SINTESIS DAN PENGOLAHAN RNA MESSANGER

Di antara ketiga macam RNA, mRNA adalah yang paling panjang, mengandung beberapa ratus sampai sekitar seribu nukleotida. Ditemukan hnRNA (RNA inti heterogen) yang merupakan prekursor utama untuk mRNA sitoplasma yang lebih kecil pada eukariotik Eksperimen James Darnell, Jr. Klaus Scherrer dan rekan. Sifat hnRNA: 1. Memiliki berat molekul yang besar (sampai sekitar 80-an, atau 50.000 nukleotida), 2. Sebagai sebuah kelompok, molekul-molekul RNA diwakili oleh RNA dari urutan nukleotida yang beragam (heterogen), dan 3. Molekul-molekul RNA hanya ditemukan di dalam nukleus.

Struktur mRNARNA messanger memiliki sifat tertentu, yaitu: 1. Berisi urutan yang kontinu dari pengkodean nukleotida sebagai polipeptida spesifik. 2. Ditemukan di sitoplasma. 3. Melekat pada ribosom ketika diterjemahkan. 4. Sebagian mRNA mengandung segmen noncoding signifikan, yaitu bagian yang tidak terlibat pada perakitan asam amino. 5. mRNA eukariotik memiliki modifikasi khusus pada termin ke 5 dan 3 yang tidak ditemukan pada mRNA bakteri ataupun pada tRNA dan rRNA. Ujung ke 3 dari hampir semua mRNA eukariotik memiliki serangkaian 50 sampai 250 residu adenosin yang membentuk ekor poli (A), sedangkan ujung 5 memiliki tudung methylguanosine.

Struktur mRNA -globin manusia

Kelengkapan untuk Transkripsi mRNARNA disintesis pada DNA template melalui proses yang disebut transkripsi DNA. Semua molekul RNA disintesis oleh enzim RNA polimerase. Enzim RNA polimerase II mengawali dan mengakhiri transkripsi pada bagian khusus untai DNA. RNA polimerase II mengikat promotor dengan kerja sama dari sejumlah faktor transkripsi umum (GTF) untuk membentuk sebuah kompleks pra-inisiasi (PIC). Elemen promotor perakitan PIC nukleat berada pada sisi ke 5 dari setiap unit transkripsi meskipun enzim membuat kontak dengan DNA pada kedua sisi transkripsi site awal. Bagian penting promoter gen (berdasarkan penelitian pada gen ovalbumin yang mengkodekan putih telur ayam, dan gen globin yang mengkodekan polipeptida hemoglobin) terletak di antara basa 24 dan 32 dari sisi di mana transkripsi dimulai. Wilayah tersebut sering berisi urutan konsensus yang identik atau sangat mirip dengan oligonukleotida 5 -TATAAA-3 dan dikenal sebagai kotak TATA. Langkah pertama dalam perakitan kompleks pra-inisiasi ini adalah pengikatan protein yang disebut TATA-binding protein (TBP) yang mengenali kotak TATA promoter. Jadi, seperti dalam sel bakteri, polimerase eukariotik yang dimurnikan tidak dapat mengenali promoter langsung dan tidak dapat memulai transkripsi sendiri secara akurat.

Lanjutan dari Kelengkapan untuk Transkripsi mRNA.TBP hadir sebagai subunit dari kompleks protein yang jauh lebih besar yang disebut TFIID (transkripsi faktor untuk polimerase II, fraksi D). Pengikatan TFIID mempersiapkan tahapan untuk perakitan kompleks prainisiasi lengkap yang diperkirakan terjadi secara bertahap. Kehadiran tiga GTF (TBP dari TFIID, TFIIA, dan TFIIB) yang terikat promoter menyediakan platform untuk pengikatan keseluruhan multisubunit RNA polimerase berikutnya dengan TFIIF. Setelah RNA polimerase-TFIIF berada dalam posisinya, sepasang GTF (TFIIE dan TFIIH) bergabung dengan kompleks dan mengubah polimerase menjadi mesin yang aktif menyalin. TFIIH adalah GTF yang dikenal memiliki aktivitas enzimatik. Salah satu fungsi subunit TFIIH sebagai protein kinase adalah untuk memfosforilasi RNA polimerase, sedangkan dua subunit lainnya dari protein ini berfungsi sebagai DNA unwinding enzim (helikase). Aktivitas DNA helikase diperlukan untuk memisahkan untaian DNA dari promoter yang memungkinkan akses polimerase ke untaian template. Setelah transkripsi dimulai, GTF tertentu (termasuk TFIID) dapat tertinggal di belakang promoter, sementara yang lain dilepaskan dari kompleks. Selama TFIID masih terikat promoter, molekul RNA polimerase tambahan mungkin dapat melampirkan ke site promotor dan menginisiasi putaran tambahan dari transkripsi tanpa penundaan.

Lanjutan dari Kelengkapan untuk Transkripsi mRNA.Domain karboksil terminal (CTD) dari subunit terbesar RNA polimerase II memiliki struktur yang tidak biasa, terdiri dari urutan tujuh asam amino (-Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4Ser5-Pro6-Ser7-) yang berulang-ulang. Pada manusia, CTD terdiri dari 52 pengulangan heptapeptida ini. Semua dari tujuh residu heptapeptida dapat secara enzimatik diubah dalam satu atau lain cara. Polimerase RNA yang merakit kompleks pra-inisiasi tidak terfosforilasi, sedangkan enzim yang sama terlibat dalam transkripsi ini sangat terfosforilasi; semua kelompok fosfat yang ditambahkan terlokalisasi dalam CTD. Fosforilasi CTD dapat dikatalisis oleh setidaknya empat protein kinase yang berbeda, termasuk TFIIH yang memposforilasi residu serin pada posisi #5. Fosforilasi polimerase oleh TFIIH dapat bertindak sebagai pemicu yang memisahkan enzim dari GTF dan/atau promoter DNA yang memungkinkan enzim untuk melarikan diri dari kompleks pra-inisiasi dan bergerak turun ke template DNA. Seperti RNA polimerase yang bergerak sepanjang gen yang ditranskripsi, kinase (P-TEFb) lain memposforilasi CTD pada residu serin pada posisi #2. Perubahan dalam pola fosforilasi ini diperkirakan untuk memfasilitasi perekrutan faktor protein tambahan yang terlibat dalam pemrosesan RNA dan transkripsi terminasi. Dengan cara ini, CTD bertindak sebagai platform untuk keuntungan dinamis dan hilangnya faktor yang diperlukan untuk pembentukan mRNA dewasa. Menurut beberapa perkiraan, perpanjangan RNA polimerase II dapat berisi lebih dari 50 komponen dan merupakan total massa molekul lebih dari 3 juta dalton.

Model struktural pembentukan kompleks pra-inisiasi

Inisiasi transkripsi dari sebuah promoter polimerase II eukariot

Inisiasi transkripsi oleh RNA polimerase II terkait dengan fosforilasi domain C-terminal (CTD)

Pengolahan mRNA EukariotikRNA polimerase II merakit sebuah transkrip primer yang komplementer dengan DNA dari unit transkripsi keseluruhan. Pemeriksaan mikroskopik elektron dari transkripsional gen aktif menunjukkan bahwa transkrip RNA menjadi terkait dengan protein dan partikel yang lebih besar ketika mereka masih dalam proses disintesis. Partikelpartikel ini, yang terdiri dari protein dan ribonukleoprotein, termasuk agen yang bertanggung jawab untuk mengubah transkrip primer menjadi messenger dewasa. Proses konversi ini membutuhkan penambahan sebuah tudung 5 dan ekor 3 poli (A) ke ujung transkrip, dan penghapusan setiap intervensi intron. Setelah pengolahan selesai, mRNP yang terdiri dari mRNA dan yang terkait protein siap untuk ekspor dari inti.

Transkrip pra-mRNA diproses sebagaimana mereka disintesis (kotranskripsional)

Langkah-Langkah Penambahan Tudung Methylguanosine 5 dan Ekor 3 Poli (A) ke Pra-mRNAUjung 5 dari semua RNA awalnya memiliki trifosfat yang berasal dari nukleosida trifosfat pertama yang digabungkan di lokasi inisiasi dari sintesis RNA. Setelah ujung 5 dari sebuah prekursor mRNA disintesis, aktivitas beberapa enzim terjadi pada molekul akhir. Ujung 5 dari pra-mRNA mengikat enzim capping, yang pada mamalia memiliki dua situs aktif yang mengkatalisis reaksi yang berbeda, yaitu: sebuah triphosphatase yang memindahkan kelompok terminal fosfat (langkah 1) dan guanylyltransferase yang menambahkan sebuah residu guanin dalam orientasi terbalik, dengan cara menghubungkan 5 -ke-5 (langkah 2). Pada langkah 3, methyltransferase berbeda menambahkan kelompok metil ke tudung guanosin terminal dan ke ribosa dari nukleotida yang telah berada di akhir RNA yang baru lahir. Sebuah kompleks protein (disebut CBC) terikat pada tudung yang sudah selesai (tidak ditampilkan). Serangkaian peristiwa yang sangat berbeda terjadi pada ujung 3 dari pramRNA, dimana sebuah kompleks protein besar dirakit. Pertama, sebuah endonuklease memotong transkrip RNA primer, menghasilkan sebuah 3 akhir yang baru pada bagian hulu dari terminal 3 asli. Dalam langkah a-c, poli (A) polimerase menambahkan residu adenosin ke ujung 3 tanpa keterlibatan template DNA. Sebuah mRNA mamalia khas berisi 200 sampai 250 residu adenosin yang didalamnya dilengkapi ekor poli (A); jumlahnya kurang signifikan pada eukariota yang lebih rendah

Penyambungan RNA: Penghapusan Intron dari Pra-RNA

Selain pembentukan topi 5 dan ekor poli (A) yang telah dibahas, bagian-bagian transkrip primer yang sesuai dengan intervensi DNA sekuens (intron) harus dihilangkan dengan sebuah proses kompleks yang dikenal sebagai RNA splicing. Untuk menyambung sebuah RNA, kerusakan dalam strand harus diperkenalkan pada ujung 5 dan 3 (situs sambungan) dari masing-masing intron, dan ekson yang terletak di kedua sisi dari situs penyambungan harus bergabung (diikat) secara kovalen. Hal ini penting bahwa proses penyambungan terjadi dengan presisi mutlak, karena penambahan atau hilangnya nukleotida tunggal pada salah satu sambungan junctions akan menyebabkan mRNA yang dihasilkan akan salah menerjemahkan.

Urutan Nukleotida pada Site Sambungan pra-mRNA

Selain pembentukan topiinformasi poli (A) Selain pengkodean 5 dan ekor untuk membangun suatu polipeptida, sebuah prayang telah dibahas, bagian-bagian transkrip mRNA juga harus berisi informasi yang primer yang sesuai dengan intervensi DNA mengarahkan mesin bertanggung dengan sekuens (intron) harus dihilangkan jawab sebuah proses kompleks sebagai untuk penyambungan yang dikenal Urutan RNA. RNA splicing. ditunjukkan dalam sebuah nukleotida yang Untuk menyambung daerah RNA, kerusakan dalam strand harus dari site penyambungan didasarkan pada diperkenalkan pada ujung 5 dan 3 (situs analisis dari sejumlah besar pra-mRNA dan sambungan) dari masing-masing intron, dan karenanya sebagai urutan ekson yang disebut di kedua sisi dari situs terletak konsensus. Basis ditampilkan dalam warna penyambungan harus bergabung (diikat) oranye yang hampir invarian; mereka dalam secara kovalen. Hal ini penting bahwa proses warna hitam mewakili dengan presisi mutlak, penyambungan terjadi dasar pilihan pada karena penambahan atau hilangnya posisi itu. N merupakan salah satu dari nukleotida tunggal pada salah satu empat nukleotida; Y merupakan suatu sambungan junctions akan menyebabkan pirimidin. Saluran polypyrimidin dekat site mRNA yang dihasilkan akan salah penyambunagn 3 biasanya berisi antara 10 menerjemahkan. dan 20 pirimidin.

Jalur Struktur dan Self-Splicing Intron Kelompok II

(a) Struktur dua-dimensi dari intron kelompok II (ditunjukkan dalam warna merah). Intron melipat ke dalam enam karakteristik domain yang memancar dari pusat struktur. Tanda bintang menunjukkan nukleotida adenosin yang menonjol keluar dari domain VI dan membentuk struktur lariat seperti yang dijelaskan dalam teks. Kedua ujung intron menjadi dirapatkan satu sama lain seperti ditunjukkan oleh kedekatan kedua batas intron-ekson. (b) Langkah-langkah dalam penyambungan sendiri intron dari kelompok II. Pada langkah 1, 2 OH sebuah adenosin dalam intron (tanda bintang di domain VI bagian a) membawa sebuah serangan nukleofilik pada site sambungan 5, membelah RNA dan membentuk 25 fosfodiester berbeda yang terikat dengan nukleotida pertama dari intron. Struktur bercabang digambarkan sebagai suatu lariat. Pada langkah 2, 3 OH bebas dari ekson yang dipindahkan menyerang site sambungan 3 yang memotong RNA di ujung lain dari intron. Sebagai hasil dari reaksi ini, intron dilepaskan sebagai lariat bebas, ujung 3 dan 5 dari dua ekson yang mengapit diligasi (langkah 3). Sebuah jalur yang sama diikuti pada penyambungan intron dari pra-mRNA, tetapi tidak terjadi dengan cara penyambungan sendiri, langkah-langkah ini memerlukan bantuan dari sejumlah faktor tambahan.

Model Skematik dari Perakitan Mesin Penyambungan dan beberapa Langkah-Langkah yang terjadi Selama Penyambungan PremRNA

DECODING KODON: PERAN RNA TRANSFER

Translasi membutuhkan informasi yang dikodekan dalam urutan nukleotida dari mRNA akan diterjemahkan dan digunakan untuk mengarahkan perakitan berurutan asam amino menjadi rantai polipeptida. Decoding informasi pada mRNA dilakukan RNA transfer yang bertindak sebagai adapter. Di satu sisi, masing-masing tRNA terkait dengan asam amino tertentu (sebagai aa-tRNA), sementara di sisi lain, tRNA yang sama mampu mengenali kodon tertentu dalam mRNA. Interaksi antara kodon berturut-turut di mRNA dan aa-tRNA spesifik mengarah pada sintesis dari polipeptida dengan memerintahkan urutan asam amino. Untuk memahami bagaimana hal ini terjadi, pertama kita harus mempertimbangkan struktur dari tRNA.

Struktur tRNA

Hipotesis Wobble

Pertukaran basa dari posisi ketiga ditemukan Francis Crick yang mengusulkan bahwa RNA transfer yang sama mungkin dapat mengenali lebih dari satu kodon. Usulannya, yang disebut wobble hypothesis menyarankan bahwa persyaratan sterik antara antikodon dari tRNA dan kodon dari mRNA sangat ketat untuk dua posisi pertama tetapi lebih fleksibel di posisi ketiga. Akibatnya, dua kodon yang menentukan asam amino yang sama dan berbeda hanya terdapat pada posisi ketiga harus menggunakan tRNA yang sama dalam sintesis protein. Peraturan yang mengatur goyangan pada posisi ketiga dari kodon adalah sebagai berikut (Gambar 11.44): antikodon U yang dapat dipasangkan dengan A atau mRNA G; antikodon G dapat pasangan dengan U atau C dari mRNA, dan antikodon I (inosin, yang berasal dari guanin dalam molekul tRNA asli) dapat dipasangkan dengan U, C, atau A dari mRNA. Sebagai akibat dari goyangan, enam kodon untuk leusin, misalnya, hanya memerlukan tiga tRNA.

Aktivasi Asam Aminoselama sintesis polipeptida, setiap molekul RNA transfer akan melekat pada asam amino yang benar (serumpun). Asam amino yang kovalen terkait dengan ujung 3 tRNA(s) serumpun mereka dengan enzim yang disebut aminoasil-tRNA sintetase (aaRS). Meskipun ada banyak pengecualian, organisme biasanya berisi 20 aminoasil-tRNA sintetase yang berbeda, satu untuk masing-masing dari 20 asam amino dimasukkan ke dalam protein. Setiap sintetase mampu mencharger semua tRNA yang tepat untuk asam amino itu. Aminoasil-tRNA sintetase memberikan contoh yang sangat baik dari kekhususan interaksi protein-asam nukleat. Fitur-fitur umum tertentu harus ada di antara semua spesies tRNA uantuk menentukan asam amino yang diberikan yang memungkinkan satu aminoasil-tRNA sintetase untuk mengenali semua tRNA. Sementara, pada waktu yang sama, terjadi diskriminasi terhadap semua tRNA untuk asam amino lainnya. Informasi mengenai fitur struktural dari tRNA yang menyebabkan mereka dipilih atau ditolak sebagai substrat terutama datang dari dua sumber:

1.

2.

Penentuan struktur tiga-dimensi enzim ini dengan kristalografi sinar-X, yang memungkinkan peneliti untuk mengidentifikasi site di tRNA membuat kontak langsung dengan protein. Seperti diilustrasikan dalam Gambar 11.45, dua ujung tRNA akseptor stem dan anticodon sangat penting untuk pengenalan oleh sebagian besar enzim. Penentuan perubahan tRNA yang menyebabkan molekul menjadi diaminosilasi oleh noncognate sintetase.

Aminoasil-tRNA sintetase meliputi dua langkah reaksi berikut: