MAKALAHREKAYASA DNA DAN SEL GERMINALDosen : Ardiansyah, M.Biotech. Stu

OLEH : ERIYANTI WAHID (09 24 279) MINAT PEMBENIHAN IKAN

BUDIDAYA PERIKANAN POLITEKNIK PERTANIAN NEGERI PANGKEP 2012

REKAYASA DNA DAN SEL GERMINAL Rekayasa DNA o Apa itu Rekayasa genetika ??? Rekayasa genetika adalah perubahan materi genetik oleh intervensi langsung dalam proses-proses genetik dengan tujuan memproduksi zat baru atau meningkatkan fungsi organisme yang ada. Ini adalah cabang yang sangat muda, menarik, dan kontroversial dari ilmu biologi. Di satu sisi, ia menawarkan kemungkinan obat untuk penyakit dan perbaikan bahan tak terhitung jumlahnya untuk kehidupan sehari-hari. Rekayasa genetika merupakan salah satu teknologi yang paling penting sekarang tersedia untuk ilmuwan. Teknologi itu penting untuk urutan genom manusia, dan telah sangat meningkatkan potensi untuk mengembangkan obat baru. Rekayasa genetika adalah proses menghilangkan gen dari satu organisme dan memasukkannya ke dalam lain. Seringkali, gen dihapus dimasukkan ke dalam bakteri atau sel ragi sehingga ilmuwan bisa mempelajari gen atau protein menghasilkan lebih mudah. Terkadang, gen yang dimasukkan ke dalam tumbuhan atau binatang. o Defenisi Rekayasa genetika mengubah susunan genetik dari suatu organisme dengan menggunakan teknik yang memperkenalkan diwariskan bahan disiapkan di luar organisme baik secara langsung ke dalam host atau ke dalam sel yang kemudian menyatu atau hibridisasi dengan tuan rumah. Hal ini melibatkan menggunakan rekombinan asam nukleat ( DNA atau RNA ) teknik untuk membentuk kombinasi baru materi genetik diwariskan diikuti dengan penggabungan material yang baik secara tidak langsung melalui vektor sistem atau langsung melalui mikro-injeksi , injeksi makro dan mikro enkapsulasi teknik. Rekayasa genetika tidak termasuk tradisional hewan dan pemuliaan tanaman , fertilisasi in vitro , induksi poliploidi , mutagenesis dan teknik fusi

sel yang tidak menggunakan rekombinan asam nukleat atau organisme dimodifikasi secara genetik dalam proses. Kloning dan sel induk penelitian, meskipun tidak dianggap rekayasa genetika, adalah terkait erat dan rekayasa genetika dapat digunakan dalam diri mereka. biologi sintetik adalah disiplin yang muncul yang membutuhkan rekayasa genetika langkah lebih lanjut dengan memperkenalkan materi genetik artifisial disintesis dari bahan baku menjadi suatu organisme. o Prinsip Rekayasa Genetika Sama seperti DNA merupakan inti dari penelitian dalam genetika, DNA rekombinan ( rDNA )-yaitu, DNA yang telah diubah secara genetik melalui proses yang dikenal sebagai gen splicing-adalah titik fokus dari rekayasa genetika. Dalam gen splicing , untai DNA dipotong setengah memanjang dan bergabung dengan untai dari organisme lain atau mungkin bahkan spesies lain. Penggunaan rekayasa gen memungkinkan dua teknik yang sangat penting lainnya. Transfer gen, atau penggabungan DNA baru ke dalam sel organisme, biasanya dilakukan dengan bantuan suatu mikroorganisme yang berfungsi sebagai pembawa, vektor atau. Terapi gen adalah pengenalan gen normal atau diubah secara genetik dengan sel-sel, biasanya untuk mengganti yang cacat gen yang terlibat dalam gangguan genetik. DNA juga dapat dipotong menjadi fragmen yang lebih pendek melalui penggunaan enzim restriksi. (Enzim adalah sejenis protein yang mempercepat reaksi kimia.) Ujung-ujung fragmen ini memiliki afinitas untuk melengkapi berakhir pada fragmen DNA lainnya dan akan mencari mereka di DNA target. Dengan melihat ukuran fragmen diciptakan oleh enzim restriksi, peneliti dapat menentukan apakah gen tersebut memiliki kode genetik yang tepat. Teknik ini telah digunakan untuk menganalisis struktur genetik pada janin sel dan untuk mendiagnosa kelainan darah tertentu, seperti anemia sel sabit . Sel Germinal o Apa itu sel germinal ??? Sel germinal adalah sel khusus yang terlibat dalam reproduksi. Contoh yang paling terkenal dari sel germinal adalah gamet, maka sperma dan telur yang datang bersama-sama untuk menciptakan sebuah zigot yang dapat berkembang menjadi janin. Selain gamet, sejumlah sel lain yang terlibat dalam reproduksi juga kuman sel, termasuk gonocytes, sel-sel yang mengatur produksi telur dan sperma. Sel germinal membawa germline, bahan genetik yang organisme dapat menyampaikan kepada keturunannya. Pada manusia, sel germinal yang haploid , yang berarti bahwa mereka hanya membawa setengah jumlah kromosom yang diperlukan untuk menciptakan organisme. Ketika kuman sel

dari dua orang yang berbeda bertemu, bahan genetik haploid mereka menggabungkan untuk membuat sel-sel diploid yang dapat mereplikasi diri melalui pembelahan sel, pada akhirnya membangun bayi. Sel yang tidak membawa germline dari suatu organisme disebut sel-sel somatik . Sebagian besar sel-sel dalam tubuh Anda adalah sel-sel somatik. Sel somatik diploid, yang berisi semua informasi yang dibutuhkan untuk membuat suatu organisme, dan banyak dari mereka memiliki tugas khusus. Cacat pada sel somatik seperti kanker tidak dapat diteruskan kepada keturunannya, karena sel-sel somatik tidak terlibat dalam reproduksi. o Pendahuluan Multiseluler eukariota terbuat dari dua jenis sel dasar. Sel germinal menghasilkan gamet dan sel-sel hanya yang dapat mengalami meiosis serta mitosis . Sel-sel ini kadang-kadang dikatakan abadi karena mereka adalah hubungan antara generasi. somatik sel semua sel-sel lainnya yang membentuk blok bangunan tubuh dan mereka hanya bagi dengan mitosis. Garis keturunan dari sel germinal yang disebut garis kuman. Kuman spesifikasi sel dimulai selama pembelahan di banyak hewan atau di epiblast selama gastrulasi dalam burung dan mamalia . Setelah transportasi, yang melibatkan gerakan pasif dan migrasi aktif, sel germinal tiba di gonad berkembang. Pada manusia, diferensiasi seksual dimulai sekitar 6 minggu setelah pembuahan. Produk akhir dari siklus sel germinal adalah telur atau sperma. Dalam kondisi khusus in vitro sel germinal dapat memperoleh sifat mirip dengan embrio sel induk (ES). Mekanisme yang mendasari perubahan itu masih belum diketahui. Sel-sel ini berubah kemudian disebut sel germinal embrio (EG). Kedua EG dan ES adalah pluripotent in vitro, tetapi hanya ES telah terbukti pluripotency in vivo. Penelitian terbaru telah menunjukkan bahwa adalah mungkin untuk menimbulkan sel-sel germinal primordial dari ES.

TEKNIK REKAYASA GEN Teknik Mikroinjeksi Mikroinjeksi adalah teknik transfer gen yang paling populer digunakan pada ikan (Hacket, 1993). Menurut Stuart et al. (1988) dan Pandian et al. (1991) dalam Collas et al.(2000), metode transgenik dengan mikroinjeksi masih merupakan metode paling sukses untuk diterapkan pada ikan. Insersi DNA yang baik dilakukan pada fase satu sel karena ketika sel membelah maka kemungkinan semua sel turunannya akan membawa gen tersebut (Delvin, 1997). Konsentrasi DNA juga merupakan faktor penting yang mempengaruhi keberhasilan mikroinjeksi pada embrio ikan. Sejauh ini, konsentrasi DNA yang digunakan pada lele Afrika adalah 20g/ml (Volckaert et al.,1994)

y

Pengenalan Gen transfer teknologi dalam ikan telah membuat keuntungan besar diCades de terakhir. Ikan zebra (Danio rerio) dan medaka (Oryzia latipes) adalah organisme model baik membangun yang digunakan dalam penelitian biologi perkembangan untuk analisis proses perkembangan awal. Injeksi adalah salah satu metode terkemuka untuk produksi ikan transgenik. Dalam Application Note, kami menggambarkan persiapan sampel dan prosedur injeksi yang dilakukan dengan bantuan sebuah mikromanipulator InjectMan Eppendorf NI 2 di bawah mikroskop bedah standar.

y

Percobaan Embrio dikumpulkan terbaru 20 menit setelah kawin sukses atau segera setelah telur diletakkan dan dibuahi. Embrio tunggal ditransfer dan selaras ke dalam parit dari jenis plat cetakan injeksi agarosa menggunakan pipet Pasteur (sekitar 20 embrio / parit). Bertujuan untuk tes sementara atau untuk generasi jalur transgenik yang stabil, embrio harus berada pada tahap satu sel untuk hasil yang konsisten. Embrio Medaka dapat disuntikkan dalam medium pemeliharaan Yamamoto embrio, yang didinginkan sampai suhu 4 C untuk memperlambat pembangunan. Hal ini tidak perlu untuk menghapus korion sebelum injeksi, karena dapat dengan mudah ditembus dengan jarum injeksi. Namun, embrio cenderung bergerak dalam korion, sehingga setiap embrio harus berorientasi dengan benar sesaat sebelum injeksi. Probe persiapan dan loading Semua probe (DNA, RNA, pewarna) yang dua kali disentrifugasi dengan kecepatan penuh (min. 10.000 xg) selama 5 menit, 90% dari supernatan dipindahkan ke yang baru, bebas debu tabung probe diambil dari bagian belakang ke dalam api-dipoles jarum suntik (misalnya Eppendorf Femtotips, terbatas penggunaan) dengan Eppendorf Microloaders (2-5 ml).

y

1) DNA Untuk transgenesis, sistem meganuclease, DNA plasmid dipersiapkan dan dimurnikan menggunakan kit persiapan tinggi kemurnian plasmid. DNA konsentrasi dan kemurnian dapat diperiksa dengan spektrometri. Rasio A260/A280 harus antara 1,8-2,0. Untuk percobaan transgenesis, DNA adalah co-disuntik dengan meganuclease (I-SCEI). Karena stabilitas rendah meganuclease itu, aliquot larutan enzim harus disiapkan (misalnya 2 ml) pada saat kedatangan dan disimpan pada -80 C. Solusi injeksi harus dipersiapkan segera sebelum injeksi dan terus es. Medaka dan ikan zebra dapat disuntikkan dengan menggunakan suntikan solusi compositionof identik: DNA 10-20 ng / ml, I-SCEI penyangga 0.5x (opsional untuk Medaka: Yamamoto penyangga 0.5x), I-SCEI enzim 0,3 U / ml, DDH 2 O iklan 30 Hasil ml di Medaka ditingkatkan dengan penambahan buffer Yamamoto. Untuk hasil yang konsisten sangat penting untuk menyuntikkan ke dalam sitoplasma dari embrio dan tidak ke kuning telur. 250,500 pl (sekitar 1/6 dari volume sel) DNA plasmid pada konsentrasi 10 ug / ml (percobaan transgenesis) sampai 50 ug / ml (mosaik ekspresi transien) yang disuntikkan ke dalam sitoplasma embrio awal. 2) RNA y mRNA Capped disintesis secara in vitro menggunakan Ambion "mMessage mMachine" kit. y RNA dimurnikan melalui kolom pemurnian standar, diendapkan dan resuspended dalam RNase bebas air. y RNA disuntikkan dalam larutan Ringer 1x pada konsentrasi 50 ug / ml hingga 1 mg / ml (yaitu dari 25 pg sampai 500 pg RNA per sel). 3) Tracer pewarna Tracer pewarna seperti FITC-dekstran atau rhodamine-dekstran yang disuntikkan pada konsentrasi 1,5% dalam larutan Ringer 1x. Teknik Elektroporesis Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik. DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif. Molekul yang berukuran besar, memiliki kesulitan melewati poripori gel sehingga bermigrasi lebih

lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA. Dua alternatif macam gel adalah poliakrilamida dan agarosa. Poliakrilamida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya beberapa atau bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa). Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa. DNA yang berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel agarosa. DNA yang sangat besar melewati matriks dengan satu ujung bergerak lebih dulu sedang ujung lainnya mengikuti. Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 kb) bermigrasi dengan jarak yang sama sehingga tidak dapat diamati pemisahannya. DNA yang sangat panjang ini dapat dipisahkan satu sama lainnya dengan jika daerah listrik diaplikasikan dalam pulses yang berasal secara orthogonal satu sama lainnya. Teknik ini disebut pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) o Sejarah Dasar pembuatan elektroresis adalah untuk memisahkan asam nukleat berdasarkan ukuran (prisipnya sama dengan elektroforesis pada protein). Intinya sebuah gel yang berisikan buffer dibentuk untuk melalui sebuah muatan molekul dan asam nukleat yang berada digel dialiri arus listrik. pH, muatan molekul negatif DNA dihasilkan dari gugus phosphate pada tulang punggug DNA, jadi arus listrik membawa muatan negatif DNA menutu kutup katoda elektroforesis. Arus listrik bermuatan positif menarik molekul DNA negate sehigga DNA akan berpisah, molekul dengan massa kecil dan negatif besar akan mudah untuk berpindah. Olehkarena itu, Kekuatan per unit massa dalam molekul dan untuk itu pada perpindahan kekutup anoda berhubungan dengan berat molekul. Jika tanpa hambatan semua molekul dapat memisah, karena itu perpindahan dalam wadah mempunyai kecepatan yang sama. Bagaimanapau juga, matriks gel menghambat dari pergerakan molekul. Secara umum dilibatkan dalam reaksi. Molekul lurus dan kecil pastinya akan mudah melalui matriks gel dengan cepat. Elektroforesis juga berkaitan dengan waktu dalam visualisasi DNA berkaitan dengan pewarnaan dan pencucian dengan etidium bromide atau autoradiografi untuk DNA radioaktif. Tentusaja pengkonversian dari posisi standart yang sudah diketahui ukurannya pada gel yang sama diperlukan, pada ukuran molekul digunakan untuk analisis (misalkan hasil sebuah potongan dari enzim restriksi. Secara empiris, untuk DNA lurus membentuk grafik dari jarak perpindahan pada alogaritma dari ukurannya dan memberikan sebuah kekuatan garis yang melebihi ambang batas kerasioalaan. Untuk molekul yang melingkar berhubungan dengan pengambatan gel matriks

pada parameter topological moleku, berbeda bentuk topologui yang bagus dengan molekul yang mobil, tetapi ukurannya tidak dapat diandalkan.

Teknik Gun Bombardment Sebuah pistol gen atau sistem partikel biolistic pengiriman, awalnya dirancang untuk tanaman transformasi , adalah alat untuk menyuntikkan sel dengan genetik informasi. Payload adalah sebuah unsur partikel dari logam berat dilapisi dengan plasmid DNA . Teknik ini sering hanya disebut sebagai bioballistics atau biolistics. Perangkat ini mampu mengubah hampir semua jenis sel, termasuk tumbuhan, dan tidak terbatas pada materi genetik inti: itu juga dapat mengubah organel, termasuk plastida .

o Manusia dan hewan Senjata gen juga telah digunakan untuk memberikan vaksin DNA . Pengiriman plasmid ke dalam neuron tikus melalui penggunaan pistol gen, neuron khusus DRG, juga digunakan sebagai prekursor farmakologis dalam mempelajari efek dari penyakit neurodegenerative seperti penyakit Alzheimer. Teknik pistol gen juga populer digunakan dalam teknik produksi vaksin yang dapat dimakan, di mana nano-partikel emas dilapisi dengan bahan genetik tanaman dalam ruang vakum bertekanan tinggi berubah menjadi jaringan tanaman yang cocok. Pistol gen telah menjadi alat umum untuk pelabelan subset sel dalam jaringan berbudaya. Selain bisa transfect sel dengan plasmid DNA yang mengkode protein neon, pistol gen dapat disesuaikan untuk memberikan berbagai macam pewarna penting untuk sel. Gene penembakan pistol juga telah digunakan untuk mengubah C. elegans , sebagai alternatif untuk injeksi . Perkembangan Rekayasa Genetika Sejak dimulainya perkembangan rekayasa genetika, beberapa teknik terus diperbaiki dan ditingkatkan dalam rangka menuju teknologi DNA rekombinan yang lebih maju. Teknik-teknik yang telah dikembangkan tersebut antara lain: (1) poliploidisasi, (2) androgenesis dan (3) ginogenesis. (4) kloning, (5) chimeras, serta (6) transgenik. Beberapa tahapan yang perlu dilakukan dalam melakukan rekayasa genetika atau teknologi DNA rekombinan sebagai berikut: 1. Isolasi DNA yang mengandung gen target atau gen of interest (GOI). 2. Isolasi plasmid DNA bakteri yang akan digunakan sebagai vektor. 3. Manipulasi sekuen DNA melalui penyelipan DNA ke dalam vektor. (a.) Pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi endonuklease. (b.) Penyambungan ke vektor menggunakan DNA ligase. 4. Transformasi ke sel mikroorganisme inang. 5. Pengklonan sel-sel (dan gen asing). 6. Identifikasi sel inang yang mengandung DNA rekombinan yang diinginkan 7. Penyimpanan gen hasil klon dalam perpustakaan DNA.

Rekayasa genetika telah merambah di berbagai bidang, tidak terkecuali bidang perikanan yang menghasilkan ikan kualitas unggul, sebagai contoh antara lain:y

y

y y

y

Ikan zebra yang biasanya berwarna perak dengan garis-garis hitam keunguan, setelah disisipi dengan gen warna ubur-ubur yang disuntikkan ke telur ikan-ikan zebra maka dapat memendarkan warna hijau atau merah dari tubuhnya. Gen pemicu dari ubur-ubur akan mengaktifkan pancaran cahaya pada ikan bila ikan berada dalam lingkungan yang mengandung bahan polutan tertentu. Ikan karper transgenik dengan pertumbuhan mencapai tiga kali dari ukuran normalnya karena memiliki gen dari hormon pertumbuhan ikan salmon (rainbow trout) yang ditransfer secara langsung ke dalam telur ikan karper. Begitu pula penelitian lainnya memberikan hasil yang serupa, yakni seperti pada ikan kakap (red sea bream) dan salmon Atlantik yang juga sama-sama disisipi oleh gen growth hormone OPAFPcsGH. Ikan goldfish yang disisipi dengan ocean pout antifreeze protein gene diharapkan dapat meningkatkan toleransi terhadap cuaca dingin. Ikan medaka transgenik yang mampu mendeteksi adanya mutasi (terutama yang disebabkan oleh polutan) sangat bermanfaat bagi kehidupan hewan akuatik lainnya dan di bidang kesehatan manusia. Ikan tersebut setelah disisipi dengan vektor bakteriofag mutagenik, kemudian vektor DNA dikeluarkan dan disisipkan ke dalam bakteri pengindikator yang dapat menghitung gen mutan. Ikan transgenik menjadi tahan lama dan tidak cepat busuk dalam penyimpanan setelah ditransplantasikan gen tomat. Namun bisa juga sebaliknya apabila penerapan ditujukan untuk dunia pertanian, maka gen ikan yang hidup di daerah dingin dapat dipindahkan ke dalam tomat untuk mengurangi kerusakan akibat dari pembekuan.

Kontroversi dalam Rekayasa Genetika Berbagai kontroversi menyelimuti produk-produk hasil rekayasa genetika. Kekhawatiran-kekhawatiran mengenai produk rekayasa genetik yang memiliki kemungkinan bersifat racun, menimbulkan alergi serta terjadi resistensi terhadap bakteri dan antibiotik selalu terjadi dalam masyarakat. Memang DNA rekombinan yang diproduksi dengan cara buatan itu dapat berbahaya jika tidak disimpan secara layak dan tindakan pencegahan yang ketat perlu diterapkan pada pekerjaan semacam ini. Jadi hanya galur-galur non-patogenik yang dipergunakan sebagai inang atau galur-galur lain yang dapat tumbuh dalam kondisi laboratorium. Namun demikian, hal ini tidaklah menyurutkan para saintis untuk terus memperbaiki kualitas penelitian di bidang rekayasa genetika semata-mata adalah demi kemaslahatan bersama. Pada akhirnya, kita harus mempertimbangkan masalah-masalah sosial, etika dan moral ketika teknologi gen menjadi lebih ampuh.

Aplikasi Rekayasa Genetika di Bidang Perikanan Ikan zebra berflourescent selain digunakan untuk mempelajari penyakit selular dan perkembangan ikan, juga dapat digunakan untuk membantu permasalahan lingkungan. Dengan memasukkan gen fluorescent ke dalam tubuh ikan, para peneliti yakin bahwa ikan ini dapat dengan cepat mendeteksi kontaminasi di perairan. Tahap awal yang digunakan untuk menghasilkan ikan yang dapat medeteksi polutan adalah dengan menyisipkan gen fluorescent ke dalam tubuh ikan tersebut. Mengapa dalam penelitian ini menggunakan ikan zebra bukan jenis ikan lain? mungkin pertanyaan itulah yang kali pertama muncul di benak kita.

Peneliti memilih ikan zebra dalam penelitian ini karena, 1. Ikan zebra merupakan ikan tropis yang secara umum hidup di wilayah Asia Tenggara; 2. Ukuran tubuh ikan zebra dewasa berukuran kecil, sehingga lebih hemat tempat; 3. Waktu generasinya cepat, hanya dalam waktu 3-4 bulan; 4. Sekali bertelur, menghasilkan ratusan telur dalam 1 minggu; 5. Ikan zebra memiliki kombinasi genetic yang unik, sehingga memungkinkan untuk digunakan untuk mempelajari perkembangan ikan.

Metode yang digunakan untuk menghasilkan ikan fluorescent ini adalah metode mikroinjeksi. Gen fluorescent disisipkan ke dalam sel sperma ikan, kemudian sperma tersebut dimikroinjeksikan ke dalam sel telur. Kemudian

akan terjadi pembuahan dan dihasilkan zigot. Zigot tersebut akan membelah menjadi 2, 4, 8,16 dst. Zigot tersebut kemudian ditumbuhkan hingga menjadi seekor ikan transgenic berflourescent. Sumber : Presentasi Mata Kuliah Bioteknologi Hewan FMIPA Universitas Al Azhar Indonesia, 2008.