PENENTUAN PRIMER

Pendahuluan

Primer adalah oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang

komplementer dengan urutan nukleotida DNA template. Primer berjalan dari kedua ujung

DNA template. Metode penentuan primer kali ini dengan bantuan software

primer3_results.cgi release 0.4.0. Gen yang diambil adalah Tumor Supresor gene P53 dari

Homo sapiens.

Hasil

No mispriming library specifiedUsing 1-based sequence positionsOLIGO start len tm gc% any 3' seq LEFT PRIMER 856 20 60.17 45.00 6.00 3.00 TTTCGAAGCCAGCATAATCCRIGHT PRIMER 1123 20 60.34 45.00 7.00 2.00 TTAGAAACGGGGTTTCACCASEQUENCE SIZE: 1190INCLUDED REGION SIZE: 1190

PRODUCT SIZE: 268, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 0.00

1 TTCCTGTATGGAAATCCAGTTATTCTGTCTCCACTTGTTGAAATAGGCTTCCTTTCTCTA

61 CTGAATGCTTTTAATTTTAATTATTTTACAGTTGGAGTATAGGGCTACCATTTTAGTGCT

121 ATTTTCTTTTTTTCTTTGTTAATTTTTGAGACAGGGACTCACACTGTTGCCCAGGCTAGA

181 GTACAATGGCACAATCAAGGCTTACTGCAGCCTCGAACCCCTGGGCTCAAGCAGTCCTCT

241 AGCAGCCTCACGAGTAGCTGGGATTACTCCACCACACCCAGCTAACTATTTTATTTTTTT

301 GTATTGACAGGATCTCACTATGTTGCCCAGGCTGGTCTCAAACTGCTGGCCTCAAGCTTT

361 CATCCCATCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCCACCATGCCTGACCT

421 CTTAGTGCTATTTTCTATTTATCTCCTCTGTTCTCTGCTCTCTTTAAACGTTGGAGGAAG

481 AAACAGTACCCATCTTACACAAACTCTTCAGAAAACAGAGGAACAGACTGGGCGCGGTGG

541 CTCATACCTGTAATCTCAGCACTTTGGTACGCTGAGGCAGGGGATCATTTGAGGTCGGGA

1

601 GTTCGAGACCAGCCTGGCCAACACGGCGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAAGTA

661 GCTAGGCGTGGTGACACATACCTGTAATGCCAGTTACTCAGGAGGCTGAGGCACAAGAAT

721 CCCTTGAACCTGGGAAGCGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATTGCGCCACTGCACTCCAGCC

781 TGGGCAACAGAGTGAGACCCTGTCTCAGAAAAAAAAAGAAAGAAAGAAAAAATAGAGGAA

841 TATTTCCCAACTTGTTTTCGAAGCCAGCATAATCCTGGTACCAAAACCAAACAAGGACAT >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

901 TATAAGAAAAGAAAATATAGACCAATATTCCTGTTAGCATAGACATGCAACAGCTAACCA

961 ATTTTAGCAAACCAAACCTGGTAATATAGAAAAAAGGATAAATAGGCCAGTCGCGGTGGC

1021 TCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCAGGCAGATCACTTGAGGTCAGGA

1081 GTTTGAGACCAGCCTGACCAACATGGTGAAACCCCGTTTCTAATAAAAATACAAAAATCA <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<

1141 GGCTGGGCACGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGA

KEYS (in order of precedence):>>>>>> left primer<<<<<< right primer

ADDITIONAL OLIGOS start len tm gc% any 3' seq

1 LEFT PRIMER 845 20 60.23 45.00 6.00 2.00 TCCCAACTTGTTTTCGAAGC RIGHT PRIMER 1123 20 60.34 45.00 7.00 2.00 TTAGAAACGGGGTTTCACCA PRODUCT SIZE: 279, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

2 LEFT PRIMER 851 20 60.39 45.00 6.00 2.00 CTTGTTTTCGAAGCCAGCAT RIGHT PRIMER 1123 20 60.34 45.00 7.00 2.00 TTAGAAACGGGGTTTCACCA PRODUCT SIZE: 273, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

3 LEFT PRIMER 702 20 59.96 55.00 3.00 3.00 GAGGCTGAGGCACAAGAATC RIGHT PRIMER 1017 20 60.84 50.00 4.00 2.00 ACCGCGACTGGCCTATTTAT PRODUCT SIZE: 316, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

4 LEFT PRIMER 856 20 60.17 45.00 6.00 3.00 TTTCGAAGCCAGCATAATCC RIGHT PRIMER 1122 20 59.29 45.00 7.00 2.00 TAGAAACGGGGTTTCACCAT PRODUCT SIZE: 267, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 0.00

Statistics con too in in no tm tm high high high sid many tar excl bad GC too too any 3' poly end ered Ns get reg GC% clamp low high compl compl X stab okLeft 8527 0 0 0 545 0 2889 2985 3 11 87 141 1848Right 8483 0 0 0 324 0 2375 3742 0 8 77 158 1782Pair Stats:considered 2579, unacceptable product size 2560, ok 19

2

primer3 release 1.1.4

(primer3_results.cgi release 0.4.0)

3

EKSTRAKSI DNA

Pendahuluan

Ekstraksi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekuler. Dalam

menganalisis DNA, DNA yang diperlukan adalah dalam bentuk murni. Selain itu, sebelum

memulai PCR (Polymerase Chain Reaction), kita harus melakukan ekstraksi dari DNA yang

ingin kita perbanyak terlebih dahulu. Proses ekstraksi ini terdiri dari 4 tahapan yaitu lisis,

binding, washing ,dan elution.

Pada sel darah putih, DNA terdapat pada nukelus dan mitokondria. Logikanya untuk

memperoleh DNA, kita harus melepaskan semua pelindung - pelindung di sekitar DNA. Hal

inilah yang dilakukan dalam proses ekstraksi DNA. Prinsip dari ekstraksi DNA ini ada dua,

yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan

campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul

besar akan berada dibawah tabung (pelet) dan molekul ringan berada pada bagian atas tabung

(supernatan). Sedangkan, presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk

mengendapkan suatu komponen dari campuran.

Tujuan

Visualisai DNA dengan elektroforesis gel,

Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik

hibridisasi southern.

Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.

Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan

DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

Tahapan Ekstraksi DNA dari Sampel Darah

1. Resuspensi pelet dengan menambahkan Buffer A sebanyak 4 x volume total sample.

2. Tambahkan SDS (Sodium Doecyl Sulfat) 18% sebanyak 1 x volume total sample

(konsentrasi akhir 3%).

3. Bolak - balik tabung agar tercampur dan lisis.

4. Diamkan dalam suhu kamar selama 2 menit.

4

5. Tambahkan fenol / kloroform (25 fenol : 24 kloroform : 1 isoamil alkohol) sebanyak 6

x volume total sample.

6. Homogenkan dengan cara membolakbalikan tabung.

7. Sentrifugasi sample dengan kecepatan 2800 rpm selama 10 menit.

8. Pindahkan fase atas ke dalam tabung baru.

9. Endapkan denga 1 / 10 volume 3M NaAc, pH 5,2 dan volume EtOH, suhu 200C.

10. Buang alkohol hati - hati agar endapan DNA tidak terbuang.

11. Larutkan endapan DNA dengan TE sebanyaj 400 μL.

12. Tambahkan fenol / kloroform lagi.

13. Ambil supernatan dan pindahkan ke tabung yang bersih, endapkan dengan 1 / 10

volume 3 M NaAc, pH 5,2 dan 2,5 volume EtOH, homogenkan.

14. Ambil endapan DNA lalu larutkan endapan DNA dengan TE sebanyak 500 μL.

15. DNA sudah terekstraksi.

Keterangan

Buffer A terdiri dari :

1. NaAc, pH 5.2 50mM

2. NaCl 100mM

3. EDTA 1mM

4. ddH2O

TE terdiri dari :

1. 10 mM Tris HCl

2. 1 mM EDTA pH 8.0 (+20C)

Analisis

Buffer A berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabungan kembali pelet yang telah

terbentuk dengan larutan yang dicampurkan dan sebagai pengkelat. Pemilihan buffer tersebut

dilihat dari kemampuan buffer menghasilkan arus listrik.

SDS (Sodium Doecyl Sulfat) atau larutan deterjen pekat berfungsi sebagai larutan

pelisis dan juga bertindak sebagai pengahambat semua enzim nuklease yang ada selama

proses ekstraksi. Hal ini bisa dipahami karena SDS memiliki 2 bagian yaitu (lipofilik dan

hidrofilik) serta bersifat basa.

5

Fenol / kloroform untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan

pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid, dan molekul lain seperti polisakarida,

yang diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisis DNA bebas kontaminan.

Sedangkan, kloroform dapat berfungsi sebgai pendenaturasi protein, tetapi DNA tidak

terdenaturasi karena tidak larut dalam pelarut organik seperti klorofom / fenol.

Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi

pengotor dengan DNA. Kemudian dilakukan penambahan alkohol sebagai presipitat DNA

setelah dilakukan sentrifugasi dan pemindahan fasa. Penambahan alkohol ini berfungsi

sebagai penghilang kloroform. sebab bila kloroform masih berada di dalam sample maka

dikhawatirkan akan menghambat kerja enzim - enzim restriksi atau enzim lain yang

diperlukan pada langkah selanjutnya.

KONVENSIONAL POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

6

Pendahuluan

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu cara yang cepat, sederhana, dan

tidak memakan biaya besar untuk menggandakan fragmen DNA tertentu dari sejumlah kecil

bahan sumber DNA secara in vitro. PCR pertama kali ditemukan Kary Mullis pada 1983,

meskipun penemuan ini belum diketahui umum sampai dengan tahun 1985. PCR merupakan

suatu teknik dasar yang harus diketahui oleh setiap orang yang ingin berkecimpung /

mempelajari biomolekuler.

Komponen - komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah DNA template,

sepasang primer (oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang

komplementer dengan urutan nukleotida DNA template), dNTPs, buffer PCR, MgCl2, DNA

polimerase.

Prinsip Kerja PCR

Materi awal yang digunakan dalam PCR berupa larutan DNA untai ganda yang

mengandung urutan nukleotida yang ditargetkan untuk disalin. Kemudian, ditambahkan jenis

DNA polimerase yang resisten terhadap panas, dNTPs, dan primer. Primer dibutuhkan agar

DNA polimerase dapat memulai sintesis DNA, juga untuk menentukan segmen DNA tertentu

yang akan diperkuat.

Terdapat 3 tahapan utama dalam PCR yang akan diulang - ulang sampai 30 - 40

siklus. Hal ini dilakukan di mesin PCR, yaitu suatu mesin yang dapat menaikkan atau

menurunkan suhu di suatu tabung tempat reaksi berjalan dalam waktu yang singkat.

1. Denaturasi (93 - 950C)

Selama proses ini, untai ganda DNA terbuka karena ikatan hidrogen yang mengikat

kedua rantai terputus serta semua reaksi enzimatis berhenti. Proses ini memakan

waktu 30 detik sampai 1 menit.

2. Annealing (37 - 650C)

7

Primer bergerak acak dikarenakan gerak brown. Ikatan ion terbentuk seketika. Untuk

ikatan yang lebih stabil, dibutuhkan waktu yang lebih lama. Proses ini memakan

waktu 30 detik sampai 1 menit.

3. Pemanjangan (70 - 750C)

Sintesis rantai DNA yang komplemen dengan utas parental dipengantarai oleh DNA

polimerase dan dNTPs yang terdapat dalam campuran reaksi setelah penempelan

primer sempurna. Pada suhu ini, DNA polimerase bekerja optimal. DNA polimerase

menambahkan nukleotida (dari dNTPs) sebagai komplemen dari rantai DNA

template. Proses ini memakan waktu sekitar 2 menit.

Aplikasi PCR

Kloning gen.

Pendeteksian kelainan genetik.

Paternity test.

Mutagenesis untuk mendeteksi fungsi protein.

Mengidentifikasi perubahan ekspresi gen dari gen yang tidak diketahui.

Analisis forensik.

kontrol kualitas dari industri.

ELEKTROFORESIS

8

Langkah - langkah PCR

Pendahuluan

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas

pergerakan molekul - molekul protein bermuatan di dalam medan listrik. Pergerakan molekul

dalam medan listrik dipnegaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan, dan sifat kimia dari

molekul. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada

makromolekul (pada proses kali ini DNA yang bemuatan - (negatif)). Jika molekul

bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri

arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut

akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut

tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk

molekulnya.

Elektroforesis DNA merupakan teknik post - PCR konvensional untuk keperluan

proses visualisasi. Elektroforesis ini bekerja berdasarkan atas ukuran ( berat molekul ) dan

struktur fisik molekulnya. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel -

partikel bermuatan negatif akan bergerak ke arah kutub positif, sedangkan partikel - partikel

bermuatan positif akan bergerak ke kutub negatif.

Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA, maupun protein.

Elektroforesis DNA misalnya dilakukan untuk menganalisis fragmen - fragmen DNA hasil

pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul DNA yang telah dipotong - potong

dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel agarosa, yaitu suatu bahan semi padat

berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Molekul RNA dapat dianalisa dengan

prinsip yang sama, yaitu menggunakan gel agarose tetapi dengan buffer yang mengandung

formaldehid. Untuk elektroforesis protein yang berbeda hanyalah gel yang digunakan yaitu

gel polikrilamid.

Tahapan Pembuatan Gel Agarose

1. Timbang agarose sebanyak 2 gr ( 25).

2. Tuang ke dalam botol / tabung tahan panas.

3. Tambahkan 100 ml buffer TBE (tris-borat-EDTA).

4. Didihkan sampai larut dalam pemanas / microwave selama 4 menit.

5. Dinginkan pada suhu kamar sampai suhu 600C.

9

6. Tambahkan EtBr sebanyak 5 μL. (EtBr bersifat karsinogenik, laboran harus selalu

memakai sarung tangan pada saat bekerja).

7. Tuang ke dalam tray yang sebelumnya sudah dipasang comb.

Tahapan Loading

1. Masukkan produk hasil RT-PCR ke dalam well yang dibentuk oleh comb pada gel

agarose.

2. Setelah semua produk RT-PCR yang akan kita analisa masuk ke dalam well, tutup cell

unit dengan cell lid dan kemudian letakkan tutup alumunium foil di atasnya. Tutup

aluminium foil digunakan untuk melindungi lid sensor dari gangguan sinal lampu

yang terlalu terang.

3. Hidupkan tombol ON lalu atur dengan ketentuan; output voltage : 100 volt; time : 40

menit; arus listrik : 400 μA.

4. Sebagai indikasi alat menyala, terlihat gelembung - gelembung udara dari elektroda.

Tahapan Visualisasi

1. Setelah proses elektroforesis selesai, rendam gel dalam larutan EtBr.

2. Letakkan gel di atas UV Box.

3. Nyalakan UV (Lindungi mata anda dengan kaca mata pelindung pada saat mengamati

di atas UV-transiluminator)

4. Atur fokus pemotretan

5. Lihat lah pita - pita pada gel.

Analisis

10

Contoh hasil elektroforesis

Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan

untuk pembuatan gel agarose, misal :

Tris-acetate : kemampuannya paling rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari

gel agarose baik elektrolusi maupun gel ekstraksi.

Tris-borat : resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari

agarose

Untuk mendeteksi potongan - potongan DNA berupa bands - DNA pada gel agarose

digunakan pewarna yang mengandung fluorosen dengan konsentrasi rendah, seperti EtBr.

EtBr akan menyisip ke dalam DNA. Penggunaan EtBr dimaksudkan untuk membantu

visualisasi karena EtBr akan memendarkan sinar UV.

Semakin luas pita hasil elektroforesis, menandakan DNA telah menjadi potongan -

potongan kecil, dimana potongan kecil tersebut berjalan lebih cepat menuju elektrodda positif

dibandingkan potongan DNA yang lebih besar. DNA memiliki muatan negatif sehingga akan

bergerak menuju elektroda positif saat di elektroforesis. Pita DNA hasil elektroforesis dapat

dilihat melalui penyinaran dengan menggunakan sinar UV, karena adanya EtBr sebagai

pewarna DNA yang menyebabkan fluoresensi.

Kegunaan Metode Elektroforesis

Pola protein dari satu spesies hewan berbeda dengan yang lainnya, secara

elektroforesis akan memperlihatkan pola yang berbeda pula. Faktor tersebutlah yang

menyebabkan pola protein dapat digunakan untuk membedakan spesies hewan. Perbedaan

pola protein inilah yang sering digunakan sebab untuk membedakan populasi secara tepat

kadang kala tidak dapat dilakukan apabila hanya menggunakan pengamatan secara

morfologis saja. Fenomena ini pula yang menyebabkan metode elektroforesis banyak

dilakukan untuk pengamatan taksonomi, sistematik dan genetik serta untuk mengidentifikasi

spesies hewan maupun tumbuhan (biosistematik). Dapat pula digunakan untuk melihat

rekonstruksi filogenetik dari suatu jenis hewan maupun tumbuhan.

DAFTAR PUSTAKA

11

Campbell.2002.Biologi. Jakarta : Erlangga

Yuwono.2005.Biologi Molekuler. Yogyakarta : Erlangga

Rianta Pratiwi. 2001. Mengenal Pustaka Elektroforesis (http://oseanografi.lipi.go.id)

Made Pharmawati.2009. Optimalisasi Ekstraksi DNA dan PCR - RAPD Pada Grevillea spp.

www.biotech.wisc.edu

12