BAMBANG SUGIHARTOLaboratorium Biologi Molekul dan Bioteknologi

UPT. Laboratorium Terpadudan Sentra Inovasi-Teknologi CDAST

UNIVERSITAS JEMBERJl. Kalimantan No. 37 Jember, 68121 Email : sugiharto.fmipa@unej.ac.id

SERTIFIKASI DAN PEMANFAATAN

TANAMAN PRODUK REKAYASA GENETIKA

TUJUAN TRANSFORMASI GENETIK PADA SEL TANAMAN

• Mempelajari fungsi gen, proses biokimia dan metabolism sel tanaman

• Mengembangkan proses transformasi genetik

• Mendapatkan tanaman produk rekayasa genetika (PRG), sifat lebih unggul:

✓Pertumbuhan dan produksi lebih tinggi

✓Tahan terhadap hama penyakit

✓Tahan terhadap stress abiotic

✓Warna bunga lebih indah

Sitem perakaran tebu NXI-4T

Terong Brinjal

Golden rice

TANAMAN PRG (Produk Rekayasa Genetika / Genetically Modified [GM] Crops)Apa tanaman PRG ?Merupakan tanaman yang materi genetiknya telah diubah dengan menggunakan teknik rekombinanDNA, dan dengan perkawinan secara alamiah. Teknik ini termasuk teknik pemuliaan/persilangantanaman dengan menggunakan materi genetik dari sesama tanaman atau spesies lain.

Penelitian dasar, kloning, konstruksi pada vector ekspresi

Transformasi genetik dan karakterisasi tanaman PRG

Pengujian Keamanan HayatiKeamanan LingkunganKeamanan PanganKeamanan PakanPemanfaatan tanaman PRG

✓ Overeskpresi gen✓ Gene silencing ✓ DNA knock out✓ Genome Editing

Coding sequenceIntronPomoter

Plant Transgene

AntibioticmarkerReplication origin

Plant Selectable Marker Gene

Plasmid DNAConstruct

Pemanfaatan tanaman PRG

Apakah tanaman PRG aman?

Saat ini berbagai tanamanpangan, hortikultura dan pohon-pohonan dihasilkansebagai tanaman PRG

Pengujian Keamanan Hayati Tanaman Produk Rekayasa Genetika

Cartagena Protocol on Biosafety 1994Secara ringkas : it seeks to protect biodiversity from the potential risks of living modified organisms (LMOs) resulting from modern biotechnology.

Peraturan Pemerintah Nomor 21 Tahun2005 (PP 21 Tahun 2005)Tentang Keamanan Hayati ProdukRekayasa Genetika. Jenis organisma PRG, hewan, ikan, tanaman dan jasad renik.

Ratifikasi oleh Pemerintah Indonesia

Keamanan Hayati PRGKomosi Keamanan Hayati – KeamananPangan PRG (KKHKP-PRG)

Pengujian keamanan Tanaman PRG

1. Keamanan Lingkungan(Environmental Safety)

2. Keamanan Pangan (Food Safety)3. Keamanan Pakan (Feed Safety)

PENGUJIAN KEAMANAN LINGKUNGAN TANAMAN PRGAda dua tahap:1. Pengujian di Laboratorium (Green House Trial) – Fasilitas Uji Terbatas (FUT)2. Pengujian di Lapang (Confined Field Trial) – Lapang Uji Terbatas (LUT)

Keamanan lingkungan adalah kondisi dan upaya yang diperlukan untuk mencegahkemungkinan timbulnya resiko yang merugikan keanekaragaman hayati sebagaiakibat pemanfaatan tanaman produk rekayasagenetik PRG (PP No 21 Tahun 2005).

Dokumen hasil analisa resiko lingkungandigunakan sebagai prasyarat sebelumdiedarkan/dikomersialkan ke masyarakat luas, untuk memastikan bahwa produk rekayasagenetik (PRG) tidak menimbulkan resikoterhadap lingkungan baik biodiversitas ataupunekosistem sekitar.

Fasilitas Uji Terbatas/Biosafety Containment ialah suatu fasilitas berupa laboratoriumdan rumah kasa/kaca yang memenuhi syarat untuk pengujian tanaman PRG sepertipembatasan untuk menghindari materi pengujian tidak keluar dari lokasi FUT.

Pengujian di Fasilitas Uji Terbatas (FUT)

Pengujian dilakukan di FUT diantaranya ialah :

1. Pengujian karakter biokimia, biomolekuler dan fisiologi tanamanPRG

2. Pengujian kesepadanan fenotipik serta karakter pertumbuhan danproduksi

3. Pengujian efikasi tanaman PRG terhadap organisme target dan nontarget

4. Pengujian sifat invasiveness tanaman PRGTanaman pembanding adalah tanaman non-PRG

IMPORTANT!!! Prevention of the spread of genetically

engineered material outside lab/field

Pengujian sifat biokimia dan biologi molekul tanaman PRG

Analisa biokimia: pengamatan aktifitas enzim dan kandungan senyawa metabolite

Ekspresi protein: Western Blot Copy gen: Southern Blot Analisa stabilitasgenetik dengan PCR

Tanaman generasi ke 3

Analisa sifat biologi molekul: Southern, Northern, Western Blot, PCR

(Anur et al, 2020 [Plants])

Pengujian morfologi dan agronomi tanaman PRG

✓ Kesepadanan fenotipik dilakukan berdasarkan kekhawatiran adanya perubahan karakter yangdisebabkan oleh masuknya gen insert pada tanaman PRG. Parameter pengujian yang digunakanialah : karakter daun, batang, akar, bunga atau tunas yang dihasilkan.

✓ Karakter pertumbuhan dan produksi dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya perbedaanpertumbuhan dan produksi pada tanaman PRG dibandingkan dengan tetuanya. Parameterpengujian yang dilakukan mencakup : tinggi batang, biomassa tanaman, jumlahanakan/buah/biji.

(Anur et al, 2020 [Plants])

Pengujian efikasi terhadapserangga target dan non-target

Efikasi dan invasiveness tanaman PRG

Pengujian Invasiveness

Pengujian invasiveness terhadap gulma alami

Pengujian Keamanan Lingkungan di Lapang Uji Terbatas (LUT)

Pengujian di LUT adalah percobaanlapang tanaman PRG pada skala kecilhanya untuk tujuan penelitian pada kondisi yang dapat mencegahpenyebaran dan mengurangidampaknya terhadap lingkungan. Tujuannya adalah untuk mendapatkandata guna evaluasi keragaan pertumbuhandan produksi tanaman PRG.

Resiko lingkungan:1. Aliran materi gentik (Gene flow)2. Masuknya tanaman PRG pada rantai makanan3. Persistensi tanaman PRG di lapang

Pengujian di LUT :

1. Tata letak percobaan, berjarak daripemungkinan, tidak ada tanaman kerabatdekat/ sejenis di sekitarnya

2. Pengamatan aliran materi genetik (horizontal gene flow) dan kontaminasi genetik

3. Pengaruh tanaman PRG terhadap organismanon-target dan biodiversitas serangga

4. Pengaruh terhadap lingkungan tanah, populasimikroba tanah dan kandungan nutrisi tanah

SPS1

WTS SPS2 SPS1 SPS3 SPS2

Bord

er

Border

Bord

er

SPS3 WTL SPS2 SPS1 WTS

WTL SPS3

SPS1 WTS SPS3 WTL

Border

WTS SPS2 SPS3

SPS2 SPS1 WTL WTS WTL

Pintu

POS

L. Pembungan

L.P

em

bu

nga

n

P. Air

Deteksi gene flow pada rhizosphere tanah dengan PCR

Amplikasi produk Cry1Ac, bar, dan nptII tidak terdeteksi pada semua sampelMenunjukkan tidak ada gen dari luar yang tersimpan di mikroorganisme perakaran tanaman PRG

Zhou et al, 2016 [Frontier Plant Sci])

Pengaruh tanaman tebu PRG terhadap komunitas-diversitas

mikrobia pada rhizosphere tanah

Zhou et al, 2016 [Frontier Plant Sci])

Wulandari et al 2020 [JCSB])

Biodiversitas serangga di LUT tanaman PRG

Semut merah (Ordo Hymenoptera)

Jengkerik (Ordo Orthoptera)

Semut hitam (Ordo Hymenoptera)

Laba-laba (Ordo Araneae)

Non target organism (NTO)

✓ Direct ✓ Indirect

✓ Pollinators✓ Predators✓ Scavengers✓ Passers-by

PemohonMenteri

PertanianMeneg LH

KKH

TTKH

BKKH

Meneg LH

1

PUBLIK

14 hr

Menteri Pertanian

2

3

414 hr

14 hr

9

10

14 hr

60 hr

11

7 hr

FUT LUT56 hr

14 hr

15 hr

7 hr

5

6

7

8

PENGUJIAN KEAMANAN PANGAN TANAMAN PRG

1. Teknik rekayasa genetik yang diketahui melibatkan vektor dan mengandung gen-gen lain(termasuk promoter, terminator, serta gen penanda resistensi terhadap antibiotik)dikhawatirkan beresiko terhadap kesehatan manusia.

2. Insersi gen pada tanaman PRG berpotensi menyebabkan terjadinya modifikasi ekspresi gen,sehingga terekspresinya protein baru dapat menyebabkan respon alergi ataupun toksik.

✓ Keamanan pangan bertujuan mencegah kemungkinan timbulnya dampak yangmerugikan dan membahayakan kesehatan manusia, akibat dari proses produksi,penyiapan, penyimpanan, peredaran dan pemanfaatan pangan PRG (PP No 21 Tahun2005).

✓ Dokumen keamanan pangan berdasarkan PP No 21 tahun 2005, Codex AlimentariusCommission (FAO-WHO) dan Organization for Economic Cooperation and Develpoment(OECD) untuk dinyatakan aman suatu PRG dibutuhkan hasil analisis berupa informasikandungan gizi/ kesepadanan substansial, toksisitas dan alergenitas dari protein baruyang diekspresikan pada PRG.

Pengujian keamanan pangan tanaman PRG

Pengujian Kesepadanan Substansi

Pengujian Allergenitas Pengujian Toksisitas

Aman konsumsi atau tidak

Pengujian keamanan pangan: Pengujian kesepadanan substansi

Kadar Abu

Mineral Makro

Kadar Serat

Protein

N-P-K-Ca-Mg

Lemak

Fe-Zn-Mn

Kadar Air

Kalori

Karbo

Mineral Mikro

Parameter analisakesepadanan substansi

Pengujian KesepadananSubstansi merupakanserangkaian uji yang terdiri daripengujian kandunganproksimat dan mineral pada tanaman PRG dibandingkandengan tanaman non-PRG tetuanya

Suatu kandungan substansi dan mineral dikatakan sepadanapabila tidak ada perbedaanyang signifikan antara PRG dan tetuanya, serta masih dalamkisaran nilai OECD Parameter kandungan mineral

Kesepadanan substansi dan mineral tanaman tebu PRG

(Sudrajat et al, 2020 [PJBS])

Pengujian Keaamanan Pangan: Pengujian Allergenitas

Alergenisitas merupakan serangkaian uji:• Uji bioinformatika, • stabilitas panas dan stabilitas cerna,• Serta uji in vivo respon alergi

menggunakan hewan cobauntuk menentukan suatu PRG berpotensialergi atau tidak.

Penentuan potensi allergi ditentukanberdasarkan “decision tree” yangdirekomendasikan oleh WHO/FAO

“Decision Tree”

Framework pengujian allergenitas

Bioinfomatika In Vitro Stabilitas Panas & Cerna In Vivo Alergi Respon

80 mers aligment

Allergenonline.org

Heat treatment28-60-90ºC

SGF-SIF treatment

Day 7 Day 14

Heat treatment28-60-90ºC

Pengujian bioinformatika

• Analisis bioinformatika dilakukan dengan membandingkan urutan asam amino dari protein targetdengan semua protein yang teridentifikasi sebagai alergen pada database online.

• Analisa bioinformatika dilakukan dengan menggunakan beberapa Website online, diantaranya :1. Food Allergy Research and Resource Program (FARRP),2. Structural Database of Allergenic Protein (SDAP),3. Allergen Database for Food Safety (ADFS),4. Allermatch dan,5. Allergenonline

• Analisis bioinformatika terdiri dari analisis full-length alignments, 80 amino acid alignments, dan 8amino acid alignments (tidak direkomendasikan).

1. Analisis full-length alignments dapat menentukan ada tidaknya potensi cross-reaksi antara protein barudengan antibodi IgE.

2. Analisis 80 amino acid alignments dapat menentukan ada tidaknya struktur protein yang berperanmempertahankan struktur epitope pada protein alergen.

3. Analisa 8 mers sama halnya dengan analisa 80 mers. Analisa ini dapat direduksi dengan melakukananalisa 80 mers.

Analisis protein insert menggunakan full lenght alignments dengan kemiripan >50% dan analisis 80 aminoacid alignments dengan kemiripan >35%, dikategorikan protein baru yang berpotensi menimbulkan reaksialergi.

SPS1

Website AllergenOnline

“allergenonline.org”

Contoh Hasil Analisa 80mers alignments

Tidak berpotensi Alergen

• Uji stabilitas panas dan stabilitas cerna merupakan kriteria lanjutan untukmenentukan suatu protein baru berpotensi alergi atau tidak

• Beberapa penelitian menunjukkan bahwa makanan yang bersifat alergen,menunjukkan kondisi yang stabil selama proses pemasakan dan stabil terhadapenzim pencernaan (trypsin dan pepsin)

• Makanan yang bersifat alergen sebagian besar struktur 3D dari konformasiepitopenya tidak berubah/resisten terhadap kondisi panas.

• Pengujian stabilitas cerna protein baru diuji secara in vitro melalui simulasipencernaan pada lambung menggunakan enzim pepsin (simulated gastric fluid-SGF)dan simulasi pencernaan pada usus halus menggunakan enzim tripsin (simulatedintestinal fluid-SIF).

Pengujian allergenitas: Stabilitas suhu dan cerna secara in vitro

Stabilitas suhu dan cerna in vitro – studi kasus pada tebu PRG

(Neliana et al, 2019 [Agronomy])

Pengujian allergenitas: In vivo respon alergi

• Pengujian in vivo respon alergi protein baru menggunakan hewan cobayang sensitif terhadap respon alergi

• Pengujian ini dilakukan dengan memberi ransum (sonde / oral gavage)protein target.

• Respon alergi dapat diketahui dari kandungan IgE pada hewan cobamelalui analisis enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Day 7 Day 14

(Neliana et al, 2019 [Agronomy])

Rancangan

pengujian

toksisitas

Day 1-14, Kematian Hewan CobaBerat badan Hewan Coba

Day 14Index Organ

Variasi Dosis• 6.25 gr/kg BB• 12.5 gr/kg BB• 25 gr/kg BB• 50 gr/kg BB• Kontrol (CMC/Na)Tebu SPS1

5 Kelompok treatment (n= 5 male/5 female)

(Neliana et al, 2019 [Agronomy])

5

Pemohon

KKH

TTKH

BKKH

PUBLIK

15 hr

14 hr

Kep Badan POM/ Mentan/MenhutMen

KP

Kep Badan POM/ Mentan/MenhutMen

KP

9

3

14 hr

1

2

8

8

14 hr

60 hr

7 hr6

56 hr

7 hr

4

7

Lab

KEAMANAN PAKAN PRODUK REKAYASA GENETIK

• Keamanan pakan produk rekayasa genetik adalah kondisi dan upaya yangdiperlukan untuk mencegah kemungkinan timbulnya dampak yang merugikan danmembahayakan kesehatan hewan dan ikan, akibat proses produksi, penyiapan,penyimpanan, peredaran dan pemanfaatan pakan produk rekayasa genetik (PP 21Tahun 2005)

• Pakan adalah bahan baku, bahan tambahan, dan bahan imbuhan ataucampurannya baik diolah maupun tidak diolah yang digunakan sebagai pakanhewan dan/atau pakan ikan.

• Untuk dinyatakan aman suatu PRG dibutuhkan hasil analisis berupa informasikandungan gizi/ kesepadanan substansial, dan toksisitas tanaman PRG terhadaphewan coba.

1. Informasi Genetik (Alasan perlunya modifikasi, deskripsi host, deskripsi gen

target, metode transformasi, stabilitas genetik dan level ekspresi)

2. Pengujian kesepadanan substansi (proksimat, asam amino, asam lemak,

vitamin, mineral, dll)

3. Toksisitas (Pengujian simulasi cerna, pengujian hewan model, dan analisa

bioinformatika)

Data yang dibutuhkan untuk pengujian keamanan pakan

Pengujian Keamanan Pangan Vs Pakan PRG

Pengujian Kesepadanan Substansi

Pengujian Allergenitas

Pengujian Toksisitas

Aman Pangan atau tidak

Pengujian Kesepadanan Substansi

Pengujian Toksisitas

Aman Pakan atau tidak

Pengujian Keamanan Pakan (Feed Safety)

Pengujian keamanan pakan PRG lebih sederhana dibandingkan pengujiankeamanan pangan.

Jenis Pengujian Keamanan Pangan Keamanan Pakan

Kesepadanan SubstansiWhole food pangan (Misal

Nira)Whole food pakan

(Misal Daun)

Pengujian AllergenitasBioinformatika - In vivo

Stability -

Pengujian ToksisitasWhole food pangan (Misal

Nira)Whole food pakan

(Misal Daun)

Perbedaan pengujian keamanan pangan dan pakan

Pengujian stabilitas cerna menggunakan cairan rumen

Sampel daundipotong kecil

Perlakukandengan cairan

rumen

Perlakukanpellet dengan

pepsin-HCl

SentrifuseAnalisis

kecernaannya

Analisis presentasibahan kering dan

bahan organik

Hasil stabilitas cerna menggunakan cairan rumen

Komponen WT SPS 4 SUT 5 D 12

DMD (%) 96,43 ± 0,13 96,39 ± 0,15 96,65 ± 0,05 96,36 ± 0,06

OMD (%) 92,59 ± 0,66 92,44 ± 0,69 92,99 ± 0,03 92,59 ± 1,36

Hasil analisamenunjukkan tidak adaperbedaan kecernaanyang signifikan antaratebu PRG dan wildtype.

DMD : Presentase Bahan KeringOMD : Presentase Bahan Organik

TERIMA KASIH MATUR SAKALANGKUNG