BAB I

Pendahuluan

1.1 Latar Belakang

Kromosom, gen serta DNA merupakan suatu kesatuan yang berperan pnting

dalam penurunan informasi genetic kepada generasi selanjutnya. Saat ini banyak sekali

kita ditemui penyakit serta kelainan-kelaianan yang disebabkan oleh adanya gen

abnormal maupun penyakit genetic yang diturunkan.

Untuk mendeteksi adanya gen abnormal pada individu perlu dilakukan

pemeriksaan. Oleh karena itu sangatlah penting untuk mengetahui berbagai macam

pemeriksaan untuk mengidentifikasi kelainan gen serta cara kerja pemeriksaan tersebut.

1.2 Tujuan

Untuk mengetahui berbagai macam pemeriksaan terhadap gen abnormal

1.3 Hipotesis

Noda hitam diturunkan secara genetic.

1.4 Sasaran pembelajaran

Mengetahui tentang pemeriksaan kromosom.

1

BAB II

Pembahasan

2.1 Kromosom

Istilah kromosom pertama kali diperkenalkan oleh Weldeyer yang berasal dari

kata latin kroma yang berarti warna dan soma yang berarti badan. Disebut demikian

karena pada waktu sel membelah, kromosom bersifat menyerap zat pewarna yang

ditambahkan. Kromosom adalah struktur dasar berpasangan yang mengandung gen

dalam sususan linier.1 Bagian-bagian dari kromosom adalah sebagai berikut :2

Kromonema : pita spiral yang tampak pada kromatid

Kromomer : penebalan pada kromonema. Didalam kromomer terdapat

protein yang mengandung molekul DNA.

Sentromer : bagian kromosom yang terletak pada daerah penyempitan

primer diantara lengan-lengan kromosom.

Telomer : bagian ujung-ujung kromosom yang menghalangi

bersambungnya ujung kromosom yang satu dengan yang lain.

Satelit : tonjolan yang terdapat pada ujung kromosom. Tidak

semua kromosom memiliki satelit

Berdasarkan letak sentromer, dan melihat panjang lengannya, maka kromosom

dapat dibedakan atas 4, yaitu :1

Metasentris :

Sentromer terletak median (kira – kira di tengah kromosom), sehingga

kromosom terbagi menjadi dua. Lengannya sama panjang dan mempunyai

bentuk seperti huruf V

Submetasentris

Sentromer terletak submedian (ke arah salah satu ujung kromosom),

sehingga kromosom terbagi menjadi dua bagian yang tidak sama panjang

2

Akrosentris

Sentromer terletak subterminal (di dekat ujung kromosom), sehingga

kromosom tidak membengkok melainkan tetap lurus seperti batang. Salah satu

lengan kromosom sangat pendek, sedang lengan lainnya sangat panjang

Telosentris

Sentromer terletak di ujung kromosom, sehingga kromosom hanya terdiri

dari sebuah lengan saja dan berbentuk lurus seperti batang ( kromosom

manusia tidak ada yang berbentuk telosentris ).

Kromosom manusia dibedakan atas 2 tipe, yaitu :2

Autosom

Tidak berperan menentukan dalam mengatur jenis kelamin. Dari 46

kromosom di dalam nucleus sel tubuh manusia, maka yang 44 buah (22

pasang) merupakan autosom.

Gonosom

Seks kromosom (kromosom kelamin), yang berperan dalam menentukan

jenis kelamin. Biasanya terdapat sepasang kromosom. Melihat macamnya

dapat dibedakan atas Kromosom X dan Kromosom Y.

2.2 Gen

Pertama kali diperkenalkan oleh Thomas Hunt Morgan, ahli Genetika dan

Embriologi Amerika Serikat (1911), yang mengatakan bahwa dalam substansi hereditas

yang dimanakan gen terdapat dalam lokus, di dalam kromosom. Gen adalah serangkaian

nukleotida kromosom yang membentuk kode produksi protein spesifik, yaitu satuan

informasi genetic. Berikut ini adalah beberapa sifat gen :3

Mengandung informasi genetic

Tiap gen mempuyai tugas dan fungsi berbeda.

3

Pada waktu pembelahan mitosis dan meiosis dapat mengadakan duplikasi.

Ditentukan oleh susunan kombinasi basa nitrogen.

2.3 DNA

DNA ( Deoxyribonucleic Acid ) adalah sejenis asam nukleat yang tergolong

biomolekul utama penyusun berat kering setiap orgisme.1 DNA memiliki fungsi-fungsi

sebagai berikut:

Membawa informasi genetic

Membentuk RNA

Berperan penting dalam proses sintesis protein

Ciri-ciri khas dari DNA adalah rantai ganda atau double helik, terdiri dari basa

nitrogen berpasangan yaitu :guanine dan sitosin serta timin dan adenine.

2.4 DNA Rekombinan

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah

yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di

dalam suatu sel yang bukan sel alaminya. DNA rekombinan dapat digunakan dalam

untuk mengidentifikasi gen cacat yang berkaitan dengan suatu penyakit.4 Berikut ini

merupakan perangkat yang diperlukan :4

Plasmid

Plasmid merupakan molekul DNA sirkular berukuran kecil umumnya

berasal dari bakteri, sering dianggap sebagai ektra kromosom. Fungsi

plasmid pada pembentukan DNA rekombinan adalah digunakan sebagai

vector untuk klon gen atau klon fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri

dan untuk memperbanyak gen (copy gene) yang telah disisipkan dengan

bantuan sel bakteri.

Enzim restriksi

4

Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Pada proses

DNA rekombinan enzim restriksi mengenal dan memotong DNA pada

sekuens spesifik yang panjangnya empat sampai enam pasang basa. enzym

restriksi dapat menghasilkan potongan DNA dengan bentuk sticky ends

(ujung lancip) sehingga mampu berpasangan dengan basa yang cocok/sesuai.

Contoh dari enzim restristik adalah : Enzim EcoRI telah diisolasi pertama

kali oleh Herbert Boyer tahun1969 dari E.coli. Enzim EcoRI memotong pada

bagian antara basa G dan A pada sekuens GAATTC. Perhatikan pada gambar

1.

Gambar 1. Enzim EcoR1

Sumber : academic.brooklyn.cuny.edu

Enzim restriksi secara tradisional dibagi menjadi 3 tipe berdasarkan

komposisi, posisi pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang

diperlukan yaitu enzim restriksi tipe I, tipe II dan tipe III.1

Enzim restristik tipe I

Memotong DNA secara acak dan jauh dari sekuen

pengenalannya. Enzim ini tidak dapat menghasilkan potongan fragmen

DNA yang diinginkan sehingga tidak diproduksi.

5

Enzim restristik tipe II

Ciri-ciri dari enzim restristik II adalah mengenali urutan

tertentu sepanjang empat hinggan tujuh basa di dalam molekul dna,

memotong ke dua untai molekul DNA ditempat tertentu dan dapat

menghasilkan fragmen-fragmen DNA

Enzim restristik tipe III

Enzim yang tidak digunakan dalam laboratorium, hal ini

dikarenakan enzim ini memotong diluar situs pengenalan dan

membutuhkan dua sekuen dengan orientasi berlawanan pada DNA yang

sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga enzim ini jarang

menghasilkan potongan sempurna

DNA ligase

DNA ligase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis

pembentukan ikatan fosfodiester  yang digunakan saat proses ligasi

pada DNA yang mengalami pemotongan dengan enzim restriksi

sebelumnya. DNA ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen saat

proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru

disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA.5

2.5 Proses DNA rekombinan :

Isolasi DNA

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel,

yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi,

beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah

berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah

diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih

kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat. Pada eukariot langkah ini harus

6

disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-

remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan

sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut

organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara

enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan

sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk

membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut

kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alcohol.4

Memotong DNA ( digestion )

Pada proses pemotongan molekul DNA dengan menggunakan enzim

restriksi. Setiap enzim restriksi mempunyai tempat pemotongan yang spesifik pada

suatu urutan molekul DNA. Sebagai contoh adalah enzim EcoRI yang selalu

memotong DNA pada posisi G. Hingga saat ini, sudah ribuan enzim restriksi yang

diperoleh dari mikroorganisme. Beberapa diantaranya yang terkenal dan sering

digunakan adalah enzim EcoRV, HindIII, SacI, TaqI, BamHI, MspI dan lain-lain.

Pemutusan ini dilakukan di dalam strain tertentu yang bertujuan untuk mencegah

agar tidak merusak DNA. Selain itu strain tersebut juga mempunyai suatu system

modifikasi yang menyebabkan pemutusan basa pada urutan tertentu yang merupakan

recognition sites bagi enzim restriksi tersebut. Pemotongan DNA genomik dan DNA

vektor dengan menggunakan enzim restriksi ini harus menghasilkan ujung-ujung

potongan yang kompatibel dalam arti setiap fragmen DNA harus dapat

disambungkan dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.4,5

Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh

beberapa pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini

akan menghasilkan fragmen fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-

masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan

ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung

runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif.

Hal itu berbeda dengan enzim restriksi seperti Hae III, yang mempunyai tempat

7

pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya

akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya

sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan

sulit untuk disambungkan. Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk

menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul

linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk

menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.5

Menyambung DNA ( ligation )

Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi

harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-

fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA

vektor yang sudah berbentuk linier. Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk

meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim

DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli

yang telah diinfeksi dengan bakteriofag. Jika cara yang pertama hanya dapat

digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan

baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga

dengan pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai

tunggal homopolimeri. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung

lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.4,5

Transforman

Tahap selanjutnya adalah memasukkan DNA ke dalam sel inangnya, hal ini

dapat dilakukan dengan banyak cara, bias dilakukan dengan cara pemanasan larutan

NaCl maupun dengan menggunakan metoda elektroporasi. Tujuan dari kedua proses

ini adalah adalah membuka pori-pori pada membrane sehingga DNA dapat masuk.4

Elektroforesis

8

Tahap berikutnya adalah analisa terhadap hasil pemotongan DNA genomik

dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekulmolekul DNA dengan

menggunakan teknik elektroforesis. Elektroforesis adalah suatu teknik yang

menggunakan medan listrik untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran. Karena

mengandung fosfat yang bermuatan negatif, DNA akan bergerak menuju elektroda

positif dalam medan listrik. Prinsip alat ini adalah : kecepatan migrasi molekul DNA

berbeda-beda tergantung pada beberapa faktor diantaranya ukuran molekul. DNA

bermigrasi di dalam gel padat yang terletak di dalam larutan penyangga yang dialiri

arus listrik. Dalam hal ini pada campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul

DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid

yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke

dalam sel inang ini dinamakan transformasi. Sehingga diharapkan sel inang

mengalami perubahan sifat tertentu setelah /dimasuki molekul DNA rekombinan.5

Seleksi transforman

Tahap selanjutnya adalah seleksi transforman dan seleksi rekombinan. Pada

dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan,

yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2)

sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang

dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang

diinginkan. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang

pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi

berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA

dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi

oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master

plate). Dengan demikian dapat menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang

membawa fragmen yang diinginkan.4,5

Polymerase Chain Reaction

9

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode in vitro yang digunakan

untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer

oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target

DNA. Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah sebagai berikut :

denaturasi DNA templat, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi

(extension) rantai DNA. Salah satu manfaat terpenting dari PCR adalah menentukan

kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.6 Dalam melakukan

PCR terdapat beberapa komponen yang tidak dapat dipisahkan, antara lain :

Primer

sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang

menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau

polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu

menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3

juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu

sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa

sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang

komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel

mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.7

dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA

yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA,

yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.6

Buffer

Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk

mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim

DNA polymerase.1

Ion Logam

10

Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor

bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak

dapat bekerja dan Ion logam monovalen, kalsium (K+).5

11

BAB III

Kesimpulan

3.1. Kesimpulan

Kesimpulannya adalah bahwa penyakit tersebut diturunkan secara genetika.

Untuk melakukan identifikasi terhadap penyakit tersebut dapat dilakukan dengan

pemeriksaan Kromosom serta DNA rekombinan. DNA rekombinan merupakan sebuah

teknik untuk mengidentifikasi gen cacat yang berkaitan dengan suatu penyakit. Selain itu

DNA rekombinan juga bermanfaat untuk terapi gen. Enzim restristik merupakan salah

salah satu factor terpenting dalam pelaksaan teknik tersebut. Enzim restristik yang baik

digunakan adalah yang membentuk sticky ends, contohnya adalah EcoRI. Selain kedua

cara tersebut teknik PCR juga dapat menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA

yang mengalami mutasi.

12

Daftar Pustaka

1. Yuwono T. Biologi molekuler. Edisi ke-7. Jakarta: Eralangga;2010.h.82-3

2. Elrod S, William DS. Genetika. Edisi ke-4. Jakarta: Erlangga;2006.h.153-9

3. Benson RC, Pernoll ML. Obstetri dan ginekologi. Edisi ke-9. Jakarta: EGC; 2009.h.61-2

4. Smith CM, Marks AD, Marks DB. Biokimia kedokteran dasar. Edisi-1. Jakarta: EGC;2008.h.237-

240

5. Sudjadi. Bioteknologi kesehatan. Edisi ke-5. Yogyakarta: Kanisius;2008.h.52-61

6. Sarjadi. Patologi umum dan sistematik. Edisi k-1. Jakarta: EGC;2000.h.46-51

7. Jhonston. Dasar-dasar pediatric. Edisi ke-3. Jakarta: EGC;2008.h.29-33

13