PT 11 Elektroforesis Aphp 2 (1)

ELECTROPHORESISELECTROPHORESIS

Department of Food and Agricultural Products Processing Technology

Faculty of Agricultural Technology Gadjah Mada University

Jalan Flora No. 1, Sleman, Yogyakarta 55281 Indonesia

Yunika Mayangsari, S.Si., M. Biotech 2012

Warming up

� Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya

dalam sebuah medan listrik.

� Prinsip kerja :

Sifat partikel bermuatan

� Bergerak ke kutub yang berlawanan

dengan muatannya (partikel/ion positif

bergerak ke katoda dan sebaliknya)

� Perbedaan muatan dan ukuran partikel

mengakibatkan laju bergerak berbeda �

terjadi pemisahan

Na+

+

Cl-

–

cathode anode

Jenis elektroforesis

�Elektroforesis kertas dan Selulosa Asetat

Elektroforesis Kertas dan

Selulosa Asetat (lanj.)�Prinsip kerja keduanya sama, perbedaan

pada media penyangga

�Berperan pada pemisahan protein atas dasarmobilitasnya pada pH tertentu

�Pada titik isoelektriknya, protein tidak akan bergerak dalam medan listriknya.

�Titik isoelektrik ??

Elektroforesis Kertas dan

Selulosa Asetat (lanj.)� Elektroforesis Kertas, menggunakan kertas

saring sebagai medium penyangga, sesuai untuk latihan � murah ; kelemahan : lama (running semalam) dan pemisahan kurang baik.

� Elektroforesis Selulosa Asetat, selulosa asetat sebagai medium penyangga, keuntungan: elusi lebih baik, shg pemisahan lebih baik, running lbh cepat dibanding kertas (1 jam).

�Elektroforesis gel

�Matriks berupa polimer berpori

�Ukuran pori (konsentrasi materi polimer) menentukan nilai koefisien gesekan (f) � semakin besar prosentase gel semakin kecil ukuran pori

�Matriks yang biasa digunakan:� Poliakrilamida

� Agarose (polisakarida)

Struktur agarose dan poliakriamida

Aplikasi

�Elektroforesis

�Analisis protein (ukuran) � SDS-PAGE

�Analisis DNA (ukuran, sekuensing)� Agarose

APPLICATION OF

Electrophoresis Gel

� Separation of protein

mixture

� Separation of glycoprotein

� Lipids separation

� Nucleic acid (DNA, RNA)

� Enzymes mixture

separation

10

Analisis protein (SDS-PAGE)�Molekul Protein

• Muatan bervariasi• Muatan per massa bervariasi

Elektroforesis Gel Poliakrilamida

Sodium Dodesil Sulfat (SDS – PAGE)� Digunakan secara luas untuk analisis protein �

lebih menguntungkan dibanding kertas danselulosa asetat � pemisahan lebih baik

� Medium penyangga : hasil polimerisasi akrilamidadan bis-akrilamida, dengan katalis amoniumpersulfat (APS) dan tetrametilendiamin (TEMED)

� Pada sampel protein, ditambahkan SDS danmerkaptoetanol untuk merusak struktur 3 dimensiprotein � (remember: reduksi ikatan …?)

Elektroforesis Gel Poliakrilamida

Sodium Dodesil Sulfat (SDS – PAGE)

(lanj.)

�Pemisahan molekul didasarkan padaperbedaan berat molekul.

�Konsentrasi akrilamid menentukan ukuranpori yang terbentuk, makin rendahkonsentrasi akrilamid yang digunakan,makin besar ukuran pori gel, gel semakinlunak dan mudah rapuh.

� Hubungan antara konsentrasi akrilamid dan pori-pori (sumber : Kurniawati dan Wanandi, 2001)

% Poliakrilamid Ukuran pori (nm)

3 4.4

5 3.6

10 2.6

20 1.8

30 1.3

SDS (sodium dodesil sulfat)� SDS berfungsi menghilangkan perbedaan muatan dan

perbedaan konformasi diantara protein-protein yang ada pada sampel, dengan cara memberikan muatan negatif.

� Pemanasan sampel dilakukan untuk tahap denaturasi protein. (remember biokimia dasar: denaturasi??)

� Kompleks SDS-polipeptida berbentuk seperti batang dan bermuatan negatif, muatan tidak dipengaruhi pH (kisaran pH 7-10)

� Sehingga, migrasi polopetida hanya berdasarkan berat molekulnya. Makin besar berat molekul, makin lambat migrasinya dalam gel elfo.

Sistem Buffer

� Buffer digunakan untuk menjaga kestabilan pHmedium pada elfo

� Pada umumnya inert, akan tetapi buffertertentu, co: borat, dapat membentuk kompleksdengan medium seperti pati, sehingga tdk tepatdigunakan untuk elfo

� Biasanya digunakan konsentrasi 0,05 – 0,10 M� semakin besar molaritas , semakin tajamzona pemisahan yang dihasilkan, akan tetapiwaktu pemisahan lebih lama

� Sodium phosphate buffer has higher ionicstrength than tris-hydrochloride buffer

� µ = ionic strength ; m = molarity of an ion ; c =the charge carried by the ion

2

2

1cm=µ

SDS-PAGE : Sistem Buffer

Diskontinyu

�Sistem buffer yang umum digunakan pada SDS-PAGE adalah sistem buffer Diskontinyu

�Sistem ini menggunakan ion buffer sample (Komposisi dan pH) yang berbeda dalam gel dengan larutan buffer elektroda.

�Keunggulan : pemisahan protein berlangsung lebih baik dan lebih tajam

Gel elektroforesisGel yang digunakan dalam sistem ini terdiri atas gel

penumpuk (Stacking gel) yang berpori besar dan Gelpemisah (separating gel/ resolving gel) yang berporilebih kecil.

Molekul sampel yang melewati gel penumpuk berada diatas gel pemisah dan sampel diletakkan di atas gelpenumpuk.

Sampel yang tertumpuk (stacked) pada gel penumpuk(pori besar), setelah dialirkan arus listrik makamolekul akan bergerak melewati pori-pori gelpemisah, dan terpisahkan berdasar BM.

Recipe for Discontinuous SDS PAGE(example)

Stock solution Stacking gel Gel concentration, % Reservoir buffer, ml

20.0 10.0 5.0

Acrylamide-bisacrylamide

(30:0.8)

2.5 20.0 10.0 5.0

Stacking gel buffer stock 5.5 - - - -

Resolving gel buffer stock - 3.75 3.75 3.75 -

Reservoir buffer stock - - - - 100

10% SDS - 0.3 0.3 0.3 -

1.5% ammonium

persulfate

0.2 1.5 1.5 1.5 -

Water 11.3 4.45 14.45 19.45 900

TEMED 0.015 0.015 0.015 0.015 -

Stacking gel : 0.0125M Tris-HCl, pH 6.8

Resolving gel : 0.375M Tris-HCl, pH 8.8

Resolving buffer : 0.025M Tris, 0.192M glicine, pH 8.3

08.01.14 suwedo hadiwiyoto : elektroforesis 19

Separating Gel Preparation

� Prepared all reagents needed

� Mix all except ammonium persulfate and

TEMED

� Degassed the solution under a vacuum to

prevent air bubbles during polymerization

� Add ammonium persulfate and TEMED, soon

the gel is ready to be polymerized

� Before the gel polimerizes, introduce solution

into gel sandwich using pipet as soon as

posible

� Stop when gel solution reach about 1.5 cm from

top of front plate or 0.5 cm below level where

teeth of comb will reach

� Gently layer about 1 cm of water on top of

separating gel solution

� Allow gel to polymerize, 30-60 minutes


Stacking Gel Preparation

� Prepare all reagents need for stacking gel

� Pour off water covering separating gel

� Mix all reagents except ammonium persulfate

and TEMED

� Degassed the solution under a vacuum to

prevent air bubbles during polymerization

� Add ammonium persulfate and TEMED, soon

the gel is ready to be polymerized

� Before the gel polimerizes, pipet stacking gel

solution onto separating gel until solution

reaches top of front plate

� Carefully insert comb into gel sandwhich

until bottom of teeth reach top of front plate


SAMPLE PROTEIN PREPARATION

� Sample must be protein isolate

� To prepare a sample protein :

� Extraction

� Determination of protein content

� Concentrating protein solution

� Protein extraction :

� Samples may be taken from whole tissue or from cell culture. In most cases,

solid tissues are first broken down mechanically using a blender, homogenizer,

or by sonication

� A combination of biochemical and mechanical techniques – including various

types of filtration and centrifugation – can be used to separate different cell

compartments and organelles



� Determination of protein content :

� Absorbance at 280 nm (absolute method; rapid method)

� Bradford (biorad) assay : reaction of bradford reagent (serva

blue G) with protein gives a blue color which can be measured at

595 nm. The standar curve for the assay is bovin serum albumin

(BSA)

� Lowry assay : reaction of lowry reagent (folin-ciocalteu phenol)

with protein gives a blue color which can be measured at 750 nm.

The standar curve for the assay is bovin serum albumin (BSA)

� Bicichoninic acid (BCA) assay : reaction of BCA and protein

gives a blue color which can be measure at 562 nm. The standar

curve for the assay is bovin serum albumin (BSA)



� Concentrating sample protein :

� Using trichloro acetic acid (TCA)

� Sample and TCA solution is mixed, incubated in ice for 30 minutes.

The prcipitate protein is collected by centrifugation, washing with

ethanol-ether (1:1) to remove TCA

� Using organic solvent : acetone

� Cold acetone is added to sample, mixed, and incubated at -20oC for

10 minutes. The precipitae protein is collected by centrifugation

(10.000 x g for 5 minutes)

� Polyethylene glycol (PEG) precipitation : solution of 50%

polyethylene glycol

� Ultrafiltration

� Lyophylization (freeze drying)


Loading sample

� The solution of proteins to be analyzed is mixed with SDS, an anionic detergent which denatures secondary and non–disulfide–linked tertiary structures, and applies a negative charge to each protein in proportion to its mass. Heating the samples to at least 60oC shakes up the molecules, helping SDS to bind

� Spin down protein solution for 1 second

� Introduce sample solution into well using syring. Be careful to avoid introducing air bubbles as this allow some of sample to be carried to adjacent well

Note :

� A tracking dye may be added to the protein to allow the experimenter to track the progress of the protein solution through the gel during the electrophoretic run

� Precipitation of protein in sample buffer may be due to denatured protein, too litle SDS, too litle reducing agent, overlay acidic condision, or presence of pottasium which precipitates SDS


Running a gel

� Attached electrode plugs to

proper electrodes

� Turn on power supply and set

the voltage to 200 V and tyhe

ampere about 60-110 mA

depend on gel thickness

� Turf off power supply

� Remove electrode plugs from

electrodes

� Carefully remove a spacer


STAINING

� Protein :

� Coomassie blue R250 stain : coomassie blue R-250, methanol, glacial acetic

acid

� Silver stain : silver nitrate, NaOH, ammonium hydroxide, citric acid,

formaldehyde

� Glycoprotein: basic fuchin – sulfite stain

� Lipids : sudan black B. Staining is carried out before electrophoresis

� Nuclein acid :

� RNA with pyronine Y : pyronine Y, lanthanum acetate, acetic acid, methanol

� Native DNA with methylene green : methylene green, acetate buffer pH 4,1

� Denatured DNA with pyronine B


Staining and destaining a gel

with coomassie blue

� Pick up the gel and transfer it into a small

container containing coomasie stain solution

� Agitate for 5-20 minutes depend upon the gel

thickness

� Cover container with lid or plastic wrap during

staining and destaining

� Pour out stain and rinse the gel with water

� Add commasie destain and agitate overnight

� Rinse the gel with water



STAINING WITH COOMASSIE BLUE STAINING WITH SILVER NITRATE

Gel elektoforesis

SEE YOU NEXT MEETING

IDENTIFICATION / INTERPRETATIONCalculate retardation factor (R

f) of sample and standard

If Rfsample and R

fstandard is same then it can be assumed sample is same with standard


Gel Agarosa (Identifikasi

DNA/RNA)� Gel ini tersusun atas agarosa.

� Agarosa untuk kualifikasi fragmen-fragmen DNA dengan rentang ukuran beberapa ratus hingga 20.000 kb.

� Agarosa tidak bersifat toksik, kompleks berupa bubuk yang terdiri dari campuran polimer dengan 2 unit dasar galaktosa, agarosa dan agaropektin.

� Agarosa dilarutkan dalam cairan buffer mendidih dan akan membentuk gel pada suhu sekitar 38 derajad C.

� Pada konsentrasi 1% w/v gel dalam bufer yang mengandung air dalam kadar tinggi, struktur seratnya baik, ukuran porinya besar dan tahan terhadap gesekan.

� Molekul DNA bermuatan negatif di dalam medan listrik dan molekul DNAbergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda bergantung pada ukurannya.

� Keuntungan : DNA dapat dideteksi

• DNA bermuatan negatif.

+-

Power

DNA��

• Jika diletakan pada medan listrik, DNA bergerak ke kutub positif

(anode).

• Gel agarose digunakan untuk memperlambat gerakan DNA dan terpisah

berdasarkan ukurannya.

Scanning Electron Micrograph of

Agarose Gel (1×1 µm) �

• Gel agarose berpori-pori, DNA

bergerak melewati

+-

Power

DNA

Seberapa cepat DNA migrasi?

Kekuatan medan listrik, bufer, konsentrasi gel agarose

ukuran DNA!

*DNA berukuran kecil bergerak lebih cepat daripada DNA yg panjang

elektroforesis memisahkan DNA berdasarkan ukurannya

kecil

besar

Membuat Gel Agarose

Gel agarose dibuat dengan

mendidihkan serbuk agarose dalam

larutan bufer.

Agarose�

Bufer�

Labu utk mendidihkan�

Casting tray�

Sisir Gel �

Power supply�

Tangki Gel � �Tutup

Kabel

�

Electrophoresis Equipment

Gel casting tray & combs

Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting

tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the

surface of the casting tray.

Preparing the Casting Tray

Agarose Larutan bufer

Campur serbuk agarose dan larutan bufer. Use a flask that is

several times larger than the volume of buffer.

Agarose tidak larut pada suhu kamar (kiri).

Larutan itu dididihkan sampai jernih (kanan).

Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose

to dissolve.

***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and

may boil violently if it has been heated too long in a microwave oven.

Membuat Gel Agarose

Diamkan larutan agarose mendingin (~60ºC) dan kemudian

tuangkan dalam cetakan. Jangan sampai ada gelembung

udara.

Menuangkan gel

Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.

Ketika dingin, agarose polimerisasi, membentuk gel yg fleksibel.

Setelah dinging (30-45 minute) gel berwarna agak putih. Hati-hati copot

sisir dan selotape.

Letakkan gel dalam alat elektroforesis.

buffer �

Tuangkan bufer sehingga diatas gel +/- 1 mm. Cak setiap

sumuran terisi bufer.

Cathode

(negative)

Anode��

(positive)

wells

DNA�

6X Loading Buffer: �

• Bromophenol Blue (for color)

• Glycerol (for weight)

Preparasi Sample

Campur sample DNA dengan bufer sampel. Ini memudahkan sampel

masuk kedalam sumuran, karena adanya gliserol yg memperberat

sampel.

Memasukkan sampel ke Gel

Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample.

The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the

gel with the pipette tip.

Letakkan penutuo, hubungkan dengan kabel, hubungkan dengan power

supply. Cek kabel terhubungkan dengan benar - DNA migrasi ke anode

(merah). Jika dihidupkan, terbentuk gelembung pada elektrode

Running the Gel

wells

Bromophenol Blue

Cathode

(-)

Anode

(+)

Gel

Setelah dihidupkan, cek bahwa warna bergerak pada arah yg benar.

Bromophenol blue bergerak serah dg DNA.

DNA

(-)

�

100

200 300

1,650

1,000

500

850

650

400

12,000 bp

5,000

2,000

Standar tangga DNA

Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to

determine the sizes of unknown DNAs.

-

+

DNA

migration

bromophenol blue�

Note: bromophenol

blue migrasi = 300 bp

DNA

PT 11 Elektroforesis Aphp 2 (1)

Documents

Transcript of PT 11 Elektroforesis Aphp 2 (1)