Iman Rosyidin

KROMATOGRAFI

Kromatografi Adalah teknik pemisahan komponen-komponen dari

sebuah campuran yang didasarkan pada perbedaan tingkat kepolaran, ukuran molekul , atau ionitas dengan cara dilewati pada sebuah fase diam menggunakan fase gerak. Dalam fase diam komponen-komponen akan terpisah. Diperkenalkan pertama kali oleh M. Tswett pada tahun 1906, melalui pemisahan klorofil.

KromatografiPlanar Fase diam berupa lapisan

Kolom Fase diam berupa kolom yang

tipis. Contoh: Kromatografi kertas dan Kromatografi lapis tipis

telah dipacking dengan zat adsorben seperti silika atau alumina Contoh: Kromatografi kolom dan KCKT

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Termasuk ke dalam kategori kromatografi kolom Telah dimodifikasi dengan menambahkan tekanan

laju alir pada fase gerak sehingga proses analisis semakin cepat, bahkan kini telah terkomputerisasi. Daya pisah tinggi, peka, dan akurat Pilihan fase diam dan fase gerak sangat luas Banyak dipakai dalam skala industri

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kolom Fase Terbalik (Rp-18)

Kolom Fase Terbalik 18 (RP-18) Kolom fase terbalik Permukaan Silika terikat dengan C18 (octadecylsilane) Bersifat non-polar

Dapat digunakan untuk analisis bersifat organik

maupun anorganik

Kolom Fase Terbalik 18 (RP-18)Tabel : Volum kolom pada beberapa variasi kolom Ukuran kolom (mm x mm) Volum kolom (ml)

250 x 4.6 150 x 1.5 150 x 3.0 150 x 2.1 50 x 4.6

2.5 1.5 0.64 0.28 0.50

30 x 4.615 x 4.6

0.300.15

Mengapa perlu dilakukan pencucian dan regenerasi? Setiap sampel yang dianalisis tidak murni zat aktif,

melainkan terdapat matriks penyusun sampel itu sendiri Garam, lipid, protein dan senyawa lainnya yang bukan analit bisa menjadi kontaminan bagi kolom Jika terus disuntikkan,maka akan terjadi penumpukan kontaminan di dalam kolom Akan berpengaruh pada kromatogram hasil analisa

Apa yang terjadi? Kehilangan performa kolom Terjadinya tekanan balik yang tinggi Peak tailing, retention time-shift dan baseline drift

PencucianFase Gerak (buffer:pelarut organik) Fase gerak (Air : pelarut organik)

Air : pelarut organik

(komposisi sesuai dengan fase gerak) Air Air : metanol/asetonitril (50:50) Metanol / asetonitril

Fase gerak Air Air : metanol/asetonitril(50:50) Metanol/asetonitril

Setiap fase dialiri sebanyak 20 x volum kolom dengan flow rate 1 ml/mnt Metanol dapat diganti dengan Acetonitril sesuai fase gerak yang dipakai untuk analisa Semua Fase Gerak harus memakai pelarut Grade HPLC

Regenerasi Jika metode pencucian masih menunjukkan performa

kolom yang kurang baik Pencucian tingkat lanjut Menggunakan gradiasi kepolaran Waktu proses lama

Regenerasi kolomPasang kolom dalam keadaan terbalik Buang sisa-sisa buffer dengan dialiri air

Aliri Diklorometan

Aliri Isopropanol

Aliri metanol

Aliri Hexane

Aliri Diklorometan

Aliri Isopropanol

Aliri Air : metanol

Pasang kolom dalam keadaan normal

Aliri Fase gerak

Cek performa dengan injek standar sampel

Tips Merawat Kolom Perhatikan Fase Gerak yang digunakan jika

komposisinya sebagian besar air. Gunakan pre-kolom untuk menghindari kontak langsung dengan preserpatif yang mungkin ada. Selalu cuci kolom setelah dipakai,apalagi jika Fase gerak mengandung buffer. Jika Fase gerak adalah buffer hendaknya mencuci sesuai urutan. Jika kolom akan tidak digunakan dalam waktu lama, maka simpan dalam keadaan air : metanol (50:50)

Kesimpulan Kromatografi merupakan ilmu yang sangat penting

dalam dunia penelitian Salah satu hasilnya adalah KCKT yang sekarang banyak digunakan baik untuk penelitian maupun komersil Kolom adalah jantung dari KCKT Pencucian dan Regenerasi perlu dilakukan untuk merawat dan memperpanjang usia kolom Sehingga hasil analisis tetap pada performa yang bagus