PEMBUATAN PREPARAT MIKROSKOPIS DAN AWETAN

Mikroteknikn Tujuan: membuat sediaan yang dapat mendukung

berbagai disiplin ilmu (histologi, fisiologi, embriologi,dsb).

n Bahan kimia à padat, cair, gas dengan sifat yang berbeda-beda (sangat toksik, toksik, tidak toksik)

n Alat-alat:- alat gelas (staining jar, beker glass, gelas ukur, dll)- Alat bukan gelas (hot plate, oven, mikrotom, pinset,

dll)

Istilah-istilah dalam pembutan preparatn Fiksasi n Dehidrasi n Clearing

Fiksasiadalah usaha untuk mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk atau jaringan.

Tujuan: diperleh gambaran struktur sel/jaringan seperti pada aslinya

Macam fiksatif :- Sederhana (tunggal): alkohol,formalin

- Majemuk (campuran): larutan Bouin (asam pikrat, formalin, acidium aceticum glaciale/AAG)

DehidrasiAdalah penarikan molekul air dari jaringan

Tujuan : agar jaringan bebas air, sehingga jaringan lebih terawetkan

Dehidrasi dilakukan secara bertahap Macam dehidrant : ethyl alkohol, aseton

ClearingAdalah proses penarikan molekul dehidrasi dari jaringan.

Clearing agent : xylol, toluol, minyak cengkeh, dll

Macam-macam sediaann Sediaan sementara : supravital stainingn Sediaan permanen - Sediaan utuh ( whole mount)- Sediaan irisan (beku, seloidin, parafin)- Sediaan untuk jaringan tipis (rentang)- Sediaan jaringan cair (apus untuk darah, limfe)- Sediaan untuk jaringan keras

Sediaan Utuh (wholemount)n Tujuan: melihat struktur internal suatu organisme.

n Cara : Fiksasi à dehidrasi à staining à clearing à mounting à labelling

n Contoh: pembuatan preparat wholemount embrio ayam

n Bahan: telur dengan umur tertentu, garam fisiologis, pewarna: hematoxylin&eosin, alkohol, formalin

n Alat: gunting, pinset, gelas timbang (Ex: Whole mount embrio ayam)

SEDIAAN BEKUMetode Parafin Tujuan : melihat struktur sel Cara : narkose à pengambilan bahan à fiksasi à washing à dehidrasi à toluol à infiltrasi parafin à penanaman (embedding)à pengirisan à affiksing à deparafinasi à staining àmounting à labelling Pewarnaan (staining):

- Zat warna asam : acid fuchsin, eosin- Zat warna basa : hematoxylin

Sediaan Apusn Alat : object glassn Bahan : cairan jaringan (darah, limfe)n Cara kerja:

- teteskan darah/limfe di atas object glass- letakkan object glass lain dengan posisi sudut 450

- Tarik dengan arah yang berlawanan

Herbariumn Tujuan?n Materi herbariumn Informasi : etiket tempel dan etiket gantung

à kolektor, nomor koleksi, nama lokal spesimen, lokasi pengambilan dan tanggal.

Insektariumn Tahapan :1. Koleksi serangga 2. Mematikan serangga 3. Memasang pada papan kayu 4. Labelling

TEKNIS ASEPTIS Tujuan à steril dan mencegah kontaminasi Kontaminasi? Kontaminan ? Kultur murni?

Sterilisasi suatu usaha untuk membebaskan bahan-bahan dan

alat-alat dari semua bentuk kehidupan mikrobia Cara sterilisasi: mekanik, fisik, kimia,

Sterilisasi secara mekanik Dengan filtrasi Digunakan untuk bahan-bahan yang tidak tahan

panas Misalnya : serum darah, antibiotika, gula sederhana Berkefeld filter Seitz filter

Sterilisasi Fisik Alat dan bahan tahan panas Insenerasi : > 5000C Perebusan : 1000C Autoclave : 1210C, tekanan 1 atm, 15 menit Pemanasan kering Pasteurisasi (batch method & flash method)

Prinsip Kerja Autoclave

Sterilisasi secara kimia Bahan kimia yang à berupa gas: etilen oksida dan

formaldehid, senyawa kimia yang bersifat cair: glutaraldehid

Teknik sterilisasi secara kimia dapat dilakuakan dengan bahan yang mempunyai daya oksidasi seperti ozon dan hidrogen peroksida.

Media Pertumbuhan Nutrisi isolasi, pengujian sifat-sifat fisiologi dan

perhitungan jumlah mikrobia dalam suatu bahan Media untuk bakteri ≠ media untuk jamur

Syarat Media mengandung zat makanan yang mudah digunakan

oleh mikrobia tidak mengandung zat penghambat pertumbuhan mempunyai tekanan osmose dan tegangan

permukaan pH sesuai dengan kondisi mikrobia dalam keadaan steril.

Macam MediaBerdasarkan kandungan kimianya:

Anorganik medium organik medium sintetik medium non sintetik

Berdasarkan konsistensinya: Padat Semi padat Cair

Media Pertumbuhan

Teknik Isolasi Isolasi ? memindahkan mikrobia tersebut dari

lingkungannya di alam dan menumbuhkan sebagai biakan murni dalam medium buatan.

Bagaimana caranya?

Cara-cara Isolasi Teknik Goresan (streak plate method) Teknik taburan (pour plate method) Teknik Sebaran ( spread method)

Teknik Goresan (streak plate method) Menghasilkan koloni terpisah Media agarà digores dg ose yg berisi koloni

bakteri/ jamur

Teknik taburan (pour plate method) Pengenceran bertingkat Inokulum diteteskan di petridis à dituang media Koloni terpisah

Pengenceran Bertingkat

Teknik Sebaran ( spread method) Pengenceran Kultur disebarkan pada media agar plate sterilà

penyebaran dengan alat penyebar yang telah disterilkan dengan alkohol dan dibakar

KAMIS, 30 DESEMBER 2010

Prinsip Kerja Pembuatan Preparat Histologi

Fiksasi

Fiksasi adalah suatu usaha manusia untuk

mempertahankan elemen -elemen sel atau jaringan

agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami

perubahan bentuk maupun ukuran. Dinamakan larutan

fiksatif karena kemampuan membuat jaringan mudah

menyerap warna. Mulanya dengan menyiapkan ikan,

lalu mengambil potongan kecil sebanyak dua potong

pada masing-masing organ insang, dan ginjal dan hati.

Organ tersebut dimasukkan ke dalam botol yang berisi

larutan Bouins dan diamkan selama ± 24

jam.

- Washing 

Washing adalah proses pencucian untuk

menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan. Dalam

proses washing diusahakan tidak terdapat molekul-

molekul fiksatif yang tertinggal di dalam jaringan.

Molekul ini akan menjadi penghalang untuk proses

selanjutnya. Fiksatif menggunakan BOINS, maka

setelah kurang lebih 24 jam difiksasi kemudian

dilakukan pencucian menggunakan alkohol 70% yang

diganti berkali-kali hingga warna kuning hilang.

- Dehidrasi

Dehidrasi adalah proses penarikan molekul air dari

dalam jaringan. Tujuan dari dehidrasi adalah agar

seluruh ruang-ruang antar sel dalam jaringan dapat diisi

dengan molekul parafin. Dehidrasi menggunakan

alkohol bertingkat dari persentase rendah ke persentasi

tinggi (70%, 80%, 96%) masing-masing 2 x 15 menit.

Hal ini dilakukan untuk menjaga agar tidak terjadi

perubahan tiba-tiba pada terhadap sel dan jaringan.

- Clearing 

Clearing adalah proses penjernihan atau

mentransparankan jaringan. Clearing berfungsi untuk

menarik alkohol atau dehidran yang lain dari dalam

jaringan agar dapat digantikan oleh molekul parafin.

Clearing menggunakan xylene dengan membenamkan

jaringan pada larutan tersebut selama 2 x 15 menit.

- Impregnasi

Impregnasi bisa juga disebut infiltrasi parafin yaitu

proses pengeluaran xilen dari dalam jaringan yang

akan digantikan oleh parafin cair. Setelah jaringan di

firdaus_1222@yahoo.com

Clearing maka sampel dimasukkan kedalam cessed

and deckel kemudian di masukkan kadalam moldtray

yang berfungsi sebagai tempat infiltrasi parafin, yang

terdiri dari tiga wadah yaitu: pertama berisi parafin cair

dan xylene, wadah ke dua berisi parafin cair tanpa

xilene, dan wadah ke tiga berisi parafin cair murni.

Masing-masing 1 x 15 menit.

- Embeding

Proses penanaman jaringan ke dalam media parafin.

Tujuannya adalah untuk mempermudah dalam

melakukan proses pemotongan atau pengirisan

sampel. Dilakukan dengan mengeluarkan jaringan yang

sudah di Impregnasi dari moldtray, kemudian

menanamnya ke dalam lempengan blok yang berisi

parafin cair. Setelah itu tutup dengan menggunakan

casette and deckel lalu didinginkan pada cold plate.

- Cutting

Proses pemotongan atau pengirisan jaringan dengan

menggunakan mikrotom. Sampel yang dipotong

tebalnya sekitar 5 – 7 mikron. Pemotongan akan

berhasil jika pisau tidak tumpul, tidak berkarat, dan

tidak terdapat sisa-sisa parafin dari hasil pemotongan

sebelumnya dan posisi sampel lurus dan baik. Suhu

pisau dan suhu sampel serta ruangan harus sama agar

sampel tidak patah atau terpotong-potong saat

pengirisan.

- Staining

Staining adalah proses pewarnaan, dimana sampel

diwarnai dengan menggunakan zat warna. Tujuannya

yaitu untuk mewarnai jaringan sehingga mudah diamati

di mikroskop. Tahapan staining terdiri dari proses

deparafinasi atau penarikan parafin dari dalam jaringan.

Proses rehidrasi atau pemasukan molekul air ke dalam

jaringan yang dilakukan secara bertahap dengan

menggunakan alkohol bertingkat dari konsentrasi tinggi

ke konsentrasi rendah. Proses ini sebagai media

penghantar zat warna ke jaringan. Selanjutnya proses

infiltrasi zat warna. Menggunakan haematoxilin untuk

mewarnai sitoplasma dan eosin untuk mewrnai inti sel.

Lalu dehidrasi kembali yang bertujuan untuk mencegah

kerusakan pada jaringan karena mengakibatkan

terjadinya pembusukan. Setelah parafin dikeluarkan

dengan menggunakan xilen selama 20 menit preparat

dikeringkan dan ditetesi dengan entelan dan ditutup

dengan deg glass. Kemudian diamati di bawah

mikroskop.