JADWAL PRAKTIKUM BIOKIMIA

Penuntun Praktikum Biokimia

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA

Program Studi Pendidikan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Pendidikan Ganesha


PERCOBAAN I

REAKSI UJI ASAM AMINO

Pendahuluan

Asam amino merupakan molekul organik dengan masa molekul rendah (antara 100-

200 Da) yang mengandung setidak-tidaknya satu gugus karboksil (-COOH) dan satu gugus

amino (-NH2). Asam amino ini merupakan komponen penting untuk biosintesis protein.

Dalam protein terdapat sekitar 20 jenis asam amino standar. Semuanya merupakan asam -

amino, kecuali prolin dan hidroksi prolin. Variasi yang terjadi antara asam-asam amino

terletak pada gugus R atau rantai sampingnya (Gambar 1.1). Berdasarkan gugus R-nya

akan dapat diramalkan sifat-sifat suatu asam amino. Sebaliknya, berdasarkan sifat-sifat

yang teridentifikasi akan dapat diketahui gugus R yang terkandung dalam asam amino

tersebut atau akan diketahui jenis asam aminonya.

N CC

O

O H

H

HH

R

Gugus -amino Gugus -karboksil

Gambar 1.1 Struktur Asam -amino. Bagian asam amino yang ditunjukkan dalam kotak

merupakan bagian yang umum untuk semua asam -amino. Gugus R yang

mewakili rantai samping memiliki struktur yang berbeda untuk setiap asam

amino. Gugus karboksil dan gugus amino dapat dimanfaatkan untuk

menganalisa suatu asam amino secara umum dalam campuran. Gugus R

dimanfaatkan dalam menganalisa asam amino secara spesifik.

Berdasarkan strukturnya, asam amino diklasifikasikan menjadi tujuh kelompok

(Tabel 1.1). Klasifikasi ini didasarkan pada sifat kimia dari gugus R-nya sehingga akan

memudahkan dalam mengingat sifat-sifat umum dari setiap asam amino. Dengan

klasifikasi ini, akan dapat dirancang metode untuk analisa suatu asam amino tertentu

(Tabel 1.2).

Tabel 1.1 Klasifikasi Asam Amino Berdasarkan Struktur Kimianya

Sifat Gugus R Contoh Asam Amino

Alifatik Gly, Ala, Val, Leu, ILe

Aromatik Phe, Tyr, Trp

Hidrosiklik Ser, Thr

Karboksiklik Asp, Glu


Mengandung sulfur Cys, Met

Imino Pro, Hyp

Amino Lys, Arg

Amida Asn, Gln

Tabel 1.2 Beberapa Reaksi untuk Mendeteksi Asam Amino Berdasarkan Gugus R

Reaksi uji Reaksi/reagen Asam Amino yang

Dideteksi Warna

Reaksi Millon HgNO3 dalam asam nitrat dengan

sedikit asam nitrit

Tirosin Merah

Reaksi

Xanthoprotein

Pendidihan dalam asam nitrat Tirosin, triptofan,

fenilalanin

Kuning

Reaksi Hopkins-

Cole

Asam glioksilat dalam H2SO4

pekat

Triptofan Ungu

Reaksi Sakaguci -naftol dan natrium hipoklorit Arginin Merah

Reaksi Nitroprusida Natrium nitroprusida dalam NH3

encer

Sistein Merah

Reaksi Pauli Asam sulfanilat terdiazotasi dalam

larutan basa

Histidin dan

tirosin

Merah

Reaksi Folin-

Ciocalteu

Asam fosfomolibdat Tirosin Biru

1.1 Uji Millon

Reagen yang digunakan dalam uji Millon adalah larutan ion merkuri dan ion

merkuro dalam asam nitrat dan asam nitrit. Warna merah yang terbentuk adalah garam

merkuri dari tirosin yang ternitrasi.

Percobaan

Alat :

Pipet tetes dan tabung reaksi

Reagen dan bahan :

Reagen Millon (larutan 10 g merkuri dalam 20 mL asam nitrat pekat kemudian encerkan

dengan 60 mL air),

Larutan protein (buat larutan albumin telur (1:5)),

Larutan asam amino 1 % (tirosin, fenilalanin, triptofan, glisin).

Prosedur :


Tambahkan 5 tetes reagen Millon ke dalam 3 mL larutan protein, panaskan campuran

baik-baik. Jika reagen yang digunakan terlalu banyak, warna akan hilang. Hal yang sama

juga dilakukan terhadap larutan asam-asam amino.

Pertanyaan

a. Apa yang terjadi jika garam merkuri ditambahkan ke dalam larutan protein?

b. Mengapa larutan albumin teragulasi?

c. Asam amino mana yang menunjukkan uji positif? Mengapa?

1.2 Uji Hopkins-Cole

Reaksi yang terjadi pada uji Hopkins-Cole adalah triptofan berkondensasi dengan

aldehid dari asam glioksilat dalam suasana asam sulfat membentuk kompleks berwarna

(Gambar 1.2).

COOH

HHH

NHN

H HH

Gambar 1.2 Asam 2,3,4,5-tetrahidro--karbolin-4-karboksilat

Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Reagen Hopkins-Cole (asam glioksilat),

H2SO4 pekat,

Larutan protein [buat larutan albumin telur (1:5)],

Larutan asam amino 1 % (tirosin, fenilalanin, triptofan, glisin).

Prosedur :

Ke dalam 2 mL larutan protein ditambahkan 2 mL reagen Hopkins-Cole. Tambahkan

sedikit demi sedikit H2SO4 pekat sampai kira-kira 5 mL melalui sisi tabung. Amati

warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan. Bila perlu putar perlahan-lahan


tabung tersebut sampai terbentuk cincin berwarna. Ulangi untuk larutan asam-asam

amino!

Pertanyaan

a. Asam amino mana yang menunjukkan uji positif ?

b. Gugus apa yang memberikan reaksi uji positif ?

1.3 Uji Ninhidrin

Apabila ninhidrin (triketohidrin hidrat) dipanaskan bersama asam amino, maka

akan terbentuk kompleks berwarna. Asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif

dengan jalan mengamati intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi

asam amino tersebut. Pada reaksi ini, dilepaskan CO2 dan NH3 sehingga asam amino dapat

ditentukan secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO2 atau NH3 yang dilepaskan.

Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan kompleks yang berbeda warnanya dengan asam

amino lainnya. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin

yang bereaksi dengan amonia yang dilepaskan pada oksidasi asam amino (Gambar 1.3).

Keseluruhan reaksi asam amino dengan ninhidrin adalah sebagai berikut :

a. dekarboksilasi oksidatif dari asam amino dan produksi ninhidrin tereduksi, amoniak,

dan karbon dioksida,

b. reaksi ninhidrin tereduksi dengan molekul ninhidrin yang lain dan dengan molekul

amoniak yang dibebaskan,

c. pembentukan kompleks berwarna biru.

Kompleks berwarna biru

C

C

H

O

HO

OO

OH

O

OHC

C

NH

H

H+ + N

O

O

C

C

C

C

O

O

C

C

R

H

OH

O

C COOHH2NOH

O

+ +

O

OHNH3

O

HC

C

RCHOCO2+ +

Ninhidrin Ninhidrin tereduksi

Gambar 1.3 Reaksi Ninhidrin


Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Larutan ninhidrin 0,1 %,

Larutan protein [buat larutan albumin telur (1:5)],

Larutan asam amino 1 % (tirosin, fenilalanin, triptofan, glisin)

Prosedur :

Tambahkan 0,5 mL larutan ninhidrin 0,1 % ke dalam 3 mL larutan protein. Panaskan

hingga mendidih. Ulangi percobaan dengan larutan asam amino yang lain!

Pertanyaan

a. Warna apa yang terbentuk ? Mengapa ?

b. Gugus apa yang memberikan uji positif ?

1.4 Uji PbS

Belerang yang terdapat dalam asam amino sistein dibebaskan sebagai ion sulfida

dengan kehadiran NaOH. Ion sulfida selanjutnya bereaksi dengan ion Pb2+

membentuk

endapan berwarna hitam.

Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Reagen Pb-asetat

Larutan NaOH

Larutan sistein

Prosedur :

Ke dalam 5 mL larutan sistein tambahkan 2 mL larutan NaOH dan 2 tetes Pb-asetat,

kemudian panaskan di atas penangas air. Jika hasilnya positif, larutan mula-mula

berwarna kuning kemudian coklat dan akhirnya hitam.


Pertanyaan

a. Senyawa apa yang berwarna hitam?

b. Terangkan fungsi NaOH!

1.4 Reaksi nitroprusida

Reaksi antara gugus sulfidril dari asam amino (sistein), peptida (glutation), atau

protein dengan natrium nitroprusida dalam amonia berlebih menghasilkan kompleks

berwarna merah.

Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Larutan natrium nitroprusida

Sistein

Prosedur :

Larutkan beberapa kristal sistein hidroklorida ke dalam 5 mL air. Tambahkan 0,5 mL

larutan natrium nitroprusida 1%. Tambahkan 0,5 mL amonium hidroksida.

Pertanyaan

a. Warna apa yang terbentu ?

b. Apakah sistein memberi uji positif ?

c. Senyawa apa selain asam amino sistein yang memberikan uji positif ?


PERCOBAAN II

REAKSI UJI PROTEIN

Pendahuluan

Protein merupakan komponen yang terdapat dalam berbagai jaringan mahluk hidup,

yaitu hewan, tumbuhan dan bakteri. Protein mempunyai fungsi sebagai arsitektur sel,

katalis, pengendali metabolit, proses kontraktil, dan senyawa penting lainya dalam

organisme tingkat tinggi. Dengan demikian, protein berkaitan erat dengan hampir semua

aktivitas fisiologis.

Protein adalah suatu polimer dari asam amino. Hidrolisis lengkap suatu protein

menghasilkan campuran 20 macam asam amino. Dengan jenis monomer sebanyak itu,

maka dapat dibayangkan besarnya kemungkinan susunan asam-asam amino dalam suatu

molekul protein. Sebagai contoh, bila suatu protein terdiri dari 100 unit monomer, maka

jumlah susunan atau urutan asam amino yang mungkin terdapat dalam protein tersebut

adalah 20100

. Oleh karena itu tidaklah mengherankan kalau protein dapat memerankan

berbagai fungsi fisiologis dalam berbagai organisme. Untuk memahami fungsi biologi dari

protein, maka terlebih dahulu harus dipelajari struktur dari protein tersebut.

Struktur protein dapat dikelompokkan menjadi empat kelas, yaitu struktur primer,

sekunder, tersier, dan kwarterner. Keempat struktur protein tersebut pada dasarnya

dibedakan atas jenis dan jumlah ikatan/interaksi kimia. Struktur primer hanya terdiri dari

satu jenis ikatan, yaitu ikatan kovalen yang menghubungkan gugus amino dan gugus

karboksil antar asam-asam amino atau disebut juga sebagai ikatan amida atau peptida

(Gambar 2.1). Oleh karena itu, pada struktur primer terdapat informasi tentang urutan dari

asam-asam amino yang menyusun suatu protein.

N CC

OH H

R2

R1

HH O

C CN

Gambar 2.1 Ikatan peptida

Ikatan yang terdapat pada struktur sekunder meliputi ikatan yang terdapat pada

struktur primer (kovalen) dan ikatan hidrogen antara oksigen karbonil dan hidrogen amida

(CO------HN) dari ikatan peptida. Ikatan hidrogen ini terbentuk menurut pola yang

teratur sehingga membentuk struktur yang unik, seperti -heliks dan -sheet.


Struktur tersier suatu protein memiliki struktur yang lengkap. Pada struktur tersier

ini, elemen-elemen struktur sekunder dikemas ke dalam bentuk tertentu. Pada pengemasan

ini dilibatkan berbagai ikatan dan interaksi kimia, seperti ikatan disulfida antar asam amino

sistein, ikatan hidrogen, ikatan ioni antar gugus-gugus yang terionisasi, interaksi hidrofobik

dan hidrofilik dan kemungkinan juga terdapat ikatan kovalen koordinasi seperti pada

metaloprotein. Kesemua ikatan maupun interaksi ini di samping membentuk struktur

tersier juga berperan sebagai penstabil.

Struktur yang terakhir adalah struktur kwarterner. Struktur ini terjadi pada beberapa

protein yang memiliki lebih dari satu sub unit. Pada struktur kwarterner terjadi interaksi

antara struktur tersier protein membentuk suatu agregat yang memiliki fungsi biologi

tertentu. Ikatan yang terlibat biasanya ikatan non-kovalen dan kebanyakan ikatan

hidrofobik terjadi pada dareah-daerah non polar. Hemoglobin, misalnya, terdiri dari empat

rantai polipeptida (sub unit), biasanya dua pasangan sub unit identik membentuk

hemoglobin tetramer yang memiliki fungsi lebih efektif dalam mentransport oksigen

dibandingkan dengan dalam keadaan monomernya.

Gambar 2.2 Struktur Protein. (a) Struktur primer, (b) struktur sekunder, (c) struktur tersier,

dan (d) struktur kwarterner

Pada percobaan ini akan dipelajari cara mengidentifikasi protein dengan

memanfaatkan ikatan yang khas pada protein, yaitu ikatan peptida dengan uji biuret dan

juga akan diamati pengaruh perubahan fisik yang diakibatkan oleh perubahan suhu, pH dan

zat-zat kimia terhadap struktur protein.

2.1 Uji Biuret

Biuret dihasilkan dengan memanaskan urea pada suhu 180oC.


C

NH2

NH2

O + O

NH2

NH2

C

C

NH

NH2

O

O

NH2

C

NH3+180 C

o

Dalam larutan basa, biuret memberikan warna ungu dengan CuSO4. Reaksi ini disebut

reaksi biuret, kemungkinan terbentuk kompleks Cu2+

dengan gugus C=O dan N-H dari

rantai peptida dalam suasana basa. Dipeptida dan asam-asam amino (kecuali histidin, serin,

dan treonin) tidak memberikan uji positif.

Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Larutan NaOH 2,5 N,

Larutan protein,

Larutan CuSO4 0,01 N

Prosedur :

Tambahkan 1 mL larutan NaOH 2,5 N ke dalam 3 mL larutan protein dan aduk.

Tambahkan tetes demi tetes larutan CuSO4 0,01 N. Aduk, jika tidak timbul warna,

tambahkan lagi satu atau dua tetes larutan CuSO4.

Pertanyaan

a. Warna apa yang terjadi?

b. Mengapa harus dihindari kelebihan penambahan larutan CuSO4?

c. Mengapa garam amonium mengganggu?

d. Sebutkan dua macam senyawa selain protein yang memberikan uji positif terhadap uji

Biuret!

2.2 Pengendapan protein dengan logam


Proten dapat diendapkan oleh ion-ion logam berat. Pengendapan ini terjadi karena

ion-ion logam berat membentuk garam proteinat yang tidak larut dalam air.

Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Larutan protein

Larutan HgCl2 0,2 M

Larutan Pb-asetat 0,2 M

Prosedur :

Ke dalam 3 mL larutan protein tambahkan 5 tetes larutan HgCl2 0,2 M. Ulangi

percobaan dengan menggunakan larutan Pb-asetat 0,2 M.

Pertanyaan

a. Perubahan apa yang terjadi ?

b. Terangkan mengapa putih telur dapat digunakan sebagai antidote pada keracunan

logam Pb dan Hg!

2.3 Pengendapan dengan garam

Apabila terdapat garam-garam anorganik pada konsentrasi tinggi dalam larutan

protein, maka kelarutan protein akan berkurang sehingga mengakibatkan pengendapan

protein tersebut. Hal ini disebabkan oleh ion-ion garam berkompetisi dengan molekul-

molekul protein untuk mengikat air (terhidrasi). Karena kemampuan ion-ion garam

terhidrasi lebih besar daripada molekul-molekul protein, maka molekul-molekul protein

akan mengendap.

Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Larutan protein

Larutan (NH4)2SO4


Reagen Millon

Reagen Biuret.

Prosedur :

Jenuhkan 3 mL larutan protein dengan amonium sulfat. Untuk pekerjaan ini : pertama,

tambahkan sedikit demi sedikit garam amonium sulfat, aduk hingga melarut.

Tambahkan lagi sedikit garam amonium sulfat dan aduk lagi, teruskan hingga sedikit

garam amonium yang tertinggal tidak melarut. Apabila larutan sudah jenuh, kemudian

saring. Uji kelarutan endapan di dalam air. Uji endapan dengan reagen Millon dan filtrat

dengan uji Biuret.

Pertanyaan

a. Jelaskan peranan garam amonium sulfat!

b. Jelaskan perbedaan salting in dan salting out pada percobaan di atas!

2.4 Uji Koagulasi

Stabilitas larutan protein ditentukan oleh struktur tersier atau struktur kwarterner

dari protein dalam larutan. Struktur tersier ini disebabkan oleh adanya interaksi ionik dan

interaksi non kovalen lainnya. Penambahan asam ke dalam larutan protein menyebabkan

ion-ion H+ dari asam akan terikat pada gugus-gugus yang bermuatan negatif sehingga

terjadi perubahan pengutuban dari molekul protein. Perubahan pengutuban ini

menyebabkan perubahan konformasi dari protein atau rusaknya struktur tersier atau

struktur kwarterner protein sehingga protein mengalami koagulasi.

Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Larutan asam asetat 1 M

Larutan protein

Reagen Millon

Prosedur :


Tambahkan 2 tetes larutan asam asetat 1 M ke dalam 5 mL larutan protein. Letakkan

dalam air mendidih selama 5 menit. Ambil endapan dengan batang pengaduk, uji

kelarutan endapan dalam air. Uji endapan dengan reagen Millon.

Pertanyaan

a. Apa fungsi asam asetat?

b. Bagaimana kelarutan endapan dalam air ?

2.5 Pengendapan protein dengan alkohol

Penambahan alkohol ke dalam larutan protein dapat menyebabkan protein

terkoagulasi. Koagulasi ini terjadi karena : pertama, alkohol dapat membentuk ikatan

dengan molekul protein, kedua molekul-molekul air yang mengelilingi molekul protein

ditarik oleh molekul-molekul alkohol. Kedua hal ini menyebabkan molekul protein

mengalami perubahan konformasi. Akibat perubahan konformasi ini molekul protein

terkoagulasi.

Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Larutan albumin

Bufer asetat pH 4,7 (1M)

Larutan HCl 0,1 M

Larutan NaOH 0,1 M

Etil alkohol 95%

Prosedur :

Masing-masing tabung (1,2,3) diisi larutan sesuai dengan tabel di bawah :

Tabung 1 2 3

Larutan albumin 5 mL 5 mL 5 ml

Larutan HCl 0,1 N 1 mL - -

Larutan NaOH 0,1 N - 1 ml -

Bufer asetat, pH 4,7 - - 1 mL

Etil alkohol 95 % 6 mL 6 mL 6 mL

Pertanyaan


a. Tabung mana yang menunjukkan protein tidak larut?

b. Bagaimana kelarutan albumin pada titik isoelektriknya?

2.6 Denaturasi protein

Denaturasi protein adalah perubahan struktur protein yang menyimpang dari

struktur alamiahnya (de-nature = penghilangan karakter alamiah). Struktur protein yang

telah berubah ini (terdenaturasi) dapat dikembalikan ke strukturnya semula (direnaturasi)

dengan mengubah lingkungan kelarutannya. Perubahan suhu atau perubahan pH yang tidak

terlalu ekstrem dapat menyebabkan protein mengalami denaturasi. Renaturasi dapat

dilakukan dengan mengubah suhu atau pH ke kondisinya semula. Misalnya, suatu protein

mempunyai kelarutan optimum pada pH 7,0. Jika pH-nya dinaikkan perlahan-lahan

menjadi 8,0, protein akan terdenaturasi (mengendap). Jika pH-nya diturunkan menjadi 7,0,

protein yang telah terdenaturasi akan larut.

Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Larutan albumin

Bufer asetat pH 4,7 (1M)

Larutan HCl 0,1 M

Larutan NaOH 0,1 M

Prosedur :

Isi masing-masing tabung (1,2,3) dengan larutan seperti tabel berikut:

Tabung 1 2 3

Larutan albumin 9 mL 9 mL 9 ml

Bufer asetat, pH 4,7 - - 1 mL

Larutan HCl 0,1 N 1 ml - -

Larutan NaOH 0,1 N - 1 mL -

Tempatkan ketiga tabung dalam air mendidih selama 15 menit dan dinginkan pada

temperatur kamar.

Pertanyaan


a. Pada tabung mana kelihatan larutan mengendap?

b. Perubahan apa yang berhubungan dengan denaturasi protein?

2.6 Uji belerang dalam protein

Belerang dalam protein dapat dioksidasi oleh oksidator menjadi ion sulfat. Ion

sulfat dalam suasana asam berekasi dengan ion Ba2+

membentuk endapan berwarna putih.

Percobaan

Alat :


Reagen dan bahan :

Fusion mixture (3 bagian Na2CO3 anhidrous dan 1 bagian KNO3)

Serbuk albumin telur

Larutan HCl

Larutan BaCl2

Prosedur :

Campur 0,5 gram serbuk albumin dengan dua kali berat fusion mixture. Panaskan dalam

cawan porselin sampai tak berwarna. Dinginkan dan larutkan dalam air panas. Saring

jika perlu. Asamkan filtrat dengan HCl. Panaskan hingga mendidih dan tambahkan

beberapa tetes larutan BaCl2.

Pertanyaan

a. Mengapa albumin memberikan uji positif untuk belerang?

b. Senyawa apa yang berupa endapan putih ?

c. Unsur-unsur apa yang biasa terdapat dalam protein, tetapi tidak terdapat dalam lipid

dan karbohidrat?


PERCOBAAN III

TITRASI POTENSIOMETRI ASAM AMINO

Pendahuluan

Semua asam amino mempunyai gugus ionisasi yang berperan sebagai asam dan

basa lemah, menerima dan memberikan proton pada saat perubahan pH berlangsung.

Seperti halnya ionisasi molekul yang lain, ionisasi asam amino juga mengikuti persamaan

Henderson-Hasselbalch :

)]asam(siterprotonabentuk[

)]basa(siterprotonatidakbentuk[logpKapH

Dari persamaan Henderson-Hasselbalch di atas dapat didefinisikan bahwa pKa adalah nilai

pH pada saat konsentrasi spesies bentuk tidak terprotonasi sama dengan spesies bentuk

terprotonasi.

Salah satu contoh aplikasi persamaan Henderson-Hasselbalch adalah pada titrasi

asam amino glisin dengan asam dan basa. Glisin memiliki dua gugus ionnisasi, yaitu gugus

karboksil dan gugus amino, dengan nilai pKa masing-masing 2,4 dan 9,6. Dalam air, pada

pH 6,0, glisin berada dalam bentuk ion dipolar, atau zwitter ion, di mana gugus

karboksilnya berada dalam keadaan tidak terprotonasi (COO-) dan gugus aminonya

terpotonasi (NH3+). Panambahan asam pada larutan glisin ini akan menurunkan pH dengan

cepat, tetapi kemudian turun perlahan-lahan karena memasuki daerah bufer. Titrasi lebih

lanjut akan memprotonasi sisa karboksil dalam larutan. Titrasi gugus amonium dengan

basa mengikuti pola yang sama. Secara spesifik, konsentrasi spesies tidak terprotonasi dan

terprotonasi pada setiap ion dapat dihitung dengan persamaan Henderson-Hasselbalch.

Titik potong antara titrasi gugus karboksil dan gugus amino, yaitu pada kondisi di mana

glisin secara keseluruhan tidak bermuatan (zwitter ion), disebut titik isoelektrik (pI,

Gambar 3.1).

Sebagian besar asam amino yang mengandung gugus karboksil dan gugus amino

memiliki nilai pKa yang mirip dengan glisin. Di samping kedua gugus ini, beberapa asam

amino memiliki gugus ionisasi lain yang turut mempengaruhi kurva titrasinya. Contohnya,

asam amino aspartat dan asam amino glutamat, keduanya memiliki gugus karboksil

tambahan, sedangkan asam amino lisin dan asam amino arginin memiliki gugus amino

tambahan.


Kambar 3.1 Kurva Titrasi Glisin

Percobaan

Alat :

Gelas kimia, buret, statif, pengaduk magnet, pH meter, Erlenmeyer,

Reagen dan bahan :

Kristal asam amino : glisin, lisin, dan glutamat

Larutan NaOH 2 N

Larutan H2SO4 2 N

Prosedur :

Larutkan 400 mg asam amino glisin ke dalam 40 mL aquades. Dengan menggunakan

pH-meter, buret dan pengaduk magnetik, larutan asam amino tersebut dititrasi dengan 2

N larutan H2SO4. Tiap penambahan volume larutan H2SO4 dan juga perubahan pH yang

terjadi dicatat. Titrasi diteruskan sampai tercapai pH 1,2. Pada tempat yang lain,

larutkan 400 mg asam amino yang sama ke dalam 40 mL aquades. Sekarang larutan ini

dititrasi dengan 2 N larutan NaOH dan catat volume larutan NaOH dan perubahan pH

yang terjadi. Titrasi dihentikan setelah tercapai pH 12,0. Lakukan juga titrasi 40 mL

aquadest sebagai blanko. Coba juga untuk asam-asam amino yang lain, seperti lisin dan

glutamat.

Pertanyaan

a. Buatlah kurva titrasi asam amino yang diselidiki (pH terhadap mL 2 N larutan H2SO4

dan 2 N larutan NaOH)!

pKa2

pKa1

pI

pH

Asam (%)

50 0 100 50 100

Basa (%)


b. Buatlah kurva titrasi asam amino yang diselidiki (pH terhadap ekuivalen H2SO4 dan

NaOH)! Tentukan harga pKa dari kurva tersebut dan bandingkan dengan harga pKa

yang ada pada literatur!

c. Hitung titik isoelektrik asam-asam amino yang diselidiki melalui harga pKa yang

diperoleh dan bandingkan harga titik isoelektrik yang diperoleh dengan harga pKa

literatur!


PERCOBAAN IV

TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Pendahuluan

Pada percobaan ini dibuat kurva titrasi dari asam amino yang diperoleh dari hasil

hidrolisis protein dengan menggunakan enzim protease. Selama hidrolisis suatu protein,

sejumlah gugus karboksil dan gugus amino bertambah terus. Penentuan secara kuantitatif

salah satu gugus akan dapat memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis dari

suatu protein. Menurut teori zwitterion, kalau satu asam amino dalam larutan dititrasi

dengan basa, berarti ion hidrogen dari gugus amonium yang dititrasi. Gugus amonium dari

asam amino bersifat bufer pada daerah pH tinggi, di atas pH 11, sehingga tidak mungkin

dititrasi pada titik akhir. Hal yang sama juga terjadi pada gugus karboksil yang bersifat

bufer pada pH rendah sehingga tidak mungkin juga dititrasi dengan basa.

Untuk mengatasi hal tersebut, formaldehid ditambahkan ke dalam larutan asam

amino agar bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan

gugus amonium membufer di daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik

akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator.

Percobaan

Alat :

Gelas kimia, Erlenmeyer, buret, statif, inkubator air, labu takar

Reagen dan bahan :

Larutan gelatin 5%

Larutan NaOH 0,2 M

Larutan HCl 0,1 M

Larutan fenolftalein 1%

Larutan formaldehid 40%, netralkan dengan alkali

Larutan larutan tripsin atau pankreatin 1%

Prosedur :

Siapkan 100 mL larutan gelatin. Tambahkan ke dalamnya 1 ml fenolftalein dan larutan

NaOH 0,2 M tetes demi tetes sampai warna merah muda timbul. Tambahkan 0,1 M HCl

tetes demi tetes sampai tepat warna merah muda tadi hilang (pH 8,0). Hati-hati jangan

terlalu asam. Rendam larutan gelatin yang telah dinetralisir tadi dalam inkubator air


pada suhu 38oC. Pada tabung yang lain, 25 mL larutan tripsin ditambahkan beberapa

tetes fenolftalein dan tetes demi tetes 0,2 M larutan NaOH sampai warna merah muda.

Kemudian teteskan 0,1 N larutan HCl sampai warna tersebut tepat hilang (pH 8,0).

Inkubasi dalam inkubator air pada suhu 38oC selama beberapa menit. Tambahkan

larutan tripsin tersebut ke dalam gelatin. Aduk perlahan. Setelah tercampur merata,

ambil 10 mL campuran, masukkan ke dalam 100 mL Erlenmeyer (larutan ini digunakan

sebagai kontrol atau waktu “Nol” menit). Didihkan untuk merusak enzim dan kemudian

dinginkan. Tambahkan 15 mL formalin netral dan 3 tetes fenolftalein. Pada interval

waktu 15, 30, 60, dan 120 menit dari waktu ke “Nol” lakukan hal yang sama seperti

pada kontrol. Pada masing-masing reaksi di atas dilakukam titrasi dengan 0,02 M

larutan NaOH sampai titik akhir warna merah muda.

Pertanyaan

a. Buatlah kurva yang menunjukkan hubungan antara volume basa terhadap waktu!

b. Buatlah kurva yang menunjukkan hubungan antara mg nitrogen asam amino terhadap

waktu!

c. Mengapa harus ditambahkan basa, asam dan fenolftalein pada formalin sampai

merah muda!

d. Apa tujuan titrasi formal ini !

Catatan : 1 mL larutan NaOH 0,1 N equivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino.


PERCOBAAN V

KROMATOGRAFI KERTAS ASAM AMINO

Pendahuluan

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan secara fisik, di mana unsur-unsur

yang akan dipisahkan terdistribusi di antara dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pada

proses kromatografi, berbagai komponen dipisahkan berdasarkan afinitas diferensial dari

komponen-komponen tersebut terhadap fasa diam (zat padat atau cairan) yang dibawa oleh

fasa gerak (gas atau cairan).

Kromatografi kertas merupakan salah satu jenis kromatografi yang memiliki fasa

diam dan fasa gerak berupa cairan yang tidak saling bercampur. Pada sistem ini biasanya

digunakan larutan jenuh dari suatu pelarut non polar (misalnya n-butanol) dan pelarut polar

(misalnya air). Campuran pelarut ini bermigrasi ke seluruh kertas, komponen polar

teradsorpsi pada media pendukung (selulosa) menghasilkan ribuan tetes-tetes kecil yang

terabsorpsi pada pendukung. Tetesan fasa diam yang teradsorpsi ini dilewati oleh fasa

gerak yang berupa pelarut non polar sehingga partisi atau pemisahan sampel campuran

terjadi.

Pada kromatografi kertas (campuran zat) diteteskan dengan pipa kapiler pada

kertas, kemudian campuran pelarut (eluen) bermigrasi melewati noda (spot) dengan arah ke

atas (ascending) atau ke bawah (descending). Lamanya proses migrasi bergantung pada

kestabilan kertas, pelarut yang dipilih, dan temperatur.

Gambar 5.1 Kromatografi kertas. (a) Posisi ascending (mendaki), (b) posisi descending

(menurun)


Jarak yang ditempuh oleh setiap senyawa dari garis dasar relatif terhadap jarak

tempuh pelarut/eluen didefinisikan sebagai Rf.

dasargarisdaripelarutditempuhyangJarak

dasargarisdarisampelditempuhyangJarakR f

Nilai Rf dari suatu senyawa pada sistem kromatografi kertas bergantung pada

banyak variabel, di antaranya sistem pelarut, temperatur, lamanya elusi, dan jenis kertas.

Karena dipengaruhi oleh banyaknya variabel, maka Rf suatu senyawa yang sudah diketahui

dijadikan standar atau patokan untuk menentukan Rf senyara lainnya. Untuk analisa

kualitatif, senyawa tertentu yang sudah diketahui digunakan bersama-sama dengan

senyawa yang akan diidentifikasi. Dua senyawa yang berbeda dalam satu sistem pelarut

tertentu dapat memiliki nilai Rf yang sama. Oleh karena itu, hasil analisa yang diperoleh

dengan teknik kromatografi kertas, harus dijustifikasi dengan metode lain.

Senyawa yang dianalisa dengan teknik kromatografi kertas dapat ditentukan

lokasinya pada kertas dengan berbagai cara. Bila senyawa yang diuji menyerap sinar UV

atau berfluoresensi dengan sinar UV, noda atau spot dapat dideteksi dengan penyinaran

menggunakan sinar UV di tempat yang gelap. Noda atau spot juga dapat ditentukan

lokasinya pada kertas dengan menggunakan senyawa pewarna, misalnya dengan ninhidrin.

Percobaan

Alat :

Pipa kapiler, kertas, ruang kromatografi, gelas kimia

Reagen dan bahan :

Larutan elusi (fase gerak) :

Ada 3 macam larutan elusi yang sering dipakai. Untuk kromatografi satu dimensi

hendaknya dipilih salah satu di antaranya, sedangkan untuk kromatografi dua dimensi

dipilih dua di antaranya :

(a) n-butanol : asam cuka : air = 25 : 6 : 25 (v/v). Campurlah sambil dikocok-kocok

dalam corong pisah : 100 mL n-butanol, 100 mL aquades, dan 24 mL asam asetat

glasial. Dua lapisan akan terjadi. Lapisan bawah dikumpulkan dalam beaker glass

dan ditaruh di dalam ruang kromatografi untuk menjenuhkan ruangan tersebut

dengan uapnya. Lapisan atas dikumpulkan juga dan lapisan inilah yang dipakai

sebagai larutan eluen.


(b) fenol : air = 100 : 39 (b/v). Perlu diperhatikan bahwa fenol yang dipakai harus

benar-benar murni.

(c) kollidin : 2,4-lutidin : air = 1 : 1 : 1 (v/v). Zat-zat ini harus benar-benar murni.

Kertas kromatografi : dipakai kertas saring Whatman No 1 yang ukurannya disesuaikan

dengan keperluan.

Larutan asam amino standar : larutan asam amino glisin, leusin, metionin, tirosin, triptofan.

Kadar larutan standar asam amino ini sekitar 1 mg per mL, dilarutkan dalam 75%

alkohol dan kalau perlu ditambahkan 1-3 tetes HCl pekat.

Larutan asam amino sampel

Larutan ninhidrin : buatlah larutan 0,25 % ninhidrin dalam aseton.

Prosedur :

Siapkan kertas kromatografi dengan ukuran 15x25 cm dan tandai dengan pensil 1,5 cm

dari tepi bawah. Kemudian dengan pipet mikro atau pipa kapiler totolkan larutan standar

asam amino dan sampel berdampingan dengan jarak 1,5 cm. Larutan ujung terletak 2 cm

dari pinggir kertas. Tiap-tiap tetesan harus dikeringkan dulu, misalnya dengan alat

pengering rambut. Haruslah diusahakan supaya cukup asam amino (sekitas 5 ug)

ditempatkan pada kertas tersebut, sedangkan besar noda hendaknya jangan melebihi

diameter 0,4 cm. Hendaknya kertas dijaga bersih dan sedapat-mungkin jangan disentuh

oleh jari, pakailah pinset. Mengapa? Yakinkan ruang kromatografi telah jenuh oleh uap

eluen. Kemudian kertas tersebut digantungkan dalam ruang kromatografi dan celupkan

tepi bawah kertas kromatografi dalam eluen, usahakan jangan sampai totolan asam

amino standar dan sampel terendam oleh eluen. Elusi asam amino standar dan sampel

sampai kira-kira eluen menempuh jarak 10 cm. Hentikan elusi dan tandai jarak yang

ditempuh oleh eluen dengan pensil. Kertas kromatografi selanjutnya dikeringkan pada

suhu 105-110o

C. Kemudian kertas disemprot dengan larutan ninhidrin dan dikeringkan

lagi pada suhu 105-110o

C selama 5 menit. Noda-noda asam amino yang berwarna akan

terlihat.

Pertanyaan

a. Hitung harga Rf tiap-tiap noda dan catat warnanya!

b. Tetapkan komponen asam-asam amino dalam larutan yang diselidiki dengan

membandingkan Rf-nya dengan Rf asam-asam amino standar!


PERCOBAAN VI

PENENTUAN KADAR PROTEIN SECARA LOWRY

Pendahuluan

Penentuan konsentrasi protein merupakan suatu proses yang rutin digunakan dalam

analisis biokimia. Ada beberapa metode yang biasa digunakan dalam rangka menentukan

konsentrasi protein, yaitu metode Biuret, metode Lowry, dan lain sebagainya. Masing-

masing metode mempunyai kekurangan dan kelebihan. Pemilihan metode yang terbaik dan

tepat untuk suatu pengukuran tergantung pada beberapa faktor, seperti banyaknya material

atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan pengukuran, alat

spektrofotometer yang tersedia ( spektofotometer VIS atau UV).

Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik, seperti reagen Folin-Ciocalteu telah

digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang kemudian dikenal

dengan metode Lowry. Dalam bentuk yang paling sederhana reagen Folin-Ciocalteu dapat

mendeteksi residu tirosin (dalam protein) karena kandungan fenolik dalam residu tirosin

yang mampu mereduksi reagen fosfotungstat dan fosfomolibdat menjadi tungstat dan

molibdenum yang berwarna biru. Reagen fosfotungstat dan fosfomolibdat ini merupakan

konstituen utama reagen Folin-Ciocalteu. Hasil reduksi ini menunjukkan puncak absorpsi

yan lebar pada daerah merah dari spektrum sinar tampak (600-800 nm).

Sensitifitas dari metode Folin-Ciocalteu ini mengalami perubahan yang cukup

signifikan apabila digabung dengan ion-ion Cu2+

(metode Biuret). Kompleks Cu-protein

yang dihasilkan oleh reagen Biuret akan menyebabkan reduksi pula pada fosfotungstat dan

fosfomolibdat dalam reagen Folin-Ciocalteu. Kira-kira 75% dari reduksi yang terjadi

diakibatkan oleh adanya kompleks Cu-protein tersebut, sementara residu-residu tirosin dan

triptofan mereduksi 25% sisanya.

Reagen Folin-Ciocalteu merupakan suatu komposisi kompleks yang diperoleh

dengan cara pemanasan refuks dari Na-tungstat dan Na-molibdat dengan asam ortofosfat.

Selain itu disertakan pula komponen-komponen lain untuk meningkatkan kestabilan reagen

yang dalam kondisi normal berwarna kuning pucat.

Pada saat menentukan konsentrasi protein dalam suatu sampel, harus dilakukan

pula pengukuran terhadap beberapa larutan protein standar yang memiliki rentang

konsentrasi tertentu di mana konsentrasi sampel protein berada di dalam rentang tersebut.


Protein dimasukkan pertama kali ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan air.

Seluruh tabung harus mempunyai volume akhir yang sama dan dilakukan pengadukan atau

pencampuran yang baik setelah penambahan zat atau reagen. Reagen penghasil warna

selalu ditambahkan terakhir dan biasanya diperlukan selang waktu tertentu untuk terjadinya

reaksi yang sempurna.

Percobaan

Alat :

Tabung reaksi, spektrofotometer, stopwatch, batang pengaduk atau vortex

Reagen dan bahan :

Reagen A : 2% Na2CO3 dalam 0,1 N larutan NaOH

Reagen B : 0,5% CuSO4.5H2O dalam 1% larutan Na atau K tartrat

Reagen Biuret : campur 50 mL reagen A dengan 1 mL reagen B. Buang setelah 1 hari

Reagen Folin-Ciocalteu 1 N (reagen fenol)

Larutan standar protein : buatlah larutan bovine serum albumin (BSA) dengan

konsentrasi antara 20 sampai 200 ug per mL.

Prosedur :

Campur larutan protein standar dan air sehingga volume akhir 1,0 mL. Campurkan pula

larutan sampel protein dengan air sehingga volume akhir 1,0 mL (lihat Tabel 6.1).

Tambahkan 5 mL reagen Biuret yang telah disiapkan ke dalam masing-masing tabung.

Inkubasi tepat 10 menit pada suhu lamar. Selang waktu ini sangat kritis. Gunakan

stopwatch (hidupkan start) ketika menambahkan larutan Biuret pada rabung 1, tunggu

hingga selang waktu tertentu (minimal 30 detik) sebelum menambahkan larutan Biuret

pada tabung 2, dan seterusnya. Setelah 10 menit, tambahkan 0,5 mL reagen fenol ke

dalam masing-masing tabung. Kocok segera dengan alat vortex atau pengaduk. Inkubasi

selama 30 menit pada suhu kamar. Waktu inkubasi ini dapat dimulai (start) setelah

penambahan/pencampuran reagen fenol ke dalam tabung terakhir. Baca absorbansinya

pada = 700 nm dengan spektrofotometer dengan menggunakan tabung 1 sebagai

blanko.

Tabel 6.1 Komposisi setiap Tabung pada Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry


Penambahan (mL) Nomor Tabung

1 2 3 4 5 6 7 8

Standar BSA (200 g/mL) - 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -

Sampel protein - - - - - - - X

H2O 1 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 - 1-X

Reagen Biuret 5 5 5 5 5 5 5 5

Aduk hingga tercampur merata. Inkubasi selama 10 menit pada suhu kamar

Reagen fenol 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Aduk segera hingga tercampur merata. Inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Baca

dengan menggunakan spektrofotometer pada 700 nm dengan tabung 1 sebagai blanko

%T700 nm

A700 nm

g/aliquot (g/tabung)

Pertanyaan

a. Buatlah kurva (A700nm terhadap g protein) dan tentukan konsentrasi protein dalam

larutan sampel !

b. Apakah kebaikan dan keburukan metode Lowry ini?

c. Berikan sedikitnya dua metode lain selain metode Lowry (secara spektrometri) yang

biasa digunakan untuk menentukan konsentrasi protein !


PERCOBAAN VII

KINETIKA REAKSI ENZIM

Pendahuluan

Enzim merupakan protein yang mengkatalisis reaksi-reaksi kimia dalam sistem

biologi. Seperti halnya katalis lain, enzim mempengaruhi laju reaksi pada saat

kesetimbangan tercapai, tetapi tidak mempengaruhi kesetimbangan total dari reaksi. Enzim

membantu reaksi dengan menyediakan jalur reaksi yang memiliki energi aktivasi lebih

rendah untuk transisi substrat menjadi produk dibandingkan dengan proses yang tidak

dikatalisis.

Tidak seperti reaksi yang tidak dikatalisis. Laju reaksi awal (Vo) dari reaksi yang

dikatalisis oleh enzim meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat hingga dicapai

keadaan, di mana penambahan substrat tidak lagi meningkatkan laju reaksi awal. Keadaan

di mana laju reaksi awal maksimum (Vmaks) dicapai pada kondisi substrat jenuh,

diilustrasikan pada Gambar 7.1. Pengamatan ini, seperti yang terjadi pada reaksi enzimatis

atau hidrolisis substrat tunggal, telah dijelaskan dengan postulat reaksi berikut, di mana E,

S, dan P masing-masing merupakan enzim, substrat, dan produk reaksi.

Reaksi berlangsug melalui pembentukan kompleks enzim-substrat (ES). Bila semua enzim

berada dalam keadaan ES (enzim dijenuhkan oleh substrat), maka laju reaksi akan

mencapai nilai maksimum (Vmaks).

Gambar 7.1 Hubungan Konsentrasi Substrat dan Laju Reaksi Enzimatis

E + S ES E +

P

k1

k2

k3

k4

KM

Vmaks

½ Vmaks

Vo


Michaelis dan Menten, dan kemudian Briggs dan Haldane, menggunakan skema

reaksi di atas untuk menurunkan persamaan matematik yang menggambarkan hubungan

antara laju reaksi awal dan konsentrasi substrat. Persamaan Michaelis-Menten adalah :

]S[K

]S[VV

M

makso

Dalam persamaan ini, Vmaks dan Vo adalah laju maksimum dan laju awal reaksi, [S]

adalah konsentrasi substrat, dan KM adalah konstanta Michaelis-Menten yang nilainya

sama dengan (k2 + k3)/k1.

Percobaan

Alat :

Stopwatch, inkubator air, sentrifuge klinis, kuvet, tabung reaksi, pipet ukur (1 mL, 5

mL, 10 mL), pengaduk, spektrofotometer, gelas kimia

Reagen dan bahan :

Larutan TCA (tri chloro acetate) 20%

Larutan Kasein 2% (b/v)

Bufer fosfat 0,1 M (pH 8,0)

Larutan Tripsin

Larutan NaOH 0,5 M

Reagen Folin-Ciocalteu

Prosedur :

Sediakan 10 buah tabung reaksi. Setiap tabung diisi dengan larutan seperti tabel

berikut.

No. Tabung Kasein (mL) Bufer fosfat (mL) Tripsin (mL)

I t = 0 menit 0,1 5,9 1

t = 20 menit 0,1 5,9 1

II t = 0 menit 0,5 5,5 1

t = 20 menit 0,5 5,5 1

III t = 0 menit 1,0 5,0 1

t = 20 menit 1,0 5,0 1

IV t = 0 menit 3,0 3,0 1

t = 20 menit 3,0 3,0 1

V t = 0 menit 5,0 1,0 1


t = 20 menit 5,0 1,0 1

Waktu inkubasi 20 menit

1. Inkubasi setiap tabung yang berisi larutan kasein dan pengaduknya selama 5 menit

dalam inkubator air 35oC. Sambil diaduk perlahan-lahan (jangan sampai berbusa),

tambahkan berturut-turut larutan bufer fosfat dan larutan tripsin (sesuai dengan tabel di

atas).

2. Inkubasi tepat 20 menit dalam inkubator air 35oC dihitung mulai tripsin ditambahkan,

reaksi dihentikan dengan penambahan 3 mL TCA 20% ke dalam masing-masing tabung

disertai pengadukan yang kuat. Agar pengendapan berlangsung sempurna diamkan

selama 30 menit dalam air es.

3. Selanjutnya sentrifugasi selama 10 menit, kemudian saring menggunakan kertas saring.

4. Filtrat dikerjakan menurut cara ANSON (lihat di bawah).

Waktu t = 0 menit

Dalam tabung reaksi berisi pengaduk, masukkan larutan bufer dan larutan enzim,

tambahkan masing-masing 3 mL larutan TCA 20%, inkubasi 30 menit dalam penangas

35oC. Terakhir tambahkan larutan kasein (semua pengukuran sesuai dengan tabel).

Diamkan selama 30 menit dalam air es, selanjutnya sentrifugasi selama 10 menit,

kemudian saring menggunakan kertas saring. Filtrat dikerjakan melalui cara ANSON (lihat

di bawah).

Metode ANSON

Campurkan 2 mL TCA-filtrat (dari percobaan di atas) dengan 4 mL larutan NaOH

0,5 M. Tambahkan 1 mL larutan Folin-Ciocalteu, lalu aduk. Diamkan selama 10 menit,

kemudian tetapkan serapannya pada 650 nm.

Pertanyaan

a. Gambarkan grafik yang menunjukkan hubungan antara 1/V terhadap 1/[S]!

b. Dari grafik pada soal nomor a, tentukan Vmaks dan KM !

c. Apa yang harus dilakukan seandainya warna larutan yang hendak diukur dengan

spektrofotometer terlalu gelap ?


PERCOBAAN VIII

PENGARUH KONSENTRASI ENZIM TERHADAP AKTIVITASNYA

Pendahuluan

Jumlah enzim dalam larutan atau ekstrak jaringan tertentu dapat diuji secara

kuantitatif dari daya katalitiknya. Untuk tujuan ini, perlu diketahui : 1) persamaan

keseluruhan reaksi yang dikatalisis, 2) suatu prosedur analitik untuk menentukan

berkurangnya substrat atau terbentuknya produk reaksi, 3) apakah enzim memerlukan

kofaktor, seperti ion logam atau koenzim, 4) ketergantungan aktivitas enzim pada

konsentrasi substrat, yaitu KM bagi subtrat, 5) pH optimum, dan 6) daerah suhu yang

memungkinkan enzim diuji dalam keadaan stabil dan memiliki aktivitas tinggi. Biasanya,

enzim diuji pada pH optimum, pada suhu kisaran 25oC sampai dengan 38

oC, dan pada

konsentrasi substrat mendekati jenuh. Pada keadaan ini, laju reaksi awal biasanya

sebanding dengan konsentrasi enzim, sedikitnya pada kisaran konsentrasi enzim tertentu

(yaitu pada daerah linier kurva laju reaksi sebagai fungsi dari konsentrasi enzim (Gambar

8.1). Setelah melewati daerah linier, aktivitas enzim terhambat atau menurun. Dengan

demikian, daerah tersebut tidak tepat digunakan dalam pengkajian aktivitas enzim.

Gambar 8.1 Karakteristik Kurva Laju Reaksi sebagai Fungsi dari Konsentrasi Enzim

Aktivitas didefinisikan sebagai ukuran jumlah berkurangnya substrat (atau

terbentuknya produk) per satuan waktu, yang dipengaruhi oleh jumlah enzim yang

digunakan untuk pengujian. Pada tahun 1961, komisi enzim dari IUB (International Union

of Biochemistry) mendefinisikan satuan aktivitas enzim, unit (U), yang kemudian dikenal

sebagai International Unit (IU), yaitu jumlah enzim yang menyebabkan berkurangnya 1

mol substrat per menit pada kondisi tertentu. Kemudian pada tahun 1973, komisi

Biochemical Nomenclature memperkenalkan katal (kat) sebagai satuan aktivitas enzim

mol/min

Konsentrasi Enzim


sistem internasional (SI), yaitu Kat didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menyebabkan

hilangnya 1 mol substrat per detik pada kondisi tertentu. Kedua satuan tersebut banyak

digunakan hingga saat ini.

Terdapat hubungan langsung antara jumlah unit aktivitas dengan jumlah enzim

(total protein content) yang diujikan. Hubungan ini disebut sebagai aktivitas spesifik yang

didefinisikan sebagai jumlah unit enzim per miligram protein atau katal per kg protein.

Aktivitas spesifik dapat digunakan sebagai ukuran kemurnian enzim; nilainya meningkat

selama pemurnian suatu enzim dan menjadi maksimum dan tetap (konstan) jika sudah

berada pada keadaan murni.

Percobaan

Alat :

Tabung reaksi, pengaduk, stopwatch, thermostat, corong, spektrofotometer

Reagen dan bahan :

Larutan TCA 20% (asam trikloroasetat). Larutan ini harus disimpan dalam lemari es

sehingga tetap baik untuk beberapa bulan.

Larutan kasein 1%. Larutkan 1 gram kasein dalam 100 mL 0,1 M bufer fosfat (pH=8,0)

dengan jalan pemanasan di atas air mendidih selama 20 menit. Kalau perlu

tambahkan aquadest untuk mengganti air yang menguap. Pakailah Erlenmeyer 250

mL, larutan ini harus disimpan dalam lemari es. Walaupun begitu sesudah 10 hari

hendaknya jangan dipakai.

Larutan bufer fosfat 0,1 M (pH=8,0). Timbang NaH2PO4 yang diperhitungkan untuk

membuat larutan 250 mL. Senyawa ini dilarutkan dalam air (lebih kurang 200 mL)

dan dengan penambahan 0,5 M larutan NaOH pH-nya dibuat tepat 8,0. Untuk ini

dipakai pH meter. Kemudian larutan tersebut dipindahkan secara kuantitatif ke dalam

labu takar 250 mL dan ditambahkan air sampai garis. Larutan bufer ini disimpan

dalam lemari es.

Larutan tripsin. Larutkan 8 gram tripsin ke dalam 20 mL 0,1 M bufer fosfat (pH=8,0).

Simpan larutan ini dalam lemari es dan dengan demikian larutan akan tetap baik

selama kurang lebih 1 minggu.

Prosedur :

1. Inkubasi 5 mL 1% larutan kasein dalam tabung reaksi selama 5 menit pada 35oC.


2. Tambahkan larutan bufer fosfat dan larutan tripsin sambil diaduk perlahan-lahan

(jangan sampai berbusa).

3. Inkubasi pada 35oC selama tepat 20 menit dihitung mulai enzim ditambahkan.

4. Reaksi dihentikan dengan penambahan 3 mL larutan TCA 20% yang disertai dengan

pengadukan yang kuat.

5. Diamkan selama 30 menit pada suhu rendah (air es) supaya pengendapan protein

termasuk tripsin berlangsung sempurna.

6. Selanjutnya sentrifugasi selama 10 menit dan saring melalui saringan kertas. Filtrat

dikerjakan menurut cara ANSON (lihat di bawah).

7. Untuk harga waktu nol menit (t=0 menit), harus dikerjakan dengan cara berikut.

a) Dalam tabung yang ada alat pengaduknya dimasukkan terlebih dahulu larutan

bufer dan larutan enzim, baru kemudian ditambahkan 3 mL larutan TCA 20%,

diaduk kuat dan terakhir tambahkan 5 mL larutan kasein 1 %.

b) Didiamkan 30 menit pada suhu rendah, selanjutnya sentrifugasi selama 10 menit

dan saring dengan menggunakan kertas saring.

c) Filtrat atau supernatan yang diperoleh dikerjakan menurut cara ANSON.

Tabung Waktu

Substrat kasein 1%

(dalam bufer fosfat

0,1 M, pH=8,0)

Bufer

fosfat,

pH=8,0

Larutan tripsin

(dalam bufer fosfat

0,1 M, pH=8,0)

I t = 0 menit

t = 20 menit

5 mL

5 mL

1,5 mL

1,5 mL

0,5 mL

0,5 mL

II t = 0 menit

t = 20 menit

5 mL

5 mL

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

III t = 0 menit

t = 20 menit

5 mL

5 mL

0,5 mL

0,5 mL

1,5 mL

1,5 mL

IV t = 0 menit

t = 20 menit

5 mL

5 mL

0 mL

0 mL

2,0 mL

2,0 mL

Metode ANSON

1. Campurkan 2 mL TCA-filtrat dengan 4 mL larutan NaOH 0,5 M.

2. Tambahkan 1 mL larutan encer reagen fenol Folin-Ciocalteu (1 vol. reagen fenol di

tambah 1 vol. air sehingga mengandung 1 N asam).

3. Diamkan campuran selama 10 menit.

4. Tetapkan esktingsinya pada 650 nm.


Pertanyaan

a. Apa maksud atau tujuan dilakukan penyaringan dan mengapa hal itu harus

dilakukan?

b. Mengapa dilakukan pengukuran absorbansi pada t = 0 menit ?

c. Buatlah grafik yang menggambarkan pengaruh konsentrasi enzim terhadap

aktivitasnya (jika aktivitas berbanding lurus dengan [P] dan [P] berbanding lurus

dengan A)!


PERCOBAAN IX

PENGARUH INHIBITOR TERHADAP AKTIVITAS ENZIM

Pendahuluan

Inhibitor merupakan suatu senyawa yang dapat menghambat atau menurunkan laju

reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Terdapat dua jenis inhibitor utama, yaitu inhibitor yang

bekerja secara tidak dapat balik (irreversible) dan inhibitor yang bekerja secara dapat balik

(reversible).

Inhibitor tidak dapat balik bekerja dengan mengikat sisi aktif enzim melalui reaksi

irreversibel, E + I EI, sehingga setelah inhibitor mengikat enzim, inhibitor tidak dapat

dipisahkan dari sisi aktif enzim. Keadaan ini menyebabkan enzim tidak dapat mengikat

substrat terhadap atau inhibitor merusak beberapa komponen (gugus fungsi) pada sisi

katalitik molekul enzim.

Inhibitor dapat balik mengikat sisi aktif enzim melalui reaksi reversible dan

inhibitor ini dapat dipisahkan atau dilepaskan kembali dari ikatannya, misalnya dengan

dialisis. Inhibitor dapat balik terdiri dari tiga jenis, yaitu inhibitor yang bekerja secara

kompetitif, non-kompetitif, dan un-kompetitif.

Inhibitor yang bekerja secara kompetitif umumnya mempunyai struktur tiga

dimensi yang mirip dengan substrat yang reaksinya dikatalisis oleh inhibitor tersebut. Oleh

karena itu, dalam suatu campuran reaksi, inhibitor akan berkompetisi dengan substrat

untuk terikat pada sisi aktif enzim. Enzim yang telah mengikat inhibitor tidak dapat

bereaksi dengan substrat untuk menghasilkan produk, sedangkan enzim yang telah

mengikat substrat dapat menghasilkan produk, tetapi tidak dapat berikatan dengan

inhibitor.

Contoh inhibitor kompetitif adalah malonat yang menginhibisi reaksi yang dikatalisis oleh

enzim suksinat dehidrogenase.

E + S ES E + P E + I EI


CH2

COO-

+CH2

COO-

E-FAD E-FADH2+

COO-

CH

COO-

CH

Suksinat

Enzim suksinat dehidrogenase mengkatalisis pembebasan dua atom hidrogen dari suksinat,

yaitu satu dari masing-masing kedua gugus metilennya (-CH2-). Dehidrogenasi suksinat ini

dihambat oleh malonat yang menyerupai suksinat karena sama-sama memiliki gugus

karboksil bermuatan negatif yang berjarak tepat sehingga dapat menempati sisi aktif enzim.

Akan tetapi, malonat tidak terhidrogenasi oleh enzim suksinat dehidrogenase; malonat

hanya menempati sisi aktif enzim tersebut dan menguncinya sehingga enzim tidak dapat

bekerja pada substrat.

Pengaruh inhibitor kompetitif dalam menginhibisi reaksi tergantung pada

konsentrasi inhibitor, konsentrasi substrat serta afinitas relatif substrat dan inhibitor

terhadap enzim. Pada konsentrasi tertentu dari inhibitor dan enzim, jika konsentrasi

substrat rendah, maka inhibitor mempunyai kemampuan berkompetisi lebih besar

dibandingkan dengan substrat dalam mengikat enzim sehingga tingkat atau derajat

inhibisinya tinggi. Namun, pada konsentrasi inhibitor dan enzim yang sama, jika

konsentrasi substrat tinggi, maka inhibitor mempunyai kemampuan berkompetisi lebih

kecil daripada substrat dalam mengikat enzim, sehingga derajat inhibisinya menjadi

rendah. Jika konsentrasi substrat sangat tinggi, maka jumlah molekul substrat jauh

melebihi jumlah molekul inhibitor. Pada keadaan ini pengaruh inhibitor menjadi sangat

kecil (dapat diabaikan).

Vo

KM

Dengan inhibitor

KM’

Tanpa inhibitor

½ Vmaks

Vmaks

[S]

Suksinat

dehidrogenase


Gambar 9.1 Pengaruh Inhibitor Kompetitif pada Plot Michaelis-Menten (pada [Eo] Tetap)

Plot Michaelis-Menten di atas menunjukkan bahwa pada konsentrasi substrat tinggi,

pengaruh inhibitor dapat ditiadakan, Vmaks = Vmaks reaksi tanpa inhibitor.

Inhibitor yang bekerja secara unkompetitif hanya dapat mengikat kompleks enzim-

subtrat, tidak dapat mengikat molekul enzim bebas.

Kompleks substrat-enzim-inhibitor adalah kompleks yang tidak aktif karena tidak dapat

menghasilkan produk.

Inhibitor yang bekerja secara nonkompetitif dapat berikatan baik dengan molekul

enzim bebas maupun dengan kompleks enzim-substrat menghasilkan kompleks inhibitor

yang tidak aktif (tidak menghasilkan produk).

Inhibitor nonkompetitif mengikat enzim pada sisi pengikatan yang berbeda dengan

substrat. Dengan terikatnya inhibitor, aktivitas katalitik enzim menjadi rusak. Hal ini

mungkin disebabkan oleh inhibitor terikat pada sisi katalitik enzim atau inhibitor terikat

pada sisi lain (bukan sisi katalitik). Tetapi pengikatannya menyebabkan perubahan

konformasi enzim yang mempengaruhi keadaan sisi katalitik walaupun tidak

mempengaruhi sisi pengikatan substrat.

Percobaan

Alat :

Tabung reaksi, batang pengaduk

Reagen dan bahan :

Larutan metilen biru 0,01%

H2O

Bufer fosfat 0,1 M (pH=7,4)

E + S ES E + P

ESI

+ I

- I

E + S ES E + P

ESI

+ I

- I

+ I

- I

+

S

- S

+

S

- S

EI


Natrium suksinat 0,1 M

Natrium malonat 0,1 M

Homogenat hati

Parafin oil

Prosedur :

1. Siapkan tabung reaksi.

2. Isi tabung dengan zat-zat seperti ditunjukkan dalam tabel. Aduk hingga homogen.

3. Tambahkan 2 mL homogenat hati pada masing-masing tabung, aduk segera (secara

perlahan) dan tambahkan beberapa tetes parafin oil untuk menutup permukaan

larutan. Catat waktu (to).

4. Amati perubahan warna tiap tabung. Catat waktu (t) apabila perubahan warna telah

sempurna (bandingkan dengan warna tabung 5 sebagai standar).

Tabung Methylene

blue 0,01%

H2O

(mL)

Bufer fosfat

0,1 M pH

7,4

Na-suksinat

0,1 M

Na-malonat

0,1 M

Homogenat

hati

1 1 mL 3 2 mL 2 mL - 2 mL

2 1 mL 2,8 2 mL 2 mL 0,2 mL 2 mL

3 1 mL 2,6 2 mL 2 mL 0,4 mL 2 mL

4 1 mL 0,6 2 mL 4 mL 0,4 mL 2 mL

5 1 mL 6 2 mL - - 2 mL

Pertanyaan

a. Jelaskan reaksi enzim yang menerangkan perubahan warna dalam percobaan !

b. Jelaskan pengaruh inhibitor pada tabung 1,2,3,4. Urutkan tingkat atau derajat

inhibisinya dari yang terkecil sampai yang terbesar ! Jelaskan mengapa demikian !

c. 1) Termasuk jenis inhibisi apakah percobaan yang dilakukan ?

2) Bagaimana cara menurunkan atau meniadakan pengaruh inhibitor terhadap jenis

reaksi inhibisi pada nomor 2 ?


PERCOBAAN X

PENENTUAN TRANSAMINASE GLUTAMAT-PIRUVAT SERUM DARAH

Pendahuluan

Pada metabolisme asam amino, gugus -amino dari ke-20 asam L-amino yang

biasa dijumpai dalam protein dapat dipindahkan melalui reaksi degradasi oksidatif.

Pemindahan gugus -amino dari kebanyakan asam L-amino dikatalisis oleh enzim yang

disebut transmainase atau aminotransferase. Pada reaksi ini gugus -amino dipindahkan

secara enzimatik ke atom karbon pada -ketoglutarat sehingga dihasilkan asam -keto,

analog dari asam amino yang bersangkutan. Reaksi ini menyebabkan aminasi -

ketoglutarat, membentuk L-glutamat.

Asam L--amino + -ketoglutarat asam -keto + L-glutamat

CH2

COO-

COO-

CH2

Glutamat

H C NH3+OCH

-ketoglutarat

CH2

COO-

COO-

CH2

NH3+CH

Asam L-amino

R

COO- COO-

R

Asam -keto

H C NH3++ +transaminase

(piridoksoal fosfat)

Kebanyakan enzim transaminase bersifat spesifik bagi -ketoglutarat sebagai

molekul penerima gugus amino. Namun demikian, enzim tersebut tidak terlalu spesifik

bagi substratnya, yaitu asama L-amino yang memberikan gugus aminonya. Berikut ini

beberapa transaminase yang paling penting, dinamakan sesuai dengan molekul pemberi

gugus aminonya.

Asam L-alanin + -ketoglutarat piruvat + L-glutamat

Asam L-aspartat + -ketoglutarat oksaloasetat + L-glutamat

Asam L-leusin + -ketoglutarat -ketoisokaroat + L-glutamat

Asam L-tirosin + -ketoglutarat p-hidroksifenilpiruvat + L-glutamat

Hati, ginjal, dan otot mengandung banyak transaminase glutamat-oksaloasetat

(TGO), disebut juga sebagai aspartat aminotransferase dan transaminase glutamat-piruvat

(TGP), disebut juga sebagai alanin aminotransferase. Serum pada keadaan normal

menunjukkan adanya aktivitas enzim tersebut, tetapi rendah. Hanya apabila terjadi

kerusakan sel pada jaringan-jaringan tersebut, maka enzim-enzim intraseluler di atas akan


keluar dari sel dan masuk ke dalam darah. Kenaikaan aktivitas TGO dan TGP serum, dapat

dijumpai pada jenis penyakit yang menyangkut jaringan tertentu.

Percobaan

Alat :

Termostat

Tabung reaksi

Batang pengaduk

spektrofotometer

Reagen dan bahan :

Bufer fosfat pH 4,7 (larutkan 11,3 gram Na2HPO4 anhidrous bersama dengan 2,7 gram

KH2PO4 anhidrous dalam 1 liter air)

Substrat (larutkan 8,9 gram asam L-alanin ke dalam NaOH 1 N sehingga pH-nya 7,4

dengan pH meter, diperlukan sekitar 90 mL NaOH. Tambahkan 0,146 gram asam -

ketoglutarat sampai larut dan tambahkan sedikit NaOH 1 N sampai pH-nya 7,4.

Akhirnya tambahkan bufer fosfat sampai volumenya 500 mL. Larutan substrat ini

konsentrasinya masing-masing 200 mM asam L-alanin dan 2 mM asam -ketoglutarat)

Larutan standar piruvat (4 mM)

Larutan 2,4-dinitrofenilhidrazin (larutkan 19,8 2,4-dinitrofenilhidrazin ke dalam 10 mL

HCl pekat. Encerkan dengan aquades sampai volumenya 100 mL dan simpan pada

suhu kamar dalam botol coklat)

Larutan 0,4 N NaOH (larutkan 16 gram NaOH ke dalam aquades sampai volumenya 1

liter).

Serum

Prosedur :

Pipet 0,5 mL substrat ke dalam tabung reaksi dan inkubasi dalam termostat panangas air

pada suhu 37oC selama 3 menit. Tambahkan 0,1 mL serum, campur dengan baik dan

inkubasi selama 60 menit. Kemudian ambillah tabung tersebut dari penangas air dan

masukkan segera 0,5 mL larutan 2,4-dinitrofenilhidrazin (DNFH), Kocok dengan baik.

Sebagai kontrol (campurkan 0,5 mL substrat dengan 0,5 mL larutan DNFH. Setelah

tercampur, tambahkan 0,1 mL serum). Sebagai blanko (campurkan 0,5 mL substrat

dengan 0,1 mL aquades dan 0,5 mL larutan DNFH). Sebagai standar (campurkan 0,1


mL larutan standar piruvat dengan 0,4 mL substrat, 0,1 mL aquades, dan 0,5 mL larutan

DNFH). Biarkan DNFH pada sumua tabung bereaksi pada suhu kamar selama 20 menit.

Kemudian tambahkan 5 mL 0,4 N NaOH. Campur dengan baik dan diamkan pada suhu

kamar selama 10 menit. Tetapkan serapannya pada 510 mm.

Perhitungan :

Piruvat yang terbentuk per menit oleh per liter serum :

piruvatmM4xBS

KT

Keterangan :

T = serapan untuk zat yang diperiksa

K = serapan untuk kontrol

S = serapan untuk standar

B = serapan untuk blanko

Piruvat yang terbentuk per menit oleh per liter serum :

μmol67xBS

KT

0,1

10000,1x

1000

1x4x

BS

KT

Batas tertinggi untuk harga normal adalah 23 mmol piruvat per menit per liter serum.

Pertanyaan

a. Bandingkan hasil perhitungan dari percobaan dengan harga normal !

b. Mengapa dilakukan pengujian terhadap larutan kontrol, blanko, dan standar?

c. Jelaskan dengan disertai reaksi-reaksi kimianya penentuan transaminase glutamat-

oksaloasetat secara kolorimetri dengan 2,4-dinitrofenilhidrazin !

d. Sebutkan beberapa penyakit yang menyebabkan kenaikan aktivitas transaminase

glutamat-oksaloasetat !


PERCOBAAN XI

ANALISIS RESTRIKSI PLASMID DNA

Pendahuluan

DNA (deoxyribonucleotide acid) merupakan suatu polinukleotida yang disusun

oleh monomer dATP, dTTP, dGTP, dCTP yang terikat melalui ikatan fosfodiester (Gambar

11.1). DNA merupakan untai ganda berbentuk heliks yang kedua untainya mempunyai

urutan nukleotida yang komplemen dan terikat oleh ikatan hidrogen. DNA merupakan

materi genetik yang menentukan sifat dari suatu organisme. DNA terdapat dalam

kromosom, mitokondria, plasmid, dan virus.

Gambar 11.1 Struktur DNA double helix, (a) padangan struktur skematik, (b) struktur yang

lebih detail

Gambar 11.2 Plasmid pBR322

Bakteri menghasilkan enzim yang dapat mendegradasi DNA. Salah satunya adalah

enzim restriksi endonuklease tipe II. Enzim ini mengkatalisa hidrolisa ikatan fosfodiester

pada DNA untai ganda. Enzim restriksi mengenal urutan nukleoptida yang spesifik pada


DNA untai ganda. Enzim ini berfungsi untuk mendegradasi molekul DNA asing, artinya

enzim ini berguna untuk petahanan bakteri. DNA sel bakteri sendiri mengalami modifikasi

agar tidak dapat dikenali oleh enzim restriksi sehingga tidak akan didegradasi oleh

enzimnya sendiri. Gambar 11.2 ditunjukkan plasmid pBR322 dengan tempat pemotongan

enzim restriksi. Salah satu contoh enzim restriksi adalah EoRI (nama enzim merupakan

singkatan dari bakteri sumbernya, yaitu Escherichia coli strain R, sedangkan angka I

merupakan enzim restriksi pertama yang ditemukan dalam E. coli). Tempat pemotongan

EcoRI merupakan heksanukleotida dengan urutan yang spesifik (5’---GAATTC---3’). Dua

ikatan fosfodiester dihidrolisis oleh enzim sehingga menghasilkan dua fragmen.

Sebanyak kurang lebih 200 enzim restriksi telah disiolasi dan dikarakterisasi.

Enzim ini digunakan dalam rekayasa genetika untuk memotong DNA. Enzim ini sering

digunakan untuk memotong plasmid sehingga dapat digabungkan dengan fragmen DNA

asing untuk menghasilkan DNA rekombinan. Enzim restriksi juga digunakan untuk analisa

DNA dan konstruksi peta restriksi dari suatu plasmid. Gambar 11.2 menunjukkan plasmid

restriksi pBR322. Plasmid pBR322 mempunyai urutan pasang basa dan mempunyai

beberapa tempat pemotongan enzim restriksi.

Tujuan percobaan ini adalah untuk membuat analisa restriksi plasmid DNA setelah

dipotong dengan beberapa enzim restriksi. DNA adalah suatu molekul bermuatan negatif.

Pemotongan plasmid DNA oleh enzim restriksi akan menghasilkan fragmen DNA linier.

Fragmen DNA akan bermigrasi dalam medium pendukung agarosa dalam suatu medan

listrik dengan kecepatan berbanding terbalik dengan ukurannya (Gambar 11.3).

Gambar 11.3 Alat untuk slab gel electrophoresis

5’---GGATCC---3’ 5’---G GATCC---

3’

3’---CCTAGG---5’ 3’---CCTAG G---

5’

EcoRI H2O

+


Fragmen DNA atau DNA hasil elektroforesis divisualisasikan dengan merendam gel hasil

elektroforesis dalam larutan etidium bromida. Fragmen DNA yang mengikat etidium

bromida akan mengalami fluoresensi jika disinari dengan sinar UV. Untuk menentukan

ukuran fragmen DNA hasil pemisahan, digunakan DNA standar (biasanya DNA ) yang

telah dipotong dengan enzim restriksi tertentu yang ukurannya telah diketahui. Tabel 11.1

menunjukkan fragmen DNA hasil pemotongan oleh enzim restriksi HindIII.

Tabel 11.1 Fragmen hasil pemotongan DNA oleh HindIII

No. Fragmen DNA Ukuran dalam kilobasa Ukuran dalam Dalton (x106)

1 23,3 15,1

2 9,5 6,1

3 6,4 4,2

4 4,2 2,7

5 2,2 1,4

6 1,8 1,2

7 0,53 0,34

8 0,125 0,08

Pada percobaan ini akan dilakukan pemotongan plasmid pBR322 oleh berbagai enzim

restriksi. Fragmen DNA yang dihasilkan dielektroforesis dalam gel agarosa. Hasil

elektroforesis divisualisasikan di bawah lampu UV.

Percobaan

Alat :

Alat elektroforesis, power supply, lampu UV, inkubator 37oC

Reagen dan bahan :

Enzim restriksi EcoRI, EcoRV, dan PstI

Bufer TAE (0,04 M Tris-asetat; 0,002 M EDTA, pH 7,8)

1% gel agarosa dalam TAE

Gel-loading buffer (0,04 M Tris-asetat mengandung 50% gliserol dan 0,25%

bromphenol blue, pH = 8,0).

Perhatian : Etidium bromida adalah senyawa mutagenik dan karsinogenik. Gunakan sarung

tangan dan jas lab selama bekerja di bawah lampu UV karena sinar UV dapat merusak

mata dan kulit. Jangan menyentuh alat elektroforesis yang sedang dihidupkan.


Prosedur :

Pemotongan DNA oleh enzim restriksi

1. Masukkan masing-masing komponen campuran ke dalam tabung Eppendorf, seperti

pada tabel berikut.

Penambahan (L) Nomor tabung

1 2 3 4

DNA (0,2-1,0 g) 2 - - -

pBR322 (0,2-1,0 g) - 2 2 2

Bufer enzim 10X 2 2 2 2

Enzim restriksi HindIII (10.000 unit) 0,5 - - -

Enzim restriksi EcorRI (10.000 unit) - 0,5 - -

Enzim restriksi EcoRV (10.000 unit) - - 0,5 -

Enzim restriksi PstI (10.000 unit) - - - 0,5

ddH2O 12,5 12,5 12,5 12,5

2. Inkubasi campuran reaksi di atas pada 37oC selama 1 jam.

Elektroforesis gel agarosa

1. Tambahkan loading buffer ke dalam campuran reaksi hasil pemotongan DNA oleh

enzim restriksi.

2. Tambahkan bufer elektroforesis ke dalam tank (tempat elektroforesis).

3. Masukkan 10 L campuran yang telah ditambahkan loading buffer ke dalam sumur

gel agarosa dan pasang penutup.

4. Hubungkan kabel ke power supply dan lakukan elektroforesis pada 50-70 Volts.

5. Matikan power supply ketika tracking dye (warna penanda) sampai pada ujung gel.

6. Angkat gel dan masukkan ke dalam larutan etidium bromida.

7. Periksa DNA di bawah lampu UV.

Pertanyaan

a. Buat kurva kalibrasi untuk fragmen DNA standar!

b. Tentukan ukuran fragmen DNA plasmid pBR322 yang telah dipotong dengan

enzim restriksi dan buat peta plasmidnya!


PERCOBAAN XII

PENENTUAN KADAR GLUKOSA DALAM DARAH

Pendahuluan

Perubahan konsentrasi senyawa tertentu dalam tubuh dapat memberikan indikasi

mengenai fungsi metabolisme dalam tubuh. Glukosa merupakan senyawa penting dalam

tubuh yang berfungsi sebagai sumber energi. Kadar glukosa normal dalam darah adalah 70-

110 mg/dL. Kadar glukosa yang terlalu tinggi dalam darah menunjukkan bahwa seseorang

sedang mengalami diabetes.

Darah mengandung sel darah merah, sel darah putih, protein, dan glukosa yang

terlarut dalam plasma darah. Untuk menentukan kadar glukosa dalam darah, sampel darah

harus diberi perlakuan khusus. Protein harus diendapkan terlebih dahulu agar tidak

mengganggu analisa darah. Sampel darah kemudian dipanaskan dengan larutan Cu2+

dalam

suasana basa. Glukosa mempunyai gugus aldehid bebas yang dalam larutan berada dalam

bentuk setimbang dengan bentuk enediol (Gambar 12.1). Dalam suasana basa, bentuk

enediol dominan dan mereduksi ion kupri (Cu2+

). Cu2O yang terbentuk kemudian

direaksikan dengan asam fosfomolibdat yang akan memberikan warna biru (molybdenium

blue). Intensitas warna yang terbentuk diukur dengan spektrofotometer. Konsentrasi

glukosa ditentukan dengan menggunakan kurva standar.

O

CH2OH

OH

OH

OHHO HO

OH

OH

OH

CH2OH

OH

Gambar 12.1 Struktur glukosa dalam bentuk hemiasetal dan aldehid

Percobaan

Alat :

Sentrifuge klinis, spektrofotometer, tabung reaksi

Reagen dan bahan :

Larutan Ba(OH)2 0,3 N

Larutan ZnSO4 5 %

Larutan standar glukosa 1,00 mg/mL


Reagen arsenomolibdat (500 gram kristal amonium molibdat dilarutkan dalam 90 mL

air, lalu tambahkan 4,2 mL H2SO4 pekat sambil daduk, dinginkan. Kristal Na2AsO4.7

H2O sebanyak 0,6 gram dilarutkan dalam 5 mL air. Larutan ini dicampur dengan

larutan pertama dan aduk. Larutan yang berwarna kuning bening ini disimpan dalam

botol coklat dan diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37oC. Setelah itu simpan

dalam lemari es)

Larutan Nelson A (1,5 gram garam natrium-kalium tartrat, 3,0 Na2CO3 anhidrous, 2,0

gram NaHCO3 dan 18 gram Na2SO4 anhidrous dilarutkan dalam air sambil diaduk dan

encerkan hingga volume 100 mL)

Larutan Nelson B (2,0 gram CuSO4.5 H2O dilarutkan dalam air lalu tambahkan 18,0

gram Na2SO4 anhidrous, aduk hingga larut semuanya, teteskan 1-2 tetes H2SO4 pekat

dan encerkan hingga volume 100 mL)

Larutan Cu-alkalis (campur 4 volume larutan Nelson A dengan 1 volume larutan Nelson

B, aduk. larutan ini harus dibuat baru).

Prosedur :

A. Pembuatan filtrat darah bebas protein

Ambil 10,0 mL darah oxalated ke dalam tabung sentrifuge yang telah berisi 1,9 mL

aquades. Campur dengan baik. Ke dalam tabung tersebut tambahkan 1,5 mL Ba(OH)2

0,3 N. Tambahkan lagi 1,5 mL ZnSO4 5,0 %, campur dengan baik. Setelah beberapa

menit (3 menit) tabung disentrifuge selama 20 menit. Ambil supernatannya!

B. Penentuan Kadar Glukosa Darah

Pipet 1,0 mL supernatan darah bebas protein. Dalam tabung reaksi tambahkan 1,0 mL

reagen Cu-alkalis. Inkubasi dalam air mendidih. Tepat 20 menit, tabung diangkat dan

masukkan dalam air dingin. Kemudian, tambahkan 1,0 mL reagen arsenomolibdat, aduk

dengan baik. Tambah 7 mL H2O, aduk dengan baik. Baca absorbansinya pada

spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm. Buat juga blanko, hanya supernatan

darah bebas protein diganti dengan H2O. Tentukan serapanlarutan standar masing-

masing dengan konsentrasi 0,02; 0,03; dan 0,05 mg glukosa/mL.

Pertanyaan

a. Buat kurva standar glukosa !

b. Hitung kadar glukosa darah dalam mg/100 mL darah (mg %) !


Daftar Pustaka

Alexander, R. R., Griffiths, J. M., and Wilkinson, M. L. (1985) Basic Biochemical

Methods. New York : John Wiley & Sons, Inc.

Clark, J. M., Jr and Switzer, R. L. (1977) Experimental Biochemistry. 2nd

Ed. San

Francisco : W. H. Freeman and Company.

Devlin, T. M. (1997) Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, Singapore :

John Wiley & Sons, Inc.

Kerese, I. (1984) Methods of Protein Analysis. Chichester : Ellis Horwood Limited.

KusnaWidjaja, K. (1984) Petunjuk Praktikum Biokimia. Bandung : Alumni.

Palmer, T. (1995) Understanding Enzymes. 4th

Ed. London : Ellis Horwood, Ltd.

Sindumarta, M., Natalia, D., Hertadi, R., dan Rachmayanti, Y. (2002) Penuntun Praktikum

Biokimia Dasar. ITB : Bandung

Soedigdo, P., Sindumarta, M. dan Wirahadikusumah, M. (1980) Penuntun Praktikum

Biokimia Dasar. bagian I dan II. ITB : Bandung.

JADWAL PRAKTIKUM BIOKIMIA

Documents

Transcript of JADWAL PRAKTIKUM BIOKIMIA