sequencing DNA

download sequencing DNA

of 29

  • date post

    10-Nov-2015
  • Category

    Documents

  • view

    36
  • download

    7

Embed Size (px)

description

dari ppt orang lain

Transcript of sequencing DNA

  • Sekuen DNA membawa informasi DNAmRNAProteinTranscriptionTranslation

  • C (cytosine) komplementer dengan G (guanine)CTCAATTGAGCGBasesA (adenine) komplementer dengan T (thymine)2-deoxyribose (sugar)Ujung 5 Ujung 3

  • Sequencing merupakan metode menentukan urutan basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, timin pada sepotong DNA.

    Urutan nukleotida menentukan urutan asam amino, yang akhirnya menentukan struktur protein dan fungsinya.

    Perubahan sekuens DNA dapat mengakibatkan perubahan protein atau menyebabkan terbentuknya protein non fungsionalAkibatnya dapat menimbulkan efek merugikan pada organisme

  • Maxam & Gilbert, menggunakan chemical sequencingSanger, menggunakan dideoxynucleotides.

    Sequencing yang modern menggunakan prinsip teknik Sanger.Terdapat dua teknik sequencing:Metode Sanger menggunakan dideoxynucleotide triphosphates(ddNTPs) yang memiliki sebuah H pada karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH pada deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).

    Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam reaksi sintesis jika dideoxynucleotide ditambahkan dan bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan berhenti karena 3OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida berikutnya tidak ada.

  • Metode Sanger dideoxy ditemukan oleh Frederick Sanger memenangkan Nobel 1980A lot of modern DNAsequencing is basedupon the followingmodified nucleotides.DNA Sequencing

  • Karena tidak ada OH, replikasi berhenti

  • DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNAPrimer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasiDNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari templateSejumlah nukeotida normalSejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)

  • Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan).Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhentiHasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi , masing-masing berhenti pada DDnukleotida tertentu yang dilabel.Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.

  • DNA SequencingMetode original dengan menggunakan radiolabeled DNA.

    Sejumlah kecil dideoxy nucleotides ditambahkan ke reaksi polymerase DNA.

  • DNA Sequencing

    1.Terdapat lebih dari satu utas DNA dalam reaksi.

    2. Tidak semua nukeotida adalah dideoxy.

  • DNA Sequencing

    1.Terdapat lebih dari satu utas DNA dalam reaksi.

    2. Tidak semua nukeotida adalah dideoxy.

    Sehingga multiple terminated products dihasilkan (tanda panah merah)

  • DNA SequencingDigunakan fluorescently labeled dideoxy nucleotides (yang dapat digabungkan dalam satu tabung) dan dipisahkan dengan capillary electrophoresis dan dibaca dengan laser saat DNAs melewati jendela detektor.

    Komputer akan menghasilkan kromatogram seperti yang terlihat dibawah ini.

  • Automated DNA sequencing pada automated DNA sequencing, deoxynucleotide radioaktif tidak digunakan dan ke-4 reaksi dideoxy dikerjakan dalam satu tabung tunggal. Ini karena tiap ddNTPs dilabel dengan pewarna flourescent yang berbeda. Sehingga warna yang ada pada tiap fragmen yang disintesa korespon dengan warna yang berikatan pada dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk menghentikan sintesis fragmen.Isi dari satu tabung reaksi dimasukkan ke satu jalur pada gel dan dielektroforesis.

  • Sebuah flourimeter dan komputer dihubungkan ke gel dan mendeteksi dan mencatat warna yang berikatan dengan fragmen saat mereka melewati gel.Urutan/sekuens ditentukan berdasarkan urutan warna yang keluar dari gel.

  • Capillary tubesSample tray goes hereReagents

  • DNA sequence alignment memasangkan dua DNA sequences untuk memaksimalkan kesamaannya

    1. AACG dan AACG

    2. AAGG dan AACG

    3. AACGGTATGC dan ATCGGGTTGC

  • Best alignment memasangkan dua sekuens dengan sesedikit mungkin jumlah mismatches dan gaps

    Score: tiap pasangan yang sama posisinya: +2; tiap mismatch/ gap: -1score = 8score = 5score = 16

  • BLAST: http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/