7/24/2019 Proses Dna Rekombinan

1/2

Dalam perlakuan dengan menggunakan DNA rekombinan ini dilakukan beberapa

tahapan yang tercakup semua teknik di atas:

1. Isolasi DNA yang diawali dengan melakukan perusakan serta

penghilangan dinding sel.

langkah selanjutnya adalah pelisisan sel hal ini dapat dilakukan dengan

menggunakan bufer nonosmotik, serta deterjen yang kuat seperti triton !

1"" atau dengan sodium dodesil sul#at $%D%&.'emukan sel yang diakibatkan oleh lisisnya sel dibuang dengan

melakukan sentri#ugasi sehingga bisa dibedakan antara bagian yang rusak

serta organel target.(ang pada akhirnya didapatlkan DNA yang nantinya dilakukan

pemurnian dengan penambahan amonium asetat dan alkohol.)ahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik

genomik maupun plasmid.

*. %elanjutnya adalah pemotongan DNA dengan menggunakan en+im restriksi

endonuklease. emutusan ini dilakukan di dalam strain tertentu yang bertujuan

untuk mencegah agar tidak merusak DNA. %elain itu strain tersebut juga

mempunyai suatu sistem modi-kasi yang menyebabkan pemutusan basa pada

urutan tertentu yang merupakan recognition sites bagi en+im restriksi tersebut.

emotongan DNA genomik dan DNA ektor dengan menggunakan en+im restriksi ini

harus menghasilkan ujung!ujung potongan yang kompatibel dalam arti setiap

#ragmen DNAnya harus dapat disambungkan dengan DNA ektor yang sudah

berbentuk linier.

/. )ahap penyambungan DNA terdapat beberapa cara, yaitu penyambungan dengan

menggunakan en+im DNA ligase dari bakteri, penyambungan dengan menggunakan

DNA ligase dari sel 0. coli yang telah diin#eksi dengan bakterio#ag ) atau sering

disebut dengan en+im ) ligase. %erta dengan pemberian en+im deoksinukleotidil

trans#erase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik /2. Dengan untai

tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat

diligasi menggunakan DNA ligase. Aktiiotas en+im ini berada pada suhu /3 o4.

namun, proses penyambungan biasa dilakukan pada suhu dan 15o4.

. )ahap berikutnya adalah analisa terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan

DNA ektor serta analisis hasil ligasi molekul!molekul DNA dengan menggunakan

teknik elektro#oresis. 6asil dari penyambungan ini dimasukkan ke dalam sel inang

agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dalam hal ini pada campuran reaksi tersebut

selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah #ragmen DNA genomik

dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. )ahap memasukkan campuran

7/24/2019 Proses Dna Rekombinan

2/2

reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan trans#ormasi. %ehingga diharapkan

sel inang mengalami perubahan si#at tertentu setelah dimasuki molekul DNA

rekombinan.

5. )ahap selanjutnya adalah seleksi trans#orman dan seleksi rekombinan. ada

dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah trans#ormasi dilakukan,

yaitu sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti trans#ormasi gagal,sel

inang dimasuki ektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan sel inang dimasuki

ektor rekombinan dengan atau tanpa #ragmen sisipan atau gen yang diinginkan.

7ntuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan

si#at yang terjadi pada sel inang. 8ika sel inang memperlihatkan dua si#at marker

ektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. %eleksi

sel rekombinan yang membawa #ragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari

#ragmen tersebut menggunakan #ragmen pelacak yang pembuatannya dilakukan

secara in itro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerasechain reaction .

'ekombinasi memiliki tiga mekanisme dasar dalam menjalani prosesnya. (aitu

trans#ormasi, konjugasi dan transduksi. )rans#ormasi merupakan trans#er DNA

telanjang yang umumnya berasal dari satu sel bakteri ke dalam sel yang berbeda.

rosesnya adalah ketika sebuah sel bakteri pecah atau lisis maka DNA sirkular akan

terlepas ke lingkungan. 0-siensi trans#ormasi bergantung pada kompetensi sel.

9onjugasi merupakan pemindahan materi genetik berupa plasmid secara langsung

melalui kontak sel dengan membentuk struktur seperti jembatan diantara dua selbakteri yang berdekatan. 7mumnya terjadi pada bakteri gram negati#. %edangkan

transduksi merupakan trans#er materi genetik dari satu bakteri ke bakteri lainnya

dengan menggunakan irus bakteri sebagai ektor. )rans#er ini menggunakan

prinsip dasar dari galur donor yang menyediakan DNA bagi galur resipien.

erbedaan utamanya dengan trans#er DNA lainnya adalah DNA ditrans#er melalui

perantaraan bakterio#ag.