PK ELISA by dr. Adang

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay atau disebut ELISA, Enzyme ImmunoAssay or EIA, adalah tehnik biokimia yang sering digunakan dalam imunologi untuk mendeteksi adanya antibodi atau antigen dalam sampel. ELISA digunakan sebagai alat diagnostic dalam kedokteran dan patologi tumbuhan, dan sebagai pengontrol kualitas dalam berbagai industri. Singkatnya, di dalam Elisa terdapat antigen yang tidak diketahui jumlahnya ditempelkan di sebuah permukaan, kemudian antibodi spesifik menyapu permukaan tersebut sehingga antibody dan antigen saling berikatan. Antibodi ini terikat dengan enzim, dan di step terakhir, sebuah zat yang mengandung enzim ditambahkan dan enzim tersebut menghasilkan sinyal yang dapat terdeteksi. Sehingga dalam kasus ELISA fluoresens, ketika sampel diberi cahaya, antibodi dan antigen juga ikut berfluoresens, maka banyaknya antigen di sampel dapat diketahui.

Tes ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifisitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui, yang diambil/dijerat pada penumpu solid (biasanya plat mikrotiter polystyrene), baik non-spesifik (melalui adsorpsi ke permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi spesifik lain terhadap antigen yang sama, dalam “sandwich” ELISA). Setelah antigen tersebut ambil, antibodi deteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi deteksi dapat berikatan kovalen dengan enzim, atau dapat dideteksi sendiri oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui bioconjugation. Di antara setiap step, plat biasanya dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk menghilangkan protein atau antibodi yang tidak terikat secara khusus. Setelah mencuci (langkah akhir), plat di teliti dengan menambahkan substrat enzimatik untuk menghasilkan sinyal yang terlihat, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Metode ELISA lama menggunakan substrat chromogenic, sedangkan metode ELISA yang baru menggunakan substrat fluoresens yang lebih sensitif.

Dari ELISA dapat diketahui adanya antigen atau antibodi dalam sampel, maka metode ini juga merupakan alat yang berguna untuk menentukan konsentrasi antibodi serum (misalnya dengan tes HIV atau West Nile Virus), selain fungsinya untuk mendeteksi adanya antigen. ELISA juga dapat diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi makanan yang berpotensi sebagai alergen seperti susu, kacang, kenari, almond, dan telur. Terus, ELISA juga dapat digunakan dalam toksikologi untuk skrining dugaan dengan cepat mengenai kelas tertentu dari obat.

ELISA adalah tes skrining pertama yang banyak digunakan untuk HIV karena sensitivitas yang tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan diterapkan/diaplikasikan ke plat yang terpajang antigen HIV. Jika antibodi terhadap HIV hadir dalam serum, mereka dapat mengikat antigen HIV. Plat tersebut kemudian dicuci untuk menghapus semua komponen lain dari serum. Sebuah "antibodi sekunder" khusus –antibodi yang mengikat antibodi lain- disiapkan, kemudian diterapkan/diaplikasikan ke plat, dan diikuti step mencuci. antibodi sekunder ini secara kimiawi terkait dengan enzim.

Kemudian, plat akan berisi enzim yang jumlahnya sebanding dengan jumlah antibodi sekunder yang terikat ke plat. Sebuah substrat untuk enzim diaplikasikan, dan katalisis oleh enzim menyebabkan perubahan warna atau fluoresensi. Hasil ELISA dilaporkan sebagai angka, aspek paling penting dari tes ini adalah menentukan nilai "cut-off" antara positif dan hasil negatif.

Salah satu metode untuk menentukan nilai cut-off adalah perbandingan dengan standard yang diketahui. Contohnya, jika sebuah test ELISA akan digunakan untuk menskrining kerja obat / obat di tempat kerja, konsentrasi nilai cut-off (e.g., 50 ng/mL of drug) akan dibentuk, dan sampel yang mengandung konsentrasi standar analit akan disiapkan. Diketahui yang menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada sampel yang dikenal adalah "positif." Sedangnkan yang menghasilkan sinyal yang lebih lemah adalah "negatif."

PROSEDUR UMUM ELISA

Kuantitas Jumlah Jejak dari Antigen oleh Antibodi Ganda Sandwich ELISA pada Plat microsumur

1. Melapisi sumur dengan antibodi100 µL antibodi diencerkan dalam buffer A, kemudian ditambahkan untuk setiap sumur. Antibodi harus diarahkan terhadap antigen yang akan ditentukan. Tutup plat dengan film plastik atau aluminium foil dan diinkubasi pada 4 ° C semalam.

2. PencucianCuci sumur 4 kali dengan penyangga B menggunakan pencuci lempeng. Atau, cuci manual 3 kali sebagai berikut: Kosongkan plat dengan membaliknya di wastafel. Tekan/sentuh/basuh plat dengan beberapa lapisan kertas tisu lembut untuk menghapus sisa cairan. Cuci plat dengan merendam larutan penyangga B di dalamnya. Diamkan di atas meja selama 3 menit. Kosongkan plat seperti dijelaskan di atas dan ulangi mencuci sebanyak dua kali.

3. Inkubasi dengan Sampel Uji100 µL sampel uji atau standar diencerkan dalam buffer B, ditambahkan per sumur.Tutup plat dan inkubasi pada suhu kamar selama 2 jam.

4. Cuci seperti yang dijelaskan pada langkah 2.

5. Inkubasi dengan Peroksidase-Konjugasi antibody100 µL antibody peroksidase-terkonjugasi diencerkan dalam buffer B ditambahkan ke setiap sumur. Tutup plat dan inkubasi pada suhu kamar selama 1 jam. Antibodi peroksidase-terkonjugasi harus diarahkan terhadap antigen yang akan ditentukan.

6.   Cuci seperti yang dijelaskan pada langkah 2. Ketika mencuci secara manual, perhatikan bahwa buffer cuci di reservoir ini benar-benar ditukar setelah 3 pencucian pertama. Jika ini tidak dilakukan, pewarnaan background yang tinggi akan terjadi.

7. Warna Pembangunan100 µL C substrat chromogenic ditambahkan ke setiap sumur. Tutup plat dan inkubasi selama 15 menit, atau sampai warna yang cocok telah tercapai. Plat sebaiknya dilindungi terhadap cahaya selama inkubasi.

8. Menghentikan Penguatan WarnaHentikan reaksi dengan menambahkan 100 µL 0,5 M H2SO4 (Reagen D) untuk setiap sumur. Hal ini penting untuk pengukuran kuantitatif tiap sumur yang telah diinkubasi dengan reagen warna untuk waktu yang sama.

9. Membaca hasilBaca hasil langsung dari bawah plat dengan menggunakan photometer otomatis atau semiotomatis (ELISA reader). Baca plat pada 490 nm. Pengurangan dari absorbansi pada referensi panjang gelombang (antara 620 dan 650 nm) dianjurkan, tapi tidak terlalu penting. Atau, baca hasil dalam waktu 3 jam di fotometer pada 490 nm menggunakan kuvet yang dengan volume kurang dari 200 µL. Cuvette dapat dikosongkan oleh sepotong plastik/sedotan yang terhubung melalui reservoir ke pompa vakum atau pompa hisap air.

10. Plot kurva standar pada kertas semilog dengan A490 nm sebagai ordinat dan konsentrasi log10 sebagai absis.

Semoga membantu kalo ada yang salah maaf ya, keburu buru, di cek lagi ajah biar aman. Sip semogas sukses!

20110310103