudah terikat dan

tidak akan mempengaruhi titik akhit titrasi sehingga titik akhir titrasi dapat ditentukan

dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolptalein (Tika, 2010).

Pada praktikum ini digunakan reagen gelatin yang merupakan produk alami yang

diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin merupakan protein yang larut dan

bersifat gelling agent (bahan pembuat gel). Sumber bahan baku gelatin dapat berasal

dari tulang dan kulit dari sapi atau babi. Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi

besar, protein dan 4-hidroksi residu.

Struktur gelatin adalah sebagai berikut :

Gambar 4. Struktur Gelatin

III. Alat dan Bahan 1. Alat – alat

No Nama Alat Ukuran Jumlah1 Gelas Kimia 100 dan 500 mL 4 buah2 Buret 50 mL 1 buah3 Statif dan Klem - 1 set4 Erlenmeyer 100 mL 3 buah5 Inkubator Air - 1 buah6 Gelas Ukur 50 dan 10 mL 2 buah7 Labu Ukur 100 dan 500 mL 2 buah8 Termometer 100oC 1 buah

2. Bahan- Bahan

No Nama Bahan Konsentrasi Jumlah1 Larutan gelatin 5 % 100 mL2 Larutan NaOH 0,2 M dan 0,02 M 200 mL3 Larutan HCl 0,1 M 50 mL4 Larutan fenol ftalein 1 % 10 mL5 Larutan Formaldehid 40 % 100 mL6 Larutan tripsin 1% 15 mL7 Aquades - 300 mL

IV. Tabel Hasil Pengamatan

No Prosedur Kerja Hasil Pengamatan1 Disiapkan 100 mL larutan - Gelatin berupa serbuk berwarna putih

gelatin kekuningan- NaOH adalah larutan bening tak berwarna- Indikator fenolftalein berwarna putih keruh- Larutan gelatin berwarna kuning kecoklatan

2 Ditambahkan ke dalamnya 1 mL fenol ftalein dan larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes sampai larutan berubah warnanya menjadi merah muda

Sebanyak 110 tetes larutan NaOH ditambahkan sampai terbentuk larutan berwarna merah muda

3 Sebanyak 0,1 M HCl ditambahkan tetes demi tetes sampai teoat warna merah muda hilang (pH= 8,0 )

Sebanyak 175 tetes larutan HCl ditambahkan ke dalam larutan sampai warna larutan kembali bening kekuningan dengan pH sebesar 8,11

4 Larutan gelatin yang telah dinetralisir direndam dalam incubator air pada suhu 38oC

Larutan direndam dalam incubator air pada suhu 38oC

5 Pada Tabung lain, sebanyak 25 mL larutan tripsin ditambahkan 3 tetes fenolftalein dan tetes demi tetes larutan NaOH 0,2 M sampai warnanya berubah menjadi merah muda

- Tripsin adalah serbuk berwarna putih - Larutan tripsin berwarna putih keruh- Setelah diteteskan 53 tetes NaOH larutan

menjadi berwarna merah muda

6 Larutan HCl 0,1 M diteteskan sampai warna merah muda hilang (pH= 8,00)

Larutan ditambahkan 85 tetes HCl sehingga warna merah mudanya hilang dengan pH sebesar 8,02

7 Campuran tersebut diinkubasi dalam incubator air pada suhu 38o C selama beberapa menit

Larutan direndam dalam incubator air pada suhu 38oC

8 Larutan tripsin ditambahkan ke dalam larutan gelatin, dan diaduk perlahan

Setelah kedua larutan tersebut dicampur , larutan menjadi berwarna kuning keruh

9 Setelah tercampur merata, diambil 10 mL campuran dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 100 mL (control /waktu “0” menit )

Diambil campuran sebanyak 10 mL

10 Dididihkan (untuk merusak enzim) selanjutnya didinginkan

Campuran dididihkan selam 3 menit dan warna tetap kuning keruh

11 Sebanyak 15 mL formalin netral dan 3 tetes fenolftalein ditambahkan ke dalam campuran tersebut

Setelah campuran ditambahkan formalin dan indikator pp warna larutan tetap kuning keruh

12 Pada interval waktu 15,30,45,60,90 dan 120 menit dari waktu ke nol dilakukan hal yang sama seperti pada kontrol.

Setelah dititrasi dengan NaOH 0,02 M warna larutan menjadi merah muda. Adapun Volume NaOH yang diperlukan

Pada masing- masing reaksi diatas, dilakukan titrasi dengan 0,02 M larutan NaOH sampai titik akhir warna merah muda

No Waktu (menit) Volume NaOH (mL)1 Kontrol (0) 14,22 15 16,63 30 17,34 45 18,55 60 21,06 90 22,07 120 23,3

V. Analisis Data dan Pembahasan

ANALISIS DATA1. Kurva titrasi asam amino yang dinyatakan dengan hubungan volume NaOH terhadap

waktu

Berdasarkan hasil praktikum diperoleh data hasil titrasi asam amino dengan menggunakan

NaOH sebagai titran yaitu sebagai berikut.

Tabel 1. Hasil titrasi asam amino dengan menggunakan NaOH sebagai titran

Waktu (menit) Volume (mL)

0 14,2

15 16,6

30 17,3

45 18,5

60 21,00

90 22,00

120 23,3

Berdasarkan data di atas, maka dapat dibuat kurva titrasi hubungan volume NaOH terhadap

waktu sebagai berikut.

0 20 40 60 80 100 120 1400

5

10

15

20

25

30

35

f(x) = 0.0746706586826347 x + 15.1455089820359R² = 0.943726128823434

Kurva Titrasi Hubungan Volume NaOH Terhadap Waktu

Hubungan volume NaOH terhadap waktu

Linear (Hubungan volume NaOH terhadap waktu)

Waktu (menit)

Volu

me

NaO

H (m

L)

Gambar 1. Kurva Hubungan Volume NaOH terhadap Waktu

Berdasarkan kurva tersebut diatas, maka dapat dihitung derajat hidrolisis dari enzim tripsin

terhadap larutan gelatin melalui perhitungan sebagai berikut.

Derajat hidrolisis=∆ V NaOH

∆ t

????

2. Penentuan Jumlah Mg Asam Amino pada Tiap Volume NaOH saat Titrasi

Dengan mengasumsikan 1 mL NaOH ekivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, maka

dapat dihitung jumlah mg asam amino pada tiap volume NaOH saat titrasi. Adapun

perhitungannya yaitu sebagai berikut.

Pada waktu t = 0

Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 14,2 mL

Mol NaOH = 14,2 mL x 0,02 M = 0,284 mmol

1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,284 mmol

NaOH ekuivalen dengan:

0,1 mmol0,284 mmol

=1,4 mgx mg

x=0,284 mmol ×1,4 mg0,1 mmol

=3,976 mg nitrogen asamamino

Pada waktu t = 15

Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 16.6 mL

Mol NaOH = 16,6 mL x 0,02 M = 0,332 mmol

1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,332 mmol

NaOH ekuivalen dengan:

0,1 mmol0,332mmol

=1,4 mgxmg

x=0,332 mmol×1,4 mg0,1 mmol

=4,648 mg nitrogenasam amino

Pada waktu t = 30

Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 17,3 mL

Mol NaOH = 8,6 mL x 0,02 M = 0,346 mmol

1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,346 mmol

NaOH ekuivalen dengan:

0,1mmol0,346 mmol

=1,4 mgx mg

x=0,346 mmol× 1,4 mg0,1 mmol

=4,844 mgnitrogen asam amino

Pada waktu t = 45

Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 18,5 mL

Mol NaOH = 8,6 mL x 0,02 M = 0,37 mmol

1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,37 mmol

NaOH ekuivalen dengan:

0,1 mmol0,37 mmol

=1,4 mgx mg

x=0,37 mmol ×1,4 mg0,1 mmol

=5,18 mg nitrogenasam amino

Pada waktu t = 60

Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 8,95 mL

Mol NaOH = 8,95 mL x 0,02 M = 0,42mmol

1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,42 mmol

NaOH ekuivalen dengan:

0,1 mmol0,42 mmol

=1,4 mgxmg

x=0,42 mmol× 1,4 mg0,1 mmol

=5,88 mgnitrogen asam amino

Pada waktu t = 90

Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 22 mL

Mol NaOH = 22 mL x 0,02 M = 0,44 mmol

1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,44 mmol

NaOH ekuivalen dengan:

0,1mmol0,44mmol

=1,4mgx mg

x=0,44 mmol ×1,4 mg0,1 mmol

=6,16 mg nitrogen asamamino

Pada waktu t = 120

Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 23,3 mL

Mol NaOH = 23,3 mL x 0,02 M = 0,466 mmol

1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,466 mmol

NaOH ekuivalen dengan:

0,1mmol0,466 mmol

=1,4 mgx mg

x=0,466 mmol× 1,4 mg0,1 mmol

=6,524 mg nitrogen asamamino

Tabel 2. mg Nitrogen asam amino yang diperoleh dari hasil titrasi

Waktu (menit) Volume (mL) mg Nitrogen

asam amino

0 14,2 3,976

15 16,6 4,648

30 17,3 4,844

45 18,5 5,18

60 21,00 5,88

90 22,00 6,16

120 23,3 6,524

Berdasarkan data diatas, maka dapat dibuat kurva hubungan antara mg nitrogen asam

amino terhadap waktu yaitu sebagai berikut. (kurva blm)

Gambar 2. Kurva hubungan waktu terhadap mg Nitrogen asam amino

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dalam percobaan ini, dilakukan titrasi formal asam amino. Titrasi formal asam amino merupakan titrasi asam amino atau campuran asam amino dalam keberadaan formaldehida. Asam amino yang digunakan merupakan hasil degradasi dari gelatin (polipeptida) yang didegradasi menggunakan enzim protease yaitu tripsin. Adapun prinsip dari percobaan ini mengikuti kenyataan bahwa suatu protein mengikuti teori zwitter ion, dimana suatu asam amino walaupun memiliki dua sisi aktif (gugus –COOH dan gugus amina –NH2), sehingga dapat dititrasi menggunakan asam dan basa. Namun kenyataannya, gugus ammonium dari asam amino merupakan buffer pada pH tinggi (di atas pH 11) sehingga tidak mungkin untuk mentitrasinya pada titik akhir suatu indikator. Hal ini mengingat dimana suatu indikator pada umumnya memiliki trayek pH sedapat mungkin mendekati pH 7 karena titrasi asam basa merupakan suatu reaksi penetralan. Dalam percobaan ini, reagen yang digunakan adalah larutan gelatin. Gelatin merupakan polipeptida (protein) yang larut dalam air, hal ini terbukti dengan mudah larutnya gelatin ketika ditambahkan ke dalam aquades. Gelatin merupakan gelting agent (bahan pembuat gel), sehingga perlu diinkubasi pada suhu 38oC. Bila suhu inkubasi diatas 38oC, maka kemungkinan akan terbentuk gel yang akan mempengaruhi proses degradasi untuk menghasilkan asam amino.

Sebelum dilakukan proses titrasi dalam percobaan ini terlebih dahulu dilakukan proses pembuatan larutan gelatin dengan cara melarutkan 5 gram padatan gelatin ke dalam 100 mL aquades. Setelah dilarutkan dan diaduk terbentuk larutan gelatin yang berwarna kuning.

Larutan gelatin ini kemudian ditambahkan indikator fenolftalein sebanyak 1 mL dan ditambahkan larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes sehingga larutan gelatin berwarna merah muda. Adapun tujuan penambahan NaOH adalah agar larutan bersifat sedikit basa.

Larutan yang berwarna merah ini kemudian ditambahkan larutan HCl 0,1 M tetes demi tetes. Penambahan larutan HCl menyebabkan warna larutan kembali berwarna kuning. Penambahan larutan HCl bertujuan agar pH menjadi 8 dimana pada pH ini enzim tripsin akan mampu bekerja secara optimal. Dalam percobaan ini diperoleh pH setelah penambahan HCl yaitu 8,02. Hal yang sama juga dilakukan terhadap enzim tripsin, dimana dilakukan penambahan fenolftalein dan NaOH kedalam 25 mL larutan tripsin sehingga warna menjadi merah muda.

Kemudian larutan ini ditambahkan larutan HCl 0,1 M tetes demi tetes hingga warna merah muda akibat penambahan fenolftalein dan NaOH ini hilang. Hal ini dilakukan agar kondisi enzim tripsin sama dengan kondisi gelatin sehingga saat direaksikan akan terjadi reaksi yang sempurna.

Setelah itu, larutan gelatin dan tripsin ini diinkubasi dengan inkubator air pada suhu 38oC, dimana suhu ini dijaga supaya tidak melebihi suhu 38oC karena dapat menyebabkan enzim rusak yang ditandai dengan pembentukan gel yang sangat mempengaruhi proses degradasi menghasilkan asam amino. Setelah diinkubasi selama beberapa menit, kedua larutan ini kemudian dicampur. Dari pencampuran ini terbentuk larutan berwarna kuning kecoklatan. Tujuan pencamuran ini adalah untuk mengdegradasi larutan gelatin dengan menggunakan enzim tripsin. Tripsin merupakan enzim proteolitik yang hanya terdiri dari suatu rantai polipeptida. Enzim ini akan mendegradasi gelatin menghasilkan asam amino penyusunnya.

Sebanyak 10 mL dari larutan ini diambil dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan dilakukan pendidihan terhadap larutan ini dengan tujuan untuk merusak enzim. Kemudian dilakukan pendinginan terhadap larutan. Setelah dingin, larutan ditambahkan 15 mL larutan formaldehid dan 3 tetes fenolftalein. Warna larutan setelah ditambahkan formaldehid dan fenolftalein yaitu tetap berwarna kuning keruh. Larutan ini kemudian dititrasi dengan larutan NaOH 0,02 M. Titrasi dihentikan ketika larutan ini berubah warna menjadi merah muda.

Adapun penambahan formaldehid sebelum titrasi berfungsi agar gugus karbonilnya bereaksi dengan asam amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium bereaksi dengan NaOH dan membuffer pada pH yang lebih rendah serta dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator. Reaksi yang terjadi pada titrasi dengan menggunakan formalin merupakan reaksi pembentukan dimetilol. Larutan protein yang telah dinetralkan dengan basa (NaOH), ditambahkan formalin sehingga membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi yang terjadi antara gugus asam (karboksil) dengan basa (NaOH) sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein. Bila titik akhir titrasi diperoleh tepat, maka akan terjadi perubahan warna larutan dari bening menjadi merah muda. Reaksi yang terjadi dalam proses ini adalah sebagai berikut :

Berdasarkan Kurva hubungan volume NaOH terhadap waktu di atas, dapat diketahui bahwa semakin lama larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang digunakan untuk proses titrasi. Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis gelatin oleh tripsin menghasilkan sejumlah asam amino yang konsentrasinya bertambah seiring dengan bertambahnya interaksi antara larutan gelatin dengan larutan tripsin. Enzim tripsin yang semakin lama menghidrolisis gelatin menyebabkan gugus karboksil dan gugus amino yang dihasilkan semakin banyak. Dengan bertambahnya gugus ini, maka jumlah NaOH yang digunakan pada saat titrasi juga bertambah.

Secara kuantitatif dari kurva yang diperoleh, maka dapat dihitung derajat

hidrolisis dari enzim tripsin terhadap larutan gelatin. Berdasarkan hasil analisis data besar derajat

hidrolisis dari enzim tripsin terhadap larutan gelatin adalah 0,0122.

Selanjutnya dari kurva hubungan waktu terhadap mg Nitrogen asam amino di atas,

terlihat bahwa semakin lama waktu yang digunakan larutan gelatin untuk bereaksi dengan enzim

pankreatin maka semakin banyak pula mg nitrogen asam amino yang dihasilkan. Terdapat

hubungan yang searah antara waktu kontak dengan mg nitrogen asam amino. Hal ini terjadi

karena selama proses hidrolisis gelatin (protein) oleh enzim pankreatin menghasilkan sejumlah

gugus karboksil dan gugus amino yang bertambah sehingga nitrogen yang terdapat pada

dimethilol juga ikut bertambah.

SIMPULAN

Berdasarkan pembahasan di atas, maka diperoleh beberapa kesimpulan antara lain :

1. Protein dapat dihidrolisis dengan enzim protease dan melalui titrasi formal asam amino.2. Kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva mg nitrogen asam amino

terhadap waktu pada titrasi formal asam amino berbanding lurus dimana semakin lama larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi larutan asam amino tersebut maka semakin banyak pula mg nitrogen dari asam amino yang dihasilkan.