Kromatografi hplc ppt
-
Upload
nakashima-taiki -
Category
Education
-
view
1.723 -
download
74
description
Transcript of Kromatografi hplc ppt
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
Any Guntarti
POMPA
DC18
Injektor
SKEMA HPLC
Integrator
Kolom analitik
Ke penampungan
Instrumen HPLC
1. Reservoir Fase Gerak↓
Bisa lebih dari 1↓
dari gelas / stainless steel↓
Daya tampung 1- 2 LDilengkapi degasser (menghilangkan gas terlarut) → gas
NO2 & O2 → membuat gelembung-gelembung di dalam kolom & detektor
↓ - Pelebaran pita analit - Respon detektor terganggu
• Degassing → pompa vakum dihubungkan reservoir &
diaduk / dipanaskan
Solven disaring dengan kertas Millipore
Pemisahan dengan 1 jenis FG dengan konsentrasi konstan
→ Elusi Isokratik
Bila dengan 1 atau lebih FG yang polaritasnya berbeda →
Elusi Gradien
Digunakan FG segar → mendapatkan hasil yang
reprodusibilitas optimum dalam pemisahan
2. Pompa
Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi)
Kec. Alir 1-3ml/menit
Bahan harus resisten secara kimiawi
Ex : dari teflon & stainless steel
Tidak ada pulsa getaran
Kontinyu
3. Peredam Pulsa Fase Gerak
Ada beberapa detektor sensitive terhadap
variasi kec. Alir FG → ex : index refraksi,
elektrokimia & konduktometer
Peredam aliran dengan gas yang ditekan
4. Sistem Injeksi Sampel
Menentukan presisi perhitungan → reprodusibilitas
sampel
Sampel dimasukkan dengan tekanan tinggi → merupakan
pita dengan sampel tipis → pelebaran diperkecil
Konvensional atau automatik
Injektor Automatik
5. Kolom Kromatografi
Bentuk tabung, permukaan dalam rataDari gelas / stainless steelLapisan luar kadang dilapisi logam → menahan tekanan ad 6000 psi, rx kimia dari FGSambungan kolom → tidak menyebabkan FG stagnantPanjang kolom (10 – 30) cmAnalisis pemisahan cepat (3 – 8) cmInternal diameter (4 – 5)mmPartikel diameter (3 – 5) µmGuard kolom → sebelum kolom analitik
Kolom dari stainless steel
6. Detektor
Pemilihan didasarkan pada problem pemisahan↓
Harus sensitif (menghindari pelebaran)
Ada 2 macam :
1. Berdasarkan sifat umum larutanRefraktif indeks → control temperaturKurang sensitive
2. Berdasarkan sifat solut/analit/sampel
UV – VisFluorescenceElektrokimia
↓Sinyal analit yang berbeda dari FG
↓Lebih sensitif (µg – ng)
↓Dikembangkan dengan derivatisasi pre & post kolom
Derivatisasi/modivikasi Instrumen HPLC
17
Alur sampel ke Detektor
7.Interpretasi output dari Detektor/integrator
• Direkam berupa rangkaian puncak-puncak• Puncak untuk data kualitatif dan kuantitatif
Profil kromatogram
Dalam gambar, area di bawah puncak Y < dibanding dengan area dibawah puncak X. Hal ini mungkin disebabkan :a.Karena Y lebih sedikit dari Xb.Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X.
Rangkaian HPLC pada spektrometer massa
Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.
Fase Normal HPLC
• Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
Fase Balik/Reverse Phase HPLCSilika dimodifikasi menjadi non polar berupa atomkarbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polardigunakan berupa campuran air dan alkoholseperti metanol.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan bereaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.
Hasil Analisis dengan menggunakan HPLC