SOUTHERN BLOTTING

Southern Blotting merupakan teknik yang digunakan untuk mendeteksi DNA. Aplikasi

dari Southern Blotting yaitu dapat mengetahui ukuran fragmen DNA target. Teknik tersebut

dilakukan dengan cara memisahkan molekul DNA menggunakan teknik elektroforesis

kemudian molekul DNA tersebut ditransfer ke membran nitroselulosa dan dihibridisasi

dengan probe DNA yang telah dilabel dengan unsur radioaktif (Martin 1996: 65).

Tahap-tahap kerja dalam Southern Blotting yaitu

1. elektroforesis fragmen DNA dengan gel agarosa.

2. denaturasi molekul DNA untai ganda menjadi molekul DNA untai tunggal.

3. transfer molekul DNA ke membran nitroselulosa.

4. hibridisasi probe radioaktif pada fragmen DNA.

5. membran dibersihkan.

6. deteksi band DNA dengan menggunakan autoradiography

Alat yang digunakan pada praktikum Southern Blotting adalah membran nitroselulosa

berukuran 20 x 20 cm atau 20 x 14 cm, kertas Whatman 3 MM, tissue, kertas basah, wadah,

dan pemberat. Bahan yang digunakan pada praktikum Southern Blotting untuk campuran

larutan A adalah 300 mL 5 M NaCl, 50 mL 10 M NaOH, dan 650 mL air, untuk campuran

larutan B adalah 200 mL 10 M amonium asetat, 4 mL 10 M NaOH, dan 1796 mL air (Davis

dkk.1994: 184).

Cara kerja pada praktikum Southern Blotting yaitu pertama gel agarosa dicelupkan ke dalam

larutan A pada suhu kamar selama 30 sampai dengan 45 menit. Larutan A dipindahkan dan

diganti dengan larutan B. Gel diinkubasi selama 30 sampai dengan 45 menit. Kedua, 500 mL

larutan B ditambahkan ke dalam wadah dan kertas basah diletakkan di atas pelat kaca pada

wadah. Ketiga, gel diletakkan di atas pelat kaca. Keempat, membran nitroselulosa

diletakkan di atas gel. Kelima, dua lembar kertas Whatman 3 MM diletakkan di atas

membran nitroselulosa. Keenam, tumpukan tissue diletakkan di atas kertas Whatman 3

MM. Ketujuh, pemberat diletakkan di atas tumpukan kertas tissue dan biarkan selama

semalam hingga semua molekul DNA dari gel berpindah ke membran nitroselulosa.

Kedelapan, setelah molekul DNA berpindah ke membran nitroselulosa, semua lapisan yang

ada di atas membran nitroselulosa dipindahkan dan membran nitroselulosa dihibridisasi

dengan larutan yang mengandung probe radioaktif. Kesembilan, membran nitroselulosa

yang telah dihibridisasi kemudian dibersihkan (washing). Kesepuluh, membran nitroselulosa

divisualisasi dengan autoradiography (Davis dkk.1994: 184-185).

Pembahsan

Inkubasi gel agarosa pada larutan A bertujuan untuk mendenaturasi untai ganda molekul

DNA menjadi untai tunggal sehingga dapat ditempeli dengan probe. Gel diinkubasi pada

larutan B bertujuan untuk mengembalikan pH ke pH netral. Kertas basah, kertas Whatman

3MM, dan kertas tissue berfungsi sebagai sumbu kapilaritas tempat molekul DNA berpindah

(Davis dkk.1994: 185). Proses washing pada membran nitroselulosa bertujuan untuk

menghilangkan probe radioaktif yang tidak berikatan. Autoradiography berfungsi untuk

melihat fragmen DNA yang telah ditempeli dengan probe radioaktif (Russell 1994: 301).

Kesimpulan

Southern Blotting adalah teknik yang digunakan untuk mendeteksi DNA spesifik

dengan menggunakan probe. Probe adalah DNA untai tunggal yang merupakan komplemen

dari DNA target yang sudah dilabel unsur radioaktif. Prinsip kerja Southern Blotting adalah

transfer molekul DNA ke membran nitroselulosa setelah dipisahkan dengan elektroforesis.

Aplikasi dari Southern Blotting antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dan

analisis DNA forensik yaitu DNA fingerprinting dan paternity test.

PCR

Prinsip

PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampu mengamplifikasi

segmen tertentu dari keseluruhan genom bakteri. Proses amplifikasi PCR melibatkan variasi

suhu yang mendekati suhu didih air, jadi diperlukan enzim polimerase yang tetap stabil

dalam temperatur yang tinggi. Pada proses PCR, enzim polimerase yang digunakan berasal

dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari 90 oC.

tiga tahap

1. Denaturasi, Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94 oC yang

mnyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal.

Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan

dibuat.

2. Penempelan (Annealing), Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu

untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai

panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target

yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer Dapat

menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 55 0C

selama 30-60 detik.

3. Pemanjangan (Ektension), Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim

DNA polymerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari

gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida.

komponen reaksi PCR,

a. DNA cetakan / DNA target, Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya

terkandung fragmen DNA target.

b. Primer, Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb =

pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target

Kriteria :Panjang primer : 15-30 pb, Kandungan GC sekitar 50%, Temperatur

penempelan kedua primer tidak jauh berbeda, Urutan nukleotida yang sama harus

dihindari, Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin

c. DNA Polimerase, Merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya

digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap

stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik

didih air.

d. Buffer / Dap , Buffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang

mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polymerase

e. dNTPS, dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida

bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan

basa dengan nukleotida dari DNA target (Innis M. and Gelfand D. in White

ELEKTROFORESIS

Prinsip elektroforesis agarose adalah teknik pemisahan asam nukleat/ protein

berdasarkan perbedaan medan listrik, molekul dan partikel bermuatan akan

bergerak ke arah elektrode yang memiliki muatan berlawanan di bawah pengaruh

medan listrik.

Prinsip elektroforesis SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel

Reaction) teknik pemisahan protein darah dengan migrasi komponen acrilamida

berdasarkan perbedaan berat molekul.

Elektroforesis Agarosa gel

Prinsip teknik elektroforesis adalah berdasarkan migrasi partikel bermuatan dibawah

pengaruh medan elektronik dalam kondisi yang konstan. Elektroforesis DNA memisahkan

sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel

yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk

memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa

(bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui

matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah

laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan

membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar

(DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di

bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya

ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel

direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet

(media UV-transilluminator).

Alat dan Bahan

1. Elektroforesis

2. Sisir pembentuk sumur pada gel

3. Pemasok daya

4. Transimuloator dan sinar ultraviolet

1. Bubuk gel agarose

2. Larutan etidium bromide 10 mg/mL

3. Larutan elektroforesis TAE

4. Larutan zat pewarna/loading buffer

IV. Cara Kerja

Pengenceran larutan TAE dari 10% menjadi 1% dengan rumus m1v1 = m2v2, volume TAE 1%

yang akan dibuat adalah 250 mL. Ukur larutan tae sebanyak 25 mL kemudian tambahkan

akuades hingga volumnya menjadi 250 mL, sehingga diperoleh larutan TAE 1%. Untuk

membuat agarose campurkan TAE 1% sebanyak 40 mL dengan agar 0,4 gram. Aduk sampai

merata dan panaskan pada microwave. Setelah itu tuangkan larutan agarose tersebut

kedalam cetakan yang sudah disiapkan dengan lengkap dengan sisir pembuat sumur pada

agarose. Diamkan beberapa saat sampai agarose dingin dan mengeras. Sisa TAE 1% akan

digunakan dalam proses elektroforesis.

Setelah agarose mengeras, dilepaskan dari cerakan dan sisir pembentuk sumurnya juga

dilepaskan. Kemudian agarose diletakkan ke dalam elektroforesis, setelah itu bagian kanan

dan kiri di isi dengan larutan TAE 1% sampai menggenangi agarose yang berperan sebagai

cairan elektrolit. Ambil sampel DNA sebanyak 1L, kemudian campurkan dengan larutan zat

pewarna/loading buffer 1L.

Cara lain :

1. Pencetakan gel agarosa

2. Upload DNA/RNA

3. Running elektroforesis

4. Pewarnaan (staining) dengan Ethidium bromida

5. Penampakan DNA dengan UV illuminator

Elektroforesi Gel poliakrilamid

Setelah dicampur merata antara sampel DNA dan loading buffer masukkan ke dalam sumur

pada agarose dengan menggunakan mikropipet tanpa merobek agarose. Apabila semua

sampel DNA sudah dimasukkan kedalam sumur agarose, elektroforesis dihubungkan dengan

sumberdaya dan dinyalakan pada tegangan 90 volt selama 30 menit. Langkah selanjutnya

adalah ambil agarose dari elektroforesis, analisis dengan di atas transimulator sinar

ultraviolet. Sampel yang terdapat DNA genomnya akan terlihat berpendar.

Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh

ammonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga monomer

terpolimerisasi menjadi rantai panjang. Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan

antar dua lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel

poliakrilamid berukuran dari 5 cm sampai 50 cm panjangnya tergantung pada keperluannya

dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertikal.

Tahapan prosedur elektroforesis gel poliakrilamid

1. Pembuatan poliakrilamid (buffer + akrilamid + bisakrilamid + Ammonium persulfat +

TEMED)

2. Pencetakan gel

3. Running elektroforesis

4. Pewarnaan (staining dengan Coomassie Blue atau perak (silver staining), atau

kombinasi keduanya

5. Penampakan protein band, Coomassie Blue berwarna biru, dan silver staining

berwarna coklat-hitam

Elektroforesis Gel Poliakrilamid-SDS ( SDS-PAGE)

Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dengan elektroforesis gel

poliakrilamid dengan system gerak. Sebelumnya, campuran protein dipanasi dengan

natrium dedosil suldat (SDS), suatu detergen anionik utnuk menyelubungi molekul protein.

Penyelubungan ini menyebabkan interaksi nonkovalen terganggu sehingga molekul protein

dalam struktur primer. Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul

SDS untuk dua residu asam amino. . (David G. Watson, 2007)

Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida.

Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang

sebanding dengan ukuran protein. Muatan negatif yuang terdapat pada ikatan SDS ini jauh

lebih besar daripada muatan pada protein asli. Kompleks protein SDS kemudian

dielektroforesis, sehingga semua molekul protein bergerak menuju kutub positif. Ketika

elektroforesis selesai, protein dalam gel dapat ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak

atau zat warna seperti Coonassie biru, yang akan menampakkan beberapa pita.

SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Dodesil Sulfat adalah teknik

elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang

bermuatan berdasarkan berat molekulnya saja.[1] Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan

deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik yang memberikan muatan negatif

pada keseluruhan struktur protein.[1] Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat

interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen.[1] Metode SDS-PAGE digunakan untuk

memisahkan protein demi keperluan biokimia, genetika forensik, dan biologi molekuler.[2]

Metode ini diawali dengan preparasi sampel untuk membuat sampel bermuatan sama

sehingga muatan tidak memengaruhi pergerakan komponen sampel dalam gel.[1] Preparasi

dilakukan dengan cara mendenaturasi protein menggunakan SDS dan memutus ikatan

disulfida pada struktur protein menggunakan beta-merkaptoetanol, bila perlu denaturasi

didukung dengan memanaskan sampel.[1] Selanjutnya gel poliakrilamida dibuat

menggunakan cetakan gel membentuk lembaran segiempat dengan ketebalan tertentu.[1]

Setelah sampel dimasukkan dalam sumur gel, gel dialiri arus listrik sehingga komponen yang

terdapat dalam sampel akan terpisah melewati matriks gel berdasarkan berat

molekulnya.[1]

Untuk melihat pita komponen yang terbentuk, gel perlu diwarnai dengan pewarna khusus.

Beberapa pewarna yang dapat digunakan dalam SDS-PAGE adalah Commasie Brilliat Blue

dan Silver Salt Staining.[2] Commasie Brilliant Blue mengikat protein secara spesifik dengan

ikatan kovalen. Silver Salt Staining memiliki sifat lebih sensitif dan akurat namun

membutuhkan proses yang lebih lama.[2]

FISH (fluorescence in situ hibridisasi

FISH (fluorescence in situ hibridisasi) adalah sebuah cytogenetic teknik yang digunakan

untuk mendeteksi dan melokalisasi keberadaan atau ketiadaan spesifik DNA sekuens pada

kromosom.

Teknik in situ hybridization telah mengalami berbagai macam modifikasi. Salah satunya

adalah dengan dipergunakannya molekul berpendar dalam teknik tersebut (Devi, et al.

2005). Lokasi yang diberi molekul tersebut, nantinya akan berpendar dan akhirnya

pendarannya dapat dilihat dengan menggunakan fluorescent microscop. Hal inilah yang

membuat lokasi fisik gen pada kromosom dapat dengan tepat ditentukan. Teknik ini biasa

disebut sebagai Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). Kelebihan teknik ini dibandingan

dengan teknik ISH adalah dapat lebih cepat dalam mendekteksi lokasi gen atau DNA,

memiliki resolusi yang tinggi, dan sentitif.

Teknik FISH biasa digunakan untuk membedakan kromosom nonhomolog di dalam genom

(Kato, et al. 2005). Prosedur ini penting untuk mendeteksi adanya kerusakan pada

kromosom, untuk menentukan kasus aneuploid, untuk mempelajri perilaku kromosom,

dan untuk menentukan lokasi fisik sekuen DNA berluang pada genom, lokus, atau gen

introgesi. FISH dapat dipakai untuk mendeteksi sekuen nucleid acid dengan label probe

berpendar yang disatukan secara spesifik untuk melengkapi sekuen target dalam sel utuh.

Terdapat 2 metode pewarnaan dalam FISH, yaitu metode langsung dan metode tidak

langsung (Devi, et al. 2005). Metode langsung dengan menggunakan fluorochrome-labelled

nucleotide sebagai penanda probe, sedeangkan metode tidak langsung menggunakan

biotin, digoxigenin, dan dinitrophenol (DNP) sebagai reporter molekul yang nanti akan

terdeteksi oleh fluocrhome-conjugated avidin atau antibodi. Metode langsung tidak

menggunakan immunochemical sehingga dapat dapat lebih cepat dan menghasilkan

resolusi yang baik

Berikut adalah tahapan tahapan dalam menggunakan FISH (Moter and Gobel, 2000):

1. Probe dan labeling

Probes untuk FISH harus spesifik, sensitif, dan mudah untuk maruk ke dalam

jaringan. Terdapat tiga tipe probe, yaitu oligonucleotide, double-stranded DNA, dan

single stranded DNA (Mcfadden, 1995). Tipe probe oligonucleotide berukuran

antara 15 dan 30 bp. Probe yang pendek dapat lebih mudah mengkses target, tetapi

ia hanya dapat membawa sedikit label. Terdapat cara yang berbeda dalam

melakukan labeling. Cara langsung atau cara tidak langsung. Cara langsung lebih

umum digunakan karena lebih cepat, murah, dan mudah.

2. Fluorescent dyes

Pewarna yang umum digunakan untuk FISH dalam microbiology adalah turunan dari

fluorescein (fluorescein-isothiocyanate, 5-(-6)carboxyfluorescein-N-

hydroxyuccimide-ester) dan turuna dari rodamine (Tetramethyl-rhodamine-

isothiocyanate, texas red) dan baru baru ini menggunakan pewarna cyanine seperti

Cy3 dan Cy5. Pendaran berwarna biru dapat dihasilkan oleh diamidines aromatic

seperti 4,6-diamidino-2-phenylidole dihyrochloride (DAPI).

3. Ribosomal RNA (rRNA) sebagar target untuk FISH

Molekul rRNA yang umum digunakan dalam bidang mikrobiologi adalah 16S rRNA.

Molekul lainnya yang umum digunakan adalah seperti 5S dan 18S-5,8S-26S rRNA

4. Fixation

Fiksasi dapat dibantu dengan menggunakan agen pengndap seperti etanol dan

metanol, agen cross-linking seperti aldehid, atau kombinasi antara keduanya. Fiksasi

yang baik sangat menentukan hasil dari FISH. Fiksasi yang baik harus bisa

mendapatkan penetrasi probe yang baik, semaksimal mungkin dalam menyimpan

RNA target, dan menjaga keutuhan sel dan morfologinya. Umumnya, larutan 3 -4 %

(v/v) formaldehid atau paraformaldehid baik untuk makteri geram-negatif,

sedangkan untuk organisme geram positif dapat digunakan etanol (50%),

etanol:formalin (9:1) atau perlakuan pemanasan.

5. Spesimen preparation dan pretreatment

Spesimen yang lebih baik dapat diperoleh dengan memberikan agen pelapis pada

permukaannya. Bahan kimia yang dapat digunakan diantaranya adalah gelatin. Pra

perlakuan yang dapat dilakukan diantaranya adalah dengan perlakuan enzimatik

dengan isozyme dan lysostaphin. Prosedur pra perlakuan dapat meningkatkan

kemampuan probe untuk mengakses target dan mengurangi banding yang tidak

spesifik.

6. Hybridization

Hibridisasi harus dilakukan dalam kondisi yang tepat. Hibridisasi merupakan step

yang penting dalam prosedur FISH. Hibridisasi dilakukan di chamber yang gelap dan

lembab. Temperatur yang digunakan antara 37C 50C. Waktu yang digunakan

bervariasi antara 30 menit sampai beberapa jam. Kemudian, dibilas denganair

destilasi. Untuk mengurangi jumlah racun dapat digunakan beberapa konsentrasi

garam atau bahkan formamide. Terakhir, slide dibilas kembali dengan air dingin,

kemudian keringkan, pasang, dan dokumentasi. Berbagai tahapan tahapan

tersebut dapat dilihat pada gambar 2 dan 3

Proses hibridisasi dilakukan dengan meneteskan probe pada slide yang telah

didenaturasi kemudian ditutup dengan coverslip serta bagian pinggir diolesi lem

kuning untuk mencegah udara masuk (penguapan). Slide diletakkan dalam lunch

box berwarna gelap dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 16 jam. Setelah proses

hibridisasi, coverslip dibuka dan slide direndam dalam waterbath suhu 45C selama

30 menit. Selanjutnya direndam berturut-turut dalam kopling jar berisi stringency

wash solution dua kali, larutan 1x SSC dua kali dan akhirnya larutan detergen selama

4 menit. Setelah dikeringkan, slide ditetesi dengan DAPI dan pengamatan translokasi

dilakukan di bawah mikroskop epi-fluorescence. Prosedur teknik FISH dapat

berbeda-beda tergantung dari produsen probe kromosom yang digunakan.

Western Blot

Western Blot adalah proses transfer dan imunodeteksi protein pada gel yang bertujuan

untuk :

1. mengetahui keberadaan & berat Molekul protein sampel pada campuran

2. Membandingkan reaksi silang antar protein

3. Mempelajari modifikasi protein selama sintesis

Metode Western Blotting diawali dibagi menjadi 6 tahapan yaitu :

1. preparasi sample

2. Separasi protein pada gel elektroforesis

3. transfer protein pada Membran NC atau PVDF

4. Blocking nonspesific - binding sites pada membran

5. penambahan antibodi primer, antibodi sekunder

5. deteksi atau visualisasi pengikatan antigen antibody

Transfer protein dari gel ke membran dapat dikerjakan dengan 3 cara yaitu :

1. simple diffusion

2. Vaccum - assisted solvent flow

3. electrophoretic elution, bisa dikerjakan dengan 2 cara yaitu dengan wet transfer dan semi dry

transfer

Prosedur Western Bloting ( Semi - Dry Sistem )

1. SDS - PAGE 10 -20 mA

2. Preparasi sample, terdiri atas

a. Gel ( dicuci dengan aquadest), soak ke dalam blot buffer

b. PVDF membran soak di blot buffer

c. kertas filter soak di blot buffer

3. sandwich of blot transfer, urutanya adalah :

a. kertas Filter ( 6 lembar )

b. Gel

c. Membran PVDF

d. Kertas saring ( 9 lembar )

4. Blocking dengan 5% non fat milk dalam PBST selama 1 jam

5. Cuci dalam PBST 5 menit 2-3x

6. Tambahkan Antibodi primer ( diluted dengan PBST yang berisi 5 % non fat milk) selama 1 jam s/d

semalaman pada suhu 4"c

7. cuci dengan TBS 5 menit 3 - 4 x

8. antibodi sekunder dikonjugat dengan alkaline phospat selama 1 jam di suhu ruang

9. cuci dengan PBST 5 menit, 4x

10. western blue substrat solution 1 1,5 ml semalaman pada suhu ruang

11. cuci dengan aquadest

HIBRIDISASI SOUTHERN

Hibridisasi Southern adalah proses perpasangan antara DNA yang menjadi sasaran dan DNA

pelacak. Hibridisasi southern biasa digunakan untuk melacak adanya DNA yang sesuai

dengan pelacak, misalnya untuk mengetahui integrasi transgen di dalam organisme

transgenik. Berdasarkan prinsipnya, hibridisasi southern dapat dibagi ke dalam 4 tahap,

yaitu :

(1) fiksasi DNA di membran (nitroselulosa atau nilon);

(2) pelabelan pelacak;

(3) prehibridisasi dan hibridisasi; dan

(4) deteksi hasil hibridisasi.

Fiksasi DNA di membran dapat dilakukan melalui beberapa cara, yaitu

(1) penetesan DNA (dot blot) langsung di membran;

(2) fiksasi DNA bakteri replika (plasmid rekombinan) di membran;

(3) fiksasi DNA fage rekombinan dari satu replika plak di membran; dan

(4) transfer DNA dari gel agarose (yang sebelumnya telah dimigrasikan dengan

elektroforesis) ke membran.

ALAT DAN BAHAN

Alat

PCR, Elektroforesis, Gel Dock, Shaker, UV transiluminator, vacuum dan mesin hibridisasi

Bahan

Fage rekombinan, Film, Probe

Pelabelan Probe

20 ul cross linker solution diencerkan dengan ditambahkan 80 ul air. DNA (atau RNA)

diencerkan untuk label sampai konsentrasi 10 ng/ul dengan air yang berbeda. Diambil 10 ul

sampel DNA (yang telah diencerkan) dan masukkan ke eppendorf, kemudian didenaturasi

dalam water bath 100C selama 5 menit. Eppendorf didinginkan di es selama 5 menit,lalu

spin down. 10 ul buffer reaksi ditambahkan ke dalam ependorf, lalu di mix. Kemudian

ditambahkan 2 ul labeling reagen, lalu di mix. Ditambahkan 10 ul cross linker solution, lalu di

mix, kemudian di spin down.kemudian dilakukan diiInkubasi 37C selama 30

menit. Probe dapat digunakan langsung atau dapat disimpan di es paling lama 2 jam (untuk

penyimpanan yang lebih lama, probe yang sudah di label dapat disimpan dalam larutan 50%

(v/v) pada 15C s.d. 30C sampai 6 bulan.

Prehibridisasi

Larutan buffer prehibridisasi dibuat dengan melarutkan NaCl 0,5 M dan 5 % (b/v) blocking

reagent ke dalam larutan hibridisasi dan dikocok dengan magnetic stearer selama 1 jam

pada suhu ruang. Membran dimasukkan ke dalam tabung hibridisasi dengan posisi yang

mengandung DNA pada bagian dalam gulungan dan ditambahkan SSC 3x sebanyak 5 ml

tanpa menyebabkan terbentuknya gelembung udara antara dinding tabung dengan

membran. Larutan SSC 3x dibuang dan ditambahkan 15 20 ml larutan buffer prehibridisasi

ke dalam tabung. Lakukan prehibridisasi selama 1 jam pada suhu 42C.

Hibridisasi

Larutan buffer prehibridisasi di dalam tabung ditambahkan dengan DNA pelacak yang sudah

dilabel dengan menggunakan pipet mikro. Tabung eppendorf tempat DNA pelacak yang

sudah dilabel dibilas dengan larutan prehibridisasi supaya seluruh pelacak dapat masuk ke

dalam larutan. Hibridisasi dilakukan pada suhu 42C.

Washing

Larutan pembilas pertama dipanaskan pada suhu 42C di dalam oven hibridisasi, dilakukan 2

kali. Membran diambil dari dalam tabung dan dimasukkan dalam wadah yang berisi larutan

pembilas kedua menggunakan pinset berujung tumpul. Wadah diletakkan di atas shaker dan

digoyang selama 5 menit pada suhu ruang, dilakukan 2 kali. Larutan pembilas kedua dalam

wadah di ganti dengan yang baru dan diinkubasikan kembali selama 5 menit pada suhu

ruang.

Deteksi Sinyal

Larutan deteksi sinyal dibuat dengan mencampurkan detection reagent 1 dan detection

reagent 2 (1:1) sebanyak 0,125 ml/cm2. Wrapping plastik disiapkan diatas permukaan kaca

yang rata dan diteteskan dengan larutan deteksi. Kelebihan larutan pembilas kedua dibuang

dan permukaan membran yang mengandung DNA disentuh (direndam) ke atas tetesan

cairan pendeteksi, selanjutnya di inkubasi selama 1 menit. Kelebihan larutan deteksi

dibuang dan membran di bungkus dengan wrapping plastik.

Membran diletakkan dalam kaset dengan permukaan yang mengandung DNA menghadap

atas. Dalam ruang gelap dengan menggunakan lampu bercahaya merah (red safe light) film

autoradiografi ECL seukuran membran diletakkan di atas membran dan dipress di dalam

Film Cassette, dilakukan dalam keadaan gelap pada suhu kamar selama 4 jam. Film diangkat

dari Film Cassette dan dicuci dengan larutan developer dalam keadaan gelap pada suhu

kamar selama 5 menit. Film dicuci dengan larutan fixer dalam keadaan gelap pada suhu

kamar selama 5 menit. Film dibilas dengan air pada suhu kamar selama 5 menit. Film

dikeringanginkan pada suhu kamar. Sinyal yang terdapat pada film diobservasi.

Hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida yang

saling komplementer melalui perpasangan basa N. Hibridisasi dapat menunjukkan suatu

keseragaman sekuens. Pasangan DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA dapat dibentuk dengan

proses ini. Sedangkan sequencing by hybridization merupakan suatu metode sekuensing

yang memanfaatkan lintasan Euler dan graf de Bruijn. Sequencing by hybridization adalah

masalah dasar dalam suatu proses rekonstruksi DNA. Tujuan sequencing by hybridization

adalah menentukan sekuens suatu nukleotida dari fragmen DNA yang tidak diketahui yang

masukan datanya merupakan hasil eksperimen hibridisasi secara biokimia, yang disebut

spektrum. Spektrum ini merupakan substring dari huruf-huruf yang melambangkan basa

nukleotida.

Setelah ditentukan spektrum-spektrum yang panjangnya konstan tersebut, maka bisa dibuat

graf de Bruijn yang tiap simpulnya merupakan representasi dari spektrum. Setelah graf de

Bruijn berhasil dibuat, lalu tentukan lintasan Eulernya.

LABEL FLUERECENT

Digunakan fluorescently labeled dideoxy nucleotides (yang dapat digabungkan dalam satu

tabung) dan dipisahkan dengan capillary electrophoresis dan dibaca dengan laser saat DNAs

melewati jendela detektor.

Komputer akan menghasilkan kromatogram

Automated DNA sequencing pada automated DNA sequencing, deoxynucleotide

radioaktif tidak digunakan dan ke-4 reaksi dideoxy dikerjakan dalam satu tabung tunggal.

Ini karena tiap ddNTPs dilabel dengan pewarna flourescent yang berbeda.

Sehingga warna yang ada pada tiap fragmen yang disintesa korespon dengan warna yang

berikatan pada dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk menghentikan sintesis fragmen.

Isi dari satu tabung reaksi dimasukkan ke satu jalur pada gel dan dielektroforesis.

Sebuah flourimeter dan komputer dihubungkan ke gel dan mendeteksi dan mencatat warna

yang berikatan dengan fragmen saat mereka melewati gel.

Urutan/sekuens ditentukan berdasarkan urutan warna yang keluar dari gel.

Antibodi Monoklonal

Hibridoma

Teknik Hibridoma adalah penggabungan dua sel dari organisme yang sama maupun berbeda

sehingga menghasilkan sel tunggal berupa sel hibrid ( hibridoma ) yang memiliki kombinasi

dari sifat kedua sel tersebut. Teknik hibridoma ini sangat penting untuk menghasilkan

antibodi dan hormon dalam jumlah yang besar.

Antibodi Monoklonal

Salah satu hasil dari teknik hibridoma ini adalah antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal

adalah antibodi yang diperoleh dari suatu sumber tunggal atau sel klona yang hanya

mengenal satu jenis antigen. Pembentukan antibodi monoklonal dilakukan dengan

menggunakan kelinci atau tikus.

Teknik pembuatan antibodi moniklonal untuk pengobatan kanker

langkah pertama adalah menginjeksikan antigen ke dalam tubuh tikus/ kelinci percobaan,

kemudian limpanya dipisahkan. Sel-sel pembentuk antibodi pada limpa dilebur ( fusi )

dengan sel-sel mieloma ( sel kanker ). Sekitar 1% dari sel limpa adalah sel plasma yang

menghasilkan antibodi, sedangkan 10% sel hibridoma akhir terdiri dari sel-sel yang

menghasilkan antibodi. Setiap hibridoma hanya dapat menghasilkan satu antibodi.

Disini teknik seleksi dikembangkan untuk mendidentifikasi sel tersebut, kemudian dilakukan

pengembangan atau pengklonan berikutnya. Klona yang diperoleh dari hibridoma berupa

antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal dapat disimpan beku, kemudian dapat

diinjeksikan ke dalam tubuh hewan atau dibiakkan dalam suatu kultur untuk menghasilkan

antibodi dalam jumlah yang besar.

Kegunaan antibodi monoklonal cukup beragam. Para ilmuwan berharap dapat

menggunakan antibodi monoklonal dalam pengobatan kanker. Beberapa jenis sel kanker

membuat antigen yang berbeda dengan protein yang dibuat oleh sel-sel sehat. Dengan

teknologi yang ada, dapat dibuat antibodi monoklonal yang hanya menyerang protein dan

menyerang sel-sel tanpa mempengaruhi sel-sel yang sehat.

Kegunaan antibodi monoklonal lainnya adalah sebagai berikut

1. untuk mendeteksi kandungan hormon korionik gonadotropin ( HCG ) dalam urin

wanita hamil.

2. untuk mengikat racun dan menonaktifkannya, contohnya racun tetanus dan

kelebihan obat digoxin dapat dinonaktifkan oleh antibodi ini.

3. mencegah penolakan jaringan terhadap sel hasil transplantasi jaringan lain.

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodI dalam suatu sampel, karenanya

merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi

konsentrasi antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi

kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk

mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan

telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada

berbagai kelas obat.

Beberapa Tipe ELISA

A. Indirect ELISA

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi

antibodi dalam serum adalah:

1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada

permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan

plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan

menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari

suatu sampel yang akan diuji.

2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin(BSA) atau

kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal

sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain

ke plate.

3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari

antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan

untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi

non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan

dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan

lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan

dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat

spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal

kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.

8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/

elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang

tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama

dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga

setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang platemikrotiter, sehingga

konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain

saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanismeindirect ELISA dapat dilihat pada

gambar di bawah ini.

B. Sandwich ELISA

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap

2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen

6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan

dengan antibodi primer

7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang

8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/

berfluoresensi/ elektrokimia

9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel

yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa

lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein

serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas

antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwichELISA dapat dilihat pada skema berikut

ini:

C. ELISA kompetitif

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas

sebelumnya, yaitu:

1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah

dilapisi antigen

3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam

sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel

pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi

4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi

sekunder ini berpasangan dengan enzim

5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/

fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal

yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:

Teknik immunofluorescence (teknik immunofluorescence), juga dikenali sebagai teknik

antibodi pendarfluor, adalah untuk menandakan teknik imun membangunkan salah satu

yang paling awal. Ia adalah dalam imunologi, biokimia dan teknik mikroskopi ditubuhkan

atas dasar teknologi a. Sebahagian ulama telah lama cuba untuk molekul dengan beberapa

pengesanan antibodi mengikat, reaksi antigen-antibodi menggunakan tisu atau sel antigen

kedudukan material.

IMUNOHISTOKIMIA

Imunohistokimia adalah suatu metode kombinasi dari anatomi, imunologi dan biokimia

untuk mengidentifikasi komponen jaringan yang memiliki ciri tertentu dengan menggunakan

interaksi antara antigen target dan antibodi spesifik yang diberi label. Imunohistokimia

merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau kadar antibodi

atau antigen dalam sediaan jaringan. Nama imunohistokimia diambil dari nama immune

yang menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam proses ini ialah penggunaan antibodi dan

histo menunjukkan jaringan secara mikroskopis. Dengan kata lain, imunohistokimia adalah

metode untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifik di dalam sel suatu jaringan dengan

menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi (Ab) dan antigen (Ag) pada jaringan hidup.

Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan yang bervariasi

tergantung dari tujuan pemeriksaan.

Teknik imunohistokimia bermanfaat untuk identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi suatu

antigen tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi, dan prognosis kanker. Teknik ini

diawali dengan pembuatan irisan jaringan (histologi) untuk diamati dibawah mikroskop.

Interaksi antara antigen-antibodi adalah reaksi yang tidak kasap mata. Tempat pengikatan

antara antibodi dengan protein spesifik diidentifikasi dengan marker yang biasanya

dilekatkan pada antibodi dan bisa divisualisasi secara langsung atau dengan reaksi untuk

mengidentifikasi marker. Adapun beberapa marker yang berupa senyawa berwarna antara

lain :

Luminescence

Zat berfluoresensi : fluorescein, umbelliferon, tetrametil rodhamin

Logam berat : colloidal, microsphere, gold, silver, label radioaktif

Enzim : Horse Radish Peroxidase (HRP) dan alkaline phosphatase.

Enzim (yang dipakai untuk melabel) selanjutnya direaksikan dengan substrat kromogen

(yaitu substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut) yang dapat

diamati dengan mikroskop bright field (mikroskop bidang terang). Akan tetapi seiring

berkembangnya ilmu pengetahuan khususnya dunia biologi, teknik imunohistokimia dapat

langsung diamati (tanpa direaksikan lagi dengan kromogen yang menghasilkan warna)

dibawah mikroskop fluorescense.

Langkah-langkah dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi 2, yaitu preparasi

sampel dan labeling. Preparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat

jaringan dari jaringan yang masih segar. Preparasi sample terdiri dari pengambilan jaringan

yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid, embedding jaringan

dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan

menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan epitop

jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik lain. Sampel labeling adalah pemberian

bahan-bahan untuk dapat mewarnai preparat. Sampel labeling terdiri dari imunodeteksi

menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan counterstaining

untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya. Antibodi adalah suatu imunoglobulin yang

dihasilkan oleh sistem imun dalam merespon kehadiran suatu antigen tertentu. Antibodi

dibentuk berdasarkan antigen yang menginduksinya. Beberapa antibodi yang telah

teridentifikasi adalah IgA, IgD, IgE, IgG, dan IgM. Antigen adalah suatu zat atau substansi

yang dapat merangsang sistem imun dan dapat bereaksi secara spesifik dengan antibodi

membentuk kompleks terkonjugasi. Ikatan antibodi-antigen divisualisasikan menggunakan

senyawa label/marker.

IHC merupakan teknik deteksi yang sangat baik dan memiliki keuntungan yang luar biasa

untuk dapat menunjukkan secara tepat di dalam jaringan mana protein tertentu yang

diperiksa. IHC juga merupakan cara yang efektif untuk memeriksa jaringan. Teknik ini telah

digunakan dalam ilmu saraf, yang memungkinkan peneliti untuk memeriksa ekspresi protein

dalam struktur otak tertentu. Kekurangan dari teknik ini adalah kurang spesifik terhadap

protein tertentu tidak seperti teknik imunoblotting yang dapat mendeteksi berat molekul

protein dan sangat spesifik terhadap protein tertentu. Teknik ini banyak digunakan dalam

diagnostik patologi bedah terhadap kanker, tumor, dan sebagainya. Adapun marker untuk

diagnosa IHC adalah sebagai berikut:

Carcinoembryonic antigen (CEA): digunakan untuk identifikasi adenocarcinoma.

Cytokeratins: digunakan untuk identifikasi carcinoma tetapi juga dapat terekspresi dalam

beberapa sarkoma.

CD15 and CD30 : digunakan untuk identifikasi Hodgkin's disease

Alpha fetoprotein: untuk tumor yolk sac dan karsinoma hepatoselluler

CD117 (KIT): untuk gastrointestinal stromal tumors (GIST)

CD10 (CALLA): untuk renal cell carcinoma dan acute lymphoblastic leukemia

Prostate specific antigen (PSA): untuk prostate cancer estrogens dan progesterone staining

untuk identifikasi tumor

Identifikasi sel B limfa menggunakan CD20

Identifikasi sel T limfa menggunakan CD 3

Radioimmunoassay merupakan metode laboratorium (in vitro method) untuk mengukur dengan relative

tepat jumlah zat yang ada pada tubuh pasien[1] dengan isotop radioaktif yang bercampur dengan antibody

yang disisipkan ke dalam sampel. Radioimmunoassay merupakan revolusi dalam pemeriksaan medis.

Pada tahun 2009, teknik ini masih revolusioner karena merupakan blueprint untuk pengembangan metode

lebih lanjut dalam teknik laboratorium di bidang medis.

Dasar-dasar teknik radioimmunoassay (RIA) atau prinsip competitive-binding radioassay ini pertama kali

dikembangkan pada tahun 1950-an oleh Solomon Berson dan Rosalyn Yallow[1,2] untuk memeriksa volume

darah, metabolism iodine, menentukan kadar hormone insulin dalam plasma darah. Dengan menggunakan

prinsip ini titer atau kadar berbagai hormon, antigen, antibodi, enzim dan obat dalam darah dapat diukur

dengan ketepatan dan ketelitian yang sangat tinggi. Karena limit deteksi yang sangat baik ini maka RIA

digunakan sebagai peralatan laboratorium standar.

RIA memanfaatkan radioaktivitas dari isotop radioaktif yang diinjeksikan ke dalam sampel. Cacahan radiasi

dideteksi menggunakan pencacah seperti detector Geiger-Muller, scintillator, dan sebagainya.

Pemanfaatan Radioaktivitas

Teknik RIA adalah suatu teknik penentuan zat-zat yang berada dalam tubuh berdasarkan reaksi imunologi

yang menggunakan tracer radioaktif[3]. Tracer radioaktif adalah isotop radioaktif yang akan meluruh pada

melalui proses radioaktivitas. Radioaktivitas adalah proses peluruhan isotop tidak stabil (radioaktif) menjadi

isotop yang lebih stabil dengan memancarkan energy melalui materi berupa partikel-partikel (alpha atau

beta) ataupun gelombang elektromagnetik (sinar gamma)[4]. Intensitas dari sumber radioaktif dinyatakan

oleh transformasi inti rata-rata per satuan waktu. Satuan radioaktivitas dinyatakan dengan Curie (Ci). 1 Ci

awalnya didefinisikan sebagai radiasi yang dipancarkan oleh 1 gram 226Ra, tetapi definisi ini diubah sebagai

kemurnian dari peningkatan nuklida. Nilai absolute dari 1 Ci sama dengan 3,71010 disintegrasi/sekon.

Satuan lain dari radioaktivitas adalah Becquerel (Bq), 1 Bq sama dengan 1 disintegrasi/sekon[5,6].

RIA memiliki 2 keampuhan metode[3] antara lain adalah: Pertama, pengukuran radioaktivitas memberikan

kepekaan dan ketelitian yang tinggi serta tidak terpengaruh oleh factor-faktor lain yang terdapat dalam

system. Kedua, reaksi immunologi berlangsung secara spesifik karena antigen hanya dapat bereaksi

dengan antibody yang sesuai dengannya sehingga zat lain atau antigen lain yang tidak sesuai

karakteristiknya tidak dapat ikut campur dalam reaksi.

Prinsip Kerja

Prinsip radioimmunoassay dapat diringkas sebagai persaingan reaksi dalam campuran yang terdiri dari

antigen/hormon berlabel radioaktif, antibodi dan antigen/hormon yang tidak berlabel radioisotop. Antigen

radioaktif dicampur dengan sejumlah antibodi. Antigen dan antibodi berikatan satu sama lain menjadi satu

zat. Kemudian ditambahkan zat yang tidak diketahui jenisnya yang mengandung sedikit antigen. Zat baru

ini merupakan zat yang diuji[1,9].

Secara sederhana digambarkan dengan asumsi bahwa antibodi yang dimaksud berkonsentrasi sangat

tinggi untuk dikombinasikan dengan antigen atau antigen yang berlabel dalam molekul antibodi. Pada saat

ikatan kadar protein dan steroid radioaktif konstan, penghambatan ikatan hormon radioaktif dengan ikatan

protein merupakan fungsi dari jumlah hormon nonradioaktif yang berada pada sampel.