BIOLOGI MOLEKULER I

HEMOGLOBIN DAN SIFAT MEMBRAN

Pendahuluan

Hemoglobin merupakan protein yang terdapat dalam sel darah merah (SDM) dan berfungsi antara lain untuk :

1. Mengikat dan membawa oksigen dari paru-paru ke seluruh jaringan tubuh.2. Mengikat dan membawa CO2 dari seluruh jaringan tubuh ke paru-paru.3. Memberi warna merah pada darah.4. Mempertahankan keseimbangan asam-basa dari tubuh.

Hemoglobin merupakan protein tetramer kompak yang setiap monomernya terikat pada gugus prostetik hem dan keseluruhannya mempunyai berat molekul 64.450 Dalton. Darah mengandung 7,8 sampai 11,2 mMol hemoglobin monomer/L (12,6 sampai 18,4 gram/dL), tergantung jenis kelamin dan umur individu.

Hemoglobin dapat mengikat 4 atom oksigen per tetramer (satu pada tiap subunit hem), atom oksigen terikat pada atom Fe2+, yang terdapat pada hem, pada ikatan koodinasi ke-5. Hemoglobin yang terikat pada oksigen disebut hemoglobin teroksigenasi atau oksihemoglobin (HbO2), sedangkan hemoglobin yang sudah melepaskan oksigen disebut deoksihemoglobin (Hb). Hemoglobin juga dapat mengikat suatu gas hasil pembakaran yang tidak sempurna yaitu karbonmonoksida (CO) dan disebut karbonmonoksidahemoglobin (HbCO). Ikatan Hb dengan CO ini 200 kali lebih kuat daripada ikatan Hb dengan oksigen, dan akibatnya Hb tidak dapat lagi mengikat, membawa dan mendistribusikan oksigen ke jaringan. Dalam keadaan lain, muatan atom Fe yang terdapat pada pusat hem dapat berubah menjadi Fe3+. Hal ini dapat terjadi karena oksidasi oleh senyawa-senyawa pengoksidasi. Hemoglobinnya disebut hemoglobin teroksida atau methemoglobin (MetHb) atau Hb(Fe3+). Dalam bentuk ini Hb tidak dapat mengikat oksigen atau kehilangan fungsinya yang amat penting. Beberapa derivat dari hemoglobin, misalnya oksiHb, Hb dan HbCO dapat dibedakan dengan melakukan pengenceran, dan pada pengenceran ini OksiHb terlihat berwarna merah kekuning-kuningan, Hb berwarna merah kecoklatan dan HbCO berwarna merah terang (carmine tint). Untuk lebih jelas lagi setiap derivat Hb dapat pula dibedakan dengan menggunakan spektroskop, yaitu suatu teknik berdasarkan perbedaan absorpsi warna-warna tertentu dari spektrum cahaya putih.

Bila suatu larutan berisi suatu zat warna diletakkan antar alat tersebut dan sumber cahaya, maka akan terlihat daerah (pita) yang berwarna hitam pada bagian spektrum tempat terjadinya penyerapan warna tersebut. Dengan menentukan letak serta insensitas pita-pita absorpsi itu, maka dapat ditentukan pigmen apa yang sedang diperiksa itu. Pada spektroskop yang tidak dilengkapi dengan skala panjang gelombang cahaya, letak pita absorpsi itu ditentukan dengan membandingkan dengan garis-garis Fraunhofer dari spektrum sinar matahari. Pada gambar berikut garis-garis Fraunhofer itu akan terletak pada perkiraan : B = 687 mu, C = 656 mu, D = 598 mu, E = 527 mu, b = 517 mu, F = 486 mu dan G = 431 mu.

Tujuan praktikum :

1. Memperlihatkan bahwa hemoglobin dapat mengikat dan melepaskan oksigen.

2. Memperlihatkan bahwa ikatan Hb dengan karbonmonoksida jauh lebih kuat dibandingkan ikatan Hb dengan oksigen.

3. Memperlihatkan bahwa besi dalam molekul Hb bila doksidasi akan menjadi MetHb dan tidak dapat mengikat oksigen lagi.

4. Demonstrasi spektrum derivat-derivat hemoglobin.5. Penetapan kadar Hb kuantitatif (cara sianmethemoglobin).

Percobaan Hemoglobin :

1. Uji oksihemoglobin dan deoksihemoglobin

Tujuan :

Membuktikan hemoglobin dapat mengikat oksigen membentuk oksihemoglobin (HbO2) dan dapat terurai kembali menjadi O2 dan deoksihemoglobin.

Dasar :

Dalam keadaan tereduksi Fe dalam molekul Hb dapat mengikat dan melepaskan oksigen tergantung pada tekanan O2 atau CO2.

Hb(Fe2+) + O2 Hb(Fe2+)O2

deoksiHb oksiHb

Untuk mereduksi oksiHb menjadi deoksiHb digunakan larutan pereduksi Stokes.

Bahan dan pereduksi :

1. Darah segar2. Pereaksi Stokes 3. Larutan NH4OH

Cara kerja :

A. OksiHb 1. Ke dalam sebuah tabung reaksi encerkan 2 mL darah dengan 6 mL air

suling. Campur dengan baik dan perhatikan warna merah terang dari oksihemoglobin yang terbentuk.

2. Bagi 2 isi tabung tersebut sehingga masing-masing tabung berisi 4 mL gunakan tabung 1 sebagai control.

B. Pembentukan deoksiHb 1. Isi tabung ketiga dengan 2 mL pereaksi Stokes dan tambahkan NH4OH

secukupnya untuk melarutkan endapan yang segera terbuka. Campuran ini merupakan larutan pereduksi yang kuat.

2. Masukkan beberapa tetes larutan stokes ke dalam tabung 2. Terlihat perubahan warna karena terbentuknya deoksiHb. Bandingkan dengan tabung 1.

C. Pembentukan kembali oksi Hb dari deoksiHb 1. Kocok kuat-kuat tabung yang berisi deoksiHb, maka akan terjadi kembali

oksigenasi dari udara. Perhatikan dan catat warna HbO2 yang kembali terbentuk

2. Oksigenasi dan deoksigenasi kembali ini dapat dilakukan berulang-ulang.

Hasil :

Hasil Tabung 1oksiHb

Tabung 2deoksiHb

Tabung 3Reoksigenasi

DeoksiHbWarna yang terbentuk

Merah kekuning-kuningan

Merah kecoklatan Merah tua

Kesimpulan :

- Pengangkutan oksigen dilakukan oleh hemoglobin dalam darah- Warna darah yang tidak mengandung oksigen berwarna agak gelap- Hemoglobin dapat mengikat oksigen membentuk oksihemoglobin

dan dapat terurai kembali menjadi O2 dan deoksihemoglobin

Pertanyaan :

1. Peristiwa faal apakah yang ditiru dari percobaan ini ?

Jawaban :

Peristiwa yang terjadi menurut faal adalah pengikatan dan pelepasan oksigen oleh darah.

2. Uji terhadap karbonmonoksida hemoglobin (HbCO)

Tujuan :

Membuktikan bahwa Hb dapat mengikat CO yang ikatannya lebih kuat daripada Hb dengan O2.

Dasar :

Gas CO yang berasal dari proses-proses pembakaran yang tidak sempurna dapat mengikat Hb membentuk HbCO. Ikatan ini sangat kuat (lebih kurang 200 kali lebih kuat daripada ikatan Hb dengan oksigen). HbCO berwarna merah terang.

HbO2 + CO HbCO + O2

HbCO + Stokes tidak bereaksi

(tetap berwarna merah terang)

Bahan dan pereaksi :

1. Darah segar2. Sumber gas CO3. Pereaksi Stokes 4. NH4OH

Pelaksanaan :

1. Encerkan 2 mL darah dengan 8 mL air suling. Bagi 2 darah encer itu (masing-masing 5 mL) dalam dua tabung reaksi.

2. Pada tabung 1 alirkan gas CO (dalam lemari asam). Oksihemoglobin akan berubah menjadi karbonmonoksihemoglobin. Bandingkan warna tabung tadi.

3. Pindahkan masing-masing 1 mL dari tabung 1 (yang berisi HbCO) kedalam tabung 3 dan tabung 4 , dan masing-masing 1 mL dari tabung 2 (yang berisi HbO2) kedalam tabung ke 5 dan ke 6.

4. Tambahkan pereaksi Stokes (yang dibuat pada percobaan IBI) pada tabung ke 3 dan tabung ke 5. Jelaskan hasil yang didapat !

5. Encerkan isi tabung ke 4 dan tabung ke 6 dengan 4 mL air suling. Bandingkan warna kedua cairan itu. OksiHb berwarna kekuning-kuningan, sedang COHb bersemu kemerahan (carmine tint).

Hasil :

Tabung OksiHb KarbonmonoksiHbWarna sebelum penambahan pereaksi Stokes

Merah Merah terang (carmine tint)

Warna setelah penambahan pereaksi Stokes

Merah kecoklatan Merah terang (carmine tint)

Kesimpulan :

Hemoglobin selain mengikat oksigen juga dapat juga mengikat CO dari pembakaran yang tidak sempurna dimana ikatan CO lebih kuat dari oksigen sehingga ikatan ini susah dilepaskan. Akibatnya akan menyebabkan distribusi oksigen ke jaringan terganggu.

Pertanyaan :

1. Gejala-gejala apakah yang jelas terlihat pada seseorang yang keracunan CO ?

Jawaban :

Gejala yang terlihat pada awalnya adalah sesak napas dan warna pada ujung-ujung badan membiru.

3. Uji untuk methemoglobin

Tujuan :

Memperlihatkan bila besi dalam molekul hemoglobin dioksida menjadi Fe3+, maka terbentuk metHb yang tidak lagi bisa mengikat oksigen.

Dasar :

Hb(Fe2+) + K3Fe(CN)6 Hb(Fe3+) + K4Fe(CN)6

Hb oksidator MetHb

MetHb ini tidak dapat lagi mengikat oksigen

Bahan dan pereaksi :

1. Darah segar 2. Pereaksi K3Fe(CN)6

3. Pereaksi Stokes

Cara kerja :

1. Encerkan 1 mL darah dengan 4 mL air suling dalam tabung reaksi. 2. Ke dalam tabung tambahan beberapa tetes K3Fe(CN)6 33%. Perhatikan

dan catat perubahan warna yang terjadi. Kemudian tambahkan pereaksi Stokes ke dalam tabung itu dan kocok kuat-kuat. Perubahan apakah yang terlihat ?

3. Encerkan 3 mL darah dengan 3 mL air suling dan panaskan sebentar, lalu tambahkan 6 mL k3Fe(CN)6. Campur dengan membalik-balikkannya. Perhatikan gelembung-gelembung oksigen yang terbentuk.

Hasil :

Warna tabung 2+ K3Fe(CN)6 Kuning kecoklatanGelembung udara Ada

Tabung Warna tabung 1+ K3Fe(CN)6 Merah cokelatPengocokan kuat Merah cokelat+ Stokes BiruPengocokan kuat Hijau

Kesimpulan :

Dengan penambahan K3Fe(CN)6 maka besi yang terkandung di dalam Hb akan mengalami oksidasi menjadi Fe3+ sehingga warnanya berubah menjadi merah cokelat. Met Hb yang terbentuk tidak bisa lagi mengikat oksigen, sehingga walaupun dengan pengocokan kuat-kuat (warnanya tetap merah cokelat dan tidak bisa lagi berubah menjadi merah terang).

Pertanyaan :

1. Percobaan ini terdiri atas dua bagian, apakah perbedaan dari kedua percobaan itu ?

Jawaban :

Perbedaannya terdapat penambahan oksidator pada tabung 1 dengan indikator perubahan warna sedangkan tabung dipanaskan akan terbentuk gelembung oksigen.

4. Demonstrasi spektrum hemoglobin

Tujuan dan dasar :

Derivat-derivat Hb masing-masing dapat dibedakan dengan menggunakan alat spektroskop, yaitu suatu teknik yang berdasarkan perbedaan absorpsi warna-warna tertentu dari spektrum cahaya putih. Bila suatu larutan berisi suatu zat warna diletakkan di antara alat tersebut dan sumber cahaya, akan terlihat daerah (pita) yang berwarna hitam pada bagian spektrum tempat terjadi penyerapan warna tersebut.

Bahan dan alat :

1. Derivat-derivat Hb yang sudah diencerkan.2. Alat spektroskop.

Cara kerja :

Untuk percobaan ini akan diperlihatkan spektrum absorpsi Hb dan beberapa derivatnya. Jelas tidaknya pita-pita absorpsi itu tergantung juga dari pengenceran zat yang diperiksa.

Untuk pemeriksaan spektroskop ini darah perlu diencerkan ( ± 100 kali). Untuk oksiHb terdapat 2 pita gelap yaitu dekat garis D (578 nm) dan yang lain dekat garis E (542 nm) dan yang ke tiga pada 415 nm (pita ini hamper tidak terlihat karena sudah mendekati sinar ultra ungu). Untuk deoksiHb pita absorpsinya lebih lebar dan terletak pada 559 nm. karbonmonoksidaHb pita spektrumnya terdapat pada 570 nm dan 542 nm. MetHb netral mempunyai pita absorpsi pada sebelah kira garis D (634 nm).

Hasil :

derivat Hb Jumlah pita dan lokasiOksiHb 2; 540,6 dan 570,6 nmDeoksiHb 1; 555 nmCOHb 2; 539 dan 568,5 nmMetHb 1; 628 nm

II. SIFAT-SIFAT MEMBRAN

Pendahuluan.

Semua membran biologis mempunyai suatu struktur yang sama yaitu dibentuk dari molekul-molekul lipid dan protein yang satu dengan lainnya saling berhubungan dengan ikatan-ikatan nonkovalen. Molekul-molekul lipid tersusun dalam dwilapis lipid (lipid bilayer) dan merupakan struktur dasar membrane. Lipid ini berperan sebagai pembatas yang bersifat impermeabel relatif terhadap aliran molekul-molekul yang larut dalam air. Molekul-molekul protein seolah-olah larut dalam lapisan dwilapis lipid dan berperan sebagai perantara dari berbagai fungsi membran, antara lain untuk fasilitas transport. Sebagai protein membran berfungsi sebagai enzim-enzim yang mengkatalisis reaksi-reaksi yang berhubungan dengan peran membran dalam sel hidup. Sebagian lainnya dari protein membran tersebut merupakan protein struktural yang menyusun rangka sel tersebut, atau sebagian reseptor untuk menerima dan meneruskan sinyal-sinyal kimia dari dan ke dalam lingkungan sel.

Berbagai percobaan berikut memperhatikan hal-hal yang mempengaruhi membran sel darah merah dan suatu model mengenai proses difusi larutan koloid melalui suatu membran.

Tujuan :

1. Memperlihatkan pengaruh larutan hiper/hipotonik terhadap membran sel darah merah

2. Memperlihatkan pengaruh pelarut organik terhadap fragilitas membran sel darah merah

3. Memperlihatkan bahwa suatu larutan koloid tidak dapat berdifusi melalui membran dialisis.

Percobaan membran :

1. Hemolisis sel darah merah

Tujuan :

Memperlihatkan pengaruh larutan hiper/hipotonik terhadap membran sel darah merah

Dasar :

Dalam larutan hipotonik sel darah akan menggembung karena cairan dari luar sel akan masuk ke dalam sel darah merah. Bila pembengkakan SDM melewati batas fragilitas SDM. Sel itu akan pecah atau terjadi hemilisis. Hemoglobin akan larut dalam cairan hipitonik sehingga larutan akan berwarna merah jernih. Di dalam larutan hipertonik terhadap tekanan osmotik plasma darah maka cairan SDM akan keluar dari sel sehingga SDM akan mengkerut (crenated)

Bahan dan pereaksi :

1. Darah segar 2. Larutan NaCL 2%

Cara kerja :

1. Ke dalam 10 tabung reaksi isikan campuran berikut :

Tabung Air suling (mL) NaCL 2% (mL) % NaCl1 10,0 0,0 0 %2 9,0 1,0 0,2 %3 8,0 2,0 0,4 %4 7,5 2,5 0,5 %5 7,0 3,0 0,6 %6 6,5 3,5 0,7 %7 6,0 4.0 0,8 %8 5,5 4.5 0,9 %9 5,0 5,0 1 %

10 4,5 5,5 1,1 %2. Campur dengan baik.3. Tambahkan 2 tetes suspense darah ke dalam setiap tabung dan kocok

dengan membalik-balikkan tabung perlahan. Diamkan selama 1 jam.4. Perhatikan dan catatlah derajat hemolisis pada setiap tabung.

Hasil :

Tabung ↓ % NaCL Hemolisis Tabung ↓ % NaCL Hemoli1 0 % Penuh 6 0,7 % Sebagian2 0,2 % Penuh 7 0,8 % Sebagian3 0,4 % Penuh 8 0,9 % Sebagian4 0,5 % Penuh 9 1 % Krenasi5 0,6 % Sebagian 10 1,1% Krenasi

Kesimpulan :

Sel darah merah mengalami isotonus pada kadar NaCl 0,9%. Jika kadar NaCl kurang dari 0,9 % maka larutan akan mengalami hipotonik, yaitu sel darah merah akan menggembung akibat masuknya cairan ekstrasel ke dalam sel. Sedangkan jika kadar melebihi 0,9 % , maka larutan akan mengalami krenasi/hipertonus yaitu cairan intrasel keluar dari dalam sel.

Pertanyaan :

1. Dari percobaan di atas diterapkan resistensi osmotic minimum sel darah merah ?

Jawaban :

Kadar NaCl 0,9 %

2.Pengaruh pelarut organik terhadap membran sel darah merah.

Tujuan :

Memperlihatkan bahwa membran sel darah merah dapat mengalami lisi dalam pelarut organik tertentu.

Dasar :

Membran SDM mengandung lipid. Pelarut organik tertentu yang bersifat melarutkan lemak akan menyebabkan lipid membran larut sehingga terjadi hemolisis.

Bahan dan pereaksi :

1.Darah segar 2.Larutan NaCL 0,9%3.Kloroform4.Eter5.Aseton6.alkohol

Pelaksanaan :

1.Ke dalam 6 tabung reaksi masukkan setiap 10 mL. larutan NaCL 0,9%.2.Tabung pertama digunakan sebagai kontrol dan pada ke 5 tabung lainnya tambahkan setiap 2 tetes kloroform, eter, aseton, dan alkohol secara berurutan.3.Tambahkan ke dalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah, biarkan selama setengah jam. Perhatikan warna yang terbentuk dan bandingkan dengan kontrol.

Hasil :

Pelarut HemolisisNaCL 0,9% (kontrol) Sebagian Kloroform Sebagian

Eter SebagianAseton SebagianAlkohol SebagianKesimpulan :

Pelarut organik terbaik yang dapat membuat sel darah merah mengalami hemolisis adalah eter, meskipun pelarut organik juga dapat menyebabkan terjadinya hemolisis.