Kloning endo-1,4-beta-D-glucanase Menggunakan Plasmid pMMB67EH

dan Sel Inang E.coli Origami

KELOMPOK 7

Andrey Sapati Wirya (1306412161)Ardita Rizky Putri Arcanggi (1306402293)

Ayip Farouk (1306447865)Julia Nofadini (1306370972)

Luthfiana Azizah (1306370966)Terry Muhammad Octaryno(1306370770)

Tahapan Kloning

Menyiapakan vektor dan host

Menentukan daerah

penyisipan

Memotong plasmid pada

daerah penyisipan

Memperbanyak GOI yang

mengandung RE

Memotong DNA yang

dimodifikasiLigasi

Transformasi (Heat Shock

dan elektroforasi)

Seleksi

Pemurnian plasmid

rekombinanSekuensing

MENYIAPKAN PLASMID

PlasmidPlasmid adalah molekul DNA sirkuler untai ganda

diluar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. Vektor plasmid digunakan untuk mengkloning DNA yang berukuran 100 bp- 10 kb.

Syarat - Syarat Plasmid Sebagai Vektor Kloning

• Origin of replicationPlasmid merupakan unsur ekstra kromosomal, maka tidak dapat menggunakan setiap origin of replication dalam DNA kromosom. Artinya sintesis DNA di dalam plasmid bergantung pada ORI nya DNA yang disintesis itu sendiri.

• Gen markermempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker (antibiotik) yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid kedalam sel inang. Contohnya ampicilin.

• Restriction sitesMempunyai tempat pengenalan restriksi di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA.

• Jumlah pasangan basa pada plasmid harus lebih banyak dibandingkan jumlah pasangan basa GoI yang akan disisipkan.

Pemilihan ORI

ORI tergantung pada berapa banyak salinan plasmid yang ingin dipertahankan, host yang ingin digunakan, dan kompabilitas plasmid yang ingin digunakan dengan satu atau lebih plasmid yang lainnya. Secara umum, plasmid dengan ORI yang sama tidak sesuai karena mereka akan bersaing untuk proses yang sama, sehingga menciptakan lingkungan yang tidak stabil dan tak terduga. Sehingga plasmid dari kelompok yang sama tidak boleh di transformasi secara bersamaan.

Selain itu, plasmid yang digunakan sebagai vektor untuk kloning harus sesuai dengan host nya.

Plasmid pMMB67EH

Plasmid pMMB67EH

Pemilihan HostMemilih host strain bergantung pada sifat protein

heterolog, yaitu :

• Jika protein mengandung sejumlah besar kodon E.coli yang langka, maka strain dari E.coli harus dimodifikasi agar punya tRNA yang cocok dengan kodon yang langka tersebut.

Pemilihan Host

• Jika protein mengandung satu atau lebih ikatan disulfida, folding yang baik dipicu oleh strain host yang memiliki lingkungan sitoplasmik yang lebih mengoksidasi.

• Jika protein bersifat racun terhadap sel, ekspresi dari vektor pLysS atau pLysE akan memperketat sistem regulasi ekspresinya yang menggunakan T7 promotor karna vektor tersebut mengekspresikan lysozyme yang mengikat dan menginaktivasi T7 RNA polimerase.

Berdasarkan data diatas, dapat dilihat bahwa protein endo-1,4-beta-D-glucanase mempunyai ikatan disulfida, sehingga host yang kami pilih adalah E.coli Origami

MENENTUKAN DAERAH PENYISIPAN

Penentuan Daerah Penyisipan

• Untuk menentukan daerah penyisipan, ada beberapa hal yang perlu diperhatikan:– Daerah seleksi– Daerah ORI– Spesifisitas restriction site pada plasmid– Spesifisitas restriction site pada GOI

Tahapan Penentuan Daerah Penyisipan

• Menentukan kemudahan seleksi plasmid pada akhir tahap kloning

Daerah Seleksi

• Daerah untuk memulai replikasi

Daerah ORI

• Adanya multiple restriction site akan menyebabkan pemotongan tidak spesifik

Spesifisitas RE

Penentuan Daerah Penyisipan

Cloning Site pada plasmid pMMB67EH ditandai dengan restriction site untuk enzim EcoRI dan HindIII.

Enzim Restriksi EcoRI

• Berasal dari strain E.coli RY13• Merupakan 6-cutters, dan enzim restriksi

endonuklease.• Hasil pemotongan berupa sticky end

Enzim Restriksi HindIII

• Berasal dari strain Haemophilus influenzae Rd• Merupakan 6-cutters, dan enzim restriksi

endonuklease.• Hasil pemotongan berupa sticky end

Spesifisitas Enzim Restriksi

• Setelah mengetahui urutan basa nukleotida yang dikenali kedua enzim tersebut, dilakukan pengecekan terhadap strain GOI dan vektor yang digunakan.

• Hasilnya adalah di dalam strain GOI tidak terdapat restriction site EcoRI dan HindIII, sehingga enzim restriksi tidak akan memotong GOI.

• Pada vektor juga tidak terdapat restriction site EcoRI dan HindIII berganda, sehingga plasmid hanya terpotong pada tempat yang spesifik

MEMOTONG PLASMID PADA DAERAH PENYISIPAN

Pemotongan Plasmid pada Daerah Penyisipan

Plasmids

Pemotongan Plasmid

• Harus mengetahui aktivitas dari enzim restriksi yang digunakan.

• Untuk EcoRI dan HindIII dari New England Biolabs, memiliki definisi unit yang sama, yaitu:

• “One unit is defined as the amount of enzyme required to digest 1 µg of λ DNA in 1 hour at 37°C in a total reaction volume of 50 µl.”

Penggunaan Buffer

• Enzim EcoRI dan HindIII sudah diuji aktivitasnya dalam larutan buffer racikan untuk setiap perusahaan enzim.

• Untuk EcoRI dan HindIII dari New England Biolabs diuji dalam larutan racikannya yaitu NEBuffers, dimana aktivitas enzim pada larutan ini mencapai 100% untuk NEBuffers 2.1

Penggunaan Buffer

• NEBuffers 2.1 memiliki komposisi sebagai berikut:– 50 mM NaCl– 10 mM Tris-HCl– 10 mM MgCl2

– 100 μg/ml BSA– pH 7.9 @ 25°C

Plasmid dimasukkan ke dalam larutan buffer dan konsentrasinya disesuaikan.

Larutan ini kemudian dimasukkan enzim restriksi dan diinkubasi selama 1 jam pada 370C

MEMPERBANYAK GOI YANG MENGANDUNG RESTRICTION SITE

Memperbanyak GOI yang Memiliki Restriction Site

• Proses replikasi GOI menggunakan PCR, sehingga dibutuhkan desain primer yang digunakan untuk memulai PCR

• Desain primer untuk PCR meliputi tahap-tahap berikut:– Penentuan daerah annealing.– Penambahan start dan stop kodon– Penambahan restriction site untuk RE

Desain Primer

• Daerah annealing ditentukan dari strain GOI, meliputi daerah annealing untuk primer forward dan reverse.

• Kriteria utama dalam mendesain primer ini adalah:– Penulisan dari 5’ ke 3’– Memiliki 18 – 30 pasangan basa nukloetida– Konten GC sebanyak 40% hingga 60%– Tm sebesar 52 – 580C

– Beda Tm antara primer-primer tidak lebih dari 50C

Primer Forward

• Annealing site:• 5’ – ACATTTCTTCACTTCACACAC – 3’

• Tm: 20C × (A+T) + 40C × (G+C)• (20C × 12) + (40C × 8) = 560C

• GC content: 40%

Primer Reverse

• Annealing site: Reverse Complement• 5’ – AGTCGACTACAGTTGTTATTC – 3’

• Tm: 20C × (A+T) + 40C × (G+C)• (20C × 14) + (40C × 7) = 560C• GC content 33%• Maka, ∆Tm = 00C, kedua primer akan melting

pada saat bersamaan

Desain Primer

• Desain Primer hampir memenuhi semua kriteria primer ideal, maka kedua primer ditambahkan restriction site dan start/stop codon.

• Untuk primer forward ditambahkan start codon ATG, dan restriction site EcoRI

• Untuk primer reverse ditambahkan stop codon TAA, dan restriction site HindIII

Desain Primer

• Forward primer:• 5’ –

TAAGCAGAATTCATGACATTTCTTCACTTCACACAC – 3’

• Reverse primer• 5’ –

TGCTTAAAGCTTAATAGTAGACTACAGTTGTTATTC

Penambahan Basa di Ujung 5’ Restriction Site

• Penambahan basa upstream atau di ujung-ujung restriction site akan menambahkan efisiensi pemotongan.

• Apabila tidak ditambahkan, maka akan mengurangi jumlah pemotongan dari yang diharapkan.

PCR

• Menyiapkan DNA yang ingin diamplifikasi dengan membuat larutan yang terdiri dari– 0.1-5 ng plasmid DNA dan 0.1-1 ug untuk genomic DNA– 200 µM dNTPs (konsentrasi akhir)– 1-1.5 U Taq polymerase dan Pfu Turbo polymerase

1.25-2.5U– 0.1-1 µM primer forward dan reverse– 1-4 mM MgCl2 Taq polymerase (MgSO4 untuk Pfu

polymerase)– DMSO hingga 10%

DNA Polymerase

• Dikombinasikan menggunakan 2 enzim, yaitu Taq Polymerase dan Pfu Polymerase

• Taq Polymerase dapat mereplikasi 1000 pasangan basa dalam 10 detik pada 720C, namun tidak memiliki 3’ – 5’ exonuklease proofreading, sehingga dapat sering terjadi salah replikasi.

• Pfu polymerase memiliki 3’ – 5’ exonuclease proofreading, sehingga jarang terjadi salah replikasi, namun pada suhu 720C enzim ini memiliki aktivitas yang jauh lebih lambat, sehingga mencapai 1 – 2 menit untuk 1x tahap PCR.

• Dikombinasikan agar memiliki kecepatan pembacaan yang tidak terlalu lambat dan jarang terjadi kesalahan.

Proses PCR

Elektroforesis Gel

• Elektroforesis gel adalah prosedur lab standar untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya, untuk visualisasi dan purifikasi.

• Elektroforesis menggunakan medan listrik untuk menggerakkan DNA bermuatan negatif menuju elektroda positif melalui matriks gel agarose.

Preparasi Agarose Gel

1. Mengukur 1g bubuk agarose2. Memasukkan bubuk agarose ke dalam wadah berisi 100ml

larutan 1xTAE (Tris-Asetat-EDTA)3. Mikrowave selama 1 – 3 menit hingga agarose terlarut,

dan dinginkan selama 5 menit.4. Apabila ingin memvisualisasikan DNA dengan sinar UV,

maka ditambahkan Etilen Bromida.5. Menuang agarose ke dalam gel tray yang memiliki lubang-

lubang (comb)6. Dinginkan dalam lingkungan dingin atau temperatur

ruangan hingga memadat.

Pengisian Sampel dan Elektroforesis1. Menambahkan loading buffer pada setiap sampel.2. Setelah memadat, memasukkan gel agarose pada gel box

(unit elektroforesis)3. Menambahkan larutan 1xTAE hingga permukaan gel tertutupi.4. Menambahkan molecular weight ladder secara hati-hati pada

baris pertama gel.5. Mengisikan sampel secara hati-hati pada well gel tambahan.6. Menambahkan tegangan 80 – 150V pada gel hingga garis

warna mencapai 75 – 80% dasar gel.7. Mematikan alat, melepaskan elektroda, dan mengeluarkan gel

tray secara hati-hati8. Memasukkan gel kedalam container berisi 100ml TAE dan 5μl

EtBr dalam rocker selama 20 – 30 menit, kemudian gunakan air untuk menghilangkan warnanya.

Elektroforesis Gel

Purifikasi DNA dari Gel Agarose

1. Memindahkan hasil elektroforesis ke dalam kotak UV terbuka, keluarkan gel dari plastik tray, dan memotong fragmen DNA bersama gelnya dengan silet atau pisau steril.

2. Memasukkan gel kedalam tabung mikrofuge berlabel.3. Dengan menggunakan timbangan mengukur massa

gel. Massa gel digunakan untuk menentukan seberapa banyak setiap buffer diperlukan untuk isolasi DNA.

4. Dengan menggunakan Gel Purification Kit, DNA diisolasi dari gelnya.

MEMOTONG DNA YANG TELAH DIMODIFIKASI

Memotong DNA yang Termodifikasi

• DNA yang diamplifikasi melalui proses PCR memiliki blunt end

• Agar dapat dimasukkan ke dalam plasmid vektor,DNA harus sticky end sehingga diperlukan pemotongan pada restriction site

• Prosedur untuk pemotongan DNA sama dengan prosedur pemotongan plasmid.

LIGASI

Ligasi

Agar proses ligasi dapat berlangsung, DNA ligase membutuhkan ujung 5’-P dan 3’-OH pada molekul DNA. ketika DNA dicerna oleh enzim restriksi yang menghasilkan ujung lengket, ujung DNA yang kompatibel dapat berikatan. Ligase dapat mengikat secara kovalen 5’-P dan 3’-OH berdekatan dengan sumber energi (ATP) dan kofaktor Mg2+.

Jika ujung semua molekul dalam reaksi (baik insert dan vektor) memiliki sticky end yang sama, ada beberapa kemungkinan produk, yaitu :

• Fragmen dari vektor asli bisa menempel untuk menghasilkan vektor utuh.

• Molekul insert (GOI) bisa menempel ke diri mereka sendiri.• Dua ujung molekul GOI bisa diligasi ke dalam fragmen plasmid.

Ligasi

Ligasi DNA mengacu pada reaksi yang membentuk molekul DNA rekombinan dengan cara mengikat bersama dua fragmen restriksi dengan ujung yang kompatibel.

Mekanisme DNA Ligase

Pembentukan intermediet enzim berenergi tinggi dengan transfer gugus adenosil dari ATP atau (NAD+) ke gugus amino dari residu lisin pada enzim (DNA ligase).

Transfer gugus adenosil ke ujung fosfat 5’ dari salah satu ujung DNA (yang rusak) sehingga membentuk ikatan pirofosfat yang teraktivasi.

Penyerangan ujung 5’ terativasi oleh gugus 3’-hidroksil pada ujung DNA yang berdekatan (ujung rusak DNA), yang membentuk ikatan fosfodiester diatara ujung-ujung DNA yang rusak, setelah reaksi ini dilepaskan AMP.

VIDEO LIGASI

Tahapan Proses Ligasi

Untuk meligase digunakan T4 Ligase karena sangat

efektif untuk meligasi Ujung DNA yang Sticky End dan terdapat nick atau celah.

Kemudian ditambahkan Alkaline Phosfat untuk

mendegradasi ujung 5’ dan 3’ yang bertujuan untuk

menghindari self ligation.

Tahapan Proses Ligasi

Agar lebih efektif

Perbandingan DNA

insert dan vektor adalah

3:1.

Bahan tambahan

adalah Buffer ligase dan

pelarut. Buffer tersebut

berguna untuk menjaga pH

agar DNA tak terdegradasi

dan menyediakan

atp untuk ligase.

Melakukan

inkubasi pada suhu ruang

selama 2 jam.

TRANSFORMASI

Transformasi

Transformasi adalah proses mentransfer DNA eksogen ke dalam sel.

Ada 2 metode umum untuk mengubah bakteri :• Metode kimia dengan memanfaatkan CaCl2 dan heat shock

untuk mempromosikan masuknya DNA ke dalam sel.• Elektroporasi yang menggunakan muatan listrik untuk

memfasilitasi penyerapan DNA.

Transformasi Kimia Menggunakan Kalsium Klorida

DNA asing dapat dengan mudah diintroduksi ke sel bakteri apabila DNA plasmid telah diberi perlakuan dengan sel kompeten. Sel kompeten dibuat dengan cara memberi perlakuan kation divalen, seperti kalsium klorida (CaCl2) ke sel. DNA plasmid kemudian dicampur dengan sel kompeten tersebut. sel kompeten kemudian diberi perlakuan kejutan panas (heat shock) pada suhu 42 °C, sehingga mengandung antibiotik untuk diidentifikasi.

Transformasi Kimia Menggunakan Kalsium KloridaMolekul CaCl2 akan

menyebabkan sel-sel bakteri membengkak dan

membentuk sferoplas yang kehilangan protein

periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor

DNA akan membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan

selKompleks Ca2+ ini

kemudian diambil oleh sel selama perlakuan

kejut panas diberikan

Transformasi Dengan Elektroporasi

Elektroporasi merupakan teknik transformasi menggunakan aliran listrik bertegangan tinggi. Aliran listrik tersebut dapat melubangi membran sel bakteri, merusak lapisan lipid, sehingga DNA dapat memasuki sel atau jaringan.

Aliran listrik dialirkan menuju suspensi sel dan DNA kemudian ditempatkan di kuvet. Aliran listrik kemudian memecah pori pada membran, sehingga DNA dapat memasuki sel. Sel dapat berfungsi secara normal kembali setelah pori tersebut tertutup.

Transformasi Dengan Elektroporasi

SELEKSI

Seleksi Biru Putih (Blue-White Selection)

Seleksi biru putih (blue-white selection) merupakan metode untuk memisahkan sel yang mengandung plasmid rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid tanpa insert. Seleksi biru putih dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi atau keberadaan DNA sisipan.

Transforman yang dihasilkan ada yang berwarna biru dan putih, adanya warna biru karena senyawa X-gal dalam medium . Hasil transformasi terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan dengan penambahan X-gal dan IPTG serta pada kontrol positif tanpa perlakuan. X-gal adalah molekul yang mirip galaktosa, sedangkan IPTG merupakan inducer enzim β-galaktosidase.

Seleksi Biru Putih (Blue-White Selection)

Terbentuknya koloni berwarna putih ini berarti sel bakteri mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses ligasi dinyatakan berhasil (Brown 1995). Jika proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak berhasil ditandai dengan warna koloni berwarna biru artinya proses transformasi yang dilakukan tidak berhasil hal ini dapat terjadi karena ukuran insert terlalu kecil sehingga tidak mampu membuat gen lacZ terinaktifasi atau posisi sisipan yang tidak tepat, dan insert yang diklon bersifat meracuni bagi sel bakteri.

Pada plasmid pMMB67EH tidak memiliki gen lac Z, sehingga tidak dapat menggunakan seleksi biru-putih.

Seleksi Menggunakan Antibiotik

Bakteri yang telah mengambil plasmid dan ditransformasikan harus di seleksi. Plasmid terlalu kecil untuk dilihat, sehingga penting bagi plasmid untuk mengandung gen yang mengekspresikan karakteristik yang dapat dilihat atau dapat ditafsirkan. Salah satu karakteristik tersebut adalah resistensi antibiotik. Dengan menumbuhkan bakteri pada media padat yang mengandung antibiotik, hanya sel-sel yang ditransformasi dengan plasmid yang mengandung gen untuk resistensi antibiotik akan tumbuh dan yang lain akan mati. Plasmid dapat memiliki beberapa gen yang dimasukkan ke dalamnya. Gen pada plasmid tidak dapat dipisahkan selama transformasi. Jika plasmid memiliki gen untuk resistensi antibiotik, dalam hal ini plasmid pmmb67EH mengandung ampisilin, maka sel-sel yang bertahan di piring media yang mengandung ampisilin, telah memperoleh gen untuk resistensi ampisilin dari plasmid yang digunakan dalam transformasi.

PEMURNIAN PLASMID REKOMBINAN

Pemurnian Plasmid Menggunakan Lisis Alkali

Pemurnian ini didasarkan pada denaturasi diferensial dari kromosom dan DNA plasmid untuk memisahkan keduanya. Bakteri akan lisis dengan larutan yang mengandung sodium Dodecyl Sulfat (SDS) dan Sodium Hidroksida. Selama langkah ini, kromosom serta DNA plasmid akan terdenaturasi. Netralisasi berikutnya dengan kalium asetat memungkinkan hanya plasmid DNA kovalen tertutup untuk reanneal. Sebagian besar DNA kromasomal dan protein mengendap dalam kompleks yang terbentuk dengan kalium dan SDS, yang dihilangkan oleh sentrifugasi. Plasmid DNA terkonsentrasi dari supernatan dengan presipitasi etanol.

Pemurnian Plasmid Menggunakan Lisis Alkali

Seperti halnya prosedur plasmid isolasi, keberhasilan dalam menggunakan lisis alkali tergantung pada strain E. coli yang digunakan. Strain yang memiliki aktivitas endo-nuklease A yang tinggi seperti HB101 atau seri JM100, menghasilkan DNA yang sering memerlukan pemurnian lebih lanjut dengan ekstraksi fenol dan / atau presipitasi tambahan. Namun, prosedur lisis alkali tampaknya menjadi protokol pemurnian plasmid paling konsisten dan juga lebih cocok untuk isolasi berat molekul tinggi (> 10 kb) atau nomor penyalinan plasmid yang rendah dari pada metode boiling lysis. Plasmid DNA yang diisolasi oleh lisis alkali, cocok untuk sebagian besar analisis dan prosedur kloning tanpa pemurnian lebih lanjut. Namun, jika plasmid DNA yang terisolasi akan diurutkan, maka dibutuhkan langkah pemurnian tambahan, seperti ekstraksi fenol.

Pemurnian Plasmid Menggunakan Pemanasan (Boiling Lysis)

Prosedur boiling lysis cepat untuk dilakukan sehingga cocok untuk skrining sejumlah besar-kecil volume kultur Escherichia coli. Namun, kualitas DNA plasmid yang terisolasi lebih rendah dibandingkan dengan menggunakan metode alkaline lysis.

Bakteri akan lisis dengan pemberian lisozim, triton, dan panas. DNA kromosomal tetap melekat pada membrane bakteri dan dihilangkan oleh proses sentrifugasi. Plasmid DNA tetap di supernatan yang kemudian diendapkan dengan isopropanol.

Pemurnian Plasmid Menggunakan Pemanasan (Boiling Lysis)

Prosedur boiling lysis tidak dianjurkan ketika mengisolasi plasmid dari E. coli EndaA+ strain yang mengekspresikan endonukleaseA, seperti HB101 danseri JM100. Kontaminasi plasmid oleh endonuklease A, yang tidak sepenuhnya dinonaktifkan oleh pemanasan, menyebabkan degradasi plasmid selama inkubasi berikutnya dengan adanya Mg2+, (misalnya, selama proses pencernaan dengan enzim restriksi). Masalah ini dapat diatasi dengan memasukkan ekstraksi dengan fenol: kloroform untuk menghapus kontaminasi endonuklease dari persiapan plasmid.

SEKUENSING

Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek

Prinsip Dasar

• DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Tujuan DNA Sequencing

Sekuen DNA membawa informasi

DNA mRNA ProteinTranscription Translation

• “Sequencing” merupakan metode menentukan urutan basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, timin pada sepotong DNA.

• Urutan nukleotida menentukan urutan asam amino, yang akhirnya menentukan struktur protein dan fungsinya.

• Perubahan sekuens DNA dapat mengakibatkan perubahan protein atau menyebabkan terbentuknya protein non fungsionalAkibatnya dapat menimbulkan efek merugikan pada organisme

METODE NEXT GENERATION SEQUENCING

Next Generation Sequencing

Next Generation Sequencing– The Archon X prize (2006): "the first Team that can build a device and use it to sequence

100 human genomes within 10 days or less, with an accuracy of no more than one error in every 100,000 bases sequenced, with sequences accurately covering at least 98% of the genome, and at a recurring cost of no more than $10,000 (US) per genome.”

• Aplikasi– Sekuensing dapat dilakukan di seluruh genom bakteri dalam menjalankan pengurutan

DNA– Sekuensing dapat diaplikasikan genom individu– metagenomics: sekuensing DNA yang diekstraksi dapat diambil dari sampel lingkungan– Dapat mencari varian langka di daerah diperkuat tunggal, tumor atau infeksi virus

Next Generation Sequencing

Video Next Generation

Definisi Ion Torren

• Instrumen sequencing Ion Torrent ™ dirancang untuk memberikan peneliti informasi urutan yang diperlukan untuk mengidentifikasi peristiwa genetik penting, dan peristiwa ini diwakili sebagai data urutan dan hasil analisis. Dengan membangkitkan highquality data urutan sangat penting untuk pencapaian sukses hasil penelitian, tetapi menyimpan data juga penting dengan pertimbangan lain ketika sedang merencanakan eksperimen sequencing.

Ion Torrent Video

Ion Torren

Perbandingan Metode Sekuensing Next Generation

Kesimpulan

Dilihat dari efektifitas alat, harga, dan waktu menjadi pilihan utama kami yaitu ION Torren

Daftar Pustaka

Barany, F., The Ligase Chain Reaction. PCR methods Appl, 1991, 1: p5-16.Creissen, D., dan Shall, S. Regulation of DNA Ligase activity by poly(ADP-ribose). Nature 296, 1982, p271- 272. (Abstract)Hayashi, K., et. al., Regulation of inter- and intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of polyethylene glycol. Nucleic Acids Research, 1986, vol. 14, No.19, p7617-7631. (Abstract)

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3431227/http://www.hindawi.com/journals/bmri/2012/251364/http://www.hindawi.com/journals/bmri/2012/251364/tab2/http://www.hindawi.com/journals/bmri/2012/251364/tab1/http://www.esciencecentral.org/ebooks/applications-of-molecular-genetics/dna-sequencing-sanger-and-nextgeneration-sequencing.phphttp://www.thermofisher.com/id/en/home/life-science/sequencing/dna-sequencing/targeted-sequencing/targeted-sequencing-ion-torrent-next-generation-sequencing.htmlhttps://www.neb.com/products/R0104-HindIIIhttps://www.neb.com/products/R0101-EcoRI#tabselect0https://www.neb.com/protocols/1/01/01/taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer-m0273https://www.addgene.org/plasmid-protocols/gel-purification/https://www.addgene.org/plasmid-protocols/gel-electrophoresis/https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragmentshttps://www.addgene.org/plasmid-protocols/pcr-cloning/http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/cuteffects.html