MAKALAH HPLC PEMISAHAN

8/16/2019 MAKALAH HPLC PEMISAHAN

http://slidepdf.com/reader/full/makalah-hplc-pemisahan 1/20

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan

berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat

cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya

menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903

menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan

pigmen dalam daun. stilah !kromatografi" dipakai oleh Tswett untuk

menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom. #erlu

diketahui bahwa $.T% $ay pada kira&kira saat yang sama memakai kromatografi

untuk memisahkan berbagai fraksi minyak bumi tetapi Tswett&lah yang pertama

kali mengenali dan menafsirkan proses tersebut.

'enurut (ritter )1991* Kromatografi merana selama bertahun&tahun,

biasanya dipakai dalam bentuk kromatografi cair&padat )K+#*. Kemudian, pada

akhir tahun 1930an dan pada awal tahun 190an, cara ini mulai berkembang.

$asar kromatografi lapis tipis )K-T* diletakkan oleh zmailo dan /chraiber pada

tahun 193, dan kemudian diperhalus oleh /tahl pada tahun 19. Karya 'artin

dan /ynge, yang pada tahun 101 membuahkan hadian 2obel, tidak hanya

mereolusikan kromatografi cair, tetapi uga secara umum meletakkan landasan

bagi perkembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. #ada tahun 194,

'artin dan 5ames mempublikasikan makalah pertamanya mengenai kromatografi

gas. 6ntara tahun 194 dan akhir tahun 1970an kromatografi gas berkembang

menadi alat analisis yang canggih.

FASE GERAK

F A S E D I A M

ZAT CAIR GAS

ZAT

PADATKromatografi cair&padat )K+KT* Kromatografi gas&padat )K(#*

ZAT CAIR Kromatografi cair&cair )K++* Kromatografi gas&cair)K(+*

1

K8'6T(86:

K8'6T(86: (6/K8'6T(86: +68

(6/&+68

K8'6T(86:

#68T/

#;2<;86#62 +68&

#6$6T

#;8T=K6862 2 ;K/K-=/(6/&#6$6T

K8'6T(86:

K;8T6/

K8'6T(86:

-6#/ T#/



B. Rumuan Maala!

>erdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan sebagai berikut ?

1. 6pakah yang dimaksud dengan Kromatografi +air Tenaga Tinggi @

4. /ebutkan 5enis A#-+ @

3. 5elaskan #rinsip $asar @

. 5elaskan nstrumen 6lat yang termasuk didalamnya @

. 5elaskan analisa kualitatif dan kuatitatif @

7. 5elaskan Keuntungan dan keterbatasan A#-+ @

C. Tu"uan

1. =ntuk mengetahui dan memahami yang dimaksud dengan Kromatografi +air

Tenaga Tinggi

4. =ntuk mengetahui dan memahami 5enis A#-+

3. =ntuk mengetahui dan memahami #rinsip $asar

. =ntuk mengetahui dan memahami nstrumen 6lat yang termasuk didalamnya. =ntuk mengetahui dan memahami analisa kualitatif dan kuatitatif

7. =ntuk mengetahui dan memahami Keuntungan dan keterbatasan A#-+

BAB II

PEMBAHASAN

A. #engertian

4



Kromatografi +air Tenaga Tinggi )K+KT* atau biasa uga disebut dengan

Aigh #erformance -iBuid +hromatography )A#-+* merupakan metode yang

tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.

K+KT paling sering digunakan untuk ? menetapkan kadar senyawa&senyawa

tertentu seperti asam&asam amino, asam& asam nukleat, dan protein&protein dalam

cairan fisiologisC menetukan kadar senyawa&senyawa aktif obat, produk hasil

samping proses sintesis, atau produk&produk degradasi dalam sediaan farmasi.

/umar )199*

#ada A#-+ terdapat kolom terbuka yaitu ? -ow pressure )tekanan rendah*,

dan Aigh pressure )tekanan tinggi D7 bar biasanya memakai satuan kpaEkilo

paskal*. #ada A#-+ terdapat oen untuk pemanas karena pada partikel kecil,

cairan ditekan teradi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi

)cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong, ika ditarik cairan

masuk*. Tekanan harus D7 bar, antara fase diam dan fase gerak teradi gesekan

sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan )dengan pendingin liebigE

ion eFchange* karena ikatannya bisa lepas dan bisa uga teradi bleeding.

Temperatur pada A#-+ digunakan untuk menaga temperatur dalam kolom

konstan sehingga K$ tetap.

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur&unsur yang akan

dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa&fasa ini membentuk

suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya

merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. :asa

stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak

mungkin suatu cairan atau suatu gas. 'aka semua enis kromatografi yang

dikenal, terbagi menadi empat golongan? cair&padat, gas&padat, cair&cair, dan gas&

cair.

#embahasan teknik kromatografi modern baru lengkap bila disebut

kromatografi cairan kinera tinggi )A#-+*. Kromatografi cairan kolom klasik

merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang

mobil mengalir lambat&lambat lewat kolom karena graitasi. =mumnya metode

itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama.

3



2amun seak kira&kira tahun 1979, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup

kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi

oleh Kirchland dan Auber, yang bekera pada tekanan sampai 4,0D F 10D 2m&4

)3000 p.s.i*. $alam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil )1&3 mm* dan

eluen dipompakan ke dalamnya dengan lau alir yang tinggi )sekitar 1& cm 3m&1*.

#emisahan dengan metode ini dilakukan auh lebih cepat )sekitar 100 kali lebih

cepat* daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. 'eskipun peralatan yang

tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, A#-+ telah terbukti luas penggunaannya

dalam kimia organik.

=mumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion

adalah contoh&contoh dari kromatografi kolom. #ada metode kromatografi cair ini

digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. #artikel dengan

dimensi yang berariasi digunakan sebagai penunang stasioner. >anyaknya cairan

pada kolom umlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan

sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam. /ecara

keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. >erbagai usaha telah dilakukan

untuk menambah lau aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom.

#enurunan ukuran partikel penunang stasioner tidak selalu menguntungkan.

Kromatografi cair kinera tinggi atau high performance liBuid chromatography

)A#-+* berbeda dari kromatografi cair klasik.

>ila dibandingkan terhadap kromatografi gas&cairEgas&liBuid

chromatography )(-+*, maka A#-+ lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak

mudah menguap, demikian uga zat yang secara termal tidak stabil. Tetapi ditinau

dari kecepatan dan kesederhanaan, (+ lebih baik. Kedua teknik ini komplementer

satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel

berumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.

6khir&akhir ini, untuk pemurnian )misalnya untuk keperluan sintesis*

senyawa organik skala besar, A#-+ )high precision liBuid chromatography atau

high performance liBuid chromatography* secara ekstensif digunakan. >ila zat

melarut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisis. +iri teknik ini

adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom.

$engan memberikan tekanan tinggi, lau dan efisiensi pemisahan dapat



ditingkatkan dengan besar. Kromatografi penukar ion menggunakan bahan

penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis kation,

anion dan ion organik.

B. #en$ HPLC

#emisahan dengan A#-+ dapat dilakukan dengan fase normal )ika fase

diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya* atau fase terbalik )ika fase

diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya*. >erdasarkan pada

kedua pemisahan ini, sering kali A#-+ dikelompokkan menadi A#-+ fase

normal dan A#-+ fase terbalik.

/elain klasifikasi di atas, A#-+ uga dapat dikelompokkan berdasarkan

pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan

enis&enis A#-+ sebagai berikut?

1. Kromatografi 6dsorbsi

#rinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam

kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. #emisahan kromatografi

adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam

silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90G kromatografi ini memakai

silika sebagai fase diamnya. #ada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang



akan berinteraksi dengan solut. (ugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas

yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat

menyebabkan puncak yang berekor.

4. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi

secara kimiawi atau fase terikat. /eauh ini yang digunakan untuk memodifikasi

silika adalah hidrokarbon&hidrokarbon non&polar seperti dengan oktadesilsilana,

oktasilana, atau dengan fenil. :ase diam yang paling populer digunakan adalah

oktadesilsilan )$/ atau +1* dan kebanyakan pemisahannya adalah fase

terbalik.

/ebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air

atau dengan larutan bufer. =ntuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah,

peranan pA sangat krusial karena kalau pA fase gerak tidak diatur maka solut

akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini

menyebabkan ikatannya dengan fase diam menadi lebih lemah dibanding ika

solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang

mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

K+KT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation

atau anion dengan suatu fase gerak. 6da banyak penukar ion yang beredar di

pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren

resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan

media air karena sifat ionisasinya. $alam beberapa hal digunakan pelarut

campuran misalnya air&alkohol dan uga pelarut organik. Kromatografi penukar

ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau

kekuatan ionik serta oleh pA fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak

menurunkan retensi solut. Aal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion

sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

. Kromatografi #asangan ion

Kromatografi pasangan ion uga dapat digunakan untuk pemisahan

sampel&sampel ionik dan mengatasi masalah&masalah yang melekat pada metode

7



penukaran ion. /ampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang

berlawanan.

. Kromatografi ;ksklusi =kuran

Kromatografi ini disebut uga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat

digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul %

4000 dalton. :ase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang

bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus )lewat diantara partikel*, atau

berdifusi lewat fase diam. 'olekul solut yang mempunyai >' yang auh lebih

besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul&molekul yang ukuran

medium, dan terakhir adalah molekul yang auh lebih kecil. Aal ini disebabkan

solut dengan >' yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara

partikel fase diam. $engan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran

ini tidak teradi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe

kromatografi yang lain.

7. Kromatografi 6finitas

$alam kasus ini, pemisahan teradi karena interaksi&interaksi biokimiawi

yang sangat spesifik. :ase diam mengandung gugus&gugus molekul yang hanya

dapat menyerap sampel ika ada kondisi&kondisi yang terkait dengan muatan dan

sterik tertentu pada sampel yang sesuai )sebagaimana dalam interaksi antara

antigen dan antibodi*.

Kromatografi enis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein )enzim*

dari campuran yang sangat kompleks.

Teknik A#-+ lebih bermanfaat dibandingkan dengan (+ )(as +hromatography*.

Kelebihan dari teknik A#-+ ini antara lain ?

1. A#-+ dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat

yang tidak stabil.

4. A#-+ memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi

3. Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi

. $apat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya

D



. $alam A#-+ dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam

beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil

)sedikit fase gerak yang dikonsumsi*

7. >iaya pelarut auh lebih rendah dibandingkan -+ kuno, sehingga dapat

menurunkan biaya karyawan.

D. Teknik A#-+ dapat dilakukan pada suhu kamar.

C. Pr$n$% Daar

Pr$n$% ker"a HPLC &

$engan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector.

+uplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. $i

dalam kolom teradi pemisahan komponen&komponen ampuran. Karena

perbedaan kekuatan interaksi antara solut&solut terhadap fasa diam. /olut&solut

yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih

dulu. /ebaliknya, solute&solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka

solute&solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. /etiap komponen

campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam

bentuk kromatogram.

D. Intrumen Alat

'enurut ;dward, )1991* nstrumentasi A#-+ pada dasarnya terdiri atas?

wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel )tempat ineksi*,

kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau

integrator atau perekam. $iagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini ?



a. :asa gerak

:asa gerak dalam A#-+ adalah berupa zat cair dan disebut uga eluen atau

pelarut. /elain berfungsi sebagai pembawa komponen&komponen campuran

campuran menuu detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut&solut. leh

karena itu, fasa gerak dalam A#-+ merupakan salah satu faktor penentu

keberhasilan proses pemisahan.

#ersyaratan fasa gerak A#-+?

1. Hat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan

dianalisis.

4. Hat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang

dapat mengganggu interpretasi kromatografi.

3. Hat air harus ernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.

. Hat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak

beracun.

. Hat air tidak kental. =mumnya kekentalan tidak melebihi 0, c# )centi #oise*.

7. /esuai dengan detector.

5enis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak?

a* A#-+ fasa normal? A#-+ dengan kombinasi antara fasa diam polar dan fasa

gerak non&polar. :asa diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau

trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. /edangkan fasa gerak

yang digunakan adalah heksana atau i&propileter.

b* A#-+ fasa terbalik? A#-+ dengan kombinasi antara fasa diam non&polar dan

fasa gerak polar. :asa gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau

asetinitril.

9



:asa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k" pada rentang yang

sesuai. =ntuk cuplikan dengan 4&3 komponen, sebaiknya menggunakan fasa gerak

yang memberikan k" antara 4&.

b. #ompa

#ompa dalam A#-+ dapat dianalogkan dengan antung pada manusia yang

berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk

halus.

#ersyaratan pompa yang digunakan dalam A#-+?

1. 'enghasilkan tekanan sampai 700psi )pointEin4*

4. Keluaran bebas pulsa

3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1&10 mlEmenit. >ahan tahan korosi

Tiga enis pompa yang digunakan dalam A#-+?

a* #ompa reciprocating

#ompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara

gerakan piston mundur&mau yang dialankan oleh motor. #iston berupa gelas dan

berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah

terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston mau maka bola bawah

menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong

masuk ke dalam kolom.

b* #ompa displacement

#ompa ini menyerupai syringe )alat suntik* terdiri dari tabung yang dilengkapi

pendorong yang digerakkan oleh motor. #ompa ini uga menghasilkan aliran

10



yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan iskositas

pelarut.

c* #ompa pneumatic

$alam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. #ompa enis ini

murah dan bebas pulsa. 6kan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan

tekanan yang dihasilkan )I4000 psi* serta kecepatan alir bergantung pada

iskositas pelarut dan takanan balik kolom.

c. #emasukan cuplikan

>eberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam system A#-+?

1. neksi syringe

/yringe disuntikan melalui septum )seal karet* dan untuk ini dirancang

syringe yang tahan tekanan sampai 100 psi. akan tetapi keterulangan

ineksi syringe ini sedikitb lebih baik dari 4&3G dan sering lebih elek.

4. neksi !stop&flow"

neksi ini adalah enis ineksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut

dihentikan sementara, sambungan pada uung kolom dibuka dan cuplikan

disuntikan langsung ke dalam uung kolom. /etelah menyambungkan

kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.

3. Kran cuplikan

5enis pemasukan uplikan ini disebut uga loop. =ntuk memasukkan

cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah?

a* /eumlah olume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi

Jload, cuplikan masih berada dalam loop

b* Kran diputar untuk mengubah posisi Jload menadi posisi

Jineksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.

11



d. Kolom dan :ase diam

6da 4 enis kolom pada A#-+ yaitu kolom konensional dan

kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian A#-+ yang mana terdapat

fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solutEanalit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan

kolom konensional, yakni?

a* Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 0G atau lebih kecil

dibanding dengan kolom konensional karena pada kolom mikrobor

kecepatan alir fase gerak lebih lambat )10 &100 LlEmenit*.

b* 6danya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor

lebih ideal ika digabung dengan spektrometer massa.

c* /ensitiitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya enis kolom ini sangat bermanfaat ika umlah sampel

terbatas misal sampel klinis.

'eskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

Kebanyakan fase diam pada A#-+ berupa silika yang dimodifikasi

secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer&polimer stiren

dan diinil benzen. #ermukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena

adanya residu gugus silanol )/i&A*. /ilika dapat dimodifikasi secara

kimiawi dengan menggunakan reagen&reagen seperti klorosilan. 8eagen&

14



reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan

gugus&gugus fungsional yang lain.

+ontoh #embuatan fasa diam dengan reaksi antara silika dengan

alkilklorosilana )reaksi silanisasi* ?

ktadesil silika )$/ atau +1* merupakan fase diam yang paling

banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa&senyawa dengan

kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. ktil atau rantai alkil yang

lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. /ilika&silika

aminopropil dan sianopropil )nitril* lebih cocok sebagai pengganti silika

yang tidak dimodifikasi. /ilika yang tidak dimodifikasi akan memberikan

waktu retensi yang berariasi disebabkan karena adanya kandungan air

yang digunakan.

e. $etektor A#-+

$etektor pada A#-+ dikelompokkan menadi 4 golongan yaitu?

detektor uniersal )yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak

bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif* seperti detektor indeks bias

dan detektor spektrometri massaC dan golongan detektor yang spesifik

yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti

detektor =M&Mis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

dealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai

berikut?

a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibelC

b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecilC

c. stabil dalam pengopersiannyaC

13

Si OH + +HClCl Si R

CH3

CH3

Si O RSi

CH3

CH3



d. mempunyai sel olume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pitaC

e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas )kisaran dinamis linier*C

f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector A#-+?

Daar

Pen'etek$an

#en$ Mak$mum

en$t$($ta

Peka ter!a'a%

ke)e%atan al$r

Sen$t$*$ta

u!u

6bsorbsi =M /pesifik 4 F 10&17 Tidak 8endah

6bsorbsi 8 /pesifik 10&7 Tidak 8endah

:lourometri /pesifik 10&11 Tidak 8endah

ndek bias =mum 1 F 10&D Tidak N 10& 0 +

Konduktometri /pesifik 10&

<a 4G0

+/pektometri

massa

=mum 10&10 Tidak Tidak ada

elektrokimia /pesifik 10&14 <a 1,G 0+

E. Anal$a Kual$tat$( 'an Kuat$tat$(

6plikasi analisis A#-+ adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan

kuantitatif. A#-+ digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu

retensi untuk identifikasi. dentifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi

sampel dibandingkan dengan larutan standar.

/edangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar A#-+ dapat

dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah?

1. #arameter percobaan sama antara standar dan sampel

4. #enentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama

3. #enentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan )korelasi* dengan

menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. <aitu

berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.

1



. Aasil analisa A#-+ diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. $alam

kromatogram akan terdapat peak&peak yang menggambarkan banyaknya

enis komponen dalam sample. /ample yang mengandung banyak

komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak

peak. >ahkan tak arang antar peak saling bertumpuk )oerlap*. Aal ini

akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. leh

karena itu biasanya untuk sample enis ini dilakukan tahapan preparasi

sample yang lebih rumit agar sample yang siap diineksikan ke A#-+

sudah cukup bersih dari impuritis. /ample farmasi biasanya auh lebih

mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. /ample ini

umumnya hanya melalui proses pelarutan saa.

+ontoh hasil analisa A#-+

/eperti pada kromatografi gas, umlah peak menyatakan umlah kompone

sedangkan luas peakmenyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kera system A#-+ dan

mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran A#-+. ;fisiensi kolom

biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plet teori, konsep yang

dipinam dari teori distilasi. #enerapannya dalam kromatografi, umlah teori plat

2, untuk kolom ditentukan dari lebar peak dan waktu retensi.

=ntuk peak&peak berbentuk simetri seperti teradi pada kebanyakan peak&

peak kromatografi gas, umlah teori plat dapat diformulasi sebagai?

1



menyatakan waktu retensi dan menyatakan leher peak pada setengah

tinggi. 6kan tetapi untuk peak&peak yang tidak simetri disarankan menggunakan

persamaan?

(ambar grafik asimetri?

#eak asimetri dengan parameter 6 dan > untuk menghitung haraga 2.

>erdasarkan gambar, adalah waktu retensi, adalah lebar peak pada

ketinggian 10G atau 6N>, 6 adalah lebar sebelah kanan, dan > adalah lebar

setengah peak sebelah kiri.

17



Tuuan utama dari kromatografi cairan kinera tinggi sama dengan

kromatografi gas adalah mendapat pemisahan yang sempurna. $eraat pemisahan

)8 s* dalam kromatografi cair kinera tinggi&pun dinyatakan dengan istilah resolusi

yang di formulasi sebagai berikut?

>erdasarkan persamaan di atas, terlihat bahwa resolusi dipengaruhi oleh

tiga factor yaitu efisiensi )2*, selektiitas )O*, dan retensi )k"*. lebih sederhana

dari kromatografi gas, di sini selektiitas cukup dinyatakan sebagai?

$imana?

+ adalah selektiitas, dan adalah masing&masing factor kapasitas

senyawa 1 dan senyawa 4. Aarga selektiitas dapat sama dengan satu atau lebih

besar dari satu. >ila harga berarti senyawa 1 dan 4 keluar dari kolom

bersama&sama. $engan kata lain senyawa 1 tidak dapat dipisahkan dari senyawa

4, sebaliknya bila harga maka senyawa 1 keluar dari kolom lebih cepat dari

pada senyawa 4. /emakin besar harga , semakin baik pemisahan.

E($$en$ Pem$a!an&

Tingkat efisiensi pemisahan dengan kromatografi tercermin pada pek&peak

kromatogram yang dihasilkan. /emakin lebar suatu peak kromatogram maka

dapat dikatakan pemisahan semakin kurang efisien. #arameter efisiensi pemisahan

1D



dinyatakan dlam bentuk A;T# )height eBuialent to a theoretical plate* yang

diformulasikan sebagai berikut?

$imana? A ? A;T# )height eBuialent to a theoretical plate*

- ? panang kolom dalam centimeter

2 ? umlah total theoretical plate

2ilai A menunukkan ukuran efisiensi yang diberikan kolom tiap unit

panang kolom. 2ilai A yang kecil menyatakan kolom yang lebih efisien dan nilai

2 yang besar. bek yang paling penting dalam K+KT adalah meminimalkan

nilai A sehingga nilai 2 maksimum dan efisiensi kolom paling tinggi.

2ilai A menurun dengan?

1. =kuran partikel kolom yang kecil

4. -au alir fase gerak yang rendah

3. :ase gerak yang kurang kental

. #emisahan pada temperature tinggi

. 'olekul&molekul sample yang kecil

7. 'eningkatkan panang kolom.

5arak diantara puncak maksimal menunukkan selektiitas sistem. -ebar

punak kromatografi menunukkan efisiensi. ;fisiensi dan selektiitas merupakan

descriptor pelengkap yang tergantung pada parameter&parameter kromatografi

yang berbeda&beda. ;fisiensi lebih tergantung pada kualitas packing kolom,

ukuran partikel, lau alir, dan optimasi instrumental, sedangkan selektiitas lebih

tergantung pada komponen fasa diam dan analit itu sendiri.

F. Keuntungan 'an keter-ataan HPLC

6da beberapa keuntungan A#-+, yaitu?

1. $apat menganalisis sampel yang tidak mudah menguap atau tidak stabil

dengan pemanasan.

1



4. nteraksi yang lebih selektif dengan molekul sample kerena fasa gerak dan

fasa diam berperan dalam proses kromatografi.

3. >erbagai enis kolom yang selektif.

. 'enghasilkan pemisahan dengan kecepatan tinggi.

. Paktu analisis yang cepat.

7. #emasukan sample yang tepat dan mudah dikendalikan sehingga menamin

presisi kuantitatif.

D. 8esiko peruraian sample yang lebih kecil karena tidak dilakukan pemanasan.

. Keragaman kolom dan detector berarti bahwa selektiitas metode tersebut

dapat disesuaikan dengan mudah.

Keterbatasan A#-+ adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali ika A#-

dihubungkan dengan spektrofotometer massa )'/*. /elain itu, keterbatasan

lainnya adalah ika sample dianalisis sangat kompleks, maka resolusi yang baik

sulit diperoleh.

BAB III

PENUTUP

A. Ke$m%ulan

Kromatografi +air Tenaga Tinggi )K+KT* atau biasa uga disebut dengan

Aigh #erformance -iBuid +hromatography )A#-+* merupakan metode yang

tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.

$ilihat dari enis fase diam dan fase gerak, K+KT )kolomnya* dibedakan

menadi? Kromatografi fase normal dan fase terbalik. >eberapa kegunaan A#-+

yaitu A#-+ dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi

dan pestisida.

Kera A#-+ pada prinsipnya adalah pemisahan analit&analit berdasarkan

kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom )sebagai fasa diam* dan larutan tertentu

sebagai fasa geraknya. <ang paling membedakan A#-+ dengan kromatografi

lainnya adalah pada A#-+ digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.

6lat yang berperan penting di dalamnya, antara lain yaitu pompa, inektor, kolom,

19



deterktor, dan fase gerak. A#-+ digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan

pada waktu retensi untuk identifikasi. dentifikasi dapat diandalkan apabila waktu

retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.

/edangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar A#-+ dapat

dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah?

1. #arameter percobaan sama antara standar dan sampel

4. #enentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama

3. #enentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan )korelasi* dengan

menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. <aitu

berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.

B. Saran

$emikianlah makalah ini semoga bermanfaat. Kami menyadari makalah

ini masaih terdapat kekurangan oleh Karen itu, kami sangat mengharapkan kritik

dan saran yang bersifat membangun demi perbaikan 'akalah selanutnya, untuk

kritik dan sarannya kami ucapkan terima kasih.

DAFTAR PUSTAKA

(ritter, 8oy 5, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. >andung? T>

>andung.

Aendayana, /umar, dkk. 199. Kimia Analitik Instrumen Edisi Kesatu. /emarang?

K# /emarang #ress.

5ohnson, ;dward -, dkk. 1991. Dasar Kromatografi Cair . >andung? T>

>andung.

40

MAKALAH HPLC PEMISAHAN

Documents

Transcript of MAKALAH HPLC PEMISAHAN