PRODUKSI ANTI-PROGESTERON SERUM PADA DOMBA

Y. Saepudjn * dan Supriyatj Kompiang *

AHSTRAK

PRODUKSIANTI-PROGKSTY.RONSKRIIHPADADOMBA.Ant i pror,!esterone serum telah di­kembangkan pada J ekor domba dengan cara imunisasi. Antigen II-alfa hidroksi pro­gesteron direaksikan denr,!an suksinat anhidrat, yang kemudian dikonyuqasikan denganBSA. Emulsi antigen konyugat dalam 0.9% NaCI-Fl'eund's adjuvant 1 : 1 (4,5 mg/3 mI)diinjeksikan ke masing-masing lernak secara subkutan di daerah sekit~r paha. Imuni­sasi I;edua dan keliga dilakukan pada selang waktu 4 minggu dengan konsentrasi anti­gen-konjugat 2mg/2ml. Sampel darah diambil setiap minqgu dan anti-serumnya dieva­luasi dengan RIA. Hasi I pengamatan menunjukkan bahwa rata-rata titer dan afinitastertinggi terjadi 2 minggu setelah injeksi ke dua, 48.7% untuk antiserum 1 : 1000dan 8,7 x 10-3 MIl. Spesifisitas anti serum cukup baik sehingga dapat dihindarkanadanya interferensi.

ABSTRACT

PRODUCTIONOF ANTI-PROGKSTKRONKSKRlIH IN SHKKP. Anti progesterone serum wasdeveloped in 3 sheep by immunisation. Antigen II-alpha hydroxy progesterone is reac­ted to sucsinate anhydrate, and then conjugated with BSA. Emulsion of antigen­conjugate in 0.9% NaCI-Freund's adjuvant 1 : 1 (4.5 g/3 mI) was injected sub­cutaneously to each sheep, in the pevic region. The second and the third injectionwere given at 4 weeks interval with the concentration of antigen conjugate 2 mg/2mi. Blood samples were taken weekly and its a~ti-serum activities were evaluated bymean of RIA. The results indicated thet the highest average titer and afinities was

-3observed 2 weeks after the secon injection. 48.7% for I : 1000 and 8.7 x 10 M/Iantiserum. Specificity of the antiserum was quiet good, hence no interferenceoccured.

PENDAHULUAN

(RIA) dewasa

terut.ama di

Analisis harmon

ini sangat berkembang

bidang biologi maupun

* Balai Penelitian Ternak

steroid dengan radioimmunoassay

berkat ditemukannya teknik nulir,

kedokteran.

567

Radioimmunoasay (RIA) untuk hormon steroid dan protein dapat

membantu diagnosa sistim fisiologi reproduksi manusia mauvun h~wa.t\

(1). Teknik ini mampu mendeteksi konsentrasi hormon yang rendah

sekali 10-10M dalam serum atau plasma darah.

Keberhas iIan analisis hormon tergantung pada kuali ta~ antiserum

(antibodi) yang dipergunakan dalam analisis. Kualitas tersebut me­

liputi titer, afinitas dan spesifisitas (2).

Antiserum yang mempunyai pengikatan spesifik tinggi dapat di­

hasilkan dengan menslimulir atau merangsang suatu hewan dengan anti­

gen. Biasanya dilakukan dengan mengimunisasi hewan dengan antigen

dari ikatan steroid protein carier melalui atom carbon (C) pada

cincin B dan C pada inti steroid (2). Protein carier yang baik di­

pergunakan adalah suatu senyawa protein yang mempunyi berat melekul

(BM) tinggi misalnya albumin dari serum kerbau (bovine serum albu­

min/BSA) dan albumin dari serum manusia (Human serum albumin/HSA).

Stet'oid antiserum dapat dihasilkan pada sejumlah species, se­

perti tikus, kera, domba, kambing, kuda dan kelinci. Kelinci banyak

dipergunakan karena ekonomis dan mudah diternakkan (3).

Pada penelitian ini dikembangkan anti progesteron serum pada

domba. Kualitas antiserum dievaluasi dengan menggunakan radioimmuno­

assay (RIA) meliputi penetapan titer, afinitas dan spesifisitas.

BAHAN DAN METODA

Pembuatan Antigen 11-a1£a Hidroksi Progesteron Hell1.isuksinat.Saban yak 0.5 g 11-alfa hidroksi progesteron (Sigma Chemical Co.)

dilarutkan dalam 20 ml piridin. Refluks selama 20 jam dengan 1,5 g

suksinat anhidrat, didinginkan di dalam es beberapa menit kemudian

tambahkan 100 ml air. Larutan kemudian diekstrak dengan dietil eter,

dipisahkan dalam corong pemisah , selanjutnya dicuci dengan air

sebanyak 2 x 25 ml dan selanjutnya diekstraksi kembali dengan 100 ml

larutan natrium bikarbonat. Hasi I ekstraksi diasamkan sampai pH 4

dengan asam khlorida (HCI) 10%. Larutan asam ini kemudian diekstrak­

si dengan 2 x 75 ml eter yang ditambahkan 20 g natrium suI fat dan

dibiarkan selama semalam. Larutan diuapkan dengan rotari evaporator.

Kristal yang lerbentuk didinginkan dalam freezer semalam untuk meng­

kristalkan secara sempurna. Kemudian dilarulkan kembali dengan metil

568

khlorida dan ditambahkan heksan secukupnya sampai terbentuk larutan

yang keruh. Kemudian disimpan dalam freezer sampai terbentuk kristal

yang akan didapat kurang lebih 80 mg, setelah rekristalisasi di­

periksa titik didihnya antara 148 - 150°C.

Konyugasi Antigen dan BSA. Kristal tersebut diatas sebanyak 200

mg dilarutkan dalam air dan ditambahkan secukupnya natrium bikar­

bonat sampai larut. Kemudian ditambahkan 100 ml larutan 1-etil-3-(3­

dimetilaminopropil)-karbodiyamida HCl dan 200 mg BSA yang dilarutkan

dengan sedikit buffer fosfat pH 8,4, serta dikocok. Larutan tersebut

dibiarkan selama 24 jam sambi 1 diputar sampai reaksi sempurna. Deri­

vat steroid diisolasi dengan car a dial is is selama 48 jam dalam

tabung dialisis dengan mengganti air beberapa kali selama dialisis.

Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifugasi dan didingin­

kan dalam freeze drier. Kandungan steroid dianalisis kadar proges­

teronnya dengan RIA ternyata kadarnya berkisar antara 6%. Hal ini

memperlihatkan adanya kandungan antara 12 steroid per BSA molekul

(12 steroid/mol BSA).

Imunisasi dan Pengambilan Darah. Tiga ekor domba (ovis aries)

lokal diimunisasi dengan antigen konyugat 11-alfa hidroksi progeste­

ron hemisuksinat-BSA sebanyak 4.5 mg yang di larutkan dalam 3 ml

campuran larutan natrium khlorida 0,9% dan Freund Adjuvant (1:1)

untuk setiap ternak secara subkutan (diantara kulit) pada beberapa

tempat di sekitar lipatan paha. Umur domba antara 1,5 - 2,0 tahun

dengan berat badan antara 30 - 40 kg dan ditempatkan secara terpisah

di dalam kandang berukuran 2 x 3 m. Semua domba diberikan ransum

rumput gajah ad lib. dan konsentrat.

Buster (penyuntikan ulang antigen) dilakukan pada minggu ke

empat (4) dan ke delapan (8) sebanyak 2 mg/2 ml larutan natrium

khlorida 0,9% dan Freund Adjuvant (1:1).

Pengambilan darah (serum) dilakukan pada setiap minggu sampai

minggu ke duabelas (12).

Pengujian Kualitas Antiserum. Antiserum dievaluasi kualitasnya

dengan mengukur titer, afinitas dan spesifisitas dengan menggunakan

metoda RIA seperti diterangkan oleh CAMERON dkk (1).

569

HASIL DAN DISKUSI

serl1:1000 dan 1:4000 yang direaksikan dengan perunut antigen progeste­

ron (3H Progesteron) dengan aktifitas sekitar 5000 cpm dapat dilihat

pada Gambar 1. Dari minggu ke satu sampai ke empat kenaikan % titer

(daya ikat) hanya mencapai maksimum 17%. Sedangkan peningkatan titer

antibodi rata-rata terjadi setelah adanya buster pertama (imunisasi

ke 2). Titer tertinggi diperoleh sebesar 80,3% untuk seri larutan

antiserum 1:100, 48,73% untuk seri larutan 1:1000 dan 35,93% untuk

seri larutan 1:4000. Pada minggu ke dua dan ke tiga setelah buster

pertama, % titer antibodi masih cukup stabil yaitu berkisar antara

80,3 - 75,7% untuk seri larutan 1:100, 49,3 - 58,7% untuk seri la­

rutan 1 :1000 dan 35,9 - 34,6% untuk sed larutan 1:4000. Menurut

pendapa t BAUMANGER dkk (4 ) dan SCAUSBR ICK (5 ) bahwa pen ingka tan

titer antibodi terjadi pada hari ke 10 setelah buster pertama. Pen­

dapat ini didukung oleh PARK dkk (6) bahwa peningkatan antibodi

terjadi pada hari ke 10 - 16, sedangkan SCARAMUZZI dkk (7) dalam

penelitiannya ternyata % titer antibodi meningkat pada hari ke 11 ­

19 setelah buster pertama.

Setelah buster kedua terjadi kembali peningkatan % titer rata­

rata yai tu 68,40% untuk seri larutan 1:100 pada minggu ke sepuluh

(dua minggu setelah buster ke dual, yang kemudian penurunan terjadi

sampai mencapai 47,03% untuk seri larutan 1:100 pada minggu ke

duabelas (empat minggu setelah buster ke dual.

Domba (Ovis aries) yang diimunisasi dengan antigen 11-alfa

hidroksi progesteron - BSA konyugat sebanyak 4,5 mg/3 ml cukup mem­

berikan timbulnya rangsangan yang spesifik terhadap t.erbentuknya

antiserum sebagai efek daya tubuh terhadap zat asing.

Evaluasi afinitas antiserum ditetapkan dengan cara mereaksikan

sejumlah konsentrasi steroid bebas dengan larutan ikatan steroid

hormon ditambah sejumlah antibodi, setelah melalui periode inkubasi

dengan steroid bertanda radioaktip, maka akan dicapai kesetimbangan,

steroid hormon yang terikat dan yang dibebaskan dapat dipisahkan

dengan teknik pemisahan. Satuan afini tas antiserum adalah Molar/

Liter (M/L). iIasil evaluasi ternyata afinitas tertinggi diperoleh

pada minggu ke enam yaitu mencapai 12,2 x 10-3, 8,1 x 10-3 dan 5,9 x

10-3 untuk masing-masing domba no. 331, 333 dan 338. Penurunan kon-

570

sentrasi antibodi terjadi pada minggu ke delapan dan kesembilan

setelah imunisasi pertama (minggu ke empat dan ke lima setelah

buster pertama) untuk setiap individu domba. Afinitas antibodi me­

ningkat kembali setelah dilakukan huster ke duaiimunisasi ke tiga

yaitu sebesar 9,00 x 10-3 untuk domba no. 331 pada minggu ke sepu­

luh, 6,8 x 10-3 untuk domba no. 333 dan 4,9 x 10-3 untuk domba no.

338.

Hasil diatas didukung oleh pendapat ROIT, (8) yang mengatakan

bahwa imunisasi buster dapat meningkatkan kenaikan affinitas anti­

bodi, akibat adanya reaksi tubuh terhadap rangsangan yang ditimbul­

kan oleh reaksi pertama pada imunisasi pertam~. Hasil percobaan yang

dilakukan SCARAMUZZI dkk (7) memperlihatkan adanya kenaikan konsen­

trasi antibodi pada minggu pertama dan kedua setelah buster pertama,

~emikian juga terhadap reaksi buster berikutnya. Pada penelitian ini

ternyata afinitas tertinggi diperoleh setelah buster pertama,

sedangkan setelah buster ke clua afini tas yang meningkat tidak se­

besar pada buster perLama.

Reaksi antibodi pada setiap domba memperl ihatkan reaksi yang

ticlak sarna, kenyataan in i menunjukan bahwa reaksi terhadap antigen

yang ditimbulkan oleh masing-masing domba berbeda. Perbedaan ini

disebabkan zat yang menimbulkan antigenik tidak cukup kuat sebagai

pembentuk zat anlibodi pada domba yang titer dan afinitasnya rendah

(9) •

Spesifisitas antiserum progesteron ditentukan clengan mereaksi­

kan antiserum tersebut dengan steroid lain sehingga terjadi reaksi

silang (10). Pada penelitian ini direaksikan sejumlah steroid hormon

lain (S) yang ditambahkan pada antiserum tersebut dengan steroid

bertanda radioaktip (S*), setelah melalui periode inkubasi perubahan

yang terjadi terhadap sejumlah steroid S dibandingkan pada reaksi

simpangan dari steroid tersebut pada 50% radioaktip penanda S*.

Jumlah steroid tersebut dapat dihitung dengan cara mengalikan 100%.

lIasil evaluasi spesi fisitas anti serum dapat di lihat pada Tabel 1.

Has i1 pada Tabel tersebut memperli hatkan rendahnya reaksi silang

terhadap hormon steroid lain yang relatip sangat kecil dan akan

memberikan interferensi pada saat, analisis hormon progesteron. Hor­

mon steroid lain yang bereaksi dengan antiserum adalah kortison

(5,14 + 0,98%), deoksikortikosteron (4,58 + 0,77%), kortikosteron

571

(2,55 + 0,46%),17-beta hidroksi progesteron (1,16 + 0,04%) dan 4

androstecon 3-17 dion 0,03 + 0,01%). Sedangkan untuk kortisOn]

prononelon, kolesteron, testosteron dan estradiol berkisar antara'0,01 + 0,005%. Spesifisitas antiserum terhadap reaksi silang hormon

11-alfa hidroksi progesteron adalah 117,8 + 1,41%, hal ini disebab­

kan karena steroid ini mempunyai struktur kimia yang hampir samadengan antibodi. Dad data di atas membuktikan bahwa antiserum ter­sebut relatif kecil terhadap adanya reaksi silang dari hormon ste­

roid lainnya.

KESIMPULAN

Anti progesteron serum dapat diperoleh dengan cara iminusasidomba dengan 11-alfa hidroksi progesteron hemisuksinat-BSA. Ti tel'dan afinitas tertinggi diperoleh pada minggu ke enam setelah imuni­

sasi pertama (minggu ke dua setelah buster pertama). Spesifisi tasantiserum relatif baik kemurniannya sehingga dapat dihindarkan ada­

nya interferensi.

DAFTARPUSTAKA

1. CAMERON,E.H.D., HILLER, S.G., and GRIFFITHS, K., "Steroidimmunoassay", Proceeding of the fifth Tenovus WorkshopCardiff, Alpha Omega Publishing, Wales U.K. (1975).

2. NISWENDER,G.D., Influence of the site of conyugating on thesfecifity of antibodies to progesteron, Steroid 22 (1975)413.

3. NIESCHLAG, E. ,and KLEY H.K., "Production of steroid antisera inrabbits", Steroid Immunoassay (CAMERON,E.H.D., et al eds.),Alpha Omega, Wales U.K. (1975) 87

4. BAUMINGER,S., KOHENF., LUDREXH.R., and WEINSTEINK., Anti-serum to 5-alfa dihydrotestosterone production, characteri­zation and use in radioimmunoasay, Steroid 24 (1975) 477.

5. SCARISBRIC, J.J., Radioimmunosay of progesterone : r~!llparationof (1,2,6,73H4)-progesterone and progesterone ( ~I)-iodo­histamin radioligand., J. Steroid Biochem. 6 (1975)

572

100

2 3 4 5 6 7 8

Vv'aktu (minggu)

9 10 11 12

GAMBAR 1:PERKEMBANGAN % TITER ANTI SERUM

--+- Le:r P.s 1 : 100 -J-r Le:r As 1 : 1000 Lar As 1 : 4000--

CJ1

[AS,PROG]/1000'J ~ 14

1210

.,1m •8

64

.1m-

2

o1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

WAKTU (MINGGU)

GAMBAR 2: PERKEMBANGAN AFINITAS ANTISERUM PROGESTERON PADA DOMBA

- Domba 331 -t- Domba 333 -4- Domba 338 -e- Rata-rata

DISKUSI

ADRIA PM.

1. Seperti diketahui produksi anti progesteron serum, didapat dari

domba. Apakah bisa dicoba pada hewan lain seperti kambing dan

keledai ? Bagaimana pendapat Anda ?

2. Imunisasi kedua dan ketiga dilakukan selang 4 minggu, waktu

imunisasi ini dilakukan berdasarkan apa ?

3. Berapa titer A/S yang didapat rata-ratanya, yang telah diperoleh?

SUPRIYATI K.

1. Bisa dilakukan pada kambing maupun keledai. Hasil produksi pada

kambing menurut pengamatan peneliti di luar negeri responnya

lebih jelek, sedangkan pada keledai labih baik. Tapi keledai

sukar diperoleh maka dalam penelitian ini dipergunakan domba.

2. Berdasarkan pengalaman dan hasil-hasil penelitian lainnya.

3. Titer A/S yang didapat rata-rat di atas 70% untuk pengenceran 1

100.

SRI ASMINAH

Informasi.

Pusat Produksi Radio isotop (PPR) di Serpong sedang meneliti

pembuatan RIA kit antara lain T3 dan T4 di bawah pimpinan Dra. Wayan

Radiatning, MS. Anda dapat menghubungi beliau.

SUPRIYATI K.

Terima kasih atas informasi. Secara informal kami telah bicara hal

ini. Akan kami coba menghubungi kembali via informal terlebih dahulu

dan bila diperlukan secara formal. Perlu ditambahkan bahwa untuk

pembuatan Kit Prog diperlukan peralatan sintesis berbeda dengan kit

T3 dan T4.

SUHARNI SADI

Sesudah dibuster, ternyata hormon progesteron naik lagi, tetapi

lebih rendah daripada suntikan I. Apakah dapat diterangkan, kenapa?

575

SUPRIYATI K.

g.uuQ~h injQhui I ternJattl rtlnl~tlnltlntidni ndnfmiiih iooil, Gnnann

adanya buster I terjadi rangsangan yang lebih baik sehingga dipero­

leh anti serum dengan titer yang lebih tinggi. Sedangkan pada.buster

II masih terjadi kenaikan walaupun'tidak setinggi buster I dikarena­

kan respon dari ternak tersebut.

576