AFLATOKSIN AFLATOKSIN dan dan

BAHAN PENGAWETBAHAN PENGAWET

AFLATOKSINAFLATOKSIN Senyawa metabolik sekunder yang bersifat toksik dan Senyawa metabolik sekunder yang bersifat toksik dan karsinogenikkarsinogenik Dihasilkan: Dihasilkan: Aspergilus flavusAspergilus flavus & & Aspergilus parasiticusAspergilus parasiticus Keduanya tumbuh pada biji-bijian, kacang-kacangan, Keduanya tumbuh pada biji-bijian, kacang-kacangan, padi-padian.padi-padian. Ada beberapa jenis Aflatoksin : B1, B2, G1 dan G2.Ada beberapa jenis Aflatoksin : B1, B2, G1 dan G2. Dapat diproduksi oleh kedua jamur tersebut baik Dapat diproduksi oleh kedua jamur tersebut baik

selama tanaman sedang tumbuh, dipanen maupun selama tanaman sedang tumbuh, dipanen maupun dalam penyimpanan.dalam penyimpanan.

Aflatoksin B1 Aflatoksin B1 toksis dan karsinogenik terhadap toksis dan karsinogenik terhadap binatang dan manusiabinatang dan manusia

Tikus yang diberi makanan yang mengandung 2ppb Tikus yang diberi makanan yang mengandung 2ppb aflatoksin dalam waktu lama aflatoksin dalam waktu lama tumor pada hati. tumor pada hati.

PENENTUAN AFLATOKSINPENENTUAN AFLATOKSIN

HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) (High Performance Liquid Chromatography)

Kolom waktu refensi Fase stasioner Fase mobil elusi Injeksi Detektor Kromatogram Standar

Penentuan aflatoksin dengan HPLCPenentuan aflatoksin dengan HPLC

Alat Alat ::Kromatografi dilengkapi 2 pompa dan kolom berukuran Kromatografi dilengkapi 2 pompa dan kolom berukuran 250 x 4,6 mm, 5 250 x 4,6 mm, 5 µµmmSupelco, fase reversi C18, Guard column dengan isian 2 Supelco, fase reversi C18, Guard column dengan isian 2 µµm (Rheodyne Model 7125 dengan 50 m (Rheodyne Model 7125 dengan 50 µµl loop) yang l loop) yang diletakkan antara injektor dan kolomdiletakkan antara injektor dan kolomDetektorfluoresenDetektorfluoresenFase mobil = air : metanol = asetonitrilFase mobil = air : metanol = asetonitril

50 : 40 : 1050 : 40 : 10laju alir 0,8 ml/menitlaju alir 0,8 ml/menitKoil reaktor berukuran 5000 x 0,3 mm untuk derivatisasi Koil reaktor berukuran 5000 x 0,3 mm untuk derivatisasi

Penentuan aflatoksin dengan HPLCPenentuan aflatoksin dengan HPLC

Cara ekstraksiCara ekstraksi : :50 g sampel + 59 NaCl + 140 ml metanol : air (70 : 30) 50 g sampel + 59 NaCl + 140 ml metanol : air (70 : 30) blender dengan kecepatan tinggi.blender dengan kecepatan tinggi.Saring ekstraknya dengan kertas saring whatmanSaring ekstraknya dengan kertas saring whatman12 ml ekstrak + 30 ml air deionisasi (agar konsentrasi 12 ml ekstrak + 30 ml air deionisasi (agar konsentrasi metanol akhir = 20%)metanol akhir = 20%)Ekstrak encer yang mengandung 1 g sampel dialirkan Ekstrak encer yang mengandung 1 g sampel dialirkan melalui affinity column untuk pemurnian afltoksinmelalui affinity column untuk pemurnian afltoksinCuci affinity column 1 x dengan 10 ml air deionisasiCuci affinity column 1 x dengan 10 ml air deionisasiAflatoksin dikeluarkan dari kolom dengan pencucian Aflatoksin dikeluarkan dari kolom dengan pencucian menggunakan 1 ml metanolmenggunakan 1 ml metanol

Kondisi kromatografKondisi kromatograf : :Alat HPLCAlat HPLCKolom Shodex R Spak DS – 613Kolom Shodex R Spak DS – 61310 10 µµl atiquod sampel injeksikan dalam koloml atiquod sampel injeksikan dalam kolomZat pengawet dielusi se c isokratis dengan kecepatan Zat pengawet dielusi se c isokratis dengan kecepatan 1,0 ml/menit1,0 ml/menitDeteksi dengan UV spektrometri pada Deteksi dengan UV spektrometri pada λλ = 230 nm = 230 nm (kompromi untuk (kompromi untuk µµ macam pengawet) macam pengawet)Kuantitatif : puncak zat pengawet dibandingkan dengan Kuantitatif : puncak zat pengawet dibandingkan dengan standarstandar

Penentuan zat pengawet dalam minuman dengan HPLCPenentuan zat pengawet dalam minuman dengan HPLC

Reagensia :Reagensia :

Larutan standar 0,1% dibuat dengan melarutkan 1 g Larutan standar 0,1% dibuat dengan melarutkan 1 g dalam 200 ml metanol dalam 200 ml metanol encerkan sp 1 l dengan air encerkan sp 1 l dengan air deionisasi.deionisasi.

Fase mobil : 0,05 MKH2PO4 (pH 2,65) dan asetonitril Fase mobil : 0,05 MKH2PO4 (pH 2,65) dan asetonitril 60 : 40 (v/v), saring melalui Duropore filter ukuran 0,45 60 : 40 (v/v), saring melalui Duropore filter ukuran 0,45 µµm, hilangkan gas dengan sonikasi.m, hilangkan gas dengan sonikasi.

Zat pengawet : Zat pengawet : asam benzoatasam benzoat asam sorbatasam sorbat

paraben paraben sering dicampur Na-benzoat sering dicampur Na-benzoat

Preparasi Sampel :Preparasi Sampel :

- Sentrifus sampel dalam tabung sentrifus 50 ml pada - Sentrifus sampel dalam tabung sentrifus 50 ml pada 1500 rpm selama 6,5 menit 1500 rpm selama 6,5 menit- Kolom C18 kartrij dielusi dengan 2 ml metanol - Kolom C18 kartrij dielusi dengan 2 ml metanol kemudian dengan 4 ml air. kemudian dengan 4 ml air.- 2 ml supernatan injeksikan melalui kartrij yang telah - 2 ml supernatan injeksikan melalui kartrij yang telah disiapkan. disiapkan.- Cuci kartrij dengan 0,4 ml heksana, elusi zat pengawet - Cuci kartrij dengan 0,4 ml heksana, elusi zat pengawet

dengan 3 ml metanol, saring melalui Duropore dengan 3 ml metanol, saring melalui Duropore- Ekstrak metanol diuapkan - Ekstrak metanol diuapkan 0,5 ml dengan aliran gas 0,5 ml dengan aliran gas

N2 N2 encerkan menjadi 1 ml dengan air deionisasi encerkan menjadi 1 ml dengan air deionisasi siap diinjeksikan siap diinjeksikan

Dengan kromatografi kolomDengan kromatografi kolom

Kolom : Kolom : kaca p = 150 mm d = 8 mm diisi dengan florisil (100 – kaca p = 150 mm d = 8 mm diisi dengan florisil (100 –

200 mesh) 15 mm dibagian bawah dan 15 mm bagian 200 mesh) 15 mm dibagian bawah dan 15 mm bagian atas dengan alumina netral yang tidak mempunyai atas dengan alumina netral yang tidak mempunyai daya fluoresensi bagian atas dan bawah dibatasi wol daya fluoresensi bagian atas dan bawah dibatasi wol kaca/pulp kertas.kaca/pulp kertas. Untuk okhratoksin A kolom ukuran sama tetapi diisi Untuk okhratoksin A kolom ukuran sama tetapi diisi dengan 60 mm florisil.dengan 60 mm florisil.

Reagensia :Reagensia : Zat pelarut untuk ekstraksi : metanol : air (8 : 2 v/v).Zat pelarut untuk ekstraksi : metanol : air (8 : 2 v/v). Larutan penjernih, 150 g Zn SO4 dan 50 g asam Larutan penjernih, 150 g Zn SO4 dan 50 g asam

fosfotungtat dilarutkan dalam 1000 ml aquadest.fosfotungtat dilarutkan dalam 1000 ml aquadest. Larutan heksan : aseton (8 : 2 v/v).Larutan heksan : aseton (8 : 2 v/v). Benzen.Benzen. Metil alkoholMetil alkohol H2SO4 0,25 NH2SO4 0,25 N

Prosedur :Prosedur :Sampel (kacang tanah) haluskan 1’ dengan blender.Sampel (kacang tanah) haluskan 1’ dengan blender.+ metanol – air, blender 1’, biji-bijian berminyak blender 2’ sampel + metanol – air, blender 1’, biji-bijian berminyak blender 2’ sampel : pelarut = 1 : 2.: pelarut = 1 : 2.Saring dengan kertas saring (15 ml ekstrak).Saring dengan kertas saring (15 ml ekstrak).+ 15 ml larutan pembersih, gojog.+ 15 ml larutan pembersih, gojog.Saring 15 ml campur melalui fiber glass.Saring 15 ml campur melalui fiber glass.+ 3 ml benzen, gojog, diamkan + 3 ml benzen, gojog, diamkan pemisah pemisah ambil 1 ml bagian ambil 1 ml bagian atas atas masukkan ke dalam mini kolom, isap dengan vakum pada masukkan ke dalam mini kolom, isap dengan vakum pada bagian bawah kolom.bagian bawah kolom.+ 5 ml heksan – asetan, keluarkan, 2’+ 5 ml heksan – asetan, keluarkan, 2’Aflatoksin Aflatoksin band (garis) biru berfluoresensi di bawah sinar UV band (garis) biru berfluoresensi di bawah sinar UV gelombang panjang (minimal 4 ppt)gelombang panjang (minimal 4 ppt)Untuk okhratoksin A, 1 ml larutan benzen pada lapisan atas Untuk okhratoksin A, 1 ml larutan benzen pada lapisan atas masukkan mini kolom untuk aflatoksin masukkan mini kolom untuk aflatoksin isap dengan vakum. isap dengan vakum.+ 3 ml metil alkohol (metanol) + 3 ml metil alkohol (metanol) isap dengan vakum 15 – 20’ isap dengan vakum 15 – 20’Lepas vakumnya + 0,3 ml H2SO4 0,25 NLepas vakumnya + 0,3 ml H2SO4 0,25 NSegera lihat kolom dengan sinar UV Okhratoksin Segera lihat kolom dengan sinar UV Okhratoksin warna biru warna biru berfluoresensi kira-kira 1 cm dari bagian atas kolomberfluoresensi kira-kira 1 cm dari bagian atas kolom beras, jagung, kacang : beras, jagung, kacang : ±± 8 ppb 8 ppb gandum/sorghun : gandum/sorghun : ±± 16 ppm 16 ppm

Penentuan bahan pengawetPenentuan bahan pengawet

Asam benzoat (kualitatif)Asam benzoat (kualitatif)Ambil sampel + 4 bagian air, aduk, saringAmbil sampel + 4 bagian air, aduk, saringAmbil Ambil ±± 50 – 100 ml larutan + H2SO4 encer (4 N), gojog 50 – 100 ml larutan + H2SO4 encer (4 N), gojog 2 x dengan 20 dan 10 ml ether 2 x dengan 20 dan 10 ml ether uapkan larutan etheris uapkan larutan etheris dengan pemanasan lambat.dengan pemanasan lambat.Residu + 10 ml H2SO4 (p) atau 1 tetes HNO3 berasap Residu + 10 ml H2SO4 (p) atau 1 tetes HNO3 berasap (HNO3 65%) atau 50 mg KNO3, panaskan 180oC, 3’(HNO3 65%) atau 50 mg KNO3, panaskan 180oC, 3’Setelah dingin + (NH4) sS atau 40 mg hidroksilaminSetelah dingin + (NH4) sS atau 40 mg hidroksilamin warna merah coklat : asam benzoat.warna merah coklat : asam benzoat.