PROSES HILIR PRODUKSI PENICILLIN

Hari Soesanto

PROSES HILIR PRODUKSI PENICILLIN

Sejarah Penicillin

Penicillin adalah salah satu antibiotika grup beta-lactam yang digunakan dalam

pengobatan infeksi oleh bakteri yang biasanya golongan gram positif. Penemuan

penicillin pertama kali dilakukan oleh Alexander Fleming pada tahun 1928. Penicillin

tersebut kemudian diketahui diproduksi oleh sejenis jamur Penicillium notatum. Sejak

penemuan Fleming, pada tahun 1929, ditemukan bahwa penicillin dapat dihasilkan dari

beberapa varietas mold dan memiliki karakteristik antibiotika yang hampir sama dengan

penicillin.

Dengan mengikuti percobaan Fleming, Clutterbuck, Lovell, dan Raistrick

meneliti kimia penicillin. Hasil penelitian mereka pada tahun 1932, mengindikasikan

bahwa penicillin adalah suatu asam organic yang dapat diekstraksi dengan pelarut

organic dari suatu campuran cairan dengan pH yang rendah, tetapi zat itu sangat labil

terhadap ion hydrogen, dan panas. Rendemen yang diperoleh saat itu sangat kecil yaitu

kurang dari 1%. Delapan tahun kemudian, yaitu pada tahun 1940, Chain dan Florey,

melakukan investigasi ulang penicillin. Mereka menanamkan organisme Fleming pada

media permukaan dengan skala pilot plant yang kecil. Dengan menjaga suhu yang rendah

selama proses ekstraksi, mereka dapat memperoleh konsentrasi penicillin yang lebih

tinggi dan menghasilkan bubuk kering (dry powder), dalam bentuk garam penicillin,

dimana memiliki kestabilan yang lebih baik dalam penyimpanan. Hasil ini menunjukkan

perkembangan yang besar dalam produksi penicillin.

Florey dan Chain mendapatkan hadiah nobel dalam bidang obat-obatan bersama

Fleming, dan setelah perang dunia II, Australia adalah negara pertama yang menyediakan

penicillin untuk penggunaan sipil. Penicillin kemudian menjadi antibiotika yang

digunakan secara luas di seluruh negara hingga sekarang.

Hari Soesanto

Kegunaan Terapi Penicillin

Penicillin tanpa diragukan merupakan obat yang luar biasa sejak penemuannya

untuk pengobatan infeksi. Aktivitasnya yang tinggi, dikombinasikan dengan non-toksik,

membuatnya menjadi obat pilihan untuk pengobatan pada kebanyakan kondisi penyakit

yang disebabkan oleh organisme merugikan.

Penicillin aktif terhadap mikroorganisme gram positif dan inaktif terhadap bakteri

gram negatif. Penicillin diketahui efektif melawan strain patogen dari genera :

Micrococcus, Streptococcus, Diplococcus, Neisseria, Clostridium, Treponema, Borrelia,

Leptospira, Corynebacterium, Bacillus, dan Actinomyces. Sebagai tambahan, beberapa

strain dari mikroorganisme tipe lain, termasuk virus dan Rickettsia (seperti

Miyagawanella psittacii) juga ada yang sensitif terhadap penicillin. Secara umum,

penicillin tidak efektif melawan genera seperti Escherichia, Aerobacter, Klebsiella,

Proteus, Salmonella, Shigella, Pasteurella, Eberthella, Pseudomonas, Vibrio, Brucella,

Hemophilus, Mycobacterium, Rickettsia, dan ragi-ragian, jamur, dan virus.

Dosis yang cukup untuk penicillin bervariasi dari 50.000 unit, pengobatan dosis

tunggal untuk gonorrhea sampai beberapa juta unit per hari selama periode yang cukup

panjang dalam pengobatan endocarditis bakteri subakut.

Penicillin dapat digunakan secara oral atau injeksi. Ketika digunakan secara oral,

dosisnya harus lebih besar (setidaknya lima kali) karena akan terjadi kerusakan penicillin

di dalam lambung dan penyerapan penicillin yang bervariasi. Ketika digunakan secara

injeksi maka pilihan melalui jalur intramuskular dapat dilakukan.

Beberapa jenis garam dari penicillin banyak digunakan pada saat ini. Garam

potassium, sodium, dan kalsium adalah garam-garam yang larut baik dalam air. Garam

kalsium belum dapat dikristalkan dan tersedia hanya dalam bentuk kasar, bentuk amorph.

Garam potassium kristal dari penicillin G adalah yang paling banyak digunakan dan

tersebar secara luas karena biaya pembuatan yang lebih rendah dibandingkan dengan

garam kristal sodium ataupun bentuk amorph lainnya. Hal ini menjadi suatu contoh

bahwa substansi kristal murni relatif lebih murah untuk diproduksi daripada komponen

yang amorph.

Hari Soesanto

Karakteristik Penicillin

Penicillin merupakan campuran asam organik berstruktur komplek yang diisolasi

sebagai garam-garam natrium, kalium dan kalsium, seperti yang ditunjukkan pada

Gambar 1. Penicillin dihasilkan selama pertumbuhan dan metabolisme kapang

Penicillium notatum dan P. chrysogenum. Kultur yang sama dapat menghasilkan

beberapa macam molekul penicillin antara lain penicillin G dan penicillin V. Penicillin G

merupakan penicillin yang paling banyak diproduksi secara komersial dewasa ini. Pada

Gambar 1 diperlihatkan gambar struktur kimia penicillin.

Gambar 1. Struktur Kimia Penicillin

Klasifikasi Penicillin.

Berdasarkan sifat kimia yang menonjol dibedakan ke dalam 5 kelompok sebagai

berikut :

1. Penicillin alami.

Misalnya penicillin-G, yang dihasilkan dari biakan jamur yang diekstraksi dan

kemudian dimurnikan. Kalau diberikan secara oral kelompok penicillin ini cepat

mengalami hidrolisis oleh asam lambung

2. Penicillin yang tahan asam, termasuk asam lambung.

Kelompok penicillin ini memiliki gugus phenoxyl yang terikat oleh gugus alkyl

dari rantai acylnya. Dalam kelompok ini terdapat Phenoxy-methyl-penicillin, Phenoxy-

aethyl-penicillin, Phebenicillin, Amoxicillin dan Ampiciliin.

3. Penicillin yang tahan terhadap enzim penicillinase (β laktamase).

Hari Soesanto

Yang disebabkan oleh penggantian cincin aromatis untuk melindungi cincin

β laktam. Termasuk kelompok ini adalah Methicillin, Azidocillin dan Pirazocillin.

4. Penicillin yang tahan asam dan enzim penicillinase.

Termasuk kelompok ini meliputi Oxacillin, Nafcillin, Cloxacillin, Quinacillin

dan Dicloxacillin.

5. Penicilin yang memiliki spektrum anti bakterial luas terhadap kuman gram positif dan

negatif.

Termasuk kelompok ini adalah Ampicillin, Carbenicillin, Epicillin, Suncillin,

Hetacillin dan Carfecilin.

Mekanisme Kerja Penicillin

Dinding sel kuman terdiri dari suatu jaringan peptidoglikan, yaitu polimer dari

senyawa amino dan gula, yang saling terikat satu dengan yang lain (crosslinked) dan

dengan demikian memberikan kekuatan mekanis pada dinding. Penicillin dan

sefalosporin menghindarkan sintesa lengkap dari polimer ini yang spesifik bagi kuman

dan disebut murein. Bila sel tumbuh dan plasmanya bertambah atau menyerap air dengan

jalan osmosis, maka dinding sel yang tak sempurna itu akan pecah dan bakteri musnah.

Penicillin bersifat bakterisid dan bekerja dengan cara menghambat sintesis dinding sel.

Obat ini berdifusi dengan baik di jaringan dan cairan tubuh, tapi penetrasi ke dalam

cairan otak kurang baik kecuali jika selaput otak mengalami infeksi. Obat ini diekskresi

ke urin dalam kadar terapeutik. Probenesid menghambat ekskresi penicillin oleh tubulus

ginjal sehingga kadar dalam darah lebih tinggi dan masa kerjanya lebih panjang.

Penicillin berpengaruh terhadap sel yang sedang tumbuh dan hanya berpengaruh kurang

berarti terhadap kuman yang sedang tidak aktif tumbuh (dorman).

Produksi Penicillin

1. The Surface-Culture Fermentation

Metode surface-culture untuk produksi komersial penicillin tidak lagi digunakan

di USA atau Inggris tapi metode ini adalah metode produksi komersial pertama

Hari Soesanto

penicillin. Metode ini memang mahal, memerlukan tenaga kerja yang banyak, secara

ekonomis dan komersial kurang begitu menguntungkan.

Sudah diketahui bahwa metode pertama untuk memproduksi penicillin secara

komersial adalah melalui surface process, dimana metode ini berdasarkan pada

kecenderungan alami mold untuk tumbuh sebagai lapisan tipis pada permukaan media

cair. Banyak variasi dari proses ini, seperti tipe kontainer yang digunakan untuk

pertumbuhan mold yang dikembangkan berbeda-beda oleh laboratorium-laboratorium.

Persyaratan utama untuk kultivasi mold dengan kondisi permukaan yaitu kedalaman

media harus kurang lebih 2 cm. Unit-unit produksi dibuat dari berbagai tipe botol, labu,

dan rak-rak dari logam atau gelas.

Kultur massa spora dari strain yang sesuai dari Penicillium (NRRL 1249-B21,

NRRl 1951-B25 dan lainnya) diproduksi pada agar slant yang besar dalam botol-botol.

Jika diinginkan, suspensi cair dari spora tersebut dapat disiapkan dengan menambahkan

air steril ke dalam kultur spora dan dilakukan pengadukan untuk memecahkan clump

spora dan mencampurkannya ke dalam air. Media steril dalam kontainer yang sesuai

diinolkulasi dengan cara menyemprotkan suspensi spora ke kontainer atau dengan cara

menambahkan beberapa mililiter suspensi tersebut dengan pipet. Setelah inokulasi,

media lalu diinkubasi pada suhu 240C sampai 280C selama 6 sampai 7 hari. Biasanya,

produksi maksimun penicillin diperoleh pada periode ini dan kultur kemudian dipanen.

Kontainer dikosongkan dan broth dikumpulkan, setelah pemisahan mold. Rendemen

maksimum diperoleh pada lot kedua media beberapa hari lebih awal daripada fermentasi

pertama. Prosedur ini dapat diulang beberapa kali.

Banyak kesulitan dalam operasi dari unit produksi industri yang menggunakan

surface-culture process yang luar biasa. Pada berapapun volume produksi diperlukan

banyak sekali kontainer, inkubator yang besar, tenaga kerja yang banyak, dan investasi

yang relatif besar pada bangunan dan peralatan pendukung. Beberapa pabrik menangani

50.000 botol atau lebih setiap harinya. Meskipun pabrik-pabrik menggunakan tray-tray

untuk memproses ribuan botol tersebut per hari untuk mencapai produksi yang signifikan,

dan melibatkan bahan-bahan yang tidak sedikit, ruang, dan tenaga kerja yang digunakan

dalam pabrik surface-culture, produksi harian dari media fermentasi diatur hanya

beberapa ribu galon. Masalah sterilisasi pada metode ini juga menjadi masalah yang

Hari Soesanto

besar yang membuat metode ini menjadi tidak layak untuk produksi besar skala

komersial. Karena begitu besarnya kesulitan yang dihadapi dan kerugian-kerugian pada

proses ini, proses lain yang lebih baik yaitu submerged-culture process dikembangkan

pada skala operasi yang besar.

2. The Submerged-Culture Fermentation

Meskipun submerged-culture process untuk produksi komersial penicillin pada

dasarnya sederhana, sistem unit produksi yang sebenarnya sangat kompleks. Pabrik

penicillin yang modern adalah unit yang sangat tinggi nilai tekniknya, dimana kunci

kesuksesan operasi tergantung pada integrasi yang baik dan pengendalian mesin-mesin

yang cukup banyak dan memerlukan sumber daya yang baik untuk mengkoordinasikan

fungsi-fungsi mesin-mesin tersebut agar berjalan dengan baik.

Pada dasarnya, submerged-culture process adalah sederhana seperti surface

process, terdiri dari menumbuhkan strain Penicillium yang sesuai pada media cair.

Meskipun setiap produsen penicillin mengembangkan metodenya masing-masing dan

detail dari prosesnya tidak tersedia secara terbuka untuk dapat diperbandingkan, tapi pada

umumnya prosesnya mirip dan perbedaannya tidak diragukan hanya pada beberapa hal

kecil. Secara umum, submerged-culture fermentation process terdiri dari tiga langkah :

(1) Persiapan inokulum, (2) Produksi fermentasi, dan (3) Pemanenan media fermentasi.

Setiap pabrik atau produsen memiliki metode detail yang mungkin berbeda satu

dengan lainnya. Akan tetapi, pada dasarnya proses utamanya sama. Pada makalah ini

disajikan disain dasar proses pada pabrik produksi penicillin dengan metode submerged-

culture. Pada Gambar 2, diagram alir proses dari tipe ini memperlihatkan beberapa

langkah proses.

Peralatan Produksi

Peralatan untuk menumbuhkan mold yang menghasilkan penicillin terdapat

berbagai macam ukuran tangki fermentasi dimana digunakan untuk dua tujuan:

menumbuhkan mold untuk inokulum dan menumbukan mold untuk produksi penicillin.

Tangki yang digunakan untuk menumbuhkan inokulum disebut sebagai seed tank,

sedangkan tangki untuk produksi penicillin disebut sebagai fermentor. Biasanya, seed

Hari Soesanto

Hari Soesan

to

tank dan fermentor memiliki disain yang identik, dimana ada sedikit perbedaaan-

pernbedaan modifikasi kecil yang diperlukan untuk fungsi-fungsi khusus. Tangki tersebut

dapat dikonstruksi dari bahan carbon steel, stainless steel, inconelclad steel, atau plastic-

coated steel. Tangki dilengkapi dengan pengaduk mekanik, sistem sparging untuk aerasi,

dan biasanya memiliki coil yang terhubungkan dengan steam bertekanan tinggi untuk

sterilisasi dan air untuk pendinginan. Media disterilisasi sebelum dimasukkan ke dalam

tangki.

Banyak tipe-tipe pengaduk yang digunakan. Biasanya tipe turbin yang banyak

digunakan. Bentuk tangki yang silinder dan tingginya biasanya dua sampai tiga kali dari

diameter. Seed tank umumnya memiliki kapasitas sekitar 10% dari fermentor. Tangki

juga dilengkapi dengan alat otomatis yang dapat menambahkan defoamer yang berfungsi

untuk mengurangi foam yang terbentuk akibat adanya aerasi. Pada Gambar 4, disajikan

interior dari fermentor dengan volume 5000 gallon.

Gambar 2. Diagram Alir Proses Produksi Penicillin dengan Metode Submerged-Culture (Sylvester, 1954)

Hari Soesan

to

Gambar 4. Interior Tangki Fermentasi 5000 gal (Cutter Laboratorios)

Seed tank dan fermentor dihubungkan dengan pipa yang membentuk sistem

tertutup. Inokulum ditransfer dari seed tank ke fermentor dengan tekanan udara. Selama

operasi, tekanan udara sebesar 5 sampai 10 psi dipertahankan pada tangki. Ketika tidak

digunakan, semua pipa koneksi ke tangki-tangki, dijaga pada tekanan steam 15 sampai 30

psi. Adalah hal yang penting bagi operasi pada tangki fermentasi bahwa sistem terus

dijaga bebas dari kontaminasi.

Persiapan Inokulum

Karena Strain Penicillium yang digunakan dalam produksi penicillin banyak

variasinya, penanganan kultur dan persiapan inokulum untuk produksi di fermentor harus

dikontrol. Stok utama dari organisme P. chrysogenum sebagai starting point untuk setiap

Hari Soesanto

fermentor yang berjalan. Inokulasi dari fermentor produksi dari fermentor produksi yang

lain tidak digunakan kecuali bila keadaan darurat yaitu jika inokulum yang disiapkan

untuk fermentor khusus tersebut tidak dapat digunakan. Seed tank untuk menumbuhkan

inokulum diilustrasikan pada Gambar 5.

Gambar 5. Seed Tank untuk Pertumbuhan Inokulum

Selama proses inokulasi di dalam seed tank, sampel diambil secara periodik dan

dievaluasi mengenai pertumbuhannya dan kontaminasinya. Evaluasi secara mikroskopik

dan subculture ke media broth dilakukan untuk memeriksa adanya kemungkinan

kontaminasi dengan bakteri atau ragi. Jika memang sudah yakin seed culture sudah

tumbuh secara memuaskan dan bebas dari kontaminasi maka akan digunakan.

Fermentasi Produksi

Fermentasi produksi dilakukan dalam tangki berkapasitas 2.500 sampai 20.000

gallon. Tangki diisi sekitar 75% dari media, dimana dapat dilakukan sterilisasi dalam

fermentor. Sebuah tangki yang berisi 4.000 gallon media memerlukan sekitar 4 jam siklus

sterilisasi dimana tekanan uap sebesar 100 psi digunakan dalam coilnya. Sekitar 90 menit

Hari Soesanto

dibutuhkan untuk meningkatkan suhu dari media sampai 1200C, lalu dijaga selama 30

menit. Tambahan waktu selama 120 menit dibutuhkan untuk mendinginkan media agar

dapat dilanjutkan inokulasi. Contoh fermentor produksi ditunjukkan pada Gambat 5.

Gambar 6. Tangki Fermentasi Produksi

Pemanenan Media Fermentasi

Pada saat pemanenan, kultur yang telah difermentasi dipompa ke reservoir tank

dimana umpan secara kontinyu masuk ke dalam rotary vacuum filter. Mycelium

dipisahkan dari campuran, dicuci dengan filter, dan dikeluarkan sebagai blanket yang

tebal. Beer yang mengandung penicillin dipompa dari filter melalui sebuah heat

exchanger yang mendinginkannya pada suhu 20 sampai 40C, masuk ke dalam tanki

penyimpanan. Selama operasi, filter biasanya disterilisasi dengan steam atau larutan

germisida. Adalah hal penting bahwa pertumbuhan bakteri tidak boleh dibiarkan ada

dalam sisten filtrasi, karena hal ini dapat menghasilkan perusakan besar terhadap

penicillin yaitu dengan aksi penicillinase bakteri. Kapasitas dari rotary vacuum filter

bervariasi sesuai dengan ukuran drumnya, berkisar antara 2.000 sampai 3000 gph untuk

suatu drun berukuran diameter 4 ft dan lebar 28 in. contoh rotary vacuum filter

ditunjukkan pada Gambar 7.

Hari Soesanto

Untuk menghasilkan 1.000 gal kultur fermentasi (5 sampai 6 pound penicillin)

dengan menggunakan submerged-culture process memerlukan sekitar 500 lb nutrient,

7.500 lb steam, 10.000 gal air, 1.000 kwh listrik, dan 250.000 cu ft udara.

Gambar 7. Rotary Vacuum Filter untuk Pemisahan

Mycelium dari Broth (Abott-Laboratories)

Recovery Penicillin

Dua proses untuk recovery penicillin telah digunakan dalam produksi komersial.

Proses pertama berdasarkan adsorpsi penicillin dari beer dengan karbon, sedangkan

proses kedua berdasarkan ekstraksi penicillin dari beer pada pH asam dengan pelarut-

pelarut yang tidak larut dengan air. Proses karbon digunakan secara luas selama periode

awal produksi penicillin, tetapi kemudian secara besar digantikan dengan proses pelarut.

Pada proses adsorpsi penicillin dengan karbon, jumlah karbon yang digunakan

tergantung pada konsentrasi penicillin dalam beer dan akan bervariasi dari 2 sampai 5%

bobot. Satu gram karbon akan mengabsorb kurang lebih 20.000 unit penicillin.

Proses ektraksi penicillin dengan menggunakan pelarut berdasarkan fakta bahwa

penicillin lebih suka larut dalam air atau pelarut-pelarut organik. Beberapa pelarut yang

Hari Soesanto

sering digunakan dalam skala besar yaitu amil asetat, metil isobutil keton, dan butil

asetat. Pemilihan pelarut yang sesuai tergantung pada beberapa faktor seperti biaya,

kelarutan dalam air, titik nyala, toksisitas terhadap manusia, penanganan yang mudah,

dan sebagainya.

Tahapan Proses Polishing Penicillin

Untuk menghasilkan garam penicillin sebagai produk akhir digunakan basa yang

sesuai. Secara komersial, garam-garam yang dihasilkan yaitu sodium, potassium, dan

kalsium. Jika bentuk garam yang amorp dari sodium, potassium, dan kalsium diinginkan,

maka larutan yang diperoleh setelah proses ekstraksi lalu di keringkan beku (freeze

drying) dan selesai tanpa proses lebih lanjut. Kebanyakan produk penicillin diproses

hingga menjadi sodium kristal atau garam potassium.

Ada beberapa prosedur untuk menghasilkan kristal garam penicillin. Salah satu

metode, dimana memberikan hasil yang memuaskan yaitu terdiri dairi larutan sodium

atau potassium penicillin (100.000 sampai 200.000 unit per ml) yang sudah difiltrasi

dimasukkan ke dalam crystallizer. Pelarut yang tidak bercampur dengan air, seperti

butanol, juga difiltrasi, ditambahkan ke dalam crystallizer dan dilakukan distilasi vakum

azeotropik. Selanjutnya air dihilangkan, garam penicillin membentuk kristal lalu

dikumpulkan secara aseptis pada filter. Operasi kristalisasi harus dijalankan dalam

kondisi aseptis untuk menghindari kontaminasi produk dari mikroorganisme. Garam

kristal kemudian dikeluarkan dari filter lalu dikeringkan pada tekanan vakum 200 sampai

400 mikron. Garam yang telah kering kemudian dipisahkan menurut ukurannya lalu

diselesaikan pada berbagai bentuk sediaan farmasi (Gambar 8)

Hari Soesanto

Gambar 8. Stainless-Steel Turnable dalam Operasi Finishing (Chas. Pfizer)

Hari Soesanto

Gambar. Diagram Alir Produksi Penicillin G (Shou Hu, 2007)

Hari Soesanto

Hari Soesan

to

to

Gambar 3. Process Flow Diagram Penicillin (Cooney, 2005)

Hari Soesan

Standar Penicillin

Sodium atau potassium penicillin G (standar USA) harus memenuhi standar

berikut ini : (1) harus steril, (2) tidak bersifat toksik, (3) non-pyrogenik, (4) mengandung

setidaknya 85% (bobot) dari sodium atau potassium penicillin G, (5) kadar air tidak

melebihi 1,5%, (6) pH-nya dalam larutan, pada konsentrasi 30 mg per ml tidak kurang

dari 5,0 dan tidak lebih dari 7,5, (7) larutan penicillin pada konsentrasi 30 mg per ml

bebas dari kekeruhan.

Standardisasi penicillin ditentukan dengan mengukur potensinya, dinyatakan

dengan satuan intenasional (IU, Internasional unit). Potensi 1 IU adalah besarnya

aktivitas dari 0,6 μg garam penicillin-G dalam bentuk mikrokristal yang distandardisasi

internasional. Satu gram kristal penicillin-G tersebut setara dengan 1667 Oxford Unit.

Pustaka

Admin. 2007. Penicillin dan Penggunaannya dalam Dunia Veteriner.

Komunitas Dokter Hewan Inonesia. www. vet- indo.com/index2.phpoption?

=com_content&do_pdf=1&id=20.

Cooney, C.L. 2005. Bioprocess Simulation, Economics, and Design.

net.shams.edu.eg/ecourses%20download/Chemical%20engineering/undergraduate,

graduate/Separation%20Processes%20for%20Biochemical%20Products,%20Summ

er%202005/lectures%20notes/lecture_10.pdf .

Sylvester, J.C., Coghill, R.D. 1954. The Penicillin Fermentation. Dalam Industrial

Fermentations. Vol. II. Underkofler, L.A., Hickey, R.J. Chemical Publishing Co.

New York.

Shou Hou, W. 2007. Bioseparation Overview. ugroup.cems.umn.edu/Education/Courses/

5751/ Lecture%20Notes / Introduction%20to%20Bioseparations.pdf.

Hari Soesanto