SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI · PDF fileGambar 2.2 Klasifikasi metode...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

SKRIPSI

NURUL ROBIATUL ADAWIYAH 109102000056

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA

OKTOBER 2013

SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI

TANAMAN KINA (Cinchona pubescens Vahl.)

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

NURUL ROBIATUL ADAWIYAH 109102000056

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA

OKTOBER 2013

SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI

TANAMAN KINA (Cinchona pubescens Vahl.)

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Nurul Robiatul Adawiyah

NIM : 109102000056

Tanda Tangan :

Tanggal : 2 Oktober 2013

v

Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh : Nama : Nurul Robiatul Adawiyah NIM : 109102000056 Program Studi : Farmasi Judul Skripsi : Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

DEWAN PENGUJI

Pembimbing 1 : Dr. Andria Agusta ( )

Pembimbing 2 : Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt. ( )

Penguji 1 : Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt. ( )

Penguji 2 : Puteri Amelia M.Farm., Apt. ( )

Ditetapkan di : Jakarta Tanggal : 2 Oktober 2013

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

ABSTRAK

Nama : Nurul Robiatul Adawiyah Program Studi : Farmasi Judul :

Jamur endofit diketahui berpotensi sebagai sumber metabolit bioaktif untuk bahan obat-obatan salah satunya sebagai antibakteri. Dalam penelitian ini, skrining aktivitas antibakteri metabolit bioaktif terhadap 10 isolat jamur endofit dari tanaman Cinchona pubescens Vahl. telah dilakukan. Hasil skrining antibakteri dengan metode bioautografi menunjukkan bahwa ekstrak kloroform jamur endofit 3-2-1-2 dan 1-3-1-1 aktif sebagai antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococus aureus dan Escherichia coli. Jamur endofit 1-3-1-1 yang memiliki aktivitas antibakteri paling besar di scaling up pada medium PDB (Potato Dextrose Broth) dan dikultivasi selama 3 minggu. Medium kultivasi dan biomassa jamur diekstraksi dengan kloroform dan difraksinasi untuk mendapatkan senyawa bioaktifnya. Kemudian dilakukan penentuan nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) dari fraksi murni 3e dengan metode mikrodilusi terhadap bakteri uji Staphylococus aureus dan Escherichia coli. Hasil uji KHM menunjukkan bahwa fraksi 3e memiliki nilai MIC 32 µg/ml terhadap bakteri uji Staphylococus aureus dan >128 µg/ml terhadap bakteri uji Escherichia coli.

Key words : Kina, Cinchona pubescens Vahl., jamur endofit, antibakteri,

bioautografi, KHM (Kadar Hambat Minimum).

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Screening, Isolation, and Antibacterial Activity of Bioactive Metabolites of Endophytic Fungi associated with Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

ABSTRACT

Name : Nurul Robiatul Adawiyah Program Study : Farmasi Title :

Endophytic fungi are known as a potential source of bioactive metabolites for pharmaceutical products including antibacterial. In this study, screening of bioactive metabolites from 10 isoloates of endophytic fungi associated with Cinchona pubescens Vahl. for its antibacterial activity has been performed. The results assayed with bioautography method showed that the chloroform extract of endophytic fungi 3-2-1-2 and 1-3-1-1 were active againts Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The endophytic fungus 1-3-1-1 that have the greatest antibacterial activity was scaled up in PDB medium (Potato Dextrose Broth) and cultivated for 3 weeks. The cultivation medium and the fungus biomass were extracted with chloroform and fractionated in order to get the bioactive compounds. The pure fraction, 3e was then evaluated for its MIC againts Staphylococcus aureus and Escherichia coli using microdilution method. The results showed that fraction of 3e inhibited Staphylococcus aureus and Escherichia coli growth with MIC of 32 µg/ml and >128 µg/ml partially, respectively.

Kata kunci : Kina, Cinchona pubescens Vahl., endophytic fungi, antibacterial, bioautography, MIC (Minimum Inhibitory Concentration).

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim

Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah

melimpahkan segala rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat

menyelesaikan penulisan skripsi dengan judul “Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas

Antibakteri Senyawa Bioaktif Jamur Endofit dari Tanaman Kina (Cinchona

pubescens Vahl.)”. Shalawat serta salam semoga senantiasa tercurah limpahkan

pada Nabi Muhammad SAW beserta para keluarga, sahabat, dan tabi’in

tabi’atnya.

Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat kelulusan tingkat sarjana di

Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian ini tidaklah dapat

terselesaikan tanpa dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Dalam kesempatan

ini, penulis ingin mengucapkan terimakasih terkhususkan kepada:

1. Bapak Dr. Andria Agusta selaku pembimbing I dan Ibu Prof. Dr. Atiek

Soemiati, M.Si., Apt. selaku pembimbing II, yang telah meluangkan waktu,

tenaga, dan pikiran serta dengan sabar membimbing dan mengajari penulis

sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

2. Kementrian Agama RI selaku pemberi beasiswa, sehingga penulis dapat

mengenyam pendidikan di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Bapak Prof. Dr. dr. (hc). MK. Tadjudin, Sp.And. selaku Dekan Fakultas

kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak Drs. Umar Mansur M.Sc. selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akademika Program Studi Farmasi Fakultas

kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah

memberikan ilmunya kepada penulis.

6. Ibu Dr. Ir. Praptiwi, M. Agr., Ibu Dra. Yuliasri Jamal, M. Si., Kang Asep, Teh

Dewi, Mba Dewi, Mas Tony, Mas Mustofa yang telah banyak membantu

penulis di laboratorium Fitokimia LIPI.

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

7. Ayahanda tercinta, Bapak Moch. Jaja Zaenudin dan Ibunda tercinta, Ibu

Rosliawati S.Pd. terima kasih atas doa yang selalu tercurah untukku, kasih

sayang, semangat, dan dukungannya yang menguatkan penulis dalam

menyelesaikan skripsi ini.

8. Adikku tersayang Intan Nurlatifatul Hasanah dan Muhammad Fauzan

Fathurrahman yang selalu mendukung, mendoakan, dan menghibur disaat

penulis kesulitan.

9. Sahabat-sahabatku yakni Ainul Mardiah, Eva Nurlatifah, Citra Rahmawati,

Neng Nuramania, Setiawan Maulani, Siti Sa’adah Hanifah, Sri Mulyanti, Nia

Habibatussa’diah, dan Sri Nurjannah yang selalu memberikan dukungan

kepada penulis.

10. Teman-teman seperjuangan yakni Luthfiana, Nurul Fithriyah, Leliana N.

Wachidah, Farichah Mansurah, Dyah Mundir Sari, Neneng Nurhalimah,

Churmatul Walidah, Ferry Indar A., M. Muwaffaq Zakky, Fakhrul Umam,

Yunita Sari, Vita fitria, dan Eriska Boru Saragih.

11. Keluarga besar CSS MoRA 2009, Farmasi 2009, dan AS-SHOF 2009, terima

kasih atas sebuah persahabatan dan persaudaraan selama ini.

Dengan keterbatasan pengalaman, pengetahuan, maupun pustaka yang

ditinjau, penulis menyadari bahwa dalam skripsi ini terdapat banyak kekurangan.

Untuk itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran konstruktif. Semoga

skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi kepentingan keilmuan maupun aplikasi

di bidang kesehatan.

Jakarta, 2 Oktober 2013

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Nurul Robiatul Adawiyah

NIM : 109102000056

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya, dengan judul :

SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI

METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI TANAMAN KINA

(Cinchona pubescens Vahl.)

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada tanggal : 2 Oktober 2013

Yang menyatakan,

(Nurul Robiatul Adawiyah)

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................ ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................... iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................ iv HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ............................................. v ABSTRAK ............................................................................................ vi ABSTRACT .......................................................................................... vii KATA PENGANTAR .......................................................................... viii HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ......... ix DAFTAR ISI ......................................................................................... x BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................ 1

1.1 Latar Belakang ....................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................. 3 1.3 Tujuan Penelitian ................................................................... 3 1.4 Manfaat Penelitian ................................................................. 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ...................................................... 4 2.1 Jamur Endofit ........................................................................ 4 2.2 Tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.) ......................... 4

2.2.1 Sejarah Singkat .......................................................... 4 2.2.2 Klasifikasi .................................................................. 5 2.2.3 Deskripsi .................................................................... 5 2.2.4 Khasiat ....................................................................... 6 2.2.5 Kandungan Kimia ...................................................... 6

2.3 Kromatografi ......................................................................... 6 2.3.1 Kromatografi Kolom ................................................. 6 2.3.2 KLT (Kromatografi Lapis Tipis) ............................... 7

2.4 Antimikroba ........................................................................... 8 2.5 Metode Skrining Antimikroba ............................................... 10

2.5.1 Metode Difusi ............................................................ 11 2.5.2 Metode Dilusi ............................................................ 12 2.5.3 Metode Bioautografi .................................................. 12

2.6 Bakteri Uji ............................................................................. 14 2.6.1 Staphylococcus aureus .............................................. 14 2.6.2 Escherichia coli ......................................................... 14

BAB 3 METODE PENELITIAN ..................................................... 15 3.1 Waktu dan Tempat ................................................................. 15 3.2 Alat dan Bahan ...................................................................... 15

3.2.1 Alat ............................................................................ 15 3.2.2 Bahan ......................................................................... 15

3.3 Tahapan Penelitian ................................................................ 16 3.4 Prosedur Kerja ....................................................................... 17

3.4.1 Skrining Aktivitas Antibakteri ................................... 17 3.4.2 Scaling up Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai

Antibakteri ................................................................. 19

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.3 Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri ................................................................. 20

3.4.4 Penentuan Nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) ... 21 3.4.5 Identifikasi Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai

Antibakteri ................................................................. 24 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................. 25

4.1 Skrining Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit Tanaman Kina 25 4.2 Scaling Up Jamur Endofit 1-3-1-1 pada Medium PDB ......... 33 4.3 Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri ...... 35 4.4 Penentuan Nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) ............... 36 4.5 Identifikasi Jamur Endofit 1-3-1-1 ........................................ 38

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................ 39 5.1 Kesimpulan ............................................................................ 39 5.2 Saran ...................................................................................... 39

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................... 40 LAMPIRAN .......................................................................................... 44

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Cinchona pubescens Vahl. ................................................................ 5

Gambar 2.2 Klasifikasi metode skrining aktivitas antimikroba ................................11

Gambar 4.1 Profil KLT dari 12 ekstrak kultur jamur ................................25

Gambar 4.2 Gambar 4.3

Profil KLT dari 16 ekstrak kultur jamur ................................Reaksi garam tetrazolium menjadi formazan ..................

28 30

Gambar 4.4 Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji S. aureus .........................................................

31

Gambar 4.5 Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji E. coli ................................................................

31

Gambar 4.6 Profil KLT-bioautografi jamur endofit 1-3-1-1 hasil scaling up ...............................................................................................

33

Gambar 4.7 Profil KLT hasil fraksinasi ekstrak kloroform biomassa jamur ................................................................................................

34

Gambar 4.8 Profil KLT hasil fraksinasi fraksi 3 ................................. 35

Gambar 4.9 Gambar jamur endofit 1-3-1-1 ...............................................................33

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 3.1 Data isolat jamur endofit dari tanaman Kina .................... 16 Tabel 4.1 Data bobot ekstrak kultur jamur ....................................... 27 Tabel 4.2 Data nilai KHM sampel uji ............................................... 36

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Diagram Alur Penelitian ................................................................44

Lampiran 2. Diagram Skrining Aktivitas Antibakteri ................................45

Lampiran 3. Diagram Scaling Up Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri ................................................................

46

Lampiran 4. Diagram Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri .............................................................................................

47

Lampiran 5. Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri ................................48

Lampiran 6. Gambar Identifikasi Bakteri Uji ............................................................49

Lampiran 7. Gambar Hasil Uji KHM ................................................................50

Lampiran 8. Komposisi dan Cara Pembuatan Medium yang Digunakan ..............................................................................................

51

Lampiran 9. Gambar Alat-Alat yang Digunakan ................................54

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pencarian sumber senyawa bioaktif terus menerus dilakukan seiring makin

banyaknya penyakit-penyakit baru yang bermunculan, mulai dari penyakit infeksi,

kanker, dan penyakit berbahaya lainnya. Senyawa bioaktif dapat diperoleh dari

beberapa sumber diantaranya dari tumbuhan, hewan, mikroba, dan organisme lain

(Prihatiningtias, 2005).

Salah satu sumber senyawa bioaktif adalah mikroba endofit. Mikroba

endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan tanaman pada periode

tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman

tanpa membahayakan inangnya. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung

beberapa mikroba endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau

metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik

(genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikroba endofit

(Tan & Zou, 2001).

Jamur endofit, mikroorganisme yang berada dalam jaringan tanaman

hidup, merupakan sumber potensial untuk pemanfaatan senyawa baru produk

bahan alam dalam bidang obat-obatan, agrikultura, dan industri tanpa merusak

atau membahayakan keberlangsungan hidup tanaman inangnya. Selain itu,

pertumbuhan mikroba endofit juga lebih cepat daripada inangnya, sehingga

eksplorasi endofit sebagai sumber penemuan obat baru sangat menguntungkan

(Strobel & Daisy, 2003).

Bakteri atau jamur endofit dapat menghasilkan senyawa metabolit yang

dapat berfungsi sebagai antibiotika (antifungi/antibakteri), antivirus, antikanker,

antidiabetes, antimalaria, antioksidan, antiimunosupressif (Strobel & Daisy,

2003), antiserangga (Azevedo et al., 2000), zat pengatur tumbuh (Tan & Zou,

2001), dan penghasil enzim-enzim hidrolitik seperti amilase, selulase, xilanase,

ligninase (Choi et al., 2005), kitinase (Zinniel et al., 2002).

Sejauh ini, penelitian melaporkan sejumlah besar senyawa antimikroba

yang diisolasi dari jamur endofit, terdiri dari beberapa golongan senyawa seperti

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

alkaloid, peptida, steroid, terpenoid, fenol, quinines, dan flavonoid. (Yu et al.,

2010). Senyawa antimikroba yang telah banyak diisolasi dari endofit hanyalah

sebagian kecil dari banyaknya spesies endofit yang berbeda, hal ini menunjukkan

bahwa mencari produk alam yang disintesis oleh endofit dapat menjadi salah satu

solusi untuk memecahkan masalah resistensi bakteri terhadap obat yang biasa

digunakan dan dapat digunakan sebagai antibiotik yang efektif secara klinis di

masa mendatang (Yu et al., 2010).

Pemanfaatan tanaman sebagai bahan obat telah dikenal oleh masyarakat

sejak lama. Salah satunya yaitu tanaman Kina yang merupakan bahan baku

farmasi yang sangat bernilai dan dikenal luas sebagai salah satu jenis tanaman

obat-obat berkhasiat dan sudah lama digunakan sebagai obat antimalaria

(Simanjuntak et al., 2002b). Sekitar tahun 1630, kulit Kina digunakan sebagai

obat demam di Peru, dan sekitar tahun 1640, Kina diperkenalkan ke Eropa dan

digunakan sebagai antimalaria (Abdi et al., 2003).

Tanaman Kina menghasilkan lebih dari 30 jenis alkaloid dan yang

terpenting adalah golongan kuinolin yakni kinin, kinidin, sinkonin, dan sinkonidin

(McCalley, 2002). Pada tahun 2002, Simanjuntak et al., berhasil mengisolasi

beberapa mikroba dari tanaman Cinchona sp., skrining dan identifikasi hasil

fermentasi dalam media sintetik menunjukkan bahwa mikroba endofit tersebut

dapat memproduksi senyawa alkaloid sinkona (Simanjuntak et al., 2002a dalam

Simanjuntak et al., 2002b).

Sejauh ini, belum ditemukan adanya penelitian mengenai aktivitas

antibakteri dari jamur endofit yang diisolasi dari tanaman Kina (Cinchona

pubescens Vahl.). Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui

adanya aktivitas antibakteri dari jamur endofit yang diisolasi dari tanaman kina.

3


1.2 Rumusan Masalah

Apakah jamur endofit yang diisolasi dari tanaman Kina dapat

menghasilkan metabolit bioaktif yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap

bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli ?

1.3 Hipotesis

Jamur endofit yang diisolasi dari tanaman Kina dapat menghasilkan

metabolit bioaktif yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

1.4 Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui adanya aktivitas antibakteri jamur endofit yang diisolasi

dari tanaman Kina terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia

coli.

1.5 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi mengenai

aktivitas antibakteri jamur endofit yang diisolasi dari tanaman Kina sebagai

bentuk pemanfaatan produk bahan alam dalam bidang farmasi.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jamur Endofit

Mikroba endofit hidup secara berkoloni di dalam jaringan internal

tanaman inang, misalnya di bagian ranting, batang, daun, akar, atau biji. Endofit

biasanya memiliki hubungan saling menguntungkan atau simbiosis mutualisme

dengan tanaman inangnya. Satu tanaman inang dapat menjadi inang bagi beberapa

spesian mikroba endofit. Senyawa yang diperoleh dari mikroba endofit biasanya

berhubungan dengan senyawa dari tanaman inangnya. Hal ini mungkin terjadi

karena adanya transfer genetik antara endofit dan inangnya. (Strobel & Daisy,

2003).

Jamur endofit memiliki peranan penting dalam industri farmasi karena

kemampuannya dalam memproduksi senyawa metabolit yang bervariasi, baik dari

struktur maupun fungsinya. Berbagai golongan senyawa metabolit sekunder

seperti alkaloid, flavonoid, terpenoid, antrakuinon, kuinon, fenil propanoid,

fenolik, turunan isokumarin, senyawa alifatik, peptida, dan senyawa lainnya telah

diisolasi dan dikarakterisasi dari kultur jamur endofit (Agusta, 2009). Senyawa

metabolit yang dihasilkan oleh jamur atau bakteri endofit dapat berfungsi sebagai

antibiotika (antifungi/antibakteri), antivirus, antikanker, antidiabetes, antimalaria,

antioksidan, antiimunosupressif (Strobel & Daisy, 2003), antiserangga (Azevedo

et al., 2000), zat pengatur tumbuh (Tan & Zou, 2001), dan penghasil enzim-enzim

hidrolitik seperti amilase, selulase, xilanase, ligninase (Choi et al., 2005), kitinase

(Zinniel et al., 2002).

2.2 Tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

2.2.1 Sejarah Singkat

Kina merupakan tanaman obat berupa pohon yang berasal dari Amerika

Selatan di sepanjang pegunungan Andes yang meliputi wilayah Venezuela,

Colombia, Equador, Peru sampai Bolivia. Daerah tersebut meliputi hutan-hutan

pada ketinggian 900-3.000 m dpl. Bibit tanaman Kina yang masuk ke Indonesia

tahun 1852 berasal dari Bolivia, tetapi tanaman Kina yang tumbuh dari biji

5


tersebut akhirnya mati. Pada tahun 1854 sebanyak 500 bibit kina dari Bolivia

ditanam di Cibodas dan tumbuh 75 pohon yang terdiri atas 10 klon

(Sultoni, 1995).

2.2.2 Klasifikasi

Phylum : Tracheophyta

Class : Magnoliopsida

Order : Gentianales

Family : Rubiaceae

Genus : Cinchona

Spesies : Cinchona pubescens

(Species 2000 & ITIS Catalogue of Life, 2013).

2.2.3 Deskripsi

( Gambar 2.1 Cinchona pubescens Vahl.)

(Orwa et al., 2009)

Habitus : Pohon, tinggi ± 17 m.

Batang : Berkayu, berwarna coklat kehijauan.

Daun : Tunggal, lonjong-hampir bulat, tepi rata-ujung dan pangkal tumpul,

panjang 15-35 cm, lebar 9-23 cm, pertulangan menyirip, daun muda

berwarna hijau setelah tua berwarna merah.

Bunga : Majemuk, bentuk bintang, tangkai 5-11 cm, berwarna putih

kekuningan, kelopak bertaju lima, bagian pangkal menyatu berwarna

hijau, benang sari berjumlah lima, tangkai sari putih, kepala sari

6


coklat, mahkota bentuk tabung dengan ujung membesar dan

berwarna coklat muda.

Buah : Lonjong, keras, coklat muda.

Biji : Kecil, hitam.

Akar : Tunggang, coklat keputih-putihan.

2.2.4 Khasiat

Kulit batang Kina berkhasiat sebagai antimalaria, antipiretik, antiperiodik,

obat sakit perut, tonik, astringent, penambah nafsu makan (Grenish, 1920).

2.2.5 Kandungan Kimia

Kulit batang Kina mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, polifenol

(Sultoni, 1995), dan tanin (Grenish, 1920).

2.3 Kromatografi

Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia

Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam

tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang

berisi kalsium karbonat (CaCO3). Saat ini kromatografi merupakan teknik

pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia

analisis, baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi,

lingkungan, industri, dan sebagainya. Kromatografi merupakan suatu teknik

pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak

(mobile phase) (Ganjar & Rohman, 2007).

2.3.1 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan teknik analisis yang digunakan dalam

penentuan jumlah komponen yang terdapat pada suatu campuran senyawa,

pemisahan, dan pemurnian komponen senyawa tertentu dari campurannya. Pada

pemisahan kromatografi kolom, suatu pelarut pengelusi dialirkan secara kontinu

melewati kolom, kemudian komponen-komponen dari campuran senyawa yang

7


dipisahkan akan keluar dari kolom, dikumpulkan, dan difraksinasi. Proses

elusinya dapat berupa elusi isokratik ataupun elusi gradien (Harvey, 2000).

Kromatografi kolom termasuk kromatografi serapan yang sering disebut

kromatografi elusi, karena senyawa yang akan terpisah terelusi dari kolom.

Pemisahan komponen campuran melalui kromatografi adsorpsi tergantung pada

kesetimbangan adsorpsi-desorpsi antara senyawa yang teradsorb pada permukaan

dari fase diam padatan dan pelarut dalam fase cair. Tingkat adsorpsi komponen

tergantung pada polaritas molekul, aktivitas adsorben, dan polaritas fase gerak

cair. Umumnya, senyawa dengan gugus fungsional lebih polar akan teradsorb

lebih kuat pada permukaan fase padatan. Aktivitas adsorben tergantung komposisi

kimianya, ukuran partikel, dan pori-pori partikel (Braithwaite & Smith, 1999).

Pelarut murni atau sistem pelarut tunggal dapat digunakan untuk

mengelusi semua komponen. Selain itu, sistem pelarut gradien juga digunakan.

Pada elusi gradien, polaritas sistem pelarut ditingkatkan secara perlahan dengan

meningkatkan konsentrasi pelarut ke yang lebih polar. Pemilihan pelarut eluen

tergantung pada jenis adsorben yang digunakan dan kemurnian senyawa yang

dipisahkan. Pelarut harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Keberadaan

pengganggu seperti air, alkohol, atau asam pada pelarut yang kurang polar akan

mengganggu aktivitas adsorben (Braithwaite & Smith, 1999).

2.3.2 KLT (Kromatografi Lapis Tipis)

Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan

Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain

kromatografi kertas dan elektroforesis. Berbeda dengan kromatografi kolom yang

mana fase diamnya diisikan atau dikemas di dalamnya, pada kromatografi lapis

tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan

bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat

plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai

bentuk terbuka dari kromatografi kolom.

8


Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak

sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik

(ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun

(descending).

Beberapa keuntungan dari kromatografi planar (Ganjar & Rohman, 2007):

1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.

2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,

fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau

dengan cara elusi 2 dimensi.

4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan

ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

Penggunaan umum KLT adalah untuk: menentukan banyaknya komponen

dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi,

menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk

kromatografi kolom, serta untuk memantau kromatografi kolom, melakukan

screening sampel untuk obat (Ganjar & Rohman, 2007).

2.4 Antimikroba

Antimikroba merupakan obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba

yang merugikan manusia. Berdasarkan toksisitas selektif, ada antimikroba yang

bersifat menghambat pertumbuhan mikroba, dikenal sebagai aktivitas

bakteriostatik dan ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai aktivitas

bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan

mikroba atau membunuhnya, masing-masing dikenal dengan kadar hambat

minimal (KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM). Antimikroba tertentu

aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar

antimikrobanya ditingkatkan melebihi KHM (Setiabudy, 2007).

9


Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibagi dalam lima

kelompok (Setiabudy, 2007) :

1. Antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba

Mikroba membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya. Berbeda

dengan mamalia yang mendapatkan asam folat dari luar, kuman patogen harus

mensintesis sendiri asam folat dari asam amino benzoat (PABA) untuk

kebutuhan hidupnya. Apabila antimikroba menang bersaing dengan PABA

untuk diikutsertakan dalam pembentukan asam folat, maka terbentuk analog

asam folat yang nonfungsional. Akibatnya kehidupan mikroba akan terganggu.

2. Antimikroba yang menghambat sintesis dinding sel mikroba

Antimikroba menghambat reaksi dalam proses sintesis dinding sel.

Dikarenakan tekanan osmotik dalam sel mikroba lebih tinggi daripada diluar

sel, maka kerusakan dinding sel mikroba akan menyebabkan terjadinya lisis,

yang merupakan dasar efek bakterisidal pada kuman yang peka.

3. Antimikroba yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba

Antimikroba dapat merusak membran sel setelah bereaksi dengan fosfat

pada fosfolipid membran sel mikroba. Antiseptik yang mengubah tegangan

permukaan (surface-active agents), dapat merusak permeabilitas selektif dari

membran sel mikroba. Kerusakan membran sel menyebabkan keluarnya

berbagai komponen penting dari dalam sel mikroba yaitu protein, asam

nukleat, nukleotida dan lain-lain.

4. Antimikroba yang menghambat sintesis protein sel mikroba

Untuk kehidupannya, sel mikroba perlu mensintesis berbagai protein.

Sintesis protein berlangsung di ribosom, dengan bantuan mRNA dan tRNA.

Pada bakteri, ribosom terdiri atas dua sub unit, yang berdasarkan konstanta

sedimentasi dinyatakan sebagai ribosom 30S dan 50S. Untuk berfungsi pada

sintesis protein, kedua komponen ini akan bersatu pada pangkal rantai mRNA

menjadi ribosom 70S.

Penghambatan sintesis terjadi dengan berbagai cara, diantaranya:

a. Antimikroba berikatan dengan komponen ribosom 30S dan menyebabkan

kode pada mRNA salah dibaca oleh tRNA pada waktu sintesis protein.

10


Akibatnya akan terbentuk protein yang abnormal dan non fungsional bagi

sel mikroba.

b. Antimikroba berikatan dengan ribososm 50S dan menghambat translokasi

kompleks tRNA-peptida dari lokasi asam amino ke lokasi peptida.

Akibatnya, rantai polipeptida tidak dapat diperpanjang karena lokasi asam

amino tidak dapat menerima kompleks tRNA-asam amino yang baru.

c. Antimikroba berikatan dengan ribosom 30S dan menghalangi masuknya

kompleks tRNA-asam amino pada lokasi asam amino.

d. Antimikroba berikatan dengan ribosom 50S dan menghambat pengikatan

asam amino baru pada rantai polipeptida oleh enzim peptidil transferase.

5. Antimikroba yang menghambat sintesis asam nukleat sel mikroba

Antimikroba berikatan dengan enzim polimerasi-RNA (pada sub-unit)

sehingga menghambat sintesis RNA dan DNA oleh enzim tersebut. Selain itu,

antimikroba juga menghambat enzim DNA girase pada kuman yang

fungsinya menata kromosom yang sangat panjang menjadi bentuk spiral

hingga bisa muat dalam sel kuman yang kecil.

2.5 Metode Skrining Antimikroba

Skrining dapat didefinisikan sebagai prosedur awal dalam menganalisis

ada atau tidak adanya suatu analit pada sampel yang dianalisis. Metode skrining

untuk deteksi aktivitas antimikroba pada produk alam terbagi menjadi tiga, yaitu

metode difusi, metode dilusi, dan bioautografi. Pada dasarnya metode skrining ini

merupakan pengukuran sederhana yang memberikan respon “ada/tidak”, cukup

sering digunakan, memberikan sensitivitas yang lebih tinggi daripada metode

lainnya. Selain itu metode-metode tersebut sederhana, murah, hemat waktu, dan

tidak memerlukan peralatan yang canggih. Metode deteksi ini dapat

dikombinasikan dengan kromatogafi lapis cair, seperti kromatografi lapis tipis,

kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, dan kromatografi elektro planar (Choma &

Grzelak, 2010).

11


Gambar 2.2. Klasifikasi metode skrining aktivitas antimikroba

(Choma & Grzelak, 2010)

2.5.1 Metode Difusi

Metode Difusi sering digunakan untuk uji antimikroba pada senyawa

murni, terutama untuk senyawa polar. Metode cakram secara resmi telah

digunakan untuk deteksi kuantitatif zat inhibitor pada susu di Amerika Serikat.

Dalam prosedur ini, cakram kertas saring (dengan diameter ± 6 mm), mengandung

senyawa uji, ditempatkan pada permukaan agar yang sebelumnya diinokulasi

dengan mikroorganisme uji. Agen antimikroba berdifusi ke dalam agar-agar dan

menghambat pertumbuhan mikroba uji tersebut. Cawan petri diinkubasi dan zona

inhibisi diukur (Choma & Grzelak, 2010).

Prosedur yang sama dilakukan dalam E-test, di mana garis-garis yang

digunakan sebagai pengganti cakram. Dalam metode silinder, stainless steel atau

porselen silinder dengan ukuran seragam (biasanya 8 mm x 6 mm × 10 mm)

ditempatkan pada permukaan agar yang diinokulasi dalam cawan petri, dan diisi

dengan sampel dan standar. Setelah inkubasi, silinder diambil dan zona inhibisi

diukur. Metode silinder adalah metode yang sering digunakan untuk deteksi

kuantitatif pada residu laktam. Untuk uji plat lubang, lubang berdiameter beberapa

milimeter dipotong di permukaan agar kemudian diinokulasi dan diisi dengan

Klasifikasi metode skrining aktivitas

antimikroba

Metode difusi

Cakram

Silinder

Uji plat lubang

Metode dilusi Dilusi agar

Cara tabung

Bioautografi

Kontak

Imersi/

Overlay

Langsung

12


sampel. Larutan senyawa uji yang berdifusi kedalam media agar akan

menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Kemudian, zona inhibisi diukur

(Choma & Grzelak, 2010).

2.5.2 Metode dilusi

Keuntungan utama dari metode dilusi adalah dapat memperkirakan

konsentrasi senyawa uji dalam medium agar atau suspensi kaldu, hal ini biasanya

digunakan untuk penentuan nilai KHM (Paxton, 1991 dalam Choma & Grzelak,

2010). Metode dilusi ini dapat diaplikasikan pada ekstrak yang kompleks, zat

murni, sampel polar dan non polar. Dalam prosedur dilusi agar, berbagai

konsentrasi senyawa uji dicampur dengan agar nutrien. Plat agar diinokulasi

kemudian diinkubasi. Konsentrasi terendah dari senyawa antimikroba yang

menunjukkan nilai KHM yaitu pada saat tidak terdeteksinya pertumbuhan

mikroorganisme. Dalam uji tabung, berbagai konsentrasi senyawa uji dicampur

dengan suspensi bakteri dalam serangkaian tabung, konsentrasi terendah

menyebabkan penghambatan pertumbuhan mikroorganisme sesuai dengan nilai

MIC. Dalam uji mikrodilusi, mikroorganisme tumbuh dalam sumuran plat,

dengan penambahan berbagai konsentrasi senyawa uji. Pertumbuhan

mikroorganisme ditunjukkan oleh adanya kekeruhan dalam sumuran plat

(Otvos et al., 2007 dalam Choma & Grzelak, 2010).

2.5.3 Metode Bioautografi

Bioautografi merupakan teknik laboratorium yang digunakan untuk

mendeteksi zat yang mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme uji dalam

campuran dan matriks yang kompleks. Metode ini menggabungkan penggunaan

teknik kromatografi lapis tipis dengan respon dari mikroorganisme yang diuji

berdasarkan aktivitas biologi dari suatu analit yang dapat berupa antibakteri,

antijamur, antitumor, antriprotozoa. (Choma, 2005).

Aplikasi dari metode bioautografi ini, diantaranya (Choma, 2005):

1. Mencari zat antibiotik, antijamur, antitumor, dan antiprotozoa baru dengan

mempelajari aktivitas biologis zat yang berasal dari tanaman, mikroorganisme,

atau kombinasi secara kimia.

13


2. Penelitian antibiotik dan senyawa biologis aktif lainnya dalam air limbah, air

minum, cairan tubuh, pakan, dan makanan.

3. Kontrol kualitas obat-obatan antibiotik.

4. Mencari senyawa antimikroba yang efektif melawan bakteri dan jamur patogen

pada tanaman.

5. Deteksi dan penentuan senyawa toksin (misalnya, aflatoksin) atau fototoksik

(misalnya, furokumarin).

Metode bioautografi dibedakan menjadi tiga, yaitu (Choma, 2005):

1. Bioautografi kontak

Bioautografi kontak dilakukan dengan meletakkan plat KLT hasil elusi

senyawa yang akan diuji di atas media padat yang sudah diinokulasi dengan

mikroba uji. Adanya senyawa antimikroba ditandai dengan adanya daerah

bening yang tidak ditumbuhi mikroba.

2. Bioautografi imersi atau bioautografi agar overlay

Pada bioautografi agar overlay, plat KLT hasil elusi senyawa yang akan

diuji dilapisi dengan agar yang masih cair yang sudah diinokulasi dengan

mikroba uji. Setelah agar mengeras, plat KLT diinkubasi dan diwarnai dengan

reagen warna tetrazolium. Penghambatan dapat dideteksi dengan terbentuknya

pita (band).

3. Bioautografi langsung

Bioautografi langsung dilakukan dengan menyemprotkan mikroba uji

pada plat KLT hasil elusi senyawa yang akan diuji atau dengan mencelupkan

plat KLT pada suspensi mikroba uji yang telah ditumbuhkan pada medium

kaldu yang cocok dan diinkubasi. Zona hambat yang terbentuk divisualisasikan

dengan menyemprot plat KLT dengan reagen warna tetrazolium.

Keuntungan metode bioautografi ini diantaranya, sifatnya yang efisien

untuk mendeteksi adanya senyawa antimikroba karena letak bercak dapat

ditentukan walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga

memungkinkan untuk mengisolasi senyawa aktif tersebut (Pratiwi, 2008).

14


2.6 Bakteri Uji

2.6.1 Staphylococcus aureus

S. aureus ditemukan pertama kali oleh Koch tahun 1878. Aureus dalam

bahasa Yunani berarti “emas”, hal ini dikarenakan S. aureus memiliki pigmen

karotenoid berwarna kuning muda sampai jingga tua. S. aureus termasuk ke

dalam familia micrococcacea, merupakan bakteri Gram positif dan berbentuk

kokus dengan diameter 0,5-1,5 μm baik berpasangan maupun bergerombol.

Bakteri ini bersifat tidak motil, dapat hidup secara aerob dan anaerob fakultatif,

pertumbuhan paling cepat pada temperatur 37 0C. Pembentukan pigmen paling

baik pada bakteri ini adalah disuhu kamar, yaitu berkisar antara 20-25 0C, serta

memiliki pH optimum 7,0-7,5 (Pelczar & Chan, 1986).

S. aureus merupakan penyebab berbagai infeksi pada manusia dan hewan.

Bakteri ini dapat menyebabkan penyakit pneumonia (infeksi paru-paru),

osteomyelitis (infeksi pada tulang), sinusitis, tonsilitis (radang amandel), dan

abses (penimbunan nanah akibat infeksi bakteri), sedangkan pada hewan S. aureus

menyebabkan penyakit mastitis (pembengkakan payudara) pada sapi dan biri-biri,

pustular dermatitis (radang kulit) pada anjing, serta abses pada unggas (Todar,

2002).

2.6.2 Escherichia coli

E. coli merupakan bakteri penghuni usus besar manusia dan hewan tingkat

tinggi lainnya. E. coli adalah mikroflora normal dalam tubuh manusia dengan

menghasilkan bakteriosin sebagai pelindung terhadap terjadiya kolonisasi bakteri

patogen. Galur-galur tertentu dari E. coli dapat menyebabkan penyakit pada

manusia dan hewan. Penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini antara lain

gastroenteritis, diare dan infeksi saluran urin (Pelczar & Chan, 1986).

E. coli termasuk ke dalam famili Enterobacteriaceae, merupakan bakteri

Gram negatif, bersifat anaerob fakultatif. Bakteri ini berbentuk batang pendek

dengan lebar kurang 1,1-1,5 μm dan panjang sekitar 2,0-6,0 μm. Nilai pH

optimumnya 7,0-7,5 dan suhu optimum 37 0C dengan kisaran suhu pertumbuhan

10-40 0C (Holt et al., 1994).


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Fitokimia, Pusat Penelitian

Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong. Waktu

pelaksanaan penelitian dimulai dari bulan April sampai dengan Agustus 2013.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: autoklaf

(Hiclave HVE 5.0 Hirayama), Lamina Air Flow (LAF), UV cabinet (Camag),

cawan petri, kawat ose, lampu bunsen, pipet tetes, pipet mikro, tip, pipa kapiler,

pinset, spatel, hot plate (Cimarec 2), shaker incubator, erlenmeyer (Pyrex),

vacuum rotary evaporator (Eyela SB-1000), labu evaporator (Pyrex), chamber,

kolom kromatografi, micropipet Effendorf Referance 200 μL, 96 well microtiter

plate, vial, spreader, corong pisah, dan mikroskop cahaya (Nikon).

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: isolat murni

jamur endofit yang diisolasi dari bagian daun (1 isolat), tangkai daun (6 isolat),

dan bunga (3 isolat) tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.) koleksi

Laboratorium Mikrobiologi Puslit Biologi LIPI Cibinong (Tabel 3.1). Bahan

lainnya meliputi bakteri uji Staphylococcus aureus LIPIMC 114 dan Escherichia

coli LIPIMC 186 (koleksi Laboratorium Mikrobiologi Puslit Biologi LIPI

Cibinong), media PDA (Potato Dextrose Agar - Difco TM), PDB (Potato Dextrose

Broth – Difco TM), GYP (Glucose Yeast extract Peptone), MHA (Mueller Hinton

Agar - Criterion), MHB (Mueller Hinton Broth – Criterion), NA (Nutrient Agar –

Criterion), BHI (Brain Heart Infusion-BBL TM), silika gel GF 254, silika gel 70-

230 mesh (Merck), Seasand (Merck), pelarut kimia etil asetat, aseton, kloroform,

diklorometan, metanol, etanol, n-heksana, aquadest, dimetil sulfoksida (DMSO),

pereaksi penampak noda serium sulfat, pereaksi Dragendorff, pereaksi warna INT

16


(2-(4-Iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolium klorida), trypan blue,

crystal violet, safranin, larutan lugol, antibiotik kloramfenikol dan eritromisin.

Tabel 3.1 Data isolat jamur endofit dari tanaman Kina


No Kode Isolat Asal Isolat

1 5-1-8-5 Daun

2 1-2-5-3 Tangkai daun



5 2-3-4-2 Bunga

6 3-3-4-2 Bunga




10 1-3-1-1 Bunga

3.3 Tahapan Penelitian

3.3.1 Skrining aktivitas antibakteri jamur endofit dari tanaman Kina (Cinchona

pubescens Vahl.)

3.3.2 Scaling up jamur endofit yang paling aktif sebagai antibakteri

3.3.3 Fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif antibakteri

3.3.4 Penentuan nilai KHM (Kadar Hambat Minimum)

3.3.5 Identifikasi secara makroskopik dan mikroskopik jamur endofit yang

paling aktif sebagai antibakteri

17


3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Skrining Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit dari Tanaman Kina


3.4.1.1 Kultivasi Jamur Endofit

Proses kultivasi dilakukan terhadap 10 isolat murni jamur endofit yang

diisolasi dari bagian daun, tangkai daun, dan bunga tanaman Kina yang dibagi

menjadi 2 tahap kultivasi: kultivasi pertama dilakukan terhadap 6 isolat jamur

(isolat no. 1-6) dan kultivasi kedua dilakukan terhadap 4 isolat jamur (isolat no.

7-10). Setiap isolat diambil sebanyak 1 ose dari stock culture pada medium PDA

(Potato Dextrose Agar) miring dan diinokulasikan pada masing-masing 40 mL

medium PDB (Potato Dextrose Broth) dan GYP (Glucose Yeast extract Peptone)

yang sudah steril, proses inokulasi ini dilakukan secara steril di dalam laminar air

flow. Proses kultivasi jamur dilakukan selama 3 minggu pada suhu ruang.

3.4.1.2 Ekstraksi Kultur Jamur Endofit

Sebanyak 6 kultur jamur endofit (isolat no. 1-6) yang sudah dikultivasi

tahap pertama pada medium PDB dan GYP diekstraksi dengan pelarut etil

asetat:metanol (4:1), sedangkan untuk 4 kultur jamur (isolat no. 7-10) yang

dikultivasi tahap kedua pada medium PDB dan GYP diekstraksi dengan etil

asetat:metanol (4:1) dan fraksi airnya diekstraksi lagi dengan kloroform. Jumlah

pelarut yang digunakan pada masing-masing ekstraksi sebanyak 40 mL yaitu 1:1

dengan jumlah medium kultur jamur. Proses ekstraksi dilakukan menggunakan

corong pisah sebanyak tiga kali. Untuk ekstraksi dengan pelarut etil

asetat:metanol (4:1) diambil lapisan atas (fraksi etil asetat:metanol), sedangkan

untuk ekstraksi dengan pelarut kloroform diambil lapisan bawah (fraksi

kloroform). Masing-masing fraksi dipisahkan dan dipekatkan dengan vacuum

rotary evaporator. Ekstrak pekat yang didapat dari masing-masing fraksi

ditimbang dan dilarutkan dengan metanol dalam jumlah tertentu sehingga masing-

masing ekstrak diperoleh konsentrasi 10 mg/mL. Selanjutnya dilakukan uji KLT

dengan menggunakan fase gerak diklorometan:metanol (7:1) dan hasilnya diamati

dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm serta disemprot dengan pereaksi

18


penampak noda serium sulfat untuk skrining metabolit sekunder dan pereaksi

Dragendorff untuk skrining senyawa alkaloid.

3.4.1.3 Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Bioautografi

a) Identifikasi Bakteri Uji dengan Pewarnaan Gram

Identifikasi bakteri uji dengan pewarnaan Gram ini dilakukan berdasarkan

panduan Alexander et al., (2004) dengan cara:

1. Kaca objek dibersihkan dengan alkohol 70% dan dikeringkan.

2. Aquadest steril diteteskan pada kaca objek kemudian diinokulasikan bakteri

uji menggunakan ose dan difiksasi diatas api bunsen.

3. Diteteskan crystal violet, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci

dengan air selama 5 detik.

4. Diteteskan dengan larutan lugol, didiamkan selama 1 menit, kemudian

dicuci dengan air selama 5 detik.

5. Dihilangkan warnanya dengan alkohol 95% selama 15-30 detik, kemudian

dicuci dengan air selama 5 detik.

6. Diteteskan zat warna safranin dan didiamkan selama 1 menit, kemudian

dicuci dengan air selama 5 detik..

7. Preparat difiksasi diatas api bunsen dan diamati dengan mikroskop cahaya

dengan skala perbesaran 400x dan 4000x.

b) Persiapan Suspensi Bakteri

Stok bakteri uji S. aureus dan E. coli yang telah diremajakan pada medium

NA (nutrient Agar) miring diambil 1 ose, lalu disuspensikan dalam 20 mL

medium BHI (Brain Heart Infusion), kemudian diinkubasi dalam shaker

incubator dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 37 0C selama 18 jam.

c) Persiapan Sampel Uji

Semua sampel dibuat konsentrasi menjadi 10 mg/mL, kemudian sebanyak

10 µL dari masing-masing sampel ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada

plat KLT. Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol dengan

konsentrasi 1 mg/mL dan kontrol negatif medium PDB, GYP, dan pelarut

metanol.

19


d) Uji Bioautografi

Plat KLT yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam suspensi bakteri

uji dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama 18 jam, kemudian disemprot dengan

pereaksi warna INT (4 mg/mL) dan diinkubasi selama 1 jam. Keberadaan

aktivitas antibakteri ditentukan dengan terbentuknya zona hambat yang tampak

karena penyemprotan INT yang dikonversikan terhadap warna formazan pada

mikroorganisme hidup.

3.4.2 Scaling up Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai Antibakteri pada

Medium PDB

3.4.2.1 Pembuatan Medium Kultivasi

Medium PDB dibuat sebanyak 2 Liter dengan komposisi 24 gram PDB

dalam 1 Liter aquadest. Setelah semua komponennya larut, medium dibagi ke

dalam 4 erlenmeyer berukuran 2 Liter yang masing-masingnya diisi 500 mL.

Medium tersebut disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 0C.

3.4.2.2 Kultivasi Jamur Endofit

Berdasarkan hasil skrining antibakteri, ekstrak kultur jamur yang paling

aktif sebagai antibakteri yaitu ekstrak kloroform dari isolat jamur endofit no. 10

(isolat 1-3-1-1) yang dikultivasi pada medium PDB. Isolat yang telah diregenerasi

pada medium PDA diambil sebanyak ±3 ose dan diinokulasikan ke dalam 4x500

mL medium PDB yang sudah steril. Proses inokulasi ini dilakukan secara steril

dalam laminar air flow. Setelah itu, kultur jamur endofit diinkubasi pada suhu

ruang selama 3 minggu.

3.4.2.3 Ekstraksi Kultur Jamur Endofit Hasil Scaling Up

Hasil kultivasi jamur endofit no.10 (isolat 1-3-1-1) dipisahkan antara

medium dan biomassanya dengan cara disaring. Medium diekstraksi dengan

pelarut kloroform sebanyak 2 Liter dengan perbandingan 1:1 terhadap jumlah

medium, sedangkan untuk biomassa dimaserasi terlebih dahulu dengan aseton

3x24 jam, diuapkan asetonnya menggunakan vacuum rotary evaporator sehingga

didapat fraksi air yang kemudian diekstraksi dengan pelarut kloroform dengan

20


perbandingan 1:1 terhadap jumlah fraksi airnya. Proses ekstraksi ini dilakukan

secara berulang sebanyak 3 kali. Lapisan bawah yang merupakan fraksi kloroform

dari medium dan biomassa jamur dipisahkan dan dipekatkan dengan vacuum

rotary evaporator. Ekstrak pekat yang didapat dilarutkan dengan metanol dan

dilakukan uji KLT dengan menggunakan fase gerak diklorometan:metanol (15:1)

dan hasilnya diamati dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm serta disemprot

dengan pereaksi penampak noda serium sulfat.

3.4.2.4 Uji KLT-Bioautografi Ekstrak Jamur Endofit Hasil Scaling Up

Berdasarkan proses ekstraksi pada kultur jamur endofit no. 10 (isolat

1-3-1-1) hasil scaling up, didapat 2 ekstrak sampel yaitu: ekstrak kloroform

medium jamur dan ekstrak kloroform biomassa jamur. Ekstrak tersebut dibuat

konsentrasi menjadi 10 mg/mL, kemudian sebanyak 10 µL dari masing-masing

ekstrak ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada plat KLT dan dielusi

menggunakan pelarut diklorometan:metanol (15:1). Setelah itu, plat KLT

dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama

18 jam. Plat KLT yang telah diinkubasi disemprot dengan reagensia pewarna INT

(4 mg/mL) dan diinkubasi selama 1-2 jam. Selanjutnya dilakukan penghitungan

nilai Rf (Retardation factor) terhadap senyawa yang memiliki aktivitas

antibakteri. Keberadaan aktivitas antibakteri ditentukan dengan terbentuknya zona

hambat yang tampak karena penyemprotan INT yang dikonversikan terhadap

warna formazan pada mikroorganisme hidup.

3.4.3 Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri

Berdasarkan hasil pengamatan uji KLT-bioautografi, selanjutnya

dilakukan fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif dari ekstrak kloroform

biomassa jamur (161,7 mg) dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam

silika gel 70-230 mesh dan fase gerak kloroform:metanol (30:1). Fase diam

disuspensikan kedalam fase gerak (eluen) kemudian dimasukkan secara perlahan

melalui corong ke dalam kolom yang telah diisi kapas dan seasand di bagian

bawah kolom. Untuk penyempurnaan proses pemisahan, fase diam dipadatkan

dengan cara menurunkan fase gerak serta dinding kolom diketok-ketok secara

21


perlahan. Setelah padat, ekstrak pekat yang telah dilarutkan dengan eluen

dimasukkan ke dalam kolom menggunakan pipet tetes, lalu dielusi dengan eluen

yang telah ditentukan sebelumnya dengan KLT. Fraksi yang keluar ditampung

dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT menggunakan eluen

diklorometan:metanol (15:1). Selanjutnya, fraksi-fraksi yang memiliki pola

kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapatkan

8 fraksi dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.

Fraksi 3 (10,4 mg) yang masih menunjukkan beberapa noda, difraksinasi

kembali dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230

mesh dan fase gerak n-heksana:etil asetat (3:1). Fraksi yang keluar ditampung

dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT menggunakan eluen

n-heksana:etil asetat (2:1). Selanjutnya, fraksi-fraksi yang memiliki pola

kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapatkan

6 fraksi dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.

3.4.4 Penentuan Nilai KHM (Kadar Hambat Minimum)

3.4.4.1 Persiapan Medium

Medium yang digunakan yaitu medium MHB (Mueller Hinton Broth)

untuk pertumbuhan bakteri uji dan medium MHA (Mueller Hinton Agar) untuk

perhitungan jumlah koloni bakteri uji.

a) Medium MHB dibuat dengan komposisi: medium MHB 1 dibuat dengan

melarutkan 21 g MHB dalam 1 Liter aquadest dan medium MHB 2 dibuat

dengan komposisi 2x medium MHB 1 (42 g MHB dalam 1 Liter aquadest).

Setelah larut, medium disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 0C selama 15

menit.

b) Medium MHA dibuat dengan melarutkan 38 gram MHA dalam 1 Liter

aquadest. Setelah larut, medium disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 0C

selama 15 menit. Setelah itu, medium dituang dalam beberapa cawan petri

steril dan dibiarkan memadat.

22


3.4.4.2 Persiapan Larutan Uji

Larutan uji yang digunakan yaitu fraksi 3e. Larutan uji dibuat konsentrasi

512 µg/mL dengan menggunakan pelarut DMSO 30%. Fraksi 3e (1,4 mg)

dilarutkan dalam 1,4 mL metanol, kemudian dipipet sebanyak 512 µL ke dalam

vial dan dikeringkan dengan nitrogen. Setelah itu, dilarutkan dengan pelarut

DMSO 30% (DMSO 300 µL dan aquabidest 700 µL).

3.4.4.3 Persiapan Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan yaitu S. aureus dan E. coli.

Persiapan bakteri uji terdiri dari:

a) Pembuatan suspensi bakteri

Sebanyak 1 ose isolat bakteri diinokulasikan ke dalam 20 mL medium

MHB. Kemudian diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 100

rpm pada suhu 37 0C selama 18 jam.

b) Pengenceran suspensi bakteri

Suspensi bakteri uji diencerkan untuk mempermudah perhitungan koloni,

yaitu dengan cara dipipet 50 µL suspensi bakteri ke dalam 4.950 µL aquadest

steril sehingga didapat pengenceran 10-2, dari suspensi bakteri pengenceran

10-2 dipipet 50 µL ke dalam 4.950 µL aquadest steril sehingga didapat

pengenceran 10-4. Suspensi tersebut diencerkan lagi dengan cara yang sama

hingga didapat suspensi dengan pengenceran 10-6, 10-8, dan 10-10 .

c) Perhitungan jumlah koloni bakteri

Suspensi dengan faktor pengenceran 10-6, 10-8, dan 10-10, diinokulasikan

sebanyak 100 µL kedalam medium MHA, disebarkan menggunakan spreader.

Kemudian diinkubasi dalam incubator pada suhu 37 0C selama 18 jam. Koloni

bakteri yang muncul dihitung (Lampiran 5).

Jumlah koloni bakteri =

Koloni yang muncul x faktor pengenceran

Volume yang dipipet

23


d) Pengenceran bakteri untuk uji KHM

Stok bakteri yang digunakan untuk uji KHM dibuat dengan cara

mengencerkan suspensi bakteri awal menjadi 105 CFU/mL berdasarkan hasil

dari perhitungan jumlah koloni bakteri yang digunakan (Lampiran 5).

3.4.4.4 Pengenceran Larutan Uji

Pengenceran larutan uji dari konsentrasi 512 µg/mL menjadi 128 µg/mL,

64 µg/mL, 32 µg/mL, 16 µg/mL, 8 µg/mL, 4 µg/mL, dan 1 µg/mL menggunakan

96 well microtiter plate dengan komposisi sebagai berikut:

a) Sumur A1-A9 diisi dengan 100 µL medium MHB 2.

b) Sumur B1-H9 diisi dengan 100 µL medium MHB 1.

c) Sumur A1-A3 diisi dengan 100 µL sampel uji.

d) Sumur A4-A6 diisi dengan 100 µL eritromisin (antibiotic control).

e) Sumur A7-A9 diisi dengan 100 µL kloramfenikol (antibiotic control).

f) Dari sumur A1-A9 masing-masing diambil 100 µL dan dimasukkan dalam

sumur B1-B9, begitu seterusnya sampai sumur H1-H9. Pada sumur H1-H9

diambil 100 µL dan dibuang.

g) Sumur A10 diisi 200 µL dengan medium MHB 2 (sterility control).

h) Sumur B10 diisi 200 µL dengan medium MHB 1 (sterility control).

i) Sumur C10-D10 diisi 100 µL dengan medium MHB 1 (growth control).

j) Sumur E10-F10 diisi 100 µL dengan medium MHB 2 dan 100 µL DMSO 30%

dan dibuang 100 µL (solvent control).

k) Sumur G10-H10 diisi 100 µL dengan medium MHB 2 dan 100 µL etanol 30%

dan dibuang 100 µL (solvent control).

l) Masing-masing sumur ditambah dengan bakteri uji 100 µL kecuali sumur

untuk sterilitiy control.

3.4.4.5 Inkubasi Microtiter Plate yang Berisi Sampel Uji

Microtiter plate yang berisi sampel uji diinkubasi dalam incubator pada

suhu 37 0C selama 18 jam.

24


3.4.4.6 Penentuan Nilai KHM

Nilai KHM ditetapkan secara visual sebagai kadar larutan uji antibakteri

terendah yang terlihat bening setelah penambahan reagensia pewarna INT

(4 mg/mL) tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji.

3.4.5 Identifikasi Secara Makroskopis dan Mikroskopis Jamur Endofit

yang Paling Aktif sebagai Antibakteri (Isolat 1-3-1-1)

Identifikasi dilakukan berdasarkan panduan Gandjar et al. (1999) dengan

mengamati beberapa karakter morfologi baik secara makroskopis maupun

mikroskopis. Secara makroskopis karakter yang diamati meliputi: warna dan

permukaan koloni (granular, seperti tepung, menggunung, licin), tekstur, garis-

garis radial dan konsentris, warna balik koloni (reverse color), dan tetes eksudat.

Pengamatan secara mikroskopis meliputi: ada tidaknya septat pada hifa,

pigmentasi hifa, dan bentuk spora.

Identifikasi secara mikroskopik dilakukan dengan cara:

a) Membersihkan kaca objek dan kaca penutup dengan alkohol 70%.

b) Meletakkan setetes zat pewarna trypan blue di tengah kaca objek.

c) Mengambil sedikit hifa jamur dengan jarum preparat dan diletakkan pada

tetesean zat pewarna trypan blue dalam kaca objek dan ditutup dengan kaca

penutup secara hati-hati.

d) Preparat diamati di bawah mikroskop cahaya dengan skala perbesaran 1000x.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Skrining Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit Tanaman Kina


Skrining aktivitas antibakteri jamur endofit ini dilakukan terhadap 10

isolat murni jamur endofit yang diisolasi dari bagian daun (1 isolat), tangkai daun

(6 isolat), dan bunga (3 isolat) tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.),

masing-masing isolat dikultivasi pada 40 mL medium PDB dan GYP yang

merupakan medium umum untuk pertumbuhan jamur dan dilakukan pada suhu

ruang selama 3 minggu. Proses kultivasi ini dibagi menjadi 2 tahap: kultivasi

tahap pertama dilakukan terhadap 6 isolat jamur (isolat no. 1-6) dan kultivasi

tahap kedua dilakukan terhadap 4 isolat jamur (isolat no. 7-10).

Sebanyak 12 kultur jamur yang telah dikultivasi pada tahap pertama

diekstraksi secara partisi menggunakan corong pisah dengan pelarut etil

asetat:metanol (4:1) sebanyak 3x40 mL. Pelarut etil asetat:metanol (4:1)

merupakan pelarut dengan tingkat kepolaran tertinggi yang dapat memisah

dengan air, sehingga diharapkan pelarut yang digunakan dapat mengekstraksi

senyawa sebanyak mungkin. Dari proses ekstraksi ini diperoleh 12 ekstrak kultur

jamur yang kemudian ditimbang dan dibuat konsentrasi 10 mg/mL dengan cara

melarutkannya dalam metanol dengan jumlah tertentu sesuai dengan masing-

masing bobot ekstrak pekat yang diperoleh. Data bobot masing-masing ekstrak

yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 4.1.

Masing-masing ekstrak diidentifikasi dengan KLT, sebagai proses awal

digunakan eluen diklorometan:metanol (7:1), diamati dibawah sinar UV 254 nm

dan UV 366 nm dan disemprot dengan penampak noda serium sulfat yang

bertujuan untuk melihat adanya metabolit sekunder dari masing-masing ekstrak.

Pada plat KLT yang berbeda, dilakukan juga identifikasi terhadap masing-masing

ekstrak dengan menggunakan pereaksi Dragendorff yang bertujuan untuk

mendeteksi adanya senyawa alkaloid yang biasanya terdapat pada tanaman Kina.

Profil KLT dari 12 ekstrak yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat

dan pereaksi Dragendorff dapat dilihat pada Gambar 4.1

26


(a) (b)

(c) (d)

Gambar 4.1 Profil KLT dari 12 ekstrak yang disemprot dengan penampak noda

serium sulfat dan pereaksi Dragendorff

Eluen : diklorometan:metanol (7:1)

Keterangan :

(a) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur yang dikultivasi pada

medium PDB yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat.

(b) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur yang dikultivasi pada

medium PDB yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff.

(c) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur yang dikultivasi pada

medium GYP yang disemprot dengan penampak noda serium sulfat.

(d) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur yang dikultivasi pada

medium GYP yang disemprot dengan pereaksi Dragendorff.

27


Berdasarkan profil KLT yang ditunjukkan pada Gambar 4.1 dengan

penyemprotan penampak noda serium sulfat dapat diketahui bahwa pada 12

ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur mengandung beberapa senyawa

kimia yang merupakan hasil bioproduksi metabolit sekunder hasil kultivasi tahap

pertama dari 6 isolat jamur pada 2 medium yaitu medium PDB dan GYP.

Sedangkan, hasil identifikasi dengan pereaksi Dragendorff menunjukkan tidak

terdapatnya senyawa alkaloid (munculnya noda warna jingga) pada 12 ekstrak

kultur jamur tersebut.

Selain itu, digunakan juga kontrol medium PDB dan GYP yang diekstrak

dengan cara yang sama yang menunjukkan tidak adanya spot pada hasil uji KLT.

Hal ini dikarenakan tidak terjadinya bioproduksi metabolit sekunder pada medium

PDB dan GYP tanpa kultur jamur.

Kultivasi tahap kedua dilakukan terhadap 4 isolat jamur (isolat no. 7-10)

yang kemudian diekstraksi secara partisi menggunakan corong pisah dengan

pelarut etil asetat:metanol (4:1) sebanyak 3x40 mL. Dari hasil ekstraksi diperoleh

2 fraksi yaitu fraksi etil asetat:metanol (lapisan atas) yang kemudian dipekatkan

menggunakan vacuum rotary evaporator dan fraksi air (lapisan bawah) yang

kemudian diekstraksi kembali dengan pelarut klroform sebanyak 3x40 mL. Proses

ekstraksi dengan menggunakan pelarut kloroform ini bertujuan untuk

mengekstraksi senyawa alkaloid yang biasanya terdapat pada tanaman Kina.

Selain itu, senyawa alkaloid juga termasuk ke dalam senyawa antimikroba yang

telah diisolasi dari jamur endofit (Yu et al., 2010). Pemilihan pelarut kloroform

ini berdasarkan pada daya larutnya yang tinggi untuk melarutkan senyawa

alkaloid (Sarker et al.,2005). Dari proses ekstraksi ini diperoleh 16 ekstrak kultur

jamur yang kemudian ditimbang dan dibuat konsentrasi 10 mg/mL dengan cara

melarutkannya dalam metanol dengan jumlah tertentu sesuai dengan masing-

masing bobot ekstrak pekat yang diperoleh. Data bobot masing-masing ekstrak

yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 4.1.

28


Tabel 4.1 Data bobot ekstrak kultur jamur endofit

No Kode

Isolat

Bobot Ekstrak Jamur (mg)

Medium PDB

Bobot Ekstrak Jamur (mg)

Medium GYP

Ekstrak Etil

Asetat:MetOH

(4:1)

Ekstrak

Kloroform

Ekstrak Etil

Asetat:MetOH

(4:1)

Ekstrak

Kloroform

1 5-1-8-5 25,0 - 12,5 -

2 1-2-5-3 20,2 - 14,8 -

3 2-2-6-4 23,0 - 16,5 -

4 3-2-10-2 13,1 - 10,0 -

5 2-3-4-2 10,2 - 15,9 -

6 3-3-4-2 20,2 - 29,2 -

7 1-2-4-4 126,8 1,9 35,2 5,3

8 1-2-6-3 86,3 2,0 31,1 5,5

9 3-2-1-2 21,4 1,1 13,2 0,9

10 1-3-1-1 31,2 1,0 93,2 7,1

Keterangan : (-) Tidak dilakukan

Masing-masing ekstrak diidentifikasi dengan KLT, sebagai proses awal

digunakan eluen diklorometan:metanol (7:1), diamati dibawah sinar UV 254 nm

dan UV 366 nm dan disemprot dengan penampak noda serium sulfat yang

bertujuan untuk melihat adanya metabolit sekunder dari masing-masing ekstrak.

Pada plat KLT yang berbeda, dilakukan juga identifikasi terhadap masing-masing

ekstrak dengan menggunakan pereaksi Dragendorff yang bertujuan untuk

mendeteksi adanya senyawa alkaloid. Profil KLT dari 16 ekstrak yang disemprot

dengan penampak noda serium sulfat dan pereaksi Dragendorff dapat dilihat pada

Gambar 4.2

29


(a) (b) (c) (d)

(e) (f) (g) (h)

Gambar 4.2 Profil KLT dari 16 ekstrak yang disemprot dengan penampak noda

serium sulfat dan pereaksi Dragendorff

Eluen : diklorometan:metanol (7:1)

Keterangan:

(a) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur pada medium PDB yang

disemprot dengan penampak noda serium sulfat

(b) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur pada medium PDB yang

disemprot dengan pereaksi Dragendorff

(c) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium PDB yang disemprot

dengan penampak noda serium sulfat

(d) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium PDB yang disemprot

dengan pereaksi Dragendorff

(e) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur pada medium GYP yang


(f) Ekstrak etil asetat:metanol (4:1) kultur jamur pada medium GYP yang

disemprot dengan pereaksi Dragendorff

30


(g) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium GYP yang disemprot

dengan penampak noda serium sulfat

(h) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium GYP yang disemprot

dengan pereaksi Dragendorff

Berdasarkan profil KLT yang ditunjukkan pada Gambar 4.2 dengan

penyemprotan penampak noda serium sulfat dapat diketahui bahwa pada 8 ekstrak

etil asetat:metanol (4:1) dan 8 ekstrak kloroform kultur jamur mengandung

beberapa senyawa kimia yang merupakan hasil bioproduksi metabolit sekunder

hasil kultivasi tahap kedua dari 4 isolat jamur pada 2 medium yaitu medium PDB

dan GYP. Hasil identifikasi dengan pereaksi Dragendorff menunjukkan bahwa

pada ekstrak kloroform no. 10 (d), 7 (h), 8 (h), 9 (h), dan 10 (h) menunjukkan

adanya senyawa alkaloid (munculnya noda warna jingga).

Untuk mengetahui adanya aktivitas antibakteri pada masing-masing ekstrak

maka dilakukan uji bioautografi. Uji bioautografi ini merupakan suatu metode

yang menggabungkan penggunaan teknik kromatografi lapis tipis dengan respon

dari mikroorganisme yang diuji berdasarkan aktivitas biologi dari suatu analit

yang dapat berupa antibakteri, antijamur, antitumor, antriprotozoa (Choma, 2005).

Keuntungan metode bioautografi ini yaitu sifatnya yang efisien untuk mendeteksi

adanya senyawa antimikroba karena letak bercak dapat ditentukan walaupun

berada dalam campuran yang kompleks sehingga memungkinkan untuk

mengisolasi senyawa aktif tersebut (Pratiwi, 2008).

Dalam uji aktivitas antibakteri ini digunakan 2 bakteri uji, yaitu bakteri

Staphylococcus aureus dan bakteri Escherichia coli yang telah diidentifikasi

secara mikroskopis dengan metode pewarnaan Gram. Gambar hasil identifikasi

dapat dilihat pada Lampiran 6. S. aureus merupakan bakteri Gram positif

berbentuk kokus (bulat) yang merupakan penyebab berbagai infeksi pada manusia

dan hewan (Pelczar & Chan, 1986; Todar, 2002). Sedangkan E. coli merupakan

bakteri Gram negatif berbentuk basil (batang) yang merupakan mikroflora normal

dalam tubuh manusia akan tetapi pada galur-galur tertentu dapat menyebabkan

penyakit pada manusia dan hewan (Pelczar & Chan, 1986; Holt et al., 1994).

31


Uji aktivitas antibakteri ini menggunakan metode bioautografi langsung,

dimana plat KLT yang telah ditotolkan dengan 10 µL dari masing-masing ekstrak

yang memiliki konsentrasi 10 mg/mL, dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji.

Setelah diinkubasi pada suhu 37 0C selama 18 jam, plat KLT disemprot dengan

reagen warna INT secara merata yang bertujuan untuk mewarnai adanya bakteri

yang masih hidup. Hal ini terjadi karena adanya reaksi enzimatik yang mengubah

garam tetrazolium menjadi formazan yang berwarna merah, sehingga akan

dihasilkan zona hambat yang tidak berwarna jika spot ekstrak bersifat aktif

sebagai antibakteri.

Gambar 4.3 Reaksi garam tetrazolium (kuning) menjadi formazan (merah)

(Senoz, 2012)

Hasil identifikasi terhadap aktivitas antibakteri dari 28 ekstrak kultur jamur

dengan bakteri uji S. aureus dan E. coli dapat dilihat pada Gambar 4.4 dan

Gambar 4.5.

Garam Tetrazolium Formazan

H+

32


(a) (b)

(e)

Gambar 4.4 Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji

S. aureus

(a) (b)

(e)

Gambar 4.5 Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur dengan bakteri uji E. coli

Keterangan:

(a) Ekstrak etil asetat kultur jamur pada medium PDB

(b) Ekstrak etil asetat kultur jamur pada medium GYP

(c) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium PDB

(d) Ekstrak kloroform kultur jamur pada medium GYP

(c)

(d)

(d)

(c)

33


(e) Kontrol positif antibiotik kloramfenikol 5 µg (kiri) dan 10 µg (kanan)

Dari hasil uji bioautografi ini, dapat diketahui bahwa ekstrak kultur jamur

endofit yang memiliki aktivitas antibakteri yaitu ekstrak no. 9 (isolat 3-2-1-2) dan

no. 10 (isolat 1-3-1-1) yang dikultivasi pada medium PDB dan diekstraksi dengan

pelarut kloroform. Diameter zona hambat ekstrak no. 10 (S. aureus : 0,9 cm dan

E. coli : 0,8) lebih besar daripada ekstrak no. 9 (S. aureus : 0,6 cm dan E. coli : 0,6

cm), sehingga dapat dikatakan bahwa jamur endofit no. 10 memiliki aktivitas

antibakteri lebih besar daripada jamur endofit no. 9. Selanjutnya dilakukan scaling

up terhadap kultur jamur endofit no. 10 pada medium PDB.

4.2 Scaling Up Jamur Endofit No. 10 (Isolat 1-3-1-1) pada Medium PDB

Berdasarkan hasil skrining, diketahui bahwa ekstrak kloroform kultur

jamur endofit no. 10 yang dikultivasi pada medium PDB memiliki aktivitas

sebagai antibakteri yang paling besar terhadap bakteri uji S. aureus dan E. coli.

Maka, dilakukan scaling up terhadap kultur jamur endofit no. 10 agar metabolit

bioaktif yang diperoleh lebih banyak dan mencukupi untuk dilakukan uji

selanjutnya. Proses scaling up ini dilakukan pada medium PDB sebanyak 2 liter

dengan masa kultivasi selama 3 minggu.

Kultur jamur endofit hasil scaling up diekstraksi secara ekstrasel dan

intarsel yaitu dengan cara memisahkan antara medium dengan biomassanya

dengan cara disaring. Medium diekstraksi dengan pelarut kloroform, sedangkan

untuk biomassa dilakukan maserasi dengan aseton sebanyak 3x24 jam. Hasil

maserasi diekstraksi dengan kloroform. Semua proses ekstraksi dilakukan dengan

menggunakan pelarut sebanyak 1:1 terhadap fraksi air kultur jamur dan dilakukan

sebanyak 3 kali. Hal ini bertujuan agar diperoleh ekstrak sebanyak mungkin.

Masing-masing fraksi yang didapat dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.

Selanjutnya dilakukan uji KLT-bioautografi pada ekstrak kloroform

medium jamur dan ekstrak kloroform biomassa jamur dengan konsentrasi masing-

masing ekstrak 10 mg/mL yang ditotolkan pada plat KLT sebanyak 10 µL dengan

pipa kapiler, dikembangkan dengan eluen diklorometan:metanol (15:1) yang

bertujuan untuk mengetahui nilai Rf dari senyawa yang aktif sebagai antibakteri.

34


Profil KLT-bioautografi ekstrak kultur jamur endofit no.10 hasil scaling up dapat

dilihat pada Gambar 4.6.

(a) (b) (c)

Gambar 4.6 Profil KLT-bioautografi ekstrak kultur jamur no. 10 (isolat 1-3-1-1)

hasil scaling up

Eluen diklorometan:metanol (15:1)

Keterangan :

(a) Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur no.10 dengan bakteri uji

S. aureus

(b) Hasil uji bioautografi ekstrak kultur jamur no. 10 dengan bakteri uji E. coli

(c) Hasil uji KLT ekstrak kultur jamur no. 10 yang disemprot dengan pereaksi

penampak noda serium sulfat

MC : Ekstrak kloroform medium jamur no.10

BC : Ekstrak kloroform biomassa jamur no.10

Berdasarkan hasil uji KLT-bioautografi pada kedua ekstrak, dapat

diketahui bahwa zona hambat pada spot ekstrak kloroform biomassa jamur lebih

besar daripada ekstrak kloroform medium jamur. Zona hambat yang terlihat pada

ekstrak kloroform biomassa jamur memiliki nilai Rf 0,18-0,78 (bakteri uji

S. aureus) dan nilai Rf 0,25-0,72 (bakteri uji E. coli). Sedangkan untuk ekstrak

kloroform medium jamur memiliki nilai Rf 0-0,53 (bakteri uji S. aureus) dan nilai

Rf 0,42-0,68 (bakteri uji E. coli). Tahap selanjutnya dilakukan fraksinasi dan

purifikasi metabolit bioaktif antibakteri dari ekstrak kloroform biomassa jamur.

35


4.3 Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif Antibakteri dari Ekstrak

Kloroform Biomassa Jamur Endofit No. 10 (Isolat 1-3-1-1)

Proses pemisahan metabolit bioaktif dari ekstrak pekat kloroform dari

biomassa jamur sebanyak 161,7 mg dilakukan dengan metode kromatografi

kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230 mesh. Berdasarkan hasil

optimasi dengan KLT maka dipilih fase gerak kloroform:metanol (30:1). Eluat

yang keluar ditampung dalam tabung reaksi dan dimonitor dengan KLT

menggunakan eluen diklorometan: metanol (15:1), dari proses pemisahan ini

diperoleh 42 tabung reaksi dan spot yang memiliki pola kromatogram yang sama

digabung menjadi satu fraksi sehingga didapat 8 fraksi yang kemudian dipekatkan

dengan vacuum rotary evaporator dan diidentifikasi dengan KLT (Gambar 4.7).

Adapun bobot dari masing-masing fraksi yaitu fraksi 1 (81,7 mg), 2 (20,6 mg),

3 (10,4 mg), 4 (1,9 mg), 5 (27,8 mg), 6 (5,7 mg), 7 (6 mg), dan 8 (7 mg).

Gambar 4.7 Profil KLT hasil fraksinasi ekstrak kloroform biomassa jamur setelah


Eluen: diklorometan:metanol (15:1)

Berdasarkan pola kromatogram diatas, spot tunggal dari senyawa yang

memiliki aktivitas antibakteri belum didapat sehingga perlu dilakukan proses

pemisahan selanjutnya. Proses pemisahan ini dilakukan pada fraksi 3 (10,4 mg)

dengan metode kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 70-230

mesh. Berdasarkan hasil optimasi dengan KLT maka dipilih fase gerak

n-heksana:etil asetat (3:1). Eluat yang keluar ditampung dalam tabung reaksi dan

dimonitor dengan KLT menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (2:1), dari proses

pemisahan ini diperoleh 44 tabung reaksi dan spot yang memiliki pola

36


kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapat 6 fraksi

yang kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator dan diidentifikasi

dengan KLT (Gambar 4.8). Adapun bobot dari masing-masing fraksi yaitu fraksi

3a (0,7 mg), 3b (2,5 mg), 3c (2,2 mg), 3d (1,6 mg), 3e (1,4 mg), dan 3f (1,8 mg).

Gambar 4.8 Profil KLT fraksi hasil kromatografi kolom fraksi 3 setelah


Eluen: n-heksana:etil asetat (2:1)

Berdasarkan profil KLT diatas, pemisahan senyawa dari fraksi 3 (10,4 mg)

menghasilkan spot tunggal pada fraksi 3e (1,4 mg). Dikarenakan keterbatasan

jumlah sampel yang didapat, uji kemurnian dari senyawa ini hanya dilakukan

dengan KLT tiga sistem eluen dan KLT dua dimensi. Senyawa yang didapat

berupa serbuk putih dan menimbulkan noda berwarna hijau pada KLT setelah

disemprot dengan penampak noda serium sulfat. Selanjutnya dilakukan uji KHM

pada fraksi murni yang didapat.

4.4 Penentuan Nilai KHM (Kadar Hambat Minimum)

Uji KHM dilakukan pada fraksi 3e yang dilarutkan dengan DMSO 30%

hingga didapat konsentrasi 512 μg/mL dengan rentang konsentrasi pengenceran

dimulai dari 128 μg/mL hingga 1 μg/mL. Medium untuk inokulasi bakteri uji

digunakan medium MHB (Mueller Hinton Broth) dan digunakan kontrol

pembanding yaitu antibiotik komersial eritromisin dan kloramfenikol.

37


Gambar dari hasil uji KHM ini dapat dilihat pada Lampiran 7 dengan

hasil yang diberikan pada Tabel 4.2.

Tabel 4.2 Data nilai KHM terhadap bakteri uji S. aureus dan E. coli

Larutan uji Nilai KHM (µg/mL)

S. aureus E. coli

Fraksi 3e 32 >128

Eritromisin ≤1 64

Kloramfenikol 4 8

Berdasarkan hasil uji KHM terhadap bakteri uji S. aureus didapatkan hasil

bahwa fraksi 3e mempunyai nilai KHM : 32 µg/mL, untuk kontrol positif

antibiotik eritromisin yaitu 1 µg/mL dan kloramfenikol 4 µg/mL. Hal ini

menunjukkan bahwa kekuatan antibakteri terhadap bakteri uji S. aureus dari fraksi

3e masih dibawah kekuatan antibiotik eritromisin dan kloramfenikol.

Sedangkan hasil uji KHM terhadap bakteri uji E. coli didapatkan hasil

bahwa fraksi 3e mempunyai nilai KHM : >128 µg/mL, dimana pada konsentrasi

128 µg/mL fraksi 3e hanya bersifat parsial menghambat pertumbuhan bakteri.

Nilai KHM untuk kontrol positif antibiotik eritromisin yaitu 64 µg/mL dan

kloramfenikol yaitu 8 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa kekuatan antibakteri

terhadap bakteri uji E. coli dari fraksi 3e masih dibawah kekuatan antibiotik

eritromisin dan kloramfenikol.

Pada uji KHM ini digunakan beberapa kontrol yaitu sterility control untuk

menunjukkan bahwa medium yang digunakan steril dan sebagai kontrol positif

dengan tidak adanya pertumbuhan bakteri uji, growth control sebagai kontrol

negatif dengan adanya pertumbuhan bakteri uji pada medium, dan solvent control

yang digunakan untuk menunjukkan bahwa pelarut yang digunakan tidak

memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji.

38


4.5 Identifikasi Jamur Endofit 1-3-1-1 secara Makroskopis dan Mikroskopis

Berdasarkan hasil pengamatan secara makroskopis jamur 1-3-1-1 pada

medium PDA hari ke-7 menunjukkan bahwa koloni berwarna coklat-hijau dengan

permukaan menggunung, memiliki tekstur wooly, memiliki garis radial dan

lingkaran konsentris, warna balik koloni coklat-hijau, dan tidak ada tetes eksudat.

Secara mikroskopis menunjukkan bahwa hifa jamur berseptat dan

berpigmentasi hialin. Diduga jamur 1-3-1-1 merupakan jamur yang berasal dari

kelas Coelomycetes. Coelomycetes merupakan jamur aseksual yang menghasilkan

hifa yang subur, berseptat, dan bercabang (Cano et al., 2004; Duan et al., 2007;

Sutton, 1999). Hasil identifikasi jamur endofit 1-3-1-1 secara makroskopis dan

mikroskopis dapat dilihat pada Gambar 4.9.

(a) (b) (c)

Gambar 4.9 Gambar jamur endofit 1-3-1-1 (a) koloni tampak atas (b) koloni

tampak bawah (reverse side) (c) hifa secara mikroskopik (skala

perbesaran 1000x).

39


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 KESIMPULAN

1. Berdasarkan hasil skrining aktivitas antibakteri terhadap 10 isolat jamur

endofit yang diisolasi dari bagian daun (1 isolat), tangkai daun (6 isolat),

dan bunga (3 isolat) tanaman Kina (Cinchona pubescens Vahl.) yang

dikultivasi pada medium PDB dan GYP, diketahui bahwa ekstrak

kloroform kultur jamur 1-3-1-1 yang dikultivasi pada medium PDB

memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar.

2. Dari hasil fraksinasi dan purifikasi ekstrak kloroform biomassa jamur

1-3-1-1 yang dikultivasi pada medium PDB, diperoleh senyawa murni

pada fraksi 3e sebanyak 1,4 mg.

3. Uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa fraksi 3e memiliki nilai

KHM 32 µg/mL terhadap bakteri uji S. aureus, dan >128 µg/mL terhadap

bakteri uji E. coli.

4. Berdasarkan hasil identifikasi secara makroskopik dan mikroskopik,

diketahui bahwa jamur endofit 1-3-1-1 merupakan jamur kelas

Coelomycetes.

5.2 SARAN

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai penentuan struktur

senyawa dari metabolit bioaktif antibakteri yang telah diisolasi.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi jamur endofit

1-3-1-1 hingga tingkat spesies.

3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai skrining aktivitas

antibakteri terhadap jamur endofit no. 1-6 (kode isolat: 5-1-8-5, 1-2-5-3,

2-2-6-4, 3-2-10-2, 2-3-4-2, dan 3-3-4-2) yang dikultivasi pada medium

PDB dan GYP dan diekstraksi dengan pelarut kloroform.


DAFTAR PUSTAKA

Abdi, Y. A., Gustafsson, L. L., Ericson, O., and Hellgren, U. 2003. Handbook of

Drugs for Tropical Parasitic Infections. 2nd Edition. London: Taylor & Fancis

Ltd.

Agusta, A. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Bandung: Penerbit ITB.

Alexander, Steve K., Strete, D., and Niles, M. J. 2004. Laboratory Exercise in

Organismal and Molecular Microbiology. New York: McGraw-Hill.

Azevedo, J. L., Maccheroni, W., Jr., Pereira, J. O., and de Araujo, W. L. 2000.

Endophytic Microorganisms: A Review on Insect Control and Recent Advances

on Tropical Plants. Electron. J. Biotechnol. 3 (1).

Braithwaite, A. and Smith, F. J. 1999. Chromatographic Methods. 5th edition.

London: Kluwer Academic Publisher.

Cano, J., Guarro, J., and Gene, J. 2004. Molecular and Morphological

Identification of Colletotrichum Spesies of Clinical Interest. Journal of Clinical

Microbiol. 42 (6). 2450-2454.

Choi, YW., Hodgkiss, IJ., Hyde, KD. 2005. Enzyme Production by Endophytes of

Brucea javanica. J. Agric. Tech. 1, 55-65.

Choma, Irena. 2005. The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct

Bioautography for Antimicrobial Analysis. LCGC Europe. 18 (9).

Choma, Irena M and Grzelak, Edtya M. 2010. Bioautography Detection in Thin-

Layer Chromatography. Elsevier. 1218 (19).

Duan, J.X., Wu, W.P., and Liu, X.Z. 2007. Dinemasporium (Coelomycetes).

Fungal Diversity. 26: 205-218.

41


Ganjar, G.I. dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka

Pelajar.

Gandjar, I., R.A. Samson, K. Van Den Tweel-Vermeulen, A. Oetari, dan I.

Santoso. 1999. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta: Yayasan Obor

Indonesia.

Grenish, Henry G. 1920. A Text Book of Materia Medica: Being an Account of the

More Important Crude Drugs of Vegetable and Animal Origin. J. & A. Churchill.

Harvey, David. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: Mcgraw-Hill

Comp.

Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H., Stanley J.T., and Williams S. T. 1994,

Burgey’s Mannual of Determinative Bacteriology, Ed ke-9. Baltimore: William

Walkins.

Orwa, C., Mutua, A., Kindt, R., Jamnadass, R., and Simons, A. 2009.

“Agroforestree Database a Tree Reference and Selection Guide Version 4.0”.

(http://www.worldagroforestry.org/af/treedb).

Pelczar, M.J. and Chan, ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS,

Imas T, Tjitrosomo SS., Angka, S. Penerjemah; Jakarta: UI Press. Terjemahan

dari: Elements of Microbiol.

Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga.

Prihatiningtias, W. 2005. “Senyawa Bioaktif Fungi Endofit Akar kuning

(Fibraurea chloroleuca Miers) sebagai Agensia Antimikroba”. Tesis. Program

Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana UGM.

Sarker, S.D., Latif, Z., Gray, A.I. 2005. Methods in BiotechnologyTM. Natural

Products Isolation. 2nd edition. New Jersey: Humana Press.

42


Setiabudy, R. 2007. Farmakologi Dan Terapi. Ed ke-5. Departemen Farmakologi

dan Terapeutik FKUI, Jakarta : Balai Penerbit FKUI.

Simanjuntak, P., Titi Parwati, Bustanussalam, Titik K. Prana, dan Shibuya, H.

2002b. Produksi Alkaloid Kuinina oleh Beberapa Mikroba Endofit dengan

Penambahan Zat Induser (Studi Mikroba Endofit Tanaman Cinchona sp. (2)).

Majalah Farmasi Indonesia 13 (1), 1-6.

Species 2000 & ITIS Catalogue of Life 2013. Indexing The World’s Known

Species. Diakses tanggal 17 Agustus 2013.

(http://www.catalogueoflife.org/col/details/species/id/9785764)

Strobel, G., and Daisy, B. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and

Their Natural Products. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 491-502.

Sultoni, A. 1995. Petunjuk Kultur Teknis Tanaman Kina. Jakarta: Asosiasi

Penelitian dan Pengembangan Perkebunan Indonesia.

Sutton, D.A. 1999. Coelomycetous Fungi in Human Disease. A Review: clinical

entities, phatogenesis, identification and therapy. Rev. Iberoam. Micol. 16, 171-

179.

Tan, R.X., and W.X. Zou. 2001. Endophytes : A Rich Source of Functional

Metabolites. Nat. Prod. Rep. 18, 448-459.

Todar, K. 2002. The Control of Microbial Growth. Wisconsin: University of

Wisconsin.

Yu, H., Zhang, L., Lin, L., Zheng, C., Guo, L., Li, W., Sun, P., and Qin, L. 2010.

Recent Developments and Future Prospects of Antimicrobial Metabolites

Produced by Endophytes. Mic. Research. Elsevier. 165, 437-449.

43


Zinniel, DK., Lambrecht, P, Haris, NB., Feng, Z., Kuczmarski, D., Higley, P.,

Ishimaru, CA., Arunakumari, A., Barletta, RG., and Vidader, AK. 2002.

Isolation and Characterization of Endophytic Colonizing Bacteria from

Agronomics Crops and Prairie Plants. Appl Environ Microbiol. 68, 2198-2208.


LAMPIRAN

Lampiran 1. Diagram Alur Penelitian

10 isolat murni jamur endofit yang diisolasi dari bagian

daun (1), tangkai daun (6), dan bunga (3) tanaman

Kina (Cinchona pubescens Vahl.)

Scaling up kultur jamur

endofit yang paling aktif

sebagai antibakteri

Fraksinasi dan purifikasi

metabolit bioaktif

antibakteri

Identifikasi jamur endofit yang

paling aktif sebagai antibakteri

Penentuan nilai KHM

Skrining aktivitas antibakteri

jamur endofit

45


Lampiran 2. Diagram Skrining Aktivitas Antibakteri

10 isolat murni jamur endofit

Diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat:metanol (4:1) sebanyak

3x40 ml

Diidentifikasi dengan

KLT- Bioautografi

Terbentuk zona hambat

(Aktivitas antibakteri (+) )

Tidak terbentuk zona hambat

(Aktivitas antibakteri (-) )

Scaling Up kultur jamur

endofit yang paling aktif

sebagai antibakteri

Kultivasi tahap pertama: Isolat no. 1-6 masing-masing

dikultivasi pada 40 ml medium PDB dan GYP

Diinkubasi selama 3 minggu pada suhu ruang

Kultivasi tahap kedua: Isolat no. 7-10 masing-masing dikultivasi pada 40 ml medium

PDB dan GYP Diinkubasi selama 3 minggu pada

suhu ruang

Diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat:metanol (4:1) dan fraksi

airnya diekstraksi lagi dengan kloroform (1:1) sebanyak 3x40 ml

46


Lampiran 3. Diagram Scaling Up Jamur Endofit yang Paling Aktif sebagai

Antibakteri

Jamur endofit no. 10 (isolat 1-3-1-1) dikultivasi pada 2 liter medium PDB selama 3 minggu pada suhu ruang

Dimaserasi dengan aseton 3 x 24 jam

Fraksi kloroform (lap. bawah)

Biomassa

Disaring untuk memisahkan biomassa dengan mediumnya

Masing-masing fraksi dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator

Dilakukan uji KLT-Bioautografi

Fraksinasi dan purifikasi metabolit bioaktif antibakteri

Penentuan nilai KHM

Hasil maserasi diekstraksi dengan kloroform (1:1) sebanyak 3 kali

Medium

Diekstraksi dengan kloroform (1:1) sebanyak 3 kali

Fraksi Kloroform (lap. bawah)

Fraksi air (lap. atas)

Fraksi air (lap. atas)

47


Lampiran 4. Diagram Fraksinasi dan Purifikasi Metabolit Bioaktif

Antibakteri

Ekstrak pekat kloroform dari biomassa jamur ( 161,7 mg)

F 1 81,7 mg

Difraksinasi dengan kromatografi kolom menggunakan silika 70-230 mesh eluen kloroform:metanol (30:1)

Dimonitor dengan KLT menggunakan eluen diklorometan:metanol (15:1), diamati dibawah sinar UV 254 dan 366 nm dan disemprot pereaksi penampak noda serium sulfat

F 2 20,6 mg

F 3 10,4 mg

F 4 1,9 mg

F 5 27,8 mg

F 6 5,7 mg

F 7 6 mg

F 8 7 mg

Difraksinasi dengan kromatografi kolom menggunakan silika 70:230 mesh eluen heksana:etil asetat (3:1)

Dimonitor dengan KLT menggunakan eluen heksana:etil asetat (2:1), diamati dibawah sinar UV 254 dan 366 nm dan disemprot pereaksi penampak noda serium sulfat

F 3a 0,7 mg

F 3b 2,5 mg

F 3c 2,2 mg

F 3d 1,6 mg

F 3e 1,4 mg

F 3f 1,8 mg

Didapat spot tunggal Dilakukan uji KHM

48


Lampiran 5. Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri

Jumlah koloni bakteri =

Bakteri uji S. aureus

Jumlah koloni bakteri = = 6,5 x 1010

Pengenceran bakteri

Bakteri uji E. coli

Jumlah koloni bakteri = = 1,05 x 109

Pengenceran bakteri

Koloni yang muncul x faktor pengenceran

Volume yang dipipet

65 x 108

0,1 ml

105 x 106

0,1 ml

Suspensi bakteri 6,5 x 1010

109 107 105

500 µl 200 µl 50 µl

4.500 µl MHB

4.950 µl MHB

19.800 µl MHB

Suspensi bakteri 1,05 x 109

107 105

50 µl 200 µl

4.950 µl MHB

19.800 µl MHB

49


Lampiran 6. Gambar Identifikasi Bakteri Uji dengan Pewarnaan Gram dan

Diamati Menggunakan Mikroskop Cahaya

Bakteri uji S. aureus (Bakteri Gram positif)

Skala perbesran 400x

Bakteri Uji E. coli (Bakteri Gram negatif)

Skala perbesran 4000x

50


Lampiran 7. Gambar Hasil Uji KHM

Sampel uji F.3e Eritromisin Kloramfenikol

Bakteri uji Staphylococcus aureus

Sampel uji F.3e Eritromisin Kloramfenikol

Bakteri uji Escherichia coli

Sterility

control

Growth

control

DMSO

30%

Etanol

20%

Sterility

control

Growth

control

DMSO

30%

Etanol

20%

128 µg/ml

64 µg/ml

32 µg/ml

16 µg/ml

8 µg/ml

4 µg/ml

2 µg/ml

1 µg/ml

128 µg/ml

64 µg/ml

32 µg/ml

16 µg/ml

8 µg/ml

4 µg/ml

2 µg/ml

1 µg/ml

51


Lampiran 8. Komposisi dan Cara Pembuatan Medium yang Digunakan

1. Medium PDB (Potato Dextrose Broth)

Komposisi Medium PDB

PDB Himedia 0,48 g

Dekstrosa 19,6 g

pH 5,1 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara Pembuatan:

24 gram PDB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar

melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15

menit.

2. Medium GYP (Glucose Yeast extract Peptone)

Komposisi Medium GYP

Glucose 20,0 g

Yeast extract 1,0 g

Peptone 5,0 g

K2HPO4 0,5 g

Mg2SO4. 7H2O 0,5 g

FeSO4 0,01 g

CaCO3 1,0 g

pH 7,0 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara Pembuatan:

Bahan-bahan medium GYP yang sudah ditimbang disuspensikan dengan

1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan

menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.

52


3. Medium PDA (Potato Dextrose Agar)

Komposisi Medium PDB

Potato Starch 4,0 g

Dekstrosa 20,0 g

Agar 15,0 g

pH 5,1 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara Pembuatan:

24 gram PDB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar


menit.

4. Medium BHI (Brain Heart Infusion)

Komposisi medium BHI

Brain Heart, Infusion from (Solids) 6,0 g

Peptic Digest of Animal Tissue 6,0 g

Sodium Chloride 5,0 g

Dextrose 3,0 g

Pancreatic Digest of Gelatin 14,5 g

Disodium Phosphate 2,5 g

pH 7,4 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara pembuatan:

37 gram BHI disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar


menit.

5. Medium MHA (Mueller Hinton Agar)

Komposisi Medium MHA

Beef Extract Powder 2,0 g

Acid Digest of Casein 17,5 g

Starch 1,5 g

53


Agar 17,0 g

pH 7,4 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara pembuatan:

38 gram MHA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar


menit.

6. Medium MHB (Mueller Hinton Broth)

Komposisi Medium MHA

Cassein Acid Hydrolysate 17,5 g

Beef Extract 2,0 g

Starch 1,5 g

pH 7,4 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara pembuatan:

21 gram MHB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar


menit.

7. Medium NA (Nutrient Agar)

Komposisi Medium NA

Agar 15,0 g

Gelatin Peptone 5,0 g

Beef Extract 3,0 g

pH 7,4 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara pembuatan:

23 gram NA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar


menit.

54


Lampiran 9. Gambar Alat-Alat yang Digunakan

Rotary evaporator Incubator

Shaker incubator UV Cabinet

Mikroskop cahaya

Laminar air flow Autoklave Oven

Timbangan digital

SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI · PDF fileGambar 2.2 Klasifikasi metode...

Documents

Transcript of SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI · PDF fileGambar 2.2 Klasifikasi metode...