i

PERTUMBUHAN BAKTERI ASAM LAKTAT Enterococcus faecium

SEBAGAI PENGHASIL BAKTERIOSIN PADA KONDISI AEROB dan

ANAEROB

Oleh

MELINDA SANGGU ARTHA

B1D 012 181

PROGRAM STUDI PETERNAKAN

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS MATARAM

MATARAM

2016

ii

PERTUMBUHAN BAKTERI ASAM LAKTAT Enterococcus faecium

SEBAGAI PENGHASIL BAKTERIOSIN PADA KONDISI AEROB dan

ANAEROB

Oleh

MELINDA SANGGU ARTHA

B1D 012 181

SKRIPSI

Diserahkan Guna Memenuhi Sebagian Syarat yang Diperlukan

untuk Mendapatkan Derajat Sarjana Peternakan

pada Program Studi Peternakan

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS MATARAM

MATARAM

2016

iii

iv

D E D I K A S I

Bukan hanya kepuasan yang bisa menciptakan senyuman, tidak selalu materi yang bisa mendatangkan bahagia, dan tidak perlu kaya untuk mendapatkan perhatian, sederhanalah sebagai dirimu sendiri dengan perlahan cinta akan menghampirimu...

Kupersembahkan karya sederhana ini kepada Ayahanda Jupri dan ibunda Hurniati, atas segala nasihat, motivasi dan perjuangan yang tak pernah kenal lelah hingga saya bisa seperti sekarang ini.

My all Girang Jova Lingga, my lovely sister Nirmala Hikmah, my partner Lina Eka Sari, terima kasih untuk tetap ada disampingk. For my spirit Pasukan Bodrex, Ilham Gagah, Ojan, Bus, Sudir, ajis, man, bang andi, bang fi’il. Kepada teman-teman penelitan ine, atin, kaq etiq, kaq dany dan a’an, terima kasih atas bantuan kalian selama di Lab.Mikrobiologi. Buat Mita, Yana, Ziad, Leny, kadri dan semua keluarga besar Kelas B 2012.

Dosen pembimbing tugas akhirku….. Bapak Dr. M. Ali, S.Pt, M.Si dan bapak Dr. Ir Djoko Kisworo, M.Sc, terima kasih banyak pak saya telah dibantu hingga akhir. Tidak dilupakan juga bapak Dedi Iswaini, S.Pt pembimbing 3 dan Ibu Evy pembimbing 4 , terima kasih banyak pak, buk atas bantuannya.

v

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah

memberikan rahmat serta nikmat sehat wal‟afiat sehingga penulis dapat

menyelesaikan tugas akhir kuliah (skripsi) ini pada waktunya. Shalawat serta

salam semoga senantiasa terlimpah dan tercurahkan kepada Nabi Muhammad

SAW, kepada keluarganya, para sahabatnya, hingga kepada umatnya hingga akhir

zaman, amin.

Penulisan skripsi ini diajukan untuk memenuhi syarat untuk mendapatkan

gelar Sarjana pada Program Studi Peternakan di Fakultas Peternakan Universitas

Mataram. Judul yang penulis ajukan adalah “Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat

Enterococcus faecium Sebagai Penghasil Bakteriosin Pada Kondisi Aerob dan

Anaerob”.

Dalam penyusunan dan penulisan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan,

bimbingan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan

ini penulis dengan sepenuh hati menyampaikan terima kasih kepada yang

terhormat :

1. Bapak Dr. Ir. Maskur, M.Si, selaku Dekan Fakultas Peternakan

Universitas Mataram.

2. Bapak Dr. Ir. M. Ashari, M.Si, selaku Ketua Program Studi Fakultas

Peternakan Universitas Mataram.

3. Bapak Dr. Ir. I Wayan Wariata, M.Si, selaku Ketua Laboratorium

Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas

Mataram.

vi

4. Bapak Dr. Muhamad Ali, S.Pt, M.Si, selaku pembimbing utama yang

selalu menyempatkan diri setiap saat untuk memberikan arahan,

masukan dan cara yang benar dari mulai penyusunan proposal hingga

tersusunnya skripsi ini.

5. Bapak Dr. Ir. Djoko Kisworo, M.Sc, selaku dosen pembimbing kedua

yang telah banyak membantu meluruskan dan memberikan masukan

sampai penulisan skripsi ini terselesaikan.

6. Kepada kedua penyemangat hidupku Ayahanda Jupri dan Ibunda

Hurniati atas do‟a, dukungan, nasihat dan perjuangannya yang belum

terbalaskan hingga saat ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, untuk

itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan demi

penyempurnaan skripsi ini. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat

sebagaimana mestinya.

Mataram, Juli 2016

Penulis

vii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ..................................................................................... i

PENGESAHAN PEMBIMBING.................................................................. iii

DEDIKASI .................................................................................................... iv

KATA PENGANTAR .................................................................................. v

DAFTAR ISI ................................................................................................. vii

DAFTAR TABEL ......................................................................................... ix

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... x

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xi

ABSTRAK .................................................................................................... xii

ABSTRACT .................................................................................................. xiii

PENDAHULUAN ........................................................................................ 1

Latar Belakang .................................................................................. 1

Tujuan dan Kegunaan Penelitian ...................................................... 3

TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................... 4

Bakteriosin ........................................................................................ 4

Bakteri Enterococcus faecium........................................................... 5

Bakteri asam laktat sebagai pengawet daging ................................... 7

Faktor pertumbuhan bakteri asam laktat ........................................... 8

Media pertumbuhan bakteri asam laktat ........................................... 9

Hipotesis ............................................................................................ 11

MATERI DAN METODE PENELITIAN .................................................... 12

Waktu dan Lokasi Penelitian ............................................................ 12

Materi Penelitian ............................................................................... 12

Alat dan Bahan Penelitian ................................................................. 12

Variabel yang Diamati ...................................................................... 13

Cara Penelitian .................................................................................. 13

Analisis Data ..................................................................................... 19

viii

HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................... 20

Pertumbuhan bakteri asam laktat ...................................................... 20

Perhitungan waktu generasi .............................................................. 24

Perhitungan biomasa bakteri ............................................................. 25

Purifikasi bakteriosin dari bakteri ..................................................... 26

Uji aktivitas bakteriosin bakteri Enterococcus faecium .................... 28

KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................................... 30

Kesimpulan ....................................................................................... 30

Saran .................................................................................................. 30

RINGKASAN ............................................................................................... 31

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 33

LAMPIRAN .................................................................................................. 37

RIWAYAT HIDUP ....................................................................................... 44

PENGESAHAN DEWAN PENGUJI ........................................................... 45

ix

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Hasil pengukuran Optical Density Bakteri

Enterococcus faecium ...................................................................... 22

Tabel 2. Hasil perhitungan waktu generasi pada masing-masing media ...... 25

Tabel 3. Produksi Biomasa Bakteri Enterococcus faecium .......................... 25

x

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Kurva fase pertumbuhan bakteri asam laktat .............................. 9

Gambar 2. Kurva Pertumbuhan BAL Enterococcus faecium pada media

MRS dan media LB ..................................................................... 24

Gambar 3. Grafik rata-rata produksi biomasa dari

BAL Enterococcus faecium ........................................................ 26

Gambar 4. Produksi Bakteriosin dari Bakteri Enterococcus faecium ........... 27

Gambar 5. Visualisasi ukuran pita protein bakteriosin

bakteri asam laktat Enterococcus faecium .................................. 28

Gambar 6. Uji anti mikroba bakteri asam laktat E. faecium

terhadap bakteri patogen Listeria Monocytogenes ...................... 29

xi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Grafik pertumbuhan bakteri Enterococcus faecium

pada masing-masing media pertumbuhan ................................ 38

Lampiran 2. Tabel Analisis sidik ragam pengukuran Optical Density ......... 41

Lampiran 3. Gambar penelitian di Laboratorium Mikrobiologi

dan Bioteknologi ...................................................................... 42

xii

PERTUMBUHAN BAKTERI ASAM LAKTAT Enterococcus faecium

SEBAGAI PENGHASIL BAKTERIOSIN PADA KONDISI AEROB dan

ANAEROB

ABSTRAK

Oleh

Melinda Sanggu Artha

B1D 012 181

Bakteriosin adalah senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh bakteri

asam laktat (BAL). Bakteriosin dapat digunakan sebagai biopreservatif pangan,

guna menambah masa simpan dari suatu bahan pangan secara alami. Salah satu

bakteri asam laktat yang menghasilkan bakteriosin yaitu bakteri Enterococcus

faecium. Sejumlah BAL yang ditumbuhkan pada media kompleks semi sintetis

seperti MRS (de Mann Rogosa Sharpe) dapat menghasilkan populasi sel bakteri

yang tinggi dan bakteriosin yang relatif banyak. Tujuan penelitian ini yaitu untuk

melihat pertumbuhan bakteri E. faecium pada media MRS dan LB dengan kondisi

aerob dan anaerob. Kultur dilakukan selama 4,5 jam, 5 jam, 5,5 jam, 6 jam, 6,5

jam dan 7 jam. Jumlah bakteriosin yang dihasilkan dilihat dengan SDS-PAGE.

Sedangkan daya hambat bakteriosin tersebut dilakukan terhadap bakteri patogen

Listeria monocytogenes. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri E. faecium

tumbuh lebih baik pada media MRS dengan kondisi anaerob daripada pada media

MRS dengan kondisi aerob maupun dalam media LB dengan kondisi aerob dan

anaerob. Hasil SDS-PAGE menunjukkan adanya band protein berukuran sekitar

90 kDa yang diduga merupakan bakteriosin. Uji daya hambat menunjukkan

adanya zona bening pada kultur LM walaupun berukuran kecil, yang

menunjukkan bahwa bakteri tersebut menghasilkan bakteriosin yang mampu

menghambat pertumbuhan bakteri patogen.

Kata Kunci : Pertumbuhan, Bakteri Asam Laktat, Enterococcus faecium,

Bakteriosin, Kondisi aerob dan anaerob

xiii

THE GROWTH OF LACTIC ACID BACTERIA Enterococcus faecium AS

THE BACTERIOCINS PRODUCING BACTERIA IN THE AEROBIC

AND ANAEROBIC CONDITIONS

ABSTRACT

By

Melinda Sanggu Artha

B1D 012 181

Bacteriocins is antimicrobial compound produced by lactic acid bacteria

(LAB). Bacteriocins can be used as food biopreserfative, prolog the self life. One

of the lactic acid bacteria which produce bacteriocins is the bacterium

Enterococcus faecium. A number of LAB that were grown on a complex medium

semi synthetics such as MRS. (de Mann Rogosa Sharpe) can produce a high

bacterial cell population and the relatifly lot of bacteriocins. The was purpose of

this research to study the growth of the E. faecium in MRS and LB media,

aerobily or anaerobily conditions.. Cultures were performed for MRS and LB

media 4,5 hours, 5 hours, 5,5 hours, 6 hours, 6,5 hours and 7 hours. The generated

bacteriocins was analyzed using SDS-PAGE and the activity inhibiti was

measured thronge clering zone against Listeria monocytogenes. The results

showed that the E. faecium grew better in MRS media anaerobicly than MRS

media aerobicly as well as in LB media aerobicly and anaerobicly. Results of

SDS-PAGE showed a band of about 90 kDa size protein that is thought to be the

bacteriocins. Inhibitory test showed a clearing zone in the culture of LM.

Key Words : The growth, Lactic Acid Bacteria, Enterococcus faecium,

Bacteriosins, Aerob and anaerob conditon

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Besarnya kontaminasi mikroba terhadap bahan pangan dapat menentukan

kualitas dan masa simpan suatu bahan pangan. Untuk menghindari kerusakan

yang lebih cepat, bahan pangan atau pangan sangat perlu untuk diawetkan dengan

tetap memperhatikan kualitas dan keamanan pangan, sehingga tidak menyebabkan

suatu hal yang negatif bagi konsumen jika digunakan ataupun dikonsumsi

(Hafsan, 2014).

Berbagai macam bahan kimia berbahaya seperti formalin dan boraks,

hingga saat ini masih banyak dijumpai penggunaannya sebagai pengawet bahan

pangan. Formalin ataupun boraks dapat mempertahankan kesegaran bahan pangan

secara fisik yang dapat terlihat dari luar dan juga dapat memperlambat proses

pembusukan bahan pangan. Namun, penggunaan bahan kimia sebagai pengawet

bahan pangan tetap tidak baik bagi kesehatan (Anonim, 2014).

Menurut Meymey (2012) salah satu cara atau alternatif untuk menambah

atau memperpanjang masa penyimpanan suatu bahan pangan secara alami dan

lebih aman yaitu dengan penggunaan biopreservatif (pengawetan alami)

menggunakan bakteriosin yang dapat disintesis oleh bakteri asam laktat (BAL).

Biopreservatif dapat memperpanjang masa simpan suatu bahan pangan dan

terjaga keamanannya.

Bakteriosin merupakan polipeptida yang mempunyai aktifitas antibakteri

yang dihasilkan oleh sejumlah mikrobia termasuk bakteri asam laktat.

Kemampuannya dalam membunuh bakteri pembusuk atau patogen serta

2

keamanannya yang terjamin telah menjadikan bakteriosin sebagai biopreservatif

pada sistem pangan (Siti, 2006).

Enterococcus faecium merupakan salah satu mikroba yang digolongkan ke

dalam BAL yang dapat menghasilkan bakteriosin. Bakteriosin yang dihasilkan

oleh BAL E. faecium dapat digunakan sebagai bahan pengawet (biopreservatif)

terutama dalam pengolahan produk peternakan seperti susu dan daging. Efek dari

pengawetan dengan biopreservatif disebabkan oleh salah satu metabolit

yang dihasilkan oleh bakteri tersebut, yaitu bakteriosin (Winkowski dan

Montville, 1992).

Untuk menghasilkan bakteriosin dalam skala tertentu maka kultur bakteri

penghasil bakteriosinnya sangat perlu dilakukan, mempelajari faktor-faktor yang

mempengaruhi pertumbuhan maupun produksi bakteriosin seperti media,

biomasa, maupun kondisi pertumbuhan pada lingkungan banyak oksigen ataupun

tanpa oksigen harus dilakukan.

Untuk mempelajari secara detail tentang pertumbuhan bakteri E. faecium

sebagai penghasil bakteriosin, maka penelitian ini perlu untuk dilakukan.

Penelitian ini bertujuan untuk melihat pertumbuhan BAL E. faecium sebagai

penghasil bakteriosin, produksi bomasa dan karakteristik bakteriosin yang

dihasilkan. Data yang diperoleh dari penelitian ini akan sangat bermanfaat untuk

kultur E. faecium dalam skala yang lebih besar untuk menghasilkan bakteriosin.

3

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Mengetahui pertumbuhan BAL E. faecium sebagai penghasil bakteriosin

pada kondisi aerob dan anaerob menggunakan media tumbuh MRS dan LB.

2. Mengetahui karakteristik bakteriosin yang dihasilkan oleh E. faecium.

3. Untuk melihat aktifitas daya hambat dari bakteriosin yang dihasilkan oleh

bakteri E. faecium.

Kegunaan Penelitian

Adapun kegunaan dari penelitian ini yaitu :

1. Untuk mendapatkan informasi dan data tentang pertumbuhan bakteri E.

faecium.

2. Mengembangkan teknologi, ilmu dan pengetahuan dalam bidang

pengolahan dan pengawetan bahan pangan secara alami yang tidak

memiliki dampak negatif dan membahayakan bagi kesehatan manusia.

3. Sebagai pembanding bagi mahasiswa yang akan melakukan penelitian

berikutnya.

4

TINJAUAN PUSTAKA

Bakteriosin

Bakteriosin asal BAL merupakan peptide atau senyawa protein yang peka

terhadap enzim proteolitik, tetapi tahan panas pada kondisi asam. Substansi

protein yang umumnya mempunyai berat molekul kecil serta memiliki akttivitas

sebagai bakterisidal yang bersifat letal terhadap intraspesies (Abdelbasset, 2008).

Bakteriosin diproduksi oleh bakteri BAL didefinisikan sebagai protein

yang aktif secara biologi atau kompleks protein (agregat protein, protein

lipokarbohidrat, glikoprotein) yang disintesis secara ribosomal, dan menunjukkan

aktivitas anti bakteri. Bakteriosin disintesis pada fase eksponensial pertumbuhan

sel mengikuti pola klasik sintesis protein. Sistem ini diatur oleh plasmid DNA

ekstrakromosomal dan dipengaruhi oleh beberapa factor utama seperti pH

(Hafsan, 2014).

Istilah bakteriosin sering dihubungkan dengan senyawa antimikroba

berupa protein yang mudah didegradasi oleh enzim proteolitik dan mampu

menghambat pertumbuhan mikroba spesies lain yang biasanya berkerabat dekat

dengan spesies penghasil substansi ini diproduksi oleh berbagai strain bakteri

(Jack et al.,1995), termasuk dalam hal ini bakteri asam laktat (Gorris dan Bennik,

1994). Umumnya, hampir semua substansi yang diproduksi oleh bakteri asam

laktat mampu menghambat pertumbuhan bakteri asam laktat lainnya, dan

beberapa diantaranya memiliki efek bakterisidal atau destruktif terhadap bakteri

lain yaitu bakteri pembusuk dan patogenik asal makanan seperti Staphylococcus

aureus, Listeria monocytogenes dan Clostridium botulinum.

5

Bakteriosin yang dihasilkan bermacam-macam jenisnya tergantung dari

strain yang menghasilkannya atau organisme penghasilnya. Contoh bakteriosin

yang banyak diteliti antara lain Nisin yang dihasilkan oleh Lactococcus lactis

subs. lactis, pediocin yang dihasilkan oleh bakteri Pediococcus acidilactici,

Enterococcus EFS2 yang dihasilkan dari bakteri Enterococcus faecalis (Anonim,

2014).

Berdasarkan karakter umum bakteriosin, potensi penggunaannya

berpeluang terutama pada bidang preservasi makanan yang dikenal dengan

biopreservatif, yaitu kemampuan substansi mikroba ini dalam mengawetkan

makanan (Kurniawati, 2000). Selain itu bakteriosin memiliki potensi sebagai

kemoterapeutik, terutama pemakaiannya dalam tindakan pencegahan ataupun

pengobatan di bidang Kedokteran Hewan seperti daging, susu dan telur tidak

khawatir lagi mengenai efek residu antibiotik sintesis yang belakangan ini

menimbulkan kasus resistensi “Mikroorganisme Super Bug” atau mikroorganisme

yang kebal terhadap atimikroba (NCBI, 2016).

Bakteri Enterococcus faecium

Enterococcus faecium merupakan bakteri kokus gram positif

berbentuk ovoid berdiameter antara 0,5 – 1 um yang dapat berkoloni secara

rantai, berpasangan ataupun soliter. Bakteri ini bersifat fakultatif anaerob,

mempunyai kemampuan untuk hidup dan berkembang biak dengan oksigen

maupun tanpa oksigen. Bakteri ini mengkatabolisme berbagai sumber energi

antara lain karbohidrat, gliserol, laktat, malate, sitrat, arginin, agmatin dan

asam α keto lainnya. Enterococcus faecalis merupakan mikroorganisme yang

6

dapat bertahan dalam lingkungan yang sangat ekstrim, termasuk pH yang

sangat alkalis dan konsentrasi garam yang tinggi (Shand, 2007).

Bakteri Enterococcus pada umumnya dapat tumbuh pada rentang

pertumbuhan yang luas. Beberapa strain dapat tumbuh pada suhu serendah 1 0C

dan dapat mencapai 50 0C, namun suhu optimal untuk sebagian besar strain yaitu

37 0C. Enterococcus dapat bertahan selama proses pembekuan dan dilaporkan

dapat bertahan hidup pada penyimpanan dengan suhu -70 0C selama beberapa

tahun. Pertumbuhan dapat terjadi pada rentang pH 4,4-10,6. Aw minimun yang

digunakan untuk pertumbuhan tergantung pada zat terlarutnya. Seperti misalnya

E. faecium dilaporkan dapat tumbuh pada Aw 0,93 (Anonim, 2013).

Bakteri E. faecium dapat tumbuh pada suhu 10 – 45 0C, suhu optimal atau

asam, dan dalam lingkungan yang isotonik atau hipertonik. E. faecium adalah

Gram-positif, sel bulat yang dapat terjadi pada pasangan atau rantai (Fitri, 2009).

Bakteri E. faecium dianggap sebagai super bug. Dikarenakan bakteri ini

dapat menjelajah banyak organ tubuh termasuk saluran pencernaan dan kulit, dan

juga bisa bertahan untuk waktu yang lama pada benda mati, dengan karakteristik

tahan multi obat yang membuatnya menjadi patogen ganas (NCBI, 2016).

Aplikasi E. faecium pada bidang bioteknologi menghasilkan peptida

antibakteri disebut bakteriosin. Bakteriosin mempunyai efek bakterisida dan

bakteriostatik terhadap bakteri perusak atau pembusuk. Mikroba ini dapat

digunakan dalam pengolahan bahan makanan seperti keju, susu, daging dan

sayuran. E. faecium juga dapat digunakan sebagai probiotik untuk bakteri

merugikan di saluran pencernaan (Nurliana et, al., 2009).

7

Bakteri Asam Laktat Sebagai Pengawet Daging

Bahan pangan hewani seperti daging merupakan sumber protein hewani

yang sangat penting bagi kehidupan manusia karena kandungan asam-asam amino

esensial, disamping sebagai sumber vitamin, mineral dan asam-asam lemak

esensial lainnya. Berbagai cara pengawetan telah dilakukan untuk meperpanjang

masa simpan, seperti pendinginan dan pengalengan, namun penerapan metode ini

masih jarang digunakan di beberapa negara mengingat biaya yang cukup besar.

Produk-produk daging yang telah lama dikenal dan dikonsumsi secara luas

oleh negara-negara maju antara lain di Amerika Serikat, Jerman, Inggris, Belanda,

Prancis, Italia dan Australia adalah sosis terfermentasi (salami, thuringer,

pepperoni, cervelat, lebanon bologna). Sosis ini dapat dibuat secara alamiah

(tanpa kultur starter BAL) dan dengan penambahan kultur starter BAL (Aryanta,

2013).

Prinsip pengawetan daging dan produk olahannya menggunakan metode

fermentasi BAL adalah dengan meningkatkan konsentrasi asam laktat dan

penurunan pH melalui metabolisme gula (karbohidrat) oleh BAL. Konsentrasi

asam laktat yang relatif tinggi dan pH yang rendah akan menghambat

pertumbuhan mikroba pembusuk dan patogen, sehingga produk pangan

terfermentasi akan dapat disimpan lebih lama dan aman bagi konsumen (Aryanta,

2013).

8

Faktor Yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat

Menurut Andika (2014) dari berbagai macam faktor yang dapat

mempengaruhi petumbuhan BAL salah satunya adalah kompetisi untuk nutrien.

BAL secara alami hidup di lingkungan yang kaya nutrient. Faktor kedua yaitu

pengaruh oksigen dalam hal ini dibedakan menjadi, aerobik hanya dapat tumbuh

apabila ada oksigen bebas. Anaerob hanya dapat tumbuh apabila tidak ada

oksigen bebas. Anaerob fakultatif dapat tumbuh dengan atau tanpa oksigen bebas

dan Mikroaerofilik dapat tumbuh apabila ada oksigen dalam jumlah kecil. Untuk

BAL ada yang dapat tumbuh pada keadaan aerobik sampai anerobik.

Faktor lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan BAL yaitu pH.

Perubahan pH merupakan suatu fungsi dari ketersediaan nutrisi dan metabolit yang

dihasilkan selama pertumbuhan yang terdapat dalam medium. BAL merupakan

mikroba yang mempunyai kemampuan dalam menciptakan respon terhadap

keasaman medim (Arina, 2007).

Kurva pertumbuhan bakteri E. faecium terdiri dari fase lag, fase log

(eksponensial) dan fase stasioner (kematian). Pada fase lag bakteri berada pada

periode penyesuaian yang sangat penting untuk penambahan metabolit pada

kelompok sel, menuju tingkat yang setaraf dengan sintesis sel maksimum.

9

Gambar 1. Fase pertumbuhan bakteri asam laktat

Fase kedua adalah fase log atau eksponensial, pada fase ini bakteri E.

faecium mengalami pertumbuhan yang sangat cepat, sel mulai membelah diri

menjadi dua kemudian masing-masing lagi membelah jadi dua hingga pada setiap

generasi sel bertambah menjadi dua kali lipat, fase log dimulai pada jam ke-2

sampai pada jam ke-16 (Fardiaz 1992).

Fase pertumbuhan yang terakhir yaitu fase stasioner (fase kematian).

Selama fase ini, jumlah sel yang hidup tetap konstan untuk periode yang berbeda,

bergantung pada bakteri, tetapi akhirnya menuju periode penurunan populasi.

Pada penelitian ini, fase stasioner dari bakteri E. faecium tidak terlihat,

dikarenakan perhitungan OD hanya dilakukan sampai pada jam ke-7 (Hanimatul

et al., 2014).

Media Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat

Media selektif untuk pertumbuhan spesies bakteri asam laktat adalah

deMan-Rogosa-Sharpe Agar (MRS Agar). Komposisi media MRS agar pada pH

6,2 ± 0,2 dan suhu 25 °C. Komposisi MRS agar per liter yaitu, glukosa 20 gram,

pepton 10 gram, agar 10 gram, ekstrak daging 8 gram, natrium asetat (3NH2O) 5

gram, ekstrak ragi 4 gram, K2HPO4 2 gram, Triamonium sitrat 2 gram,

10

MgSO4.7H2O 0,2 gram, Sorbiton monooleat 0,05 gram, MnSO4.4H2O 1,0 ml.

Sejumlah BAL yang ditumbuhkan pada media kompleks semi sintesis yang

mengandung protein tinggi seperti tripton, pepton, ekstrak daging dan ekstrak

khamir seperti MRS dapat menghasilkan populasi bakteri yang tinggi dan

bakteriosin yang relatif banyak (Anonim, 2012).

Media Lysogeny broth atau yang belakangan ini dikenal sebagai Luria

bertani telah digunakan secara luas sebagai media untuk pertumbuhan bakteri.

Sebenarnya Luria bertani pada awalnya secara khusus sebagai media

bakteriofage. Penemu media ini Guiseppi Bertani mencoba formula ini ketika

ingin mengoptimalkan produksi flak pada bakteri Shigela (Bertani, 1952).

Singkatan LB berasal dari Lysogeny broth. Meskipun pada awalnya media ini

digunakan dalam rangka studi bakteriofag dan shigela namun belakangan ini

media LB secara umum digunakan untuk E. coli juga (Williams et al., 2013).

Menurut Luc De Vuyst (2007) jenis media dan nutrisi yang ada

didalamnya sangat mempengaruhi laju pertumbuuhan sel BAL, seperti sumber

karbon dan sumber nitrogen yang digunakan dalam medium. Selanjutnya

berpengaruh terhadap metabolisme produksi bakteriosin, selain itu tingkat

salinitas medium produksi seperti kandungan garam dari media turut

mempengaruhi metabolisme produksi bakteriosin. Secara umum kondisi optimum

produksi bakteriosin selain dipengaruhi oleh fase pertumbuhan, pH media, suhu

inkubasi, jenis sumber karbon dan sumber nitrogen juga dipengaruhi oleh

konsentrasi NaCl.

11

Hipotesis

Berdasarkan uraian latar belakang, hipotesis yang digunakan dalam

penelitian ini adalah pertumbuhan BAL pada media MRS dengan kondisi anaerob

akan lebih cepat dibandingkan dengan pada media MRS dengan kondisi aerob dan

media LB dengan kondisi aerob ataupun anaerob.

12

MATERI DAN METODE PENELITIAN

Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan

Bioteknologi, Fakultas Peternakan, Universitas Mataram pada bulan Februari

hingga bulan Juni 2016.

Materi Penelitian

Materi penelitian ini menggunakan BAL E. faecium yang diambil dari stok

gliserol milik Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Peternakan

Universitas Mataram. Materi penelitian ini dikelompokkan menjadi 4 kelompok

(media MRS pada kondisi aerob dan anaerob, dan media LB pada kondisi aerob

dan anaerob) dengan 6 perlakuan lama waktu kultur dan masing-masing

menggunakan 3 ulangan.

Alat dan Bahan Penelitian

Alat Penelitian

Timbangan analitik, erlenmeyer, hot plate stirrer, rak tabung, cawan

Petri, maghnet stirrer, pH meter, autoclave, laminar air flow, lampu bunsen,

tabung reaksi, gelas ukur, incubator, alat centrifugasi, tip, nano drop, tabung

konical (falcon), kulkas (Freezer) 4 0C, micro pipet, spektrofotometer, alat SDS -

PAGE dan shaker.

13

Bahan Penelitian

Media MRS Broth, media MRS Agar, media Lysogeny Broth (trypton

powder, NaCl, yeast ekstrak), gliserol stok BAL E. faecium, aquades, alkohol

70%, aluminium foil, kapas/kasa dan kertas label.

Variabel Yang di Amati

Adapun variabel yang diamati dalam penelitian ini yaitu, pertumbuhan

BAL E. faecium pada media MRS dan media LB pada kondisi aerob dan anaerob,

berat biomasa, dan karakteristik bakteriosin (ukuran dan daya hambat).

Cara Penelitian

Persiapan

Persiapan Media MRS Cair

Pembuatan media MRS sebanyak 50 ml membutuhkan 2,6 g media MRS

dan 50 ml aquades, dilarutkan dalam tabung Erlenmeyer (penggunaan media

MRS adalah 52% dalam 1000 ml). Media di larutkan pada hotplate stirrer dengan

bantuan maghnet stirrer hingga larutan homogen. Tingkat pH diatur dengan

penambahan HCl untuk mendapatkan pH asam. Larutan kemudan dituangkan ke

dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml dan ditutup menggunakan

kapas. Tabung reaksi selanjutnya dimasukkan ke dalam beker glass dan ditutup

dengan aluminium foil untuk disterilisasi pada autoclave selama 15 menit.

14

Persiapan Media MRS Padat

Sebanyak 3,1 g MRS ditimbang dan dilarutkan pada tabung erlenmeyer

menggunakan aquades sebanyak 50 ml dan ditutup dengan kapas dan aluminium

foil (penggunaan MRS adalah 62% dalam 1000 ml). Larutan dihomogenkan pada

hotplate stirrer. Kemudian pH diatur dengan penambahan HCl untuk mendapatkan

pH asam. Selanjutnya larutan dimasukkan ke dalam autoclave untuk di sterilkan

selama 15 menit. Setelah 15 menit, media didiamkan pada suhu ruang hingga

media tidak terlalu panas untuk selanjutnya dituangkan pada cawan Petri.

Sebanyak 25 ml media MRS dituangkan pada masing-masing cawan Petri dan

dibiarkan hingga padat di bawah sinar UV selama kurang lebih 5 menit.

Persiapan Media LB Cair

Untuk membuat 50 ml media LB dibutuhkan tryptone powder 0,5 g, yeast

ekstrak 0,25 g, NaCl 0,5 g dan aquades 50 ml. semua bahan dimasukkan ke dalam

tabung erlenmeyer dan dihomogenkan pada hot plate stirrer dengan bantuan

maghnet stirrer. Setelah homogen larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi

masing-masing sebanyak 5 ml dan ditutup menggunakan kapas. Tabung reaksi

berisi larutan kemudian dimasukkan ke dalam beker glass dan ditutup dengan

aluminium foil untuk disterilisasi selama 15 menit pada autoclave.

Persiapan Media LB Padat

Pembuatan media LB padat membutuhkan tryptone powder 0,5 g, yest

extract 0,25 g, NaCl 0,5 g, agar 0,015 g dan aquades 50 ml. Bahan dimasukkan ke

dalam tabung erlenmeyer dan dihomogenkan menggunakan hot plate stirrer.

Larutan yang telah homogen disterilisasi selama 15 menit pada autoclave. Setelah

15

proses sterilisasi selesai larutan dikeluarkan dari autoclave dan didiamkan pada

suhu ruang hingga tidak terlalu panas untuk selanjutnya dituangkan pada cawan

Petri. Media didiamkan hingga menjadi padat di bawah sinar UV selama kurang

lebih lima menit.

Tahapan Penelitian

Peremajaan

Peremajaan bakteri E. faecium sebagai penghasil bakteriosin diawali

dengan menginokulasi bakteri E. faecium dari stok gliserol ke media MRS 5 ml

menggunakan jarum ose yang telah dipanaskan terlebih dahulu. Kultur kemudian

diinkubasi semalaman atau kurang lebih 24 jam pada shaker dengan suhu 37 0C.

Kultur BAL pada Media MRS

Bakteri yang telah dikultur 12 jam, keesokan harinya kemudian di

inokulasi kembali pada media MRS dengan metode streak (goresan)

menggunakan jarum ose. Hasil kultur pada media MRS selanjutnya di inkubasi

pada incubator 37 0C, minimal kurang lebih selama 24 jam hingga bakteri

tumbuh. Jika bakteri tidak tumbuh dalam waktu 24 jam, kultur kembali

dimasukkan ke dalam incubator hingga 24 jam berikutnya. Jika bakteri kembali

tidak tumbuh, lakukan kembali metode dari peremajaan hingga bakteri benar-

benar tumbuh.

Kultur BAL pada Media MRS

Bakteri yang tumbuh setelah di kultur pada media MRS, selanjutnya

diinokulasi pada media MRS untuk pembuatan starter. Selanjutnya dilakukan

16

inkubasi pada suhu 37 0C menggunakan shaker selama semalaman atau kurang

lebih 24 jam.

Kultur BAL pada Media MRS dan Media LB (pada kondisi aerob dan

anaerob)

Starter yang dikultur pada media MRS dimasukkan ke dalam 6 tabung

media MRS dan 6 tabung media LB, masing-masing sebanyak 50 µl

menggunakan mikro pipet. Tabung kemudian dimasukkan ke dalam shaker untuk

perlakuan aerob dan inkubator untuk perlakuan anaerob. Pada masing-masing

perlakuan terdapat tiga kultur media MRS dan tiga kultur media LB.

Pertumbuhan BAL pada kondisi aerob dan anaerob diukur menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Sebanyak 200 µl kultur

dimasukkan ke dalam tabung kuvet, kemudian dilakukan pengenceran dengan

aquades 1800 µl. Pertumbuhan diukur sebanyak 6 kali.

Penentuan Waktu Generasi

Waktu generasi memiliki rumus g=

. Dimana g adalah waktu generasi

(generation time), ln2 = 0,69 dan µ adalah waktu spesifik generasi (Brock et al.,

1994). Sebelum mendapatkan waktu generasi, terlebih dahulu menentukan waktu

spesifik generasi (µ) dengan rumus yang digunakan adalah µ =

(Brock et al., 1994). Dimana ln1 adalah nilai OD awal dan ln2 adalah nilai OD

akhir yang telah dipilih dari hasil pengukuran OD, sedangkan nilai t1 dan t2

adalah waktu kultur dari nilai OD yang telah dipilih tersebut.

17

Purifikasi bakteriosin dengan Amonium Sulfat (NH4)2SO4

Ammonium sulfat (NH4)2SO4 sebanyak 15 g ditimbang dan dilarutkan

dengan aquades 15 ml pada tabung falcon. Larutan ammonium sulfat kemudian

dimasukkan kedalam beker glas yang berisi 25 ml kultur BAL pada media MRS

yang telah dishaker selama 24 jam, selanjutnya kultur dihomegenkan

menggunakan hot plate stirrer selama 4 jam untuk mendapatkan lendir yang

diasumsikan sebagai bakteriosin. Setelah 4 jam stirrer, kultur dimasukkan ke

dalam tabung falcon dan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 4000

rpm. Lendir yang tersisa pada maghnet stirrer dan pada dinding beker glasss

dibilas menggunakan PBS. Lendir hasil centrifuge dan hasil bilasan PBS pada

beker glass disimpan pada tabung ependrop sebelum dilakukan metode

berikutnya. Metode yang sama juga dilakukan pada kultur BAL pada media MRS

yang dishaker 48 jam.

Deteksi Kuantitas Bakteriosin Dengan SDS – PAGE

Preparasi Gel

Disiapkan 2 lempeng kaca sebagai alat pencetak gel. Dalam pembuatan gel

dengan konsentrasi 10 %, gel yang pertama kali dibuat adalah separation gel

sebagai gel bawah, yang terdiri dari 30 % acrilamide solution 2,1 ml, 4x

separation buffer 1,5 ml, 50 % gliserol 1,2 ml, aquades 1,14 ml, 10 % APS 60 µl

dan TEMED 60 µl. Semua bahan dicampur dan dihomegenkan untuk selanjutnya

di masukkan ke dalam cetakan kaca menggunakan mikropipet dan ditunggu

sampai memadat (membentuk gel). Setelah memadat, cetakan sumuran berupa

sisiran dimasukkan ke dalam cetakan gel. Kemudian di siapkan stacking gel yang

terdiri dari 30 % akrilamid solution 188 µl, 4x stacking gel buffer 313 µl, aquades

500 µl, 10 % APS 10 µl dan TEMED 2 µl. Larutan kemudian dimasukkan ke

dalam tabung dan dihomogenkan. Larutan stacking gel dimasukkan ke dalam

18

cetakan gel yang sudah terdapat cetakan untuk sumuran dan di tunggu hingga

membeku. Setelah membeku, sisiran dilepas dan lempengan kaca yang berisi gel

dipindahkan ke dalam alat elektroforesis.

Preparasi Sampel

Sampel yang disimpan menggunakan tabung ependrop pada freezer -20 0C

kemudian diresuspensi dengan aquades dan 2x sampel buffer. Penambahan

aquade dan 2x sampel buffer tergantung dari jumlah pellet yang diperoleh.

Kemudian sampel didenaturasi selama 5 menit dalam air mendidih suhu 100 0C.

Setelah itu, sampel diloading ke sumuran yang ada pada gel untuk kemudian

dilakukan elektroforesis.

Elektroforesis Gel

Dam mesin running diisi dengan elektroforesis buffer. Sampel yang telah

didenaturasi kemudian di masukkan ke dalam sumuran gel sebanyak 15 µl. setelah

semua sampel dimasukkan, mesin running di tutup dan dinyalakan dengan voltase

100 volt selama 2 jam. Gel selanjutnya diwarnai menggunakan CBB (Commasie

Briliant Blue) sambil digoyangkan menggunakan mesin shaker selama 30 menit.

Kemudian gel dibilas (destaining) menggunakan campuran larutan aquades,

methanol, dan asam asetat dengan perbandingan 6 : 3 : 1. Kertas tissue

ditambahkan pada gel yang dibilas yang berfungsi sebagai penyerap warna pada

saat pembilasan. Pembilasan dilakukan sampai gel bersih dari sisa pewarna CBB.

19

Uji Daya Hambat Bakteriosin Terhadap Bakteri Patogen

Uji daya hambat aktivitas bakteriosin terhadap bakteri patogen dilakukan

menggunakan metode difusi sumur agar. Sebanyak 100 µl bakteri indikator

Listeria monocytogenes diinokulasi pada media LB padat, kemudian dibuat

sumuran berdiameter kurang lebih 6 mm pada agar yang telah memadat. Sumuran

dibuat menggunakan yellow tip yang diputar pada media LB padat sesuai dengan

label yang diberikan. Pada setiap sumuran dimasukkan sebanyak 10 µl sampel

(control positif menggunakan ampisilin). Cawan LB padat kemudian di inkubasi

pada suhu 370C selama 24 jam. Aktivitas bakteriosin ditunjukkan dengan adanya

zona bening di sekitar sumuran.

Analisis Data

Data pertumbuhan bakteri E. faecium yang diperoleh pada penelitian ini

dianalisis menggunakan analisis sidik ragam. Sedangkan kuantitas bakteriosin

yang dihasilkan diamati menggunakan SDS-PAGE. Untuk uji aktifitas daya

hambat bakteri E. faecium terhadap bakteri patogen Listeria monocytogenes

dilakukan dengan melihat ada tidaknya zona bening di sekitar sumuran yang telah

diisi dengan supernatant E, faecium.

20

HASIL DAN PEMBAHASAN

Bakteri Asam Laktat Enterococcus faecium merupakan bakteri gram

positif, yang umumnya dapat tumbuh dengan baik pada suhu 10 – 45

0C. Namun

suhu optimum pertumbuhan bakteri tersebut adalah 370C pada pH 4,2 – 4,6 dan

masih dapat tumbuh pada pH 9,6 (John et al., 1994).

Bakteri E. faecium dapat menghasilkan bakteriosin yang bermanfaat

sebagai biopreservatif (pengawet alami) bahan pangan. Selain sebagai

biopreservatif, bakteri E. faecium juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri

gram positif maupun gram negatif dan sebagai trapeutik (Ali dan Radu, 1998).

Pada penelitian tentang pertumbuhan Bakteri Asam Laktat E. faecium

sebagai penghasil bakteriosin, pH media yang digunakan adalah pH asam, yaitu

5,43 untuk media MRS, pH 5,45 untuk media MRS, dan pH 5,03 untuk media LB

dan dengan menggunakan suhu optimum pertumbuhan BAL secara umum yaitu

37 0C.

Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat E. Faecium

BAL E. faecium merupakan bakteri gram positif yang dapat tumbuh

dengan baik pada media MRS, dimana pada media MRS bakteri E. faecium

mendapatkan nutrisi yang cukup untuk pertumbuhannya. Media MRS

mengandung pepton 10 gram, ekstrak daging 8 gram, yeast ekstract 4 gram,

dextrose 20 gram, tween 80 1 gram, dipotasium phosphate 2 gram, sodium acetate

5 gram, ammonium citrate 2 gram, magnesium sulfate 0,20 gram, manganese

sulfat 0,05 gram (Anonim, 2012).

21

Menurut Rinto (2012), beberapa media yang sering digunakan untuk

pembiakan bakteri asam laktat adalah media MRS (de Man Rogosa and Sharpe),

Triptone Glukose yeast Extract (TGE), dan Glucose, Yeast Pepton (GYP).

Beberapa komponen nutrisi penyusun media kultur bakteri asam laktat yaitu

glukosa dan gliserol sebagai sumber karbon dan energi, yeast extract dan beef

extract sebagai sumber vitamin dan nitrogen, pepton/tripton sebagai sumber asam

amino, N, S, dan P, serta berbagai mineral KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, MnSO4,

dan FeSO4 serta CaCO3 sebagai penstabil pH.

Pertumbuhan bakteri asam laktat E. faecium dapat dilihat dari tingkat

kekeruhan pada media pertumbuhannya. Semakin keruh media setelah inkubasi

dan kultur dapat menjadi petunjuk bahwa bakteri tersebut telah tumbuh. Tingkat

kekeruhan atau kepadatan bakteri dapat diukur dengan menghitung Optical

Density (OD) menggunakan alat spekterofotometer.

Hasil pengukuran OD bakteri E. faecium menunjukkan adanya perbedaan

tingkat kepadatan bakteri dari masing-masing perlakuan. Tabel 1 menampilkan

OD kultur yang diukur pada panjang gelombang 600 nm. Pada media MRS

dengan kondisi anaerob, kepadatan sel bakteri didapatkan paling tinggi,

berikutnya diikuti oleh media MRS pada kondisi aerob. Sedangkan media LB

pada kondisi anaerob dan pada kondisi aerob lebih rendah. Hasil ini menunjukkan

bahwa pertumbuhan BAL E. faecium lebih baik pada media MRS dibandingkan

dengan media LB.

22

Tabel 1. Hasil pengukuran OD600 nm bakteri E .facium pada kondisi aerob dan anaerob menggunakan media MRS dan LB.

Waktu

Kultur

(jam)

Jenis Media

MRS LB

Aerob Anaerob Aerob Anaerob

1 2 X 1 2 X 1 2 X 1 2 X

4,5 0,27 0,19 0,23±0,06 0,94 1,07 1,01±0,09 0,07 0 0,04±0,05 0,05 0,04 0,05±0,01

5 0,67 0,45 0,56±0,16 1,84 1,96 1,90±0,08 0,19 0,01 0,10±0,13 0,07 0,05 0,06±0,14

5,5 0,74 0,82 0,78±0,06 2,43 2,62 2,53±0,13 0,11 0,02 0,07±0,06 0,08 0,07 0,08±0,01

6 1,30 1,18 1,24±0,08 3,01 2,89 2,95±0,08 0,13 0,04 0,09±0,06 0,08 0,12 0,10±0,03

6,5 1,19 1,45 1,32±0,18 3,06 2,89 2,96±0,12 0,14 0,07 0,11±0,05 0,11 0,12 0,12±0,01

7 1,96 1,27 1,62±0,49 3,83 3,39 3,61±0,31 0,18 0,08 0,13±0,07 0,14 0,16 0,15±0,02

23

Jika dibandingkan antar medium pertumbuhan, bakteri E. faecium tumbuh

paling baik pada kondisi anaerob. Namun bakteri tersebut masih dapat tumbuh

pada kondisi aerob meski sedikit lebih lambat jika dibandingkan dengan pada

kondisi anaerob. Hasil ini menandakan bahwa bakteri E. faecium bersifat anaerob

fakultatif, yang mempunyai kemampuan untuk berkembang biak dengan atau

tanpa oksigen.

Sebagian besar bakteri asam laktat bersifat anaerobic fakultatif meskipun

ada yang bersifat anaerobic obligat seperti Bifidobacteria. Keberadaan oksigen

pada kultur bakteri asam laktat akan berpengaruh terhadap pertumbuhan sel dan

berbagai komponen metabolit yang dihasilkan (Kamoun et al., 2009).

Medium untuk pertumbuhan BAL yang umum digunakan yaitu medium

MRS yang dikembangkan oleh de Man, Rogossa, dan Sharpe. Medium tersebut

dibuat untuk menunjang pertumbuhan BAL genus Lactobacillus secara umum,

namun media ini dapat pula digunakan untuk pertumbuhan seluruh BAL lain

seperti Streptococcus, Pediococcus, dan Leuconostoc (Yuliana, 2008).

Hasil pengukuran kepadatan bakteri pada Tabel 1 selanjutnya ditampilkan

pada Gambar 2, dapat dilihat bahwa pertumbuhan bakteri E. faecium di media

MRS pada kondisi anaerob terus meningkat memasuki fase log setelah 4,5 jam

kultur. Selanjutnya diikuti oleh media MRS pada kondisi aerob dan media LB

pada kondisi anaerob dan aerob.

24

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

4.5 Jam 5 Jam 5.5 Jam 6 Jam 6.5 Jam 7 Jam

Op

tica

l D

en

sity

60

0 n

m

Waktu Kultur

MRS Aerob

MRS Anaerob

LB Aerob

LB Anaerob

Gambar 2. Kurva Pertumbuhan BAL E. faecium pada media MRS aerob, MRS

anaerob, LB aerob dan media LB anaerob

Bakteriosin umumnya diproduksi secara optimal oleh BAL pada fase akhir

yaitu fase logaritmik hingga awal fase stasioner (Jimenez 1993). Menurut Rinto

(2012) bakteriosin disintesis selama fase eksponensisal pertumbuhan sel

mengikuti pola klasik sintesis protein. System ini diatur oleh plasmid DNA ekstra

kromosomal dan dipengaruhi oleh beberapa factor utama seperti pH. Umumnya

bakteriosin disintesis melalui jalur ribosomal sebagai peptide kemudian

mengalami modifikasi. Prinsip regulasi sintesis bakteriosin diatur oleh adanya gen

pengkode produksi dan pengkode imunitas. Grafik pertumbuhan bakteri E.

faecium untuk masing-masing media perlakuan selanjutnya dapat dilihat pada

Lampiran 1.

Perhitungan Waktu Generasi BAL Enterococcus faecium

Waktu generasi bakteri E. faecium dihitung dengan menggunakan rumus

g=

. Dimana g adalah waktu generasi (generation time), ln2 = 0,69 dan µ

adalah waktu spesifik generasi (Brock et al., 1994). Sebelum mendapatkan waktu

25

generasi, terlebih dahulu menentukan waktu spesifik generasi (µ) dengan rumus

yang digunakan adalah µ =

(Brock et al., 1994). Dimana ln1 adalah

nilai OD awal dan ln2 adalah nilai OD akhir yang telah dipilih dari hasil

pengukuran OD, sedangkan nilai t1 dan t2 adalah waktu kultur dari nilai OD yang

telah dipilih tersebut.

Tabel 2. Hasil perhitungan waktu generasi bakteri asam laktat E. faecium

pada masing-masing media perlakuan.

Media pertumbuhan Waktu spesifik generasi

(generasi/jam)

Waktu generasi

(jam)

MRS Aerob 1,73 0,40

MRS Anaerob 1,82 0,38

LB Aerob 2,88 0,24

LB Anaerob 1,64 0,42

Perhitungan Biomasa Bakteri Enterococccus faecium

Produksi biomasa bakteri E. faecium didapatkan dari pemisahan pellet

dengan supernatan menggunakan alat centrifugasi pada kecepatan 1200 rpm

selama lima menit. Sehingga di dapatkan hasil seperti yang ditampilkan pada

Tabel 3, yang memperlihatkan bahwa rata-rata produksi biomasa dari masing-

masing perlakuan pada media pertumbuhan berbeda-beda.

Tabel 3. Produksi Biomasa Bakteri E. faecium pada media MRS dan

media LB

Rataan berat pellet pada masing-masing jenis media (mg/ml)

MRS LB

Aerob Anaerob Aerob Anaerob

1 2 X 1 2 X 1 2 X 1 2 X

17,2 13,6 15,40 17,8 32,8 25,30 15,4 25,8 20,60 24,4 20,6 22,50

Produksi biomasa dari bakteri E. faecium terlihat lebih tinggi pada media

MRS dengan kondisi anaerob, berikutnya diikuti oleh media LB pada kondisi

26

anaerob. Sedangkan media MRS pada kondisi aerob dan media LB dengan

kondisi aerob lebih rendah. Hasil tersebut menunjukkan bahwa pertumbuhan

bakteri E. faecium lebih baik pada media MRS dengan kondisi anaerob. Hasil

tersebut konsisten dengan pengukuran kepadatan bakteri pada (Tabel 1). Adams

dan Maurice (2008) mengatakan bahwah BAL pada umumnya bersifat anaerob

dan tumbuh baik pada media MRS.

Untuk lebih jelasnya, rata-rata produksi biomasa dapat dilihat pada

Gambar 2. Dari rata-rata produksi biomasa yang dihasilkan oleh bakteri E.

faecium dapat dilihat bahwa, media MRS pada kondisi anaerob memiliki jumlah

biomasa yang paling banyak, berikutnya menyusul media MRS pada kondisi

aerob, selanjutnya media LB pada kondisi anaerob dan media LB pada kondisi

aerob.

0

5

10

15

20

25

30

MRS Aerob MRS Anaerob LB Aerob LB Anaerob

Bio

ma

sa (m

g)

Media Pertumbuhan

Gambar 3. Grafik rata-rata produksi biomasa dari BAL E. faecium

Purifikasi Bakteriosin dari Bakteri E.faecium

Stern et al., (2006) melakukan purifikasi terhadap bakteriosin dari

Lactobacillus salivarius. Aktivitas bakteriosin hasil purifikasi meningkat

89,8% dibandingkan dengan supernatant dari kultur bakteri. Purifikasi

27

bakteriosin pada penelitian ini menggunakan amonium sulfat (NH4)2SO4 15 g

dan pelarut PBS. Hasil purifikasi ditampilkan pada Gambar 3.

(1)

(2)

Gambar 4. Produksi bakteriosin dari bakteri E. faecium (1) Hasil

sentrifugasi kultur falcon 24 jam (2) Hasil sentrifugasi

kultur 48 jam.

Berdasarkan visualisasi bakteriosin dari keempat hasil purifikasi pada

Gambar 3 yang dielektroforesis pada SDS-PAGE (Gambar 4), terlihat ban

pita protein bakteriosin yang berukuran sama sekitar 95 kDa pada kultur

24 jam maupun 48 jam dan pada hasil bilasan kultur 48 jam dengan

PBS pada beker glas. Sedangkan hasil bilasan PBS pada dinding beker

glas yang dikultur 24 jam menunjukkan adanya ban pita protein yang

berukuran sekitar 90 kDa. Hasil penelitian ini berbeda dengan yang

dilakukan oleh Stern et al., (2006), namun menunjukkan kemiripan dengan

yang dilakukan Albano et al., (2007) yang menyatakan bahwa bentuk

separasi bakteriosin dengan tricine SDS-PAGE yang kurang jelas juga

didapatkan pada penelitian yang melakukan separasi peptide bakteriosin HA-

5692 dari Pediococcus acidilactici dengan presipitasi menggunakan

ammonium sulfat jenuh 60%.

28

kDa 250

130

100

70

55

35

25

15

10

M S1 S2 S3 S4

Gambar 5. Visualisasi ukuran pita protein bakteriosin bakteri asam

laktat E. Faecium setelah purifikasi menggunakan

ammonium sulfat. (M) Marker protein, (S1) Bakteriosin

dari kultur 24 jam yang menempel pada dinding beker glas,

(S2) Bakteriosin dari kultur 24 jam yang diperoleh setelah

sentrifugasi, (S3) Bakteriosin dari kultur 48 jam yang

menempel pada dinding beker glas, (S4) Bakteriosin dari

kultur 48 jam yang diperoleh setelah sentrifugasi

Uji Aktivitas Bakteriosin Bakteri E. faecium

Uji antimikrobia bakteri asam laktat terhadap bakteri patogen

menggunakan bakteri Listeria monocytogenes, dikarenakan bakteri LM adalah

kontrol positif yang berarti bahwa, bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri E.

faecium positif dapat menghambat pertumbuhan bbakteri LM. Uji antimikroba ini

menggunakan metode difusi sumur, menurut Cadirci dan Citak (2005) metode

difusi sumur memiliki kelebihan yaitu seluruh metabolit yang dihasilkan bakteri

asam laktat dapat diproduksi selama uji antimikrobia.

29

Hasil pengujian aktivitas penghambatan menggunakan hasil purifikasi

dengan ammonium sulfat menunjukkan adanya zona bening yang terlihat di

sekitar sumuran (Gambar 4). Hal ini menandakan bahwa bakteriosin yang

dihasilkan oleh bakteri E. faecium dapat menghambat bakteri patogen LM.

(a) (b) (c)

Gambar 6. Uji anti mikroba supernatant bakteri asam laktat E. faecium

terhadap bakteri patogen Listeria Monocytogenes, (a) Sampel

yang dikultur selama 24 jam (b) Sampel yang dikultur selama

48 jam (c) kontrol Ampisilin.

Penghambatan bakteri asam laktat E. faeium kurang optimal jika

dibandingkan dengan kontrol positif menggunakan antibiotik (Ampisilin). Hal ini

dapat disebabkan karena jumlah senyawa antimikroba yang dihasilkan selain

asam organik jumlahnya relatif lebih sedikit dibanding dengan produksi asam

organik (Daeschel, 1989).

Umumnya bakteriosin memiliki spektrum penghambatan yang luas

dan stabil pada kisaran suhu dan pH yang luas. Keluasan spektrum daya

hambat bakteriosin biasanya diuji terhadap bakteri Gram negatif dan positif

yang bersifat patogen. Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif, bersifat

parasit di usus manusia dan hewan, dan banyak diantaranya bersifat patogen

(Wilson dan Miles, 1964 dalam Bell dan Kyriakides 2002).

30

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

1. Bakteri asam laktat E. faecium tumbuh paling baik di media MRS pada

kondisi anaerob.

2. Hasil elektroforesis pada SDS – PAGE, dapat memperlihatkan bakteriosin

dengan ukuran sekitar 90 kDa.

3. Uji aktifitas anti mikroba bakteri E. faecium memperlihatkan adanya zona

bening di sekitar sumuran, yang menandakan bahwa bakteri asam laktat E.

faecium dapat menghambat bakteri patogen.

Saran

1. Untuk dapat memastikan efektifitas hambat bakteri patogen oleh bakteri E.

faecium diperlukan uji lanjutan di lapangan.

2. Diperlukan kultur yang lebih besar dan purifikasi yang lebih optimal untuk

menguji aktivitas bakteriosin agar zona hambatan pada sumuran dapat

terlihat dengan jelas.

31

RINGKASAN

Bakteri Enterococcus faecium merupakan salah satu mikroba yang

digolongkan ke dalam BAL yang dapat menghasilkan bakteriosin. Bakteriosin

yang dihasilkan oleh BAL E. faecium dapat digunakan sebagai bahan pengawet

(biopreservatif) terutama dalam pengolahan produk peternakan seperti susu dan

daging. Efek dari pengawetan dengan biopreservatif disebabkan oleh salah

satu metabolit yang dihasilkan oleh bakteri tersebut, yaitu bakteriosin

(Winkowski dan Montville, 1992).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan bakteri E.

faecium sebagai penghasil bakteriosin pada kondisi aerob dan anaerob.

Mengetahui karakteristik bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri E. faecium

dengan melihat berat molekul dan aktivitas uji daya hambat dari bakteriosin yang

dihasilkan. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan

Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram pada bulan maret hingga

bulan juni 2016. Variabel yang diamati pada penelitian ini yaitu pertumbuhan

BAL E. faecium pada media MRS dan media LB pada kondisi aerob dan anaerob,

berat biomasa, dan karakteristik bakteriosin (ukuran dan daya hambat dengan

bakteri patogen Listeria monocytogenes (LM).

Hasil penelian menunjukkan bahwa bakteri E. faecium tumbuh paling baik

pada media MRS dengan kondisi anaerob, diikuti oleh media MRS pada kondisi

aerob, kemudian media LB pada kondisi anaerob dan aerob. Hal ini menandakan

bahwa bakteri E. faecium bersifat fakultatif anaerob, dapat tumbuh pada kondisi

dengan atau tanpa oksigen.

32

Hasil Elektroforesis dari hasil purifikasi bakteriosin menggunakan

ammonium sulfat pada SDS-PAGE memperlihatkan adanya ban pita protein

bakteriosin yang berukuran sekitar 95 kDa. Uji daya hambat bakteri E. faecium

terhadap bakteri patogen Listeria monocytogenes dengan menggunakan metode

sumur menunjukkan adanya zona bening disekitar sumuran yang menandakan

bahwa bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri E. faecium dapat menghambat

bakteri patogen LM setelah diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam.

33

DAFTAR PUSTAKA

Albano H., S. D. Todorov, C. A. Van Reenen, T. Hogg, L. M. T. Dicks and P.

Teixeira. 2007. Characterization of two bacteriocins produced by

Pediococcus acidilactiti isolated from" Alheira", a fermented

sausage traditionally produces in Portugal. Int. J . Food Microbial.

116:239-247.

Abdelbasset M and Kirane Djamila., 2008. Antimicrobial activity of

autochthonouslactic acid bacteria isolated from Algerian traditional

fermented milk “Raïb” AfricanJournal of Biotechnology.7:2908-

2914.

Adam dan maurince. 2008. Karakteristik Bakteri Asam Laktat.

http//dagalih.unila.ac.id/13382/37/pdf. [Diakses tanggal 03-07-

2016].

Ali. G.R.R. and S. Radu. 1998. Isolation and Screening of Bakteriosin Producing

LAB from Tempe. University of Malaysia.

Andika, benson. 2014. Faktor Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat.

(http//:bensonandika.blogspot.co.id/2014/05/faktor-faktor-yang-

mempengaruhi.html) [ Diakses tanggal 12-02-2016].

Anonim. 2012. Media Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat.

(http//:teknologipascapanen.blogspot.com/2012/01/optimalisasi-

produksi-bakteriosin.html). [Diakses tanggal 25-02-2016].

. 2013. Kondisi Umum Pertumbuhan Enterococcus faecium.

http://foodsafety.blogspot.com/2013/09/enterococci.html. [Diakses

tanggal 25-02-2016].

. 2014. Pertumbuhan Bakteri Enterococcus.

(http//:lovefoodsafety.blogspot.com/2013/09/eneterococci.html).

[Diakses tanggal 11-02-2016].

Aryanta, I W.R.2013. Mikrobiologi Pangan dan Pakan. Udayana University Press.

Udayana Denpasar.

34

Arina. 2007. Kemampuan Bakteri Asam Laktat Dalam Menghambat Pertumbuhan

dan Produksi Aflatoksin B2 Aspergillus flavus. Jurnal BIOMA. 9:45-51.

Bell, C. and A. Kyriades. 2002. Pathogenic Eschericia coli. In: Foodborne

Pathogens: Hazards, Risk Analysis and Control (Blackburn, Clive De

W. and Peter J. Mcclure, (Eds.), Woodhead Publishing Limited,

England. 280.

Bertani, G. 1952. „‟Studies on Lysogenesis. I. The mode of phage liberation by

lysogeny Escherichia coli.‟‟ J Bacteriology. 62:293-300.

Brock, T. D., M. T. Medigan, J. M. Maktiriko, and J. Parker. 1994. Biology of

microorganisms. Practice hall. England chffts, New yersy.pp. 323-324.

Cardici, B.H. and S. Citak. 2005. A comparison of two methods used for

measuring antagonistics activity of lactic acid bacteria. Pakistan

Journal of Nutrition 4:237-241.

Daeschel MA. 1989. Antimicrobial substance from lactic acid bacteria for use as

food preservation. J Food Technol. 1989; 43: 148-155.

Fardiaz, S. 1992. Analisis Mikrobiologi Pangan. Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Fitri, SA. 2009. Analisis Mikrobiologi Pangan. Universitas Padjajaran.

Yogyakarta.

Gorris, L.G.M. and M.H.J.Bennik.1994. Bacteriocins for food Preservation.

International Zeitschrift fur-Lebensmittel-Technik,-Marketing,-

Verpackung-und-Analytik. 45:65-68.

Hafsan. 2014. Bakteriosin Asal Bakteri Asam Laktat Sebagai Biopreservatif

Pangan. Jurnal Teknosains. UIN Alauddin Makasar. 8:175-184.

Hanimatul, K. Puji, A. dan Afghani, J. 2014. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum

Terhadap Aktivitas Bakteriosin Lactobacillus sp. RED. JKK. 3:7-12.

Jack, R.W., Tagg J.R. and Ray, B. 1995. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria.

Microbiol. Rev. 59:171-200.

Jimenez-Diaz, R. 1993. Plantaricin S and two new bacteriocins produced by

Lactobacillus plantarum LPC010 isolated from a green olive

fermentation, Appl. Environ. Microbiologi. 59: 1416-1429.

35

John G. Holt, Noel R. Krieg, Peter H. A. Sneath, James T. staley, Stanley T.

Williams. 1994. Bergey‟s Manual of Determinative Bacteriology.

Ninth Edition.

Kamoun , F., N. Zouari, I. Saadaoui, and S. Jaoua. 2009. improvement of Bacillus

thuringiensis bacteriocin production through culture condition

optimization. Preparative Biochemistry & Biotechnology. 39: 400-412.

Kurniawati, N. 2000. Peranan Bakteri Asam Laktat Dalam Menghambat Listeria

monocytogenes Pada Bahan Pangan. Jurnal Teknologi Pangan dan Gizi.

1:16.

Luc De Vuyst. 2007. Bakteriosins from Lactic Acid Bacteria: Production,

Purification, and Food Apllication, Journal of Molecular Micribiology

and Biotechnology. 13:194-199.

Meymey. 2012.Kegunaan Bakteri Asam Laktat Dalam Pengolahan Pangan.

(http//:meymeyrahma.blogspot.com/2012/03/bakteri-asam-laktat.html).

[Diakses tanggal 10-02-2016]

NCBI. 2016.Description and Significance Enterococcus Faecium.

(https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Enterococcus faecium).

[Diakses tanggal 15-02-2016].

Nurliana, S. 2009. Aplikasi Bakteri Enterococcus faecium. Jurnal Mikrobiologi

Indonesia. 2:50-53.

Rinto. 2012. Optimalisasi Produksi Bakteriosin.

(http://teknologipascapanen.blogspot.co.id/2012/01/optimalisasi-

produksi-bakteriosin.html) [Diakses tanggal 30-05-2016].

Shand RF, Leyva KJ. 2007. Peptide and protein antibiotics from the domain

archaea: halocins and sulfolobicins. In: Riley MA, Chavan MA, editors.

Bacteriocins: ecology and evolution. Berlin (Germany): Springer Berlin

Heidelberg. p. 93-109.

Stern, N. J., E. A Svetoch, B. V. Eruslanov, V. V. Perelygin, E. V. Mitsevich, I.

P. Mitsevich, V. D. Phokilenko. V. P. Levchuk, O. E Svetoch and B.

S. Seal. 2006. Isolation of a Lactobacillus salivarius strain and

purification of it‟s bacteriocin, wich is inhibitory to Campylobacter

36

jejuni in the chicken gastrointestinal system antimicrob. Agents

Chemother. 50:3111-3116.

Williams, M.P.M., Liao, M.K. 2013. Luria Broth (LB) and Luria Agar (LA)

Media and Their User Protocol.

(http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-

test/3031-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-

protocol. [Diakses tanggal 14-05-2016].

Winkowski, K. and Montville, T.J., 1992. Use of Meat Isolate, Lactobacillus

bavaricus MN to Inhibit Listeria monocytogenes Growth in Model

Meat Gravy System. J. Food Safety 13: 19-31.

Yuliana, N. 2008. Kinetika Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat. Jurnal Teknologi

Industri dan Hasil Pertanian, 13:2-5.

37

Lampiran 1. Grafik Perumbuhan bakteri Enterococcus faecium pada masing-

masing media

Sampel 1 MRS Aerob

y = 0.302x - 0.035R² = 0.909

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 2 4 6 8

Series1

Linear (Series1)

Sampel 2 MRS Aerob

y = 0.250x + 0.017R² = 0.890

0

0.5

1

1.5

2

0 2 4 6 8

Series1

Linear (Series1)

Sampel 3 MRS Anaerob

y = 0.534x + 0.649R² = 0.957

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8

Series1

Linear (Series1)

38

Sampel 4 MRS Anaerob

y = 0.418x + 1.004R² = 0.892

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8

Series1

Linear (Series1)

Sampel 5 LB Aerob

y = 0.020x + 0.048R² = 0.974

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0 2 4 6 8

Series1

Linear (Series1)

Sampel 6 LB Aerob

y = 0.017x - 0.023R² = 0.964

-0.02

-0.01

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0 2 4 6 8

Series1

Linear (Series1)

39

Sampel 7 LB Anaerob

y = 0.016x + 0.031R² = 0.913

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0 2 4 6 8

Series1

Linear (Series1)

Sampel 8 LB Anaerob

y = 0.024x + 0.007R² = 0.949

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0 2 4 6 8

Series1

Linear (Series1)

40

Lampiran 2. Tabel analisis sidik ragam pengukuran Optical Density

Tabel Analisis Variansi Hasil Pengukuran OD Bakteri Asam Laktat Enterococcus

faecium.

S.K DB JK KT F hitung F tabel

0,05 0,01

Kelompok 7

5,63 0,80 4,71** 2,30 3,21

Perlakuan 5

46,41 9,28

Galat 14

6,03 0,17

Total 26

58,07

Pada tabel terlihat bahwa F. hitung lebih besar dari F. tabel (0,05) dan (0,01)

sehingga (H0) pada hipotesis diterima dan disimpulkan bahwa terdapat perbedaan

yang sangat nyata pada setiap perlakuan penelitian.

41

Lampiran 3. Foto pelaksanaan penelitian di Laboratorium Mikrobiologi dan

Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.

Pembuatan Media MRS

Stirrer Kultur Purifikasi Bakteriosin

Penyimpanan Media pada Anaerob Jar

Penimbangan Bahan untuk Pembuatan

Media

Supernatan Bakteri E. faecium pada

Media MRSB

Supernatan Bakteri E. faecium pada

Media LB

42

Perlakuan untuk kondisi aerob dan

anaerob

Pengenceran untuk pengukuran OD

Sentrifugasi untuk memisahkan pellet

dengan supernatan

Kuktur yang telah dipurifikasi dengan

ammonium sulfat

Pengecatan gel hasil SDS-PAGE

Pembilasan gel hasil pengecatan

43

Membuat sumuran untuk uji daya

hambat

Perlakuan aerob dengan shaker

Mix kultur sebelum diukur OD

Inokulasi bakteri

Penuangan media padat

Penambahan HCl untuk mengatur pH

44

RIWAYAT HIDUP

Penulis atas nama Melinda Sanggu Artha dilahirkan pada

tanggal 20 Mei 1994 di Dusun Montong Wasi Desa

Jerowaru Kec. Jerowaru Kab. Lombok Timur. Merupakan

anak pertama dari dua bersaudara pasangan bapak Jufriandi dengan ibu Hurniati.

Riwayat pendidikan penulis sebagai berikut :

1. Lulus Sekolah Dasar pada Tahun 2006 di SD Negeri 11 Jerowaru.

2. Lulus Sekolah Menengah Pertama pada Tahun 2009 di SMP Negeri 1

Keruak.

3. Lulus Sekolah Menengah Atas pada Tahun 2012 di SMA Negeri 1

Keruak.

4. Pada Tahun 2012 Masuk Fakultas Peternakan Universitas Mataram dan

Memperoleh Gelar Sarjana Peternakan pada Tahun 2016.

45