PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA

8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA

1/30

tugas mata kuliah biologi molekuler


2/30

I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Infertilitas merupakan suatu keadaan yang menyebabkan kegagalan konsepsi

pada pasangan yang telah menikah lebih dari satu tahun, yang tidak menghasilkan

keturunan meskipun tidak mengikuti program keluarga berencana. Sekitar 10% dari

pasangan suami-istri mengalami infertilitas. Faktor peyebab infertilitas berasal dari

suami, istri, atau keduanya. Faktor lain dari kedua belah pihak sebesar 30-0%.

!enurut penelitian yang dilakukan "im dan #atnam, faktor penyebab yang berasal

dari suami sebesar 33%, sedangkan hasil penelitian $& pada 1'(' sebesar 0%.)enelitian yang dilakukan *rsyad terhadap + pasangan infertil di )alembang

menunukkan infertilitas yang disebabkan faktor pria sebesar (,%. Setengah dari

kasus infertilitas pria tersebut disebabkan oleh rendahnya motilitas sperma

astheno/oospermia dan atau umlah sperma oligos/oopermia, dan kelainan

morfologis sperma terato/oospermia.+,3 riteria yang digunakan oleh $& tahun

1''', tentang fertilitas pria.

!itokondria adalah tempat teradinya respirasi sel melalui reaksi en/imatik

fosforilasi oksidatif &2)&S menghasilkan suatu energi dalam bentuk *denosine

riphosphate *). !atriks di dalam mitokondria yang berfungsi sebagai respirasi

sel disebut 4eo5yribonucleic *cid 46*, 46* mitokondria tersebut dikenal dengan

sebutan mt46*. 4i dalam mt46* banyak terdapat gen dan uga terdapat daerah

yang tidak menyandi noncoding region pada mt46* disebut daerah gelung-4 4-

loop, yang merupakan tempat a7al teradinya proses replikasi dan transkripsi.

ecepatan mutasi mt46* pada 4-loop adalah 108+0 kali 46* inti 46*, sehingga

urutan 46* pada daerah 4-loop ini sangat 9ariatif orai and ayasaka, 1''0:

$allace, 1''+: ;ro7n and $allace, 1''3. *kibat adanya mutasi mt46* di samping

mengakibatkan menurunnya *), akan diperoleh #eacti9e &5ygen Species #&S

antara lain hidrogen peroksida yang tinggi. Sedangkan sifat dari hidrogen peroksida


3/30

adalah oksidator, yang mana pada konsentrasi yang tinggi akan mengoksidasi lipid,

protein dan 46*.

Sasaran oksidasi #&S adalah lipid, protein dan 46* Sies and !enck, 1''+.

)ada oksidasi 46*, nukleotida guanin adalah nukleotida yang ra7an terhadap

oksidasi #&S. asil oksidasi guanin adalah (-hidroksideoksiguanosin (-&-d. erusakan pada n46* akan

mengganggu proses pembelahan sel pada spermatogenesis, dan pada mitokondria

mengganggu rantai respirasi sel yang dapat menurunkan energi sel Sohal and ;runk,1''+.

Saat ini lebih dari 100 mutasi titik point mutation pada mitokondria telah

ditemukan dan berhubungan dengan penyakit-penyakit manusia, namun baru

beberapa mutasi mt46* yang dilaporkan teradi pada spermato/oa. *pabila hal ini

teradi pada spermato/oa dika7atirkan dapat menyebabkan menurunnya motilitas

spermato/oa dikarenakan motilitas spermato/oa sangat membutuhkan *) #ui/-

)esini et al., 1''(.

4ari beberapa paparan di atas dapat diduga bah7a (-hidroksideoksiguanosin

(-&-d


4/30

BAB II

DASAR TEORI

2.1 Mitokondria

!itokondria adalah organela yang terletak di dalam sitoplasma sel eukariota.

Struktur organela ini berupa kantung yang selaputi oleh dua membran yaitu membran

luar dan membran dalam, selain itu memiliki dua kompartemen yaitu matriks

mitokondria yang diselimuti langsung oleh membran dalam dan ruang antar

membran.

!embran luar mengandung seumlah protein transpor yang disebut porin dan

en/im-en/im yang terlibat dalam biosintesis lipid dan metabolisme mitokondria.

Ga!ar 1. Struktur !itokondria.

"eterangan # !itokondria diselaputi oleh dua membran yaitu membran luar dan membran dalam.

!embran dalam membentuk struktur yang melipat ke dalam disebut krista. !itokondria

memiliki dua kompartemen yaitu matriks dan ruang antar membran. !embran luar dapat

dilalui ion atau molekul kecil, sedangkan membran dalam bersifat impermeabel. )adamembran dalam terdapat kompleks protein rantai respirasi, *) sintase dan transporter

membran. #uang matriks mengandung en/im, ribosom, 46* mitokondria.


5/30

!embran dalam memiliki struktur melekuk, melipat ke bagian matriks

mitokondria, yang dikenal sebagai krista. Struktur melekuk ini sangat membantu dalam

meningkatkan luas permukaan membran dalam sehingga meningkatkan

kemampuannya menghasilkan *). Struktur yang melekuk ini uga membantu

mempercepat komponen matriks mencapai membran dalam. !embran dalam dan

matriks mitokondria terkait erat dengan akti9itas utama mitokondria yaitu terlibat

dalam pembentukan energi, oksidasi asam lemak dan siklus rebs. !atriks

mitokondria mengandung protein sekitar ?% dari seluruh protein mitokondria,

en/im, 46* mitokondria dan ribosom "odish et al., +000: *rtika, +003.

=umlah mitokondria di dalam sel tergantung dari umlah kebutuhan sel akan

energi. Sel dengan kebutuhan energi yang besar mengandung banyak mitokondria,misalnya oosit yang mengandung 100.000 mitokondria, sedangkan pada spermato/oa

matang, umlah mitokondria sekitar ++-+( St. =ohn et al., +00>. &osit membutuhkan

energi yang banyak terutama untuk pembelahan setelah dibuahi spermato/oa.

Sedangkan pada spermato/oa matang, energi yang dibutuhkan hanya dipakai untuk

pergerakan atau motilitas dalam rangka membuahi o9um.

Ga!ar 2. Spermato/oa manusia.

"eterangan @ Spermato/oa dengan tudung akrosom, nukleus, selubung mitokondria dan

mitokondria yang tersusun heliks di daerah midpiece *. )enampang melintang

bagian spermato/oa, mulai bagian kepala, leher dan ekor ;.


6/30

)ada spermato/oa, mitokondria terletak pada daerah midpiece, terdiri atas 11-13

gira masing-masing girus ada + mitokondria yang tersusun secara heliks, melingkari

bagian pusat midpiece ekor Bamboni, 1''1: olstein et al., +003.

!itokondria yang tersusun heliks ini bertanggung a7ab menyediakan energi

bagi motilitas spermato/oa irata et al., +00+.

membuktikan bah7a pada subek asteno/oospermia, daerah midpiece yang berisi

mitokondria secara bermakna lebih pendek dibanding subek normal. Sedangkan

menurut Aardullo dan ;alt/ 1''1 ada korelasi antara 9olume mitokondria, panang

sperma dan frekuensi gerak flagela. !enurunnya motilitas dapat disebabkan oleh

gangguan gen-gen yang terlibat dalam pembentukan ekor dan fungsi a5onema ekor spermato/oa !oore dan #eio-)era, +000.

2.2 $%ng&i $o&'orila&i Ok&idati' Mitokondria

Fungsi mitokondria dalam sel adalah menghasilkan energi dalam bentuk *)

adenosine triphosphate. Sebagian besar *) dihasilkan melalui proses fosforilasi

oksidatif. Cnergi yang dihasilkan ini digunakan sel untuk homeostatis, regulasi,

pembelahan, motilitas dan kematian $allace, 1''': St. =ohn et al., +00>: !ay

)anloup et al., +00.

Fosforilasi oksidatif merupakan reaksi kondensasi molekul *4) dengan )i

phosphate inorganic, )i menadi *) menggunakan energi yang dihasilkan dari

rantai respirasi Saraste, 1''': "ehtonen, +00+. Fosforilasi oksidatif melibatkan

perpindahan elektron dari senya7a 6*4 dan suksinat, keduanya merupakan substrat

yang akan melepaskan elektronnya untuk reaksi transduksi energi ke molekul oksigen

sebagai akseptor elektron terakhir dan membentuk +&.


7/30

)roses fosforilasi oksidatif melibatkan lima kompleks en/im rantai respirasi

: Saraste,

1''': "ehtonen, +00+.

ransfer elektron antara kompleks I, III dan ID disertai transpor proton dari

matriks ke ruang antar membran dengan menggunakan energi bebas yang dilepaskan

oleh masing-masing kompleks. )emindahan proton ini mengakibatkan akumulasi

proton pada ruang antar membran sehingga menimbulkan suatu gradien potensial

proton. eadaan ini dimanfaatkan oleh kompleks D untuk mensintesis *) dari *4)

dan )i dengan menggunakan energi yang dilepaskan saat proton berpindah dari ruang

Ga!ar (. Fosforilasi oksidatif pada membran dalam mitokondria.

"eterangan @ Clektron ditransfer melalui 6*4 masuk ke dalam kompleks I AI dan ditranspor ke

koen/im E E. ;eberapa elektron dari oksidasi asam organik ditransfer melalui

kompleks II AII langsung ke E. Clektron-elektron tersebut kemudian ditransfer ke

kompleks III AIII, ke sitokrom c cyt c dan dilanutkan ke kompleks ID AID,

kemudian direduksi menadi air. ransfer elektron disertai transpor proton dari matrik ke

ruang membran dalam mitokondria inner membrane space, I!S. ranspor proton

menyebabkan gradien potensial yang menimbulkan energi, yang dipakai untuk

membentuk *) "ehtonen, +00+.


8/30


9/30

mitokondria *ndersons et al., 1'(1. etiga belas polipeptida meliputi tuuh sub unit

641, +, 3, , ", > dan dari kompleks I rantai respirasi, satu sub unit apositokrom

b dari kompleks III, tiga sub unit A& I, II, III dari kompleks ID dan dua sub unit

*) ase dan *) ase ( dari kompleks D *ttardi et al., 1'(?.

erdapat suatu daerah pengontrol yang tidak menyandi non coding region,

disebut sebagai displacement loop 4-loop. 4aerah 4-loop merupakan struktur

beruntai tiga triple stranded, terdiri dari 11++ pb 10+-00>?>, mempunyai titik asal

replikasi rantai & dan + promoter utama untuk untai dan " ) dan )".

ranskripsi !t46* diinisiasi dari dua promoter yang ada di daerah 4loop yaitu )

dan )", transkripsi beralan mengelilingi mt46* sehingga membentuk #6* yang

polisistronik. 4-loop merupakan daerah kontrol utama ekspresi mt46*, dan berfungsi

sebagai promoter utama transkripsi Alayton, 1''1. 4i daerah 4-loop terdapat dua

daerah yang sangat ber9ariasi yaitu hyper9ariable region 1 D#1 dan hyper9ariable

Ga!ar *.


10/30

region + D#+, kedua daerah ini tidak menyandi gen tertentu, namun telah diketahui

berperan penting pada studi populasi. 4aerah 4-loop diperkirakan ber9ariasi sekitar 1-

3% 1-3 per 100 nukleotida antara indi9idu yang tidak memiliki hubungan keluarga

Sudoyo, +003.


11/30

2.* Peran Genetik tDNA Pada Motilita& S)erato+oa

!otilitas sperma adalah pergerakan sperma. Sperma bergerak motil, dengan

maksud agar sampai di alat reproduksi 7anita untuk pembuahan. Cnergi untuk

motilitas bersumber pada bagian tengah spermato/oa. 4i bagian itu terdapat

mitokhondria, yang memecah bahan-bahan tertentu untuk mengeluarkan energi.

;agian tengah spermato/oa dapat diibaratkan generator spermato/oa. Cnergi dari

bagian tengah disalurkan ke distal, yaitu ke ekor. Ckor kemudian bergerak. =adi ekor

dapat diibaratkan sebagai kemudi uga sebagai pendorong spermato/oa ipto, +00(.

!itokondria spermato/oa memegang peranan penting terhadap fungsi sperma,

perubahan genetik pada 46* mitokondria karena mutasi atau 9arian haplogroup

memba7a konsekuensi tersendiri pada fertilisasi secara normal terutama kesuburan pria Sanche/ et al., +003. al ini dapat dipahami karena selain genom inti, mt46*

ikut bertanggung a7ab menyandi kompleks en/im respirasi dalam menghasilkan *)

yang digunakan untuk motilitas spermato/oa !oore dan #eio-)era, +000. *)

digunakan untuk menggerakkan protein dinein penyusun axonema flagela. elah

dilaporkan bah7a gangguan pada motor dinein atau komponen lain yang mengatur

akti9itas motor dapat menyebabkan infertilitas dan respirasi Supp et al., +000.

*) yang dihasilkan oleh mitokondria sebagian besar berasal dari rantai

transfer elektron pada 7aktu fosforilasi oksidatif, dimana segala protein yang terlibat

pada proses rantai respirasi ini disandi oleh genom inti dan genom mitokondria.

ambatan fosforilasi oksidatif diyakini uga terkait dengan genom mitokondria karena

secara genetik mt46* ikut berperan dalam menyandi kompleks en/im respirasi.

. !utasi pada mt46* dapat mengganggu

ekspresi satu atau lebih protein en/imatik Schon et al., 1''?. !utasi mt46* dapat

menurunkan motilitas spermato/oa dengan cara menurunkan produksi *).


12/30

;eberapa mutasi yang teradi pada mt46* yang terkait dengan motilitas

spermato/oa banyak diteliti. Folgero et al. 1''3 menemukan mutasi mt46* *3+3<

menurunkan motilitas sperma. )ada le9el yang sangat rendah mutasi *3+3< sudah

mampu menyebabkan gangguan metabolisma energi Ahinnery et al., +000.

Spiropoulos et al. +00+ menemukan mutasi mt46* *3+3< yang teradi pada

mitokondria dengan le9el yang tinggi secara kuat berhubungan dengan penurunan

motilitas spermato/oa.

Selain mutasi *3+3


13/30

atas, disamping menderita mitochondrial myopathy uga mengalami penurunan

fertilitas dan motilitas.

2., H%!%ngan M%ta&i tDNA dengan In'ertilita& Pria

Salah satu penentu fertilitas pria adalah motilitas sperma. Sperma memerlukan

energi yang besar sehingga dapat berfungsi secara layak untuk keberhasilan fertilisasi.

"okasi mitokondria dalam sperma yang unik yaitu terletak pada bagian basal dari

flagela mid piece, berperan penting dalam ketersediaan energi secara efektif dan

cepat. etapi, motilitas sperma yang sangat bergantung pada fungsi respirasi

mitokondria, dapat diprediksi bah7a akumulasi mutasi yang bersifat patogenik dari

mt46* dan kelainan respirasi menyebabkan disfungsi sperma dan infertilitas.!engingat bah7a kelainan respirasi bisa teradi akibat mutasi n46* maupun

mt46*, maka untuk meyakinkan bah7a energi yang digunakan untuk motilitas

sperma, lebih banyak berasal dari respirasi sistem respirasi oksidatif mitokondria

&2)&S bila dibandingkan dengan glikolisis, dilakukan dua macam percobaan.

)ercobaan pertama menggunakan mencit yang mengalami kelainan ekspresi en/im

gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase dan percobaan kedua menggunakan mencit

transmitokondria mitomice yang memba7a mt46* patogen mt 46*. !itomice

ini merupakan mencit yang mengalami delesi ' bp dari posisi nukleotida ??>' bp

pada gen t "NA#ys yang berpindah translokasi ke posisi 1+> pada gen ND$ mutan

mt 46* ini sama seperti pada manusia dengan penyakit yang umum teradi akibat

delesi pada mt 46*. )enelitian membuktikan bah7a akumulasi mutasi pada mt46*

menginduksi oligo/oospermia dan astheno/oospermia. Sebagian besar mitomice

adalah infertil dan pengamatan pada testis menunukkan berhentinya proses meiosis

pada tahap /igoten, uga teradi peningkatan apoptosis.

Sekitar 1181+% dari kasus infertilitas, mt46* mengalami mutasi titik point

mutation yang spesifik pada daerah kompleks I 64> yaitu pada urutan nukleotida

11?1' dan kompleks ID A&I pada nukleotida '0>>.1.3 ;eberapa laporan lainnya

menyatakan bah7a astheno/oospermia dan oligo/oospermia berkaitan dengan mutasi

titik, delesi berulang, substitusi, polimorfisme nukleotida tunggal haplogroup, delesi


14/30

pada alel 46* polimerase γ mitokondria, dan mutasi pada glutathion %transferase

!&. >

!utasi yang teradi pada n46*, bisa menyebabkan mitokondria cacat, karena

sel cenderung mengalami delesi berulang pada mt46*. !utasi ini berakibat pada

kelainan fungsi respirasi sebagai akibat koordinasi ekspresi gen dari genom nukleus

dan mitokondria. oordinasi antara genom nukleus dan mitokondria uga dinyatakan

oleh )anloup dkk +003, bah7a penurunan umlah copy mt46* pada sampel sperma

dari pasien infertil merupakan akibat dari penurunan faktor transkripsi * tfam dari

n46* yang mengkode banyaknya copy mt46*.

4elesi dari protein kapsul mitokondria yang disebut mitochondrial capsule

selenoprotein !scp dan sperm mitochondriaassociated cysteinerich proteinSmcp, dapat mempengaruhi motilitas sperma meskipun sperma tampak normal secara

morfologis. Sedangkan mutasi gen n46* yang mengkode mitochondrial 'oltage

dependent anion channel 3 Ddac3 pada membran luar mitokondria, menyebabkan

flagela abnormal yang mengganggu motilitas sperma selama transit ke epididimis.

*kumulasi mutasi polimorfisme pada mt46* teradi sekitar 10 8 1? kali lebih

cepat daripada n46*.1 )olimorfisme gen γ polimerase )&"J+>.1?,1(

)olimorfisme nukleotida tunggal S6) mitokondria +1A merupakan hasil

perubahan satu asam amino histidin yang disubstitusikan ke tirosin pada subunit 641

dari ompleks I 6*4 ubi+uinone oxidoreductase. *lel dari +1A ini

diasosiasikan dengan infertilitas pria akibat astheno(oospermia, diabetes insipidus,

diabetes melitus, atrophy optik, tuli, dan #ebers hereditary optic neuropathy.

)olimorfisme mitokondria *103'(< mengubah threonin menadi alanin subunit 643

dari 6*4 dehidrogenase, yang diasosiasikan dengan neurodegeneratif dan penyakit-

penyakit akibat berkurangnya produksi energi atau meningkatnya produk radikal

bebas. )olimorfisme *'1?< menyebabkan perubahan urutan asam amino asparagin


15/30

ke asam aspartat pada subunit 64+ kompleks I yang menyebabkan peningkatan #&S

dan merusak mt46* dan n46*.


16/30

III

METODE PENELITIAN

ntuk melihat peranan genetik 46* mitokondria pada infertilitas pria berupa gangguan

motilitas spermato/oa, dilakukan dua pendekatan @

1. Anali&a kadar -idrogen )erok&ida )ada &een dengan arian T1/10

engg%nakan etoda keil%i&en&i.

4ipilih Semen dengan 9arian 11('A mt46*. arena 9arian ini merupakan

bagian 46* mitokondria yang sangat 9ariable pada semen, mengandung

homopolimerik sitosin antara nt 11(811'3 ;endall and Sykes, 1''>. Darian ini

berhubungan dengan kelainan energy mitokondria melalui suatu proses respirasi

fosforilasasi oksidatif. )enurunan fungsi &2)&S berhubungan dengan gangguan

replikasi, yang menyebabkan umlah *) menurun ;ro7n dan $allace, 1''3 yang

akan berdampak pada penurunan motilitas. 4isamping itu, idrogen peroksida yang

merupak #&S #eacti9e &5ygen Spesies terbentuk akibat adanya penurunan *) yang

dihasilkan pada kasus mutasi mt46* Scri9er et al, 1''>: Sohal and ;runk, 1''+:

Aahill et al., 1''?: #ichter, 1''+ . Sehingga dengan dua pendekatan ini,dengan

menggunakan uibeda makna t-test antara kadar hidrogen peroksida pada 9arian 11('

A dan non 9arian 11(', akan diteliti gambaran pengaruh hidrogen peroksida pada

motilitas spermato/oa.

>0 sampel semen yang diambil secara acak dari pasien yang datang rutin di poli

Infertilitas #umah sakit ;udi !ulia, Surabaya untuk kontrol kualitas semen ditentukan

konsentrasi dan motilitas spermato/oanya menurut petunuk laboratorium $& 1''+.

Semen dari sampel yang ada tergolong normo/oospermia sperma normal dan

asteno/oospermia motilitas sperma rendah. emudian masing-masing sampel ditentukan enis 9ariannya,lalu masing-masing diui kadar hidrogen peroksidanya. 4ari

data kadar hidrogen peroksida 9arian 11('A dan data kadar hidrogen peroksida

negatif 9arian tersebut pada golongan normo/oopernia dibandingkan dengan ui t,

begitu pula pada golongan asthenospermia. 4ari hasil analisa akan dilihat pengaruh


17/30

50

14

Pe

n

en

t

u

a

n

El

e

kt

r

o

f

o

r

es

i

s

(+

)

Va

r i

a

n

T

1

61

8

9

Pe

n

en

t

u

a

n

(-

)

Va

r

i

a

n

T

16

1

8

Pe

n

en

t

u

a

n

U j

i

6

Pe

n

en

t

u

a

n

El

e

kt

r

o

f

o

r

es

i

s

(+

)

Va

r i

a

n

T

1

61

8

9

Pe

n

en

t

u

a

n

(-

)

Va

r

i

a

n

T

16

1

8

Pe

n

en

t

u

a

n

U j

i

hidrogen peroksida pada motilitas spermato/oa. *dapun kerangka operasional seperti

diba7ah ini@


18/30

ntuk dapat dilakukan analisa #F") restriction fragment length polymorphism,

diperlukan sampel berupa 46*, sehingga semen harus dipreparasi untuk mengisolasi

46*, dengan cara diba7ah ini.

I&ola&i DNA

Prin&i) i&ola&i tDNA#

mt46* yang terdapat dalam mitokondria, di dalam sel pada sampel semen

diisolasi dengan cara osmotic shok untuk melisis membrane sel, kemudian melisis

protein semen menggunakan en/im proteinnase , 4, dan S4S. Setelah protein dan

membrane sel lisis, mt46* akan keluar dari sel dan berada di larutan. ntuk

memisahkan protein, lemak, dan mt46* dilakukan ekstraksi menggunakan fenol-

chloroform dalam buffer tris Al. Sehingga lemak dan protein yang telah lisis akan

cenderung berada di fasa organik dan mt46* yang bersifat lebih polar akan berada di

fasa air. 4engan bantuan sentrifugasi kedua fasa Ini dipisahkan, dan untuk

menghilangkan pengotor yang terlarut difasa air dan memekatkan mt46* dilakukan

pengendapan 46* menggunakan etanol pada suhu rendah. 4an untuk menghilangkan

sisa pelarut, pengeringan pelarut dilakukan dengan menggunakan 9acuum speed9ac,

hal ini dilakukan untuk menghindari degradasi mt46*. *dapun diagram alir isolasi

mt46* adalah seperti diba7ah ini @


19/30

A)li'ika&i DNA

ntuk dapat dilanutkan ke proses penentuan 9arian 11('A, diperlukan

mt46* dalam konsentrasi yang tinggi, maka dilakukan )A# dari hasil isolasi mt46*

sperma.

Prin&i) PR %nt%k enga)li'ika&i arian T1/10#

mt46* sebagai template 46* diperbanyak secara in9itro sebanyak 3> kali

siklus, dengan temperature denaturasi 46* untai ganda pada '> A selama 10 menit,⁰

tahap penempelan primer spesifik untuk 9arian ini menggunakan pasangan primer

"1>'0 >KA***A*AA*


20/30


21/30

Setelah diamplifikasi, 46* dideteksi secera elektroforesis pada 1,>% gel

agarosa dengan 9oltase 100D selama 30 menit dan di7arnai dengan etidium bromide

dan diamati diba7ah sinar u9. Disualisasi mobilitas 46* hasil amplifikasi dilakukan

dengan membandingkan terhadap 46* standar yang dibuat dari 46* lamda phage

yang dipotong dengan aeIII sehingga menghasilkan beberapa potongan 46* dengan

ukuran tertentu yang diketahui. *dapun skema 9isualisasi hasil )A# adalah sebagai

berikut@

Penent%an arian T1/10 tDNA

1 lg fragmen 46* yang telah diamplifikasi didigesi menggunakan en/im

restriksi !n"1 pada temperature 3?9A semalam 1-1( am. asil digesti dipisahkan

dengan cara elektroforesis agarosa dan di9isualisai dengan cara mengamati fragmen

hasil elktroforesis yang telah diba7arnai dengan etidium bromide di ba7ah sinar D.

Penent%an kon&entra&i -idrogen )erok&ida

Prin&i) )enent%an kon&entra&i -idrogen )erok&ida#"uminol adalah >-amino-+,3-dihidro-1,-phthala/inedione. etika digunakan bersama

hidrogen peroksida, salah satu cincin pada molekul luminol akan terbuka, melepaskan gas

nitrogen dan menghasilkan senya7a yang dikenal sebagai 3-aminophthlate dalam keadaan

$:ati ;ita %.$


22/30

tereksitasi. Seenak kemudian, 3-*)*L melepaskan photon dan menghasilkan cahaya 9iolet

kebiruan berpendar. es dilakukan pada ruangan gelap agar cahaya yang dihasilkan dapat

dilihat dengan elas. *dapun diagram kera sebagai berikut @

2. Anali&a kadar 04-idrok&i4deok&ig%ano&in engg%nakan etoda HPL.

Sebelum dilakukan analisa (-hidroksi-deoksiguanosin, sampel diambil secara acak dari donor

sprma pada poli infertilitas rumah sakit ;udi !ulia, Surabaya, ditentukan konsentrasi dan

motilitasnya menurut petunuk $&, dan dilakukan isolasi 46* dengan cara yang sama

seperti metode sebelumnya.

Penent%an 04-idrok&i4deok&ig%ano&in

Prin&i)#

mt46* yang telah diisolasi difragmentasi dengan natrium asetat dan didigesti dengan

nuclease-)1, hasil fragmentasi dianalisa dengan menggunakan )"A. orelasi antara (-

hidroksi-deoksiguanosin dengan motilitas spermato/oa menggunakan ui korelasi dan ui

beda makna menggunakan t-test dan nilai batas denan #&A cur9e. *dapun alur kera

sebagai berikut@


23/30


24/30

I3

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Anali&a kadar -idrogen )erok&ida )ada &een dengan arian T1/10

engg%nakan etoda keil%i&en&i.

Penent%an arian T1/10 tDNA

*nalisa 9arian digunakan dengan metode )A#-#F") dengan menggunakan

en/im restriksi !n"I pada fragmen mt46* sepanang 3 pb denganpasang primer

"1>'0-1>0. *da tidaknya situs restriksi ditentukan oleh ukuran fragmen 46*.

asil dinyatakan dengan tanda positif dan negati9e, diba7ah ini pada alur 1 dan 3

menunukkan mt46* dengan 9arian sepanang 11( dan 3+1 pb. Sedangkan tandanegati9e menunukkan mt46* bukan 9arian11('A sepanang +( dan 11( pb

pada alur 1 dan +. eteroplasmi diperoleh apabila ada ketiga fragmen 11(,+(, dan

3+1 pb pada laur seperti yang terlihat pada gambar diba7ah.

asil analisis 9arian menunukkan dari 1 semen astheno/oospemia yang

mengalami 9ariasi 11('A sebanyak ? sampel dan yang tidak ? sampel. Sedangkan


25/30

untuk semen normo/oospermia yang mengalami 9ariasi 11('A sebanyak 1'

sampel dan yang lain tidak.

)ada analisis 9ariasi 11('A mt46a, sampel semen normospermia

diperoleh hasil positi9e hal ini karena sampel semen normospermia dan

asteno/oospermia terdiri dari campuran motilitas spermato/oa tanpa dipisahkan

dahulu.

Penent%an kadar Hidrogen Perok&ida

ntuk persen motilitas spermato/oa motil terlihat seperti tabel diba7ah ini@

)ada normospermia dan asteno/oospermia teradi perbedaan yang bermakna, dapat

dielaskan bah7a adanya 9arian 11('A mt46* mempunyai hubungan dengan

meningkatnya total hidrogen peroksida. Sifat #&S dari hidrogen peroksida adalah

oksidator yang dapat mengoksidasi 46*, dan berpengaruh pada motilitas

spermato/oa yang merupakan salah satu penyebab fertilitas.


26/30

2. Anali&a kadar 04-idrok&i4deoki&g%ano&in engg%nakan etoda HPL.

*nalisa konsentrasi dan motilitas sperma

4ari >3 sampel yang diambil secara acak, 1 tergolong asthenospermia motilitas rendah,

oligospermia umlah sperma kurang, dan 3> normo/oospermia, dengan kossentrasi dan

motilitas seperti berikut.

abel diatas menunukkan motilitas dan kualitas sperma yang rendah pada

asthenospermia dan oligospermia bila dibandingkan dengan normo/oospermia.

Selanutnya dilakukan penentuan konsentrasi (-hidroksi-deokisguanosin menggunakan

metoda )"A, dengan data seperti tabel diba7ah ini@

abel diatas menunukkan bah7a konsentrasi (-hidroksi-deokisguanosin paling tinggi

pada oligospermia, diikuti dengan asthenospermia dan normo/oospermia. al ini

dielaskan bah7a kelainan sperma dapat dilihat dari konsentrasi (-hidroksi-

deokisguanosin dan menunukkan bah7a kerusakan 46* dalam hal ini guanine

menghasilkan (-hidroksi-deokisguanosin akibat oksidasi #&S lebih tinggi di

oligospermia dan asthenospermia daripada normo/oo/permia.


27/30

4ari gambar 1 diatas, terlihat hubungan antara konsentrasi (-hidroksi-deokisguanosin

dengan % motilitas sperma yang berbanding terbalik.

*dapun nilai batasnya, bah7a sperma dengan kadar (-hidroksi-deokisguanosin di

atas nilai ambang 3,?' fmolGng 46* termasuk sperma yang tidak normal. al

ini disebabkan kadar (-hidroksi-deokisguanosin berbanding terbalik dengan motilitas

sperma, dan tingginya (-hidroksi-deokisguanosin merupakan salah satu indicator

kerusakan 46*. *dapan kur9a nilai batas terlihat pada gambar diba7ah ini.


28/30

3

PENUTUP

,.1 "e&i)%lan

a. !utasi mt46* merupakan salah satu faktor penyebab infertilitas pada pria, yang

dapat menyebabkan astheno(oospermia, oligo(oospermia, dan terato(oospermia.

!utasi ini antara lain menyebabkan berkurangnya energi dari proses fosforilasi

oksidatif &2)&S yang sangat diperlukan dalam proses spermatogenesis dan

motilitas sperma.

b. *danya mutasi mt46* di samping mengakibatkan menurunnya *), akan

diperoleh "eacti'e )xygen %pecies#&S antara lain hidrogen peroksida yang

tinggi. ingginya konsentrasi hidrogen peroksida pada semen dengan 9arian

11('A mempunyai hubungan dengan menurunnya motilitas spermato/oa.

c. asil akhir dari oksidasi 46* adalah senya7a (-&-d


29/30

DA$TAR PUSTA"A

*rtika, I!. +003. %truktur, fungsi dan biogenesis mitokondria. Cikman "ecture Series I@

!itochondrial medicine. "embaga ;iologi !olekul Cikman =akarta@1?-+.

;ro7n !4 dan $allace 4A, 1''3. *enetic approaches to mitochondria DNA disease of

oxidati'e phosphorylation.

olstein *F, Schul/e $, 4a9idoff !. +003. -nderstanding spermatogenesis is a

prere+uisite for treatment . #eprod ;iol Cndocrinol 1@10?.

orai S dan ayasaka , 1''0, ntraspecific nucleotide se+uence difference in the ma/or

noncoding region of human mitochondria DNA, *merican =ournal of uman . !itochondrial deoxyribonucleic acid 0122bp deletion

is associated with diminished fertility and motility of human sperm, 3iology of

"eproduction, >+@ ?1+'8?3.

"odish , ;erk *S, Bipursky ", !atsudaira ), ;altimore 4, 4arnell =. +000. !olecular

4ell 3iology. $. . Freeman and Aompany.

St. =ohn =A, =okhi #), ;arratt A"#. +00>. The impact of mitochondrial genetics on male

infertility. Int. =. *ndrol +(@>-?3.

Sies dan !enck, 1''+. %inglet oxygen induced DNA damage,!utation "esearch, +?>@ 3?8

3?>.

Sohal #S dan ;runk , 1''+. !itochondrial production of prooxidants and cellular

senescence, !utation "esearch, +?>@ +'>830.

Sudoyo, . +003. Polimorfisme DNA mitokondria dan kedokteran forensik . Cikman

"ecture Series I@ !itochondrial medicine. "embaga ;iologi !olekul Cikman

=akarta@3->.


30/30

Sudar7o,+00. 5hidroksideoksiguanosin %ebagai %alah %atu ndikator nfertilitas Pria.

Fakultas Farmasi ni9ersitas *irlangga, Surabaya.

Sudar7o,+00. !eningkatnya Hidrogen Peroksida Pada 6arian T&7&514 mtDNA %emen

!anusia. Fakultas Farmasi ni9ersitas *irlangga, Surabaya.

Sumiarsih, . +010. Peran *enetik DNA !itokondria 8mtDNA9 Pada !otilitas

%permato(oa, !aalah esehatan )harma!edika, =akarta.

ipto, +00(. :a/ian nfertil Pria di #aboratorium nfertil; Andrologi Puslitbang %istem dan

:ebi/akan :esehatan%urabaya, T ahun

PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA

Documents

Transcript of PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA