LAPORAN PRAKTIKUM ANALISI FARMASI II PENETAPAN KADAR AMOKSISILIN DALAM TABLET SEDIAAN FARMASI DENGAN METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Oleh : Kelompok 10, Gelombang 1 Made Krisna Adi Jaya Putu Desi Padmasari Luh Putu Eka Wahyuni Ni Luh Desy Rupadani (0908505034) (0908505035) (0908505036) (0908505037)

JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 20111

PENETAPAN KADAR AMOKSISILIN DALAM TABLET SEDIAAN FARMASI DENGAN METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

I. Tujuan 1. Menentukan kadar zat aktif amoksisilin dalam sedian tablet dengan metode HPLC.2. Mampu menganalisis suatu senyawa dengan alat High Performance Liquid

Chromatography(HPLC). II. Dasar Teori1. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fase gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fase diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960-an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography(HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas (Efendy, 2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Johnson dan Stevenson, 1978). yaitu : Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran Mudah melaksanakannya Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi2

Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi yang baik Dapat digunakan bermacam-macam detektor Kolom dapat digunakan kembali Mudah melakukan "sample recovery" Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan salah satu metode pemisahan yang memanfaatkan teknologi dalam proses pemisahan suatu senyawa campuran atau suatu analit. Komponen-komponen penting dari KCKT yang harus diperhatikan, dapat dilihat pada gambar berikut (Efendy, 2004).

3

Gambar 1. Skema Alat HPLCA. Pompa (Pump)

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada 2 tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas (Anonim, 2001).B. Injektor (Injector)

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum (Anonim, 1995). Yaitu : 1. Stopped Flow 2. Solvent Flowing Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :1. Stop-Flow :

Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi2. Septum :

4

Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. 3. Loop Valve : Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom (Anonim, 2001). C. Kolom Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok (Anonim, 1995) yaitu : 1. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10-30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.2. Kolom preparatif :

Umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC).D. Detektor (Detector)

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respon linier yang luas, dan memberi respon untuk semua tipe senyawa. Suatu5

kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan rentang yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain: (Gandjar, dkk. 2007).

Detektor Fluorometer -Detektor Spektrofotometer Massa Detektor lonisasi nyala -Detektor Refraksi lndeks Detektor Elektrokimia -Detektor Reaksi Kimia

E. Elusi Gradien Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradient dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan, yaitu : 1. Total waktu analisis dapat direduksi 2. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah3. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

4. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Tabel berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa (Efendy, 2004). Tabel Perbandingan Metode Kromatografi Terhadap Solven MODE Kromatografi Cair padat (LSC) Kromatografi ekslusi Kromatografi Penukar Ion (IEC) Kromatografi Cair Cair (LLC) Kromatografi Fase Terikat (BPC)F. Pengolahan Data (Data Handling) 6

SOLVEN GRADIEN Ya Tidak Ya Tidak Ya

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada rekorder. Suatu tipe kromatogram dapat dilihat pada gambar berikut.

Gambar 2. Kromatogram Senyawa Nukleotida Waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui/dihitung. Ini bias digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif (Anonim, 2001).G. Fase gerak

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fase gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu fase gerak harus (Anonim, 1995) : 1. Murni, tidak terdapat kontaminan 2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing) 3. Sesuai dengan detektor7

4. Melarutkan sampel 5. Memiliki visikositas rendah 6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery" 7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price) Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting (Lindsay. S, 1992). Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detector sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan. Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitive terhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2) (Snyder and Kirkland, 1979).H. Parameter HPLC

Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada beberapa faktor, antara lain waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, dan resolusi. Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum. Faktor kapasitas (k) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k yang lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k optimum, yaitu antara 1 sampai 10. Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas () harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fase gerak (misalnya dengan memperbesar polaritas), mengubah fase diam, mengubah temperatur karena pada umumnya kenaikan temperatur akan memperkecil waktu retensi, dan mengubah bentuk komponen. Efisiensi kolom merupakan kemampuan8

kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi R (ukuran besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik. Kromatogram HPLC merupakan relasi antara tanggapan detektor sebagai koordinat dan waktu sebagai absis dalam sistem koordinat Cartesian, dimana titik nol dinyatakan sebagai saat dimulainya injeksi sampel.I.

Keuntungan HPLC KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam

banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan. KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain : 1. Cepat Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit, waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua fase dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan fase diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fase diam dan fase gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan (Rucker, G 1988). 2. Sensitivitas detektor Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumLah nanogram (10 - 9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektordetektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumLah sampai picogram

9

(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT (Rucker, G 1988).3. Kolom yang dapat digunakan kembali

Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable). Banyak analisis yang bias dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bias dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah, biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut (Rucker, G 1988).4. Mudah merecovery sampel :

Umumnya selektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan kecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus (Rucker, G 1988). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metoda pemisahan canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organic makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (Chirale Trenn Phasen) yang mampu menentukan rasemis dan isomer aktif (Efendy, 2004). Pada Farmakope Indonesia Edisi III (1979) KCKT belum digunakan sebagai suatu metoda analisis baik kualitatif maupun kuantitatif. Di Farmakope negara-negara maju sudah lama digunakan, seperti Farmakope Amerika Edisi 21 (United State of Pharmacopoeia XXI), Farmakope Jerrnan Edisi 10 (Efendy, 2004). Pada Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 sudah digunakan KCKT dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif dan uji kemumian sejumLah 277 (dua ratus tujuh puluh tujuh) obat/bahan obat. Perubahan yang sangat spektakuler dari Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 ini menunjukkan bahwa pemerintah Indonesia melalui10

Departemen Kesehatan Republik Indonesia dan Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan benar-benar telah mengikuti perkembangan dan kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi canggih dalam bidang analisis obat. Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 jenis obat/bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi, waktu analisis cepat.

Gambar 3. Instrumen HPLC2. Senyawa Amoksisilin

Menurut Farmakope Indonesia Ed IV (1995), sifat fisika dan kimia amoksisilin adalah sebagai berikut :

Stuktur Amoksisilin Rumus molekul : C16H19N3O5S. 3H2O Berat molekul : 419, 45 365, 9 dalam bentuk anhidrat Pemerian : serbuk hablur, putih, praktis tidak berbau. Kelarutan : sukar larut dalam air dan metanol, tidak larut dalam benzena, dalam karbon tertraklorida dan dalam kloroform. Waktu Retensi : 3,1 menit11

a. Indikasi : Amoksisilin digunakan untuk mengatasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri gram negatif seperti Haemo philus Influenza, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella. Amoksisilin juga dapat digunakan untuk mengatasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri gram positif seperti : Streptococcus pneumonia, enterococci, nonpenicilinase-producing staphylococci, Listeria. Tetapi walaupun demikian, amoksisilin secara umum tidak dapat digunakan secara sendirian untuk pengobatan yang disebabkan oleh infeksi streprtococcus dan staphilococcal. Amoksisilin diindikasikan untuk infeksi saluran pernapasan, infeksi saluran kemih, infeksi klamidia, sinusitis, bronkitis, pneumonia, abses gigi dan infeksi rongga mulut lainnya (Pertiwi, 2010). b. Farmakologi Amoksisilin adalah antibiotik dengan spektrum luas, digunakan untuk pengobatan seperti yang tertera diatas, yaitu untuk infeksi pada saluran napas, saluran empedu, dan saluran seni, gonorhu, gastroenteris, meningitis dan infeksi karena Salmonella sp., seperti demam tipoid. Amoxicillin adalah turunan penisilin yang tahan asam tetapi tidak tahan terhadap penisilinase. Amoksisilin aktif melawan bakteri gram positif yang tidak menghasilkan -laktamase dan aktif melawan bakteri gram negatif karena obat tersebut dapat menembus poripori dalam membran fosfolipid luar. Untuk pemberian oral, amoksisilin merupakan obat pilihan karena di absorbsi lebih baik daripada ampisilin, yang seharusnya diberikan secara parenteral (Pertiwi, 2010). Amoksisilin merupakan turunan dari penisilin semi sintetik dan stabil dalam suasana asam lambung. Amoksisilin diabsorpsi dengan cepat dan baik pada saluran pencernaan, tidak tergantung adanya makanan. Amoksisilin terutama diekskresikan dalam bentuk tidak berubah di dalam urin. Ekskresi Amoksisilin dihambat saat pemberian bersamaan dengan probenesid sehingga memperpanjang efek terapi (Pertiwi, 2010). Amoksisilin mempunyai spektrum antibiotik serupa dengan ampisilin. Beberapa keuntungan amoksisilin dibanding ampisilin adalah absorbsi obat dalam saluran cerna lebih sempurna, sehingga kadar darah dalam plasma dan saluran seni lebih12

tinggi. Efek terhadap Bacillus dysentery amoksisilin lebih rendah dibanding ampisilin karena lebih banyak obat yang diabsorbsi oleh saluran cerna (Pertiwi, 2010). Resistensi terhadap amoksisilin dan ampisilin merupakan suatu masalah, karena adanya inaktifasi oleh plasmid yang diperantai oleh penisilinase. Pembentukan dengan penghambat laktamase seperti asam klavunat atau sulbaktam melindungi amoksisilin atau ampisilin dari hidrolisis enzimatik dan meningkatkan spektrum antimikrobanya (Pertiwi. 2010). c. Interaksi Obat : Amoksisilin dapat memberikan interaksi dengan senyawa lain bila diberikan dalam waktu yang bersamaan. Interaksi tersebut antara lain:1.

Eliminasi amoksisilin diperlambat pada pemberian dengan uricosurika

(misal probenesid), diuretika, dan asamasam lemah ( misal asam Acetylsalicylat dan Phenilbutazon).2.

Pemberian bersama antasidaalumunium tidak ketersediaan biologik Pemberian bersamaan allopurinol dapat memudahkan timbulnya reaksi Menurunkan keterjaminan kontrasepsi preparat hormon. Kemungkinan terjadi alergik silang dengan antibiotik sepalosporin. Antibiotik bacteriostatik mengurangi bactericidal dari amoksisilin. Inkompabilitas dengan cairan/larutan dekstrosa bersamaan.

dari Amoksisilin.3.

reaksi kulit alergik. 4.5. 6. 7.

III. Alat dan Bahan Alat :1. Mortir + Stamper

Bahan : 1. Tablet Amoksisilin2. Kalium Dihidrofosfat (KH2PO4)

2. Beaker Glass 3. Batang pengaduk 4. Labu Ukur 5. Gelas Ukur 6. Pipet Tetes7. Alat HPLC

3. Aquadest 4. NaOH 5. Asetonitril P 6. Standar Amoksisilin 7. Metanol8. Water for irrigation (WFI) 13

8. Kolom C18 Okta Desil Silanon 9. Syringe 10. Ultrasonik11. pH Meter

12. Timbangan IV. Prosedur KerjaIV.1 Pembuatan Larutan Buffer Fosfat 0,02M pH 4,8

Larutan buffer Fosfat yang dibuat sejumLah 500mL. Cara Kerja :1. Ditimbang 1,3609 g Kalium dihirdofosfat, kemudian dilarutkan dalam 500 mL

water for irrigation.2. Diatur pH larutan dengan kalium hirdoksida dalam pH meter hingga kondisi pH

larutan berada pada 4,8 0,1. IV.2 Pembuatan Fase Gerak Fase gerak yang akan digunakan adalah : I. Metanol (sebagai fase gerak pencuci kolom) Cara Kerja : -Dipipet 100 mL etanol, dimasukkan ke dalam botol/wadah fase gerak.II. WFI : Asetonitril (95 : 5) dibuat sejumLah 100mL.

(sebagai fase gerak pencuci kolom) Cara Kerja :1. Dipipet 95 mL WFI dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL. 2. Ditambahkan Asetonitril P hingga tanda batas (Ad 100 mL)

3. Digojog hingga homogen.III. Dapar fosfat : Asetonitril P (95 : 5) dibuat sejumLah 300mL.(fase gerak untuk

elusi) Cara Kerja :1. 2.

Dipipet 285 mL dapar fosfat dimasukkan ke dalam beaker glass. Ditambahkan 15 mL Asetonitril P, diaduk hingga homogen.14

IV.3 Pembuatan NaOH 0,2M1. Ditimbang 200 mg NaOH dimasukkan dalam labu ukur 25mL.

2. Ditambahkan WFI hingga tanda batas.

IV.4 Penyiapan Sampel1. SejumLah 3 tablet amoksisilin ditimbang dan dihitung bobot rata-ratanya. 2. Tablet digerus hingga homogen, lalu ditimbang hingga diperoleh 100 mg

amoksisilin.3. Serbuk di masukkan ke dalam labu ukur 100 mL, tambahkan WFI, gojog hingga

homogen (Larutan 1)4. Lakukan pengenceran terhadap larutan 1 dengan factor pengenceran 100x dengan

pelarut fase gerak hingga konsentrasinya 5 g/mL (Larutan 2)5. Sampel yang sudah diiencerkan (Larutan 2) disaring, diultrasonik dan sampel siap

dianalisis. IV.5 Penetapan Kadar Amoksisilin Dalam Tablet1. Diinjeksikan10 l standar amoksisilin, dengan kosentrasi 2 L/mL, 4 L/mL, 6

L/mL, 8 L/mL, masing-masing ke dalalam HPLC dengan menggunakan syringe. 2. Dilihat waktu retensi, mAU, luas puncak kromatogram yang terbentuk dalam spektum pada masing-masing kosentrasi senyawa standar amoksisilin, kemudian dicatat spektumnya. 3. Dibuat persamaan regresi linier antara konsentrasi senyawa standar terhadap luas puncak kromatogram.4. Diinjeksikan 20 l sampel, ke dalalam HPLC dengan menggunakan syringe. 5. Dicatat spektrum yang terbentuk, kemudian di tentukan kadar senyawa

amoksisilin dalam sampel dengan memasukkan nilai luas puncak kromatogram ke dalam persamaan regresi linier. IV.6 Skema Kerja1.

Pembuatan Larutan Buffer Fosfat 0,02M pH 4,8

Ditimbang 1,3609 g Kalium dihidrofosfat, kemudian dilarutkan dalam 500 mL WFI15

Diatur pH larutan dengan natrium hirdoksida dalam pH meter hingga kondisi pH larutan berada pada 4,8 0,1. 2. Pembuatan Fase Gerak

Dipipet 285 mL Buffer Fosfat dimasukkan ke dalam beaker glass Ditambahkan 15 mL Asetonitril P, diaduk hingga homogen. 3. Pembuatan NaOH 0,2M

Ditimbang 200mg NaOH dimasukkan dalam labu ukur 25mL. Ditambahkan WFI hingga tanda batas. 4. Preparasi Sampel

SejumLah 3 Tablet amoksisilin ditimbang dan dihitung bobot rata-ratanya Tablet digerus hingga homogen, lalu ditimbang hingga diperoleh 100 mg amoksisilin. . Serbuk di masukkan ke dalam labu ukur 100mL, tambahkan WFI, gojog hingga homogen. (Larutan 1) Lakukan pengenceran terhadap larutan 1 dengan factor pengenceran 100x dengan pelarut fase gerak hingga konsentrasinya 5g/mL. (Larutan 2) Sampel yang sudah diiencerkan (Larutan 2) disaring, diultrasonik dan sampel siap dianalisis.5. Pembuatan kurva kalibrasi

16

Dipipet 10l standar amoksisilin, dengan kosentrasi 2 L/mL, 4 L/mL, 6 L/mL, 8 L/mL, 10 L/mL kemudian masing-masing diijeksikan ke dalalam HPLC dengan menggunakan syringe. Dilihat nilai luas puncak kromatogram yang terbentuk dalam spektum pada masingmasing kosentrasi senyawa standar amoksisilin, kemudian dicatat spektumnya.

Dari data yang diperoleh, kemudian dibuat kurva baku atau kurva kalibrasinya.

Dibuat persamaan regresi linier antara konsentrasi senyawa standar terhadap luas puncak kromatogram.6. Penetapan Kadar Amoksisilin dalam Tablet

Diinjeksikan 10l sampel, ke dalalam HPLC dengan menggunakan syringe. Dicatat spektrum yang terbentuk, kemudian di tentukan kadar senyawa amoksisilin dalam sampel dengan memasukkan nilai luas puncak kromatogram ke dalam persamaan regresi linier.

Y = bx + a

V. Hasil Pengamatan 1. Data Penimbangan Tabel 1. Penimbangan bobot tablet amoksisilin. No 1 2 3Rata-rata

TABLET I 0,6416 g 0,6439 g 0,6328 g 0,6394 g

TABLET II 0,6419 g 0,6298 g 0,6245 g 0,6320

TABLET III 0,6375 g 0,6307 g 0,6369 g 0,6350 g

17

Tabel 2 Penimbangan Sampel AmoksisilinTABLET I (2a) TABLET II (2b) TABLET III (2c) 2. Data Standar amoksisilin

Bobot Sampel 42,6 mg 42,1mg 42,3 mg

Bobot yang ter timbang 42,7 mg 42,5 mg 42,3 mg

Tabel 3 Data AUC dari Standar amoksisilin No 1 2 3 4

Kadar Larutan Standar Amoksisilin 2 g/mL 4 g/mL 6 g/mL 8 g/mL Standar 2 g/mL

Area Under Curve (AUC) 6908 15234 20781 25615

Standar 4 g/mL

18

Standar 6 g/mL

Standar 8g/mL

19

3. Data Sampel tablet amoksisilin Sampel 2a

Sampel 2b

Sampel 2b

20

Sampel 2c Sampel 2c

\

Tabel 4. AUC Amoksisilin Dalam Sampel SAMPEL 2a 2b KONSENTRASI YANG DIBUAT 5g/mL 5g/mL AUC 7832 652821

2c VI. Perhitungan

5g/mL

14587

7.1 Pembuatan Larutan Buffer Fosfat 0,02M PH 4,8

Larutan buffer Fosfat yang dibuat sejumLah 500mL. Jadi, perhitungannya adalah sebagai berikut : BM KH2PO4 = 136,09 g/mol Masa Kalium dihirdofospat yang ditimbang = 0,02M x 136,09 g/mol x 0,5 L = 1,3609 g 7.2 Pembuatan Fase Geraka. WFI : Asetonitril (95 : 5) dibuat sejumLah 100mL.

(sebagai fase gerak pencuci kolom) Perhitungannya adalah sebagai berikut : WFI yang diambil = x 100

= 95 mL Asetonitril P yang diambil = =5 mLb. Bufer fosfat : Asetonitril P (95 : 5) dibuat sejumLah 300mL.(fase gerak untuk

x 100

elusi) Perhitungannya adalah sebagai berikut : Buffer Fosfat yang diambil = x 300

= 285 mL Asetonitril P yang diambil = x 300 = 15 mL 7.3 Pembuatan NaOH 0,2M NaOH yang dibuat sejumLah 25mL. Jadi perhitungannya adalah sebagai berikut :22

Massa NaOH yang ditimbang = M x BM x Volume Masaa = 0,2M x 40g/mol x 25 mL Massa = 200mg 7.4 Pembuatan Larutan Standar

a. Ingin dibuat larutan standar primer dengan konsentrasi = 1mg/mL sejumLah 25mL.

Sehingga jumLah amoksisilin yang ditimbang adalah 25 mg. Karena standar yang tersedia di lab adalah amoksisilin trihidrat maka bobot amoksisilin sebenarnya dikonversikan ke jumah amoksisilin trihidrat. Jadi perhitungannya adalah :

Massa Amoksisilin trihidrat = Massa Amoksisilin trihidrat yang ditimbang =

x massa amoksisilin anhidrat x 25mg

= 28,66 mg Jadi untuk membuat larutan standar dengan konsentrasi 1mg/mL dilarutkan 28,66 mg amoksisilin trihidrat dalam 25mL pelarut. b. Untuk memudahkan pembuatan larutan standar, maka dibuat larutan standar sekunder dengan konsentrasi 0,1mg/mL dengan mengencerkan larutan standar primer. M1 x V1 = M2 x V2 0,1mg/mL x 10mL 1mg/mL x V1 =c.

V1 = 1 mL Dari larutan standar sekunder dibuat larutan dengan konsentrasi 2 g/mL, 4 g/mL, 6 g/mL, dan 8 g/mL I. Standar 2 g/mL M1 x V1 0,1mg/mL x V1 V1 II. Satandar 4 g/mL23

= = =

M2 x V2 2 x 10-3mg/mL x 10mL 0,2 mL

M1 x V1 0,1mg/mL x V1 V1III. Standar 6 g/mL

= = =

M2 x V2 4 x 10-3mg/mL x 10mL 0,4 mL

M1 x V1 0,1mg/mL x V1 V1IV. Standar 8 g/mL

= = =

M2 x V2 6 x 10-3mg/mL x 10mL 0,6 mL

M1 x V1 0,1mg/mL x V1 V1 7.5 Perhitungan Preparasi Sampel

= = =

M2 x V2 8 x 10-3mg/mL x 10mL 0,8 mL

Dari 3 tablet, setelah bobot tablet yang ditimbang, ditentukan bobot rata-ratanya sebagai berikut : Sampel 2a : Bobot tablet 1,2, dan 3 = 0,6416 g ; 0,6439 g ; 0,6328 g. Bobot rata-rata = 0,6394 g = 639,4mg Tiap tablet mengandung @500mg amoksisilin. Diinginkan sampel terambil dengan kadar 100mg dari ketiga tablet, sehingga perhitungannya adalah sebagai berikut : Bobot sampel yang ditimbang = Bobot sampel yang ditimbang = Bobot sampel yang ditimbang = 42,6mg Sampel 2b x bobot rata-rata ketiga tablet x 639,4mg

Bobot tablet 1,2, dan 3 = 0,6419 g ; 0,6298 g ; 0,6245 g.24

Bobot rata-rata = 0,6320 g = 632mg Bobot sampel yang ditimbang = Bobot sampel yang ditimbang = Bobot sampel yang ditimbang = 42,1mg Sampel 2c x bobot rata-rata ketiga tablet x 632mg

Bobot tablet 1,2, dan 3 = 0,6375 g ; 0,6307 g ; 0,6369 g. Bobot rata-rata = 0,6350 g = 635mg Bobot sampel yang ditimbang = Bobot sampel yang ditimbang = Bobot sampel yang ditimbang = 42,3mg Setelah sampel ditimbang, selanjutnya diencerkan dengan pelarut sejumLah 25mL sehingga kosentrasinya menjadi 4mg/mL. Dari sampel ini dilakukan pengenceran kembali hingga diperoleh sampel dengan konsentrasi 5g/mL melalui perhitungan sebagai berikut: Pengenceran I : Dibuat menjadi konsentrasi 0,4 mg/mL. M1 x V1 4mg/mL x V1 V1 = = M2 x V2 0,4 mg/mL x 10mL x bobot rata-rata ketiga tablet x 635mg

= 0,4 mL

Pengenceran II : Dari sampel dengan konsentras 0,4mg/mL dibuat menjadi 5g/mL M1 x V1 0,4 mg/mL x V1 V1 = = M2 x V2 5 x 10-3mg/mL x 10mL

= 0,12 mL

7.6 Penentuan Persamaan Regresi Kurva Kalibrasi 25

Berdasarkan hasil AUC yang diperoleh dari keempat larutan standar, maka dapat ditentukan persamaan regresinya. Berdasarkan data berikut : No 1 2 3 4 Kadar Larutan Standar Amoksisilin 2 g/mL 4 g/mL 6 g/mL 8 g/mL Area Under Curve (AUC) 6908 15234 20781 25615

Dari data di atas, dengan menggunakan software dipeoleh nilai-nilai : r2= 0,98 a = 1717,5 b = 3083,4 Dimana persamaan regresinya adalah y = bx + a. Jadi, persamaannya adalah y = 3083,4x + 1717,5

Dari data-data di atas maka diperoleh kurva baku untuk menentukan kadar amoksisilin dalam sampel :

26

Kurva baku di atas dapat digunakan untuk menentukan kadar sampel amoksisilin karena nilai r2 mendekati satu. 7.7 Penentuan Kadar Amoksisilin Sampel Data AUC sampel SAMPEL 2a 2b 2c KONSENTRASI YANG DIBUAT 5g/mL 5g/mL 5g/mL AUC 7832 6528 14587

Berdasarkan data di atas, kadar amoksisilin dalam sampel dapat ditentukan dengan memasukkan nilai AUC sampel ke dalam persamaan rrregresi linier : Penentuan Perolehan Kembali Amoksisilin Dalam Sampel -Konsentrasi semula -Konsentrasi penenceran I -Konsentrasi Pengenceran II = 4 mg/mL = 400 g/mL = 5 g/mL

Sampel 2a : y = 3083,4x + 1717,5 x= x= x = 1,98 g/mL Sampel 2b : y = 3083,4x + 1717,5 (Dimana y = AUC ; x = Kadar)27

(Dimana y = AUC ; x = Kadar)

x= x= x = 1,56 g/mL Sampel 2c : y = 3083,4x + 1717,5 x= x= x = 4,17 g/mL a. Penentuan Perolehan Kembali Sampel 2a =X = 158,4 g/mL. Untuk memperoleh nilai sebelum pengenceran, maka nilai ini

(Dimana y = AUC ; x = Kadar)

harus dikalikan 10, karena diencerkan sejumLah 10mL.Jadi, 158,4 g/mL x 10 = 1584 g/mL = 1,584 mg/mL

Tahap selanjutnya, nilai ini di konversikan kembali ke keadaan sebelum pengnceran. Jadi,

= x = 39,6 mg % perolehan kembali = = 39,6 % Jadi, amoksisilin yang terkandung dalam sampel adalah 1,584 mg/mL atau 39,6 mg dari konsentrasi awal 4mg/mL atau 100mg dengan perolehan kembali sebesar 39,6%. x 100 %

28

b.Penentuan Perolehan Kembali Sampel 2b =X = 124,8 g/mL. Untuk memperoleh nilai sebelum pengenceran, maka nilai ini

harus dikalikan 10, karena diencerkan sejumLah 10mL.Jadi, 124,8 g/mL x 10 = 1248 g/mL = 1,248 mg/mL

Tahap selanjutnya, nilai ini di konversikan kembali ke keadaan sebelum pengnceran. Jadi,

= x = 31,2 mg % perolehan kembali = x 100%

= 31,2 % Jadi, amoksisilin yang terkandung dalam sampel adalah 1,248 mg/mL atau 31,2 mg dari konsentrasi awal 4mg/mL atau 100mg dengan persentase perolehan kembali sebesar 31,2 %. c. Penentuan Perolehan Kembali Sampel 2c =

X = 333,6 g/mL. Untuk memperoleh nilai sebelum pengenceran, maka nilai ini harus

dikalikan 10, karena diencerkan sejumLah 10mL.Jadi, 333,6 g/mL x 10 = 3336 g/mL = 3,336 mg/mL

Tahap selanjutnya, nilai ini di konversikan kembali ke keadaan sebelum pengnceran. Jadi,

29

= x = 83,4 mg % perolehan kembali = x 100%

= 83,4 % Jadi, amoksisilin yang terkandung dalam sampel adalah 3,336 mg/mL atau 83,4 mg dari konsentrasi awal 4mg/mL atau 100mg dengan perolehan kembali sebesar 83,4 %. 7.8 Penentuan Standar Deviasi (SD) = 39,6mg + 31,2mg + 83,4mg 3 = 51,4 mg Kadar awal sampel yang ditentukan adalah 100mg. Yang berarti serbuk gerusan 3 tablet amoksisilin yang diambil mengandung sejumLah 100mg amoksisilin. Tabel Penentuan SD x (Kadar) 39,6 31,2 83,4 (kadar rata2) 51,4 51,4 51,4 JumLah (x - )2 (x - ) -11,8 -20,2 32 (x - )2 139,24 408,4 1024 1571,64 Kadar Rata-Rata amoksisilin dalam Sampel () :

SD =

SD = SD = 28,03 Jadi kadar rata-rata amoksisilin dalam sampel dengan 3 kali pengulangan adalah : 51,4 28,03 mg.7.9

Penentuan Coefficient Variation30

CV =

x 100%

CV =

x 100%

CV = 54, 54 % Nilai CV yang diharapkan tidak boleh lebih dari 5%

VII. Pembahasan Pada praktikum kali ini dilakukan penetapan kadar amoxicillin dalam sediaan tablet dengan metode High Performance Liquid Cromatography (HPLC). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography(HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya diantaranya Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah dalam pelaksanaanya, kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi, dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis, resolusi yang baik dapat digunakan bermacam-macam detector, kolom dapat digunakan kembali, dan mudah melakukan "sample recovery". (Efendy.2004) Dalam praktikum ini dilakukan penetapan kadar senyawa amoksisilin dari tablet amoksilin yang beredar di pasaran. Kondisi analisis senyawa ini mengacu pada jurnal penelitian, dimana metode yang digunakan adalah fese terbalik sehingga fase gerak yang digunakan bersifat polar dan fase diamnya bersifat non polar. Fase gerak yang digunakan31

adalah campuran Bufer fosfat : Asetonitril P (95 : 5) dan fase diam yang digunakan adalah packing coloumn C18 oktadesil silanon. Sebelum dilakukannya penetapan kadar amoksisilin dalam tablet dilakukan pengkondisian alat seperti pengaturan tekanan kolom, laju alir fase gerak, serta pencucian kolom dengan menggunakan methanol, dilanjutkan dengan campuran WFI:Asetonitril dan terakhir pencucian dengan menggunakan fase gerak buffer fosfat : asetonitril (95:5) yang bertujuan untuk menghilangkan pengotor dalam kolom sehingga pengelusian berjalan dengan baik. Pencucian dilakukan secara berurut dari methanol, WFI:Asetonitril, dan Buffer Fosfat:asetonitril bertujuan untuk menghindari kolaps atau shock pada kolom karena pencucian tiba-tiba dengan fase gerak sehingga tidak mengganggu proses elusi. Sebelum semua larutan tersebut digunakan dilakukan proses degassing. Degassing merupakan proses penyaringan dengan menggunakan pompa vakum dimana larutan dilewatkan melalui membrane filter yang bertujuan menghilangkan gas yang terkandung dalam larutan sehingga mencegah timbulnya gelembung yang dapat mengganggu proses elusi. Setelah pengkondisian alat dilakukan pembuatan larutan standar eksternal amoksisilin dengan konsentrasi 2 g/mL, 4 g/mL, 6 g/mL, dan 8g/mL yang digunakan untuk pembuatan kurva kalibrasi dimana kadar sampel dapat ditentukan melalui persamaan dalam kurva kalibrasi.kemudian larutan standar tersebut diinjeksikan kedalam kolom HPLC dengan menggunakan syringe. Berdasarkan pustaka, waktu retensi amoksisilin sebesar 3,1 menit (Moffat, et al, 2005). Berdasarkan hasil pengamatan terhadap nilai AUC diperoleh data yang menunjukkan bahwa pada larutan standar amoksisilin 2 g/mL diperoleh nilai AUC sebesar 6908 dengan waktu retensi 2,907. Pada larutan standar 4 g/mL diperoleh nilai AUC sebesar 15234 dan waktu retensi 2,921. Pada larutan standar 6 g/mL diperoleh waktu retensi 2,717 dengan AUC 20781 dan larutan standar 8 g/mL diperoleh nilai AUC sebesar 25615 dengan waktu retensi sebesar 2,727. Berdasarkan data tersebut diperoleh kurva kalibrasi sebagai berikut:

32

Kurva kalibrasi ini menunjukkan bahwa pada larutan standar memenuhi persamaan regresi karena memiliki nilai regresi mendekati 1. Sehingga penetapan kadar amoksisilin dapat dilakukan menggunakan persamaan tersebut. Selanjutnya dilakukan preparasi sampel. Pada analisis sampel amoksisilin seluruh sampel dibuat dengan konsentrasi 5 g/mL dari 3 tablet yang berbeda merk. Sampel tersebut masing-masing diinjeksikan kedalam kolom HPLC. Untuk uji kualitatif batas spectrum yang diperoleh dicocokkan dengan spectrum standar amoksisilin yang telah tersedia. Berikut ini adalah spectrum dari ketiga sampel yang diinjeksikan. Spectrum Sampel 2a

2b

Spectrum Sampel

33

34

Spectrum Sampel 2c

Berdasarkan ketiga spectrum diatas dapat disimpulkan bahwa senyawa yang dianalisis merupakan senyawa amoksisilin. Selanjutnya dapat dilakukan uji kualitatif. Berdasarkan uji kualitatif, pada sampel 2a dengan konsentrasi 5 g/mL diperoleh nilai retensi sebesar 2,759 dengan AUC 7832, pada sampel 2b dengan konsentrasi yang sama diperoleh nilai retensi sebesar 2,846 dengan AUC 6528 dan pada sampel 2c siperoleh nilai retensi sebesar 2,933 dan AUC 14587. Nilai AUC ini kemudian dimasukkan kedalam persamaan regresi sehingga dapat ditentukan kadar masing-masing sampel. Pada sampel 2a,2b, dan 2c masing-masing diperoleh kadar amoksisilin sebesar 39,6 %, 31,2 %, dan 83,4 %. kadar yang diperoleh memiliki nilai presisi yang sangat rendah dengan standar deviasi 28,03 % dan nilai koefisien variasinya 54,54 % . kadar amoksisilin yang diperoleh tidak sesuai dengan yang diharapkan yaitu 100 %. Hal ini dikarenakan pada proses preparasi sampel, tidak dilakukan ultrasonic pada setiap kali pengenceran sebelum dilakukan penyaringan Akibatnya banyak pertikel amoksisilin yang belum larut tertinggal dalam saringan, sehingga tingkat kelarutan amoksisilin dalam larutan sangat kecil. Yang seharusnya jika konsentrasi sampel sama, maka nilai AUC antar sampel harus sama atau saling mendekati.

35

VIII.Kesimpulan

1.

Kadar persen recovery amoksisilin yang diperoleh dari 3 tablet amoksisilin yang

beredar dipasaran yaitu 39,6 %, 31,2 %, dan 83,4 %.2.

Pada praktikum kali ini praktikan mampu menggunakan alat dan melakukan

penetapan kadar amoksisilin dalam tablet dengan menggunakan metode High performance liquid chrotomagraphy (HPLC) hingga diperoleh hasil persen recovery dari sampel amoksisilin.

36

DAFTAR PUSTAKA Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Ed IV. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia Anonim. 2001. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. http:// upi. edu/ direktori /fpmipa / jur _ pend. _ kimia. Hokcu _ suhanda / kuliah _ kimia _ instrumen / kckt. Pdf. Disadur, 22 April 2011. 02.50pm. Pertiwi. 2010. Penetapan Kadar Amoksisilin Dalam Tablet. http:// repository.usu.ac.id /bitstream/123456789/18820/.../Chapter%20II.pdf. Disadur, 01 Oktober 2011. 11.54am. Efendy D.L.P. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. http://epository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3616/1/farmasi-effendy2.pdf. Disadur, 22 April 2011. 02.56pm. Gandjar Gholib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar Harianto, Sabarijah W dan Fitri T. 2006. Perbandingan Mutu dan Harga Tablet Amoksisilin 500 mg Generic Dengan Non- Generic yang Beredar di Pasaran. http:// Perbandingan Mutu dan Harga Tablet Amoksisilin 500 mg Generic Dengan NonGeneric yang Beredar di Pasaran. Disadur, 02 Oktober 2011. 09.12am. Johnson, E. L. dan R Steven son. 1978. Basic liquid Chromatography. California : Varian. Lindsay, S. 1992. High performance liquid chrotomagraphy.second edition. New York, Brisbane, Toronto, Singapore : John Wiley &Sons, Chischer. Moffat, et al. 2005. Analysis of Drugs and Poisons 3rd ed. Electronic book Pharmaceutical press. Rucker, G 1988. Instrumentelle pharmazeutische Analytik. Germany : lehbuch zu spektroskop, Chrotography. Snyder, L. R and J.J Kirkland. 1979. Introduktion to modern liquid Chromatographysecond edition. NewYork, Chihester, Briebane, Toronto. Singapore : John Wiley & Sons.Inc Surya, Kharismala, et al. 2011. Metode Pemisahan Kimia HPLC. http://webcache. googleusercontent.com/pdf. Disadur. 23 April 2011. 02.56pm Widjaja INK, WidyanPi Astuti, Pitri Susanti, Gelgel Wirasuta. 2007. Buku Ajar Analisis Fisiko Kimia. Bukit Jimbaran : Jurusan Farmasi F.MIPA UNUD.

37