PCR
2
HASIL DISKUSI Kelompok 4 Anggota: Ayunda Nur Hidayatiningsih 132210101014 Muhammad Ridlo 132210101038 Yuli Antika W. 132210101072 Rizki Putri Aulia 132210101098 1. Apa yang Dimaksud dengan RT PCR? RT-PCR (reverse transcription) merupakan metode deteksi alternatif berdasarkan adanya RNA secara kulitatif dan kuantitatif, RNA pertama-tama di transkrip balik menjadi DNA komplemen (complementary DNA, atau cDNA) menggunakan enzim reverse transcriptase, dan cDNA yang dihasilkan akan digandakan sepertihalnya PCR. Tahapan yang perlu dilakukan dalam melakukan RT PCR ada beberapa tahap, yaitu Reverse Transcription (RT) selama 30 menit pada suhu 37oC, initial PCR activation step 95oC selama 15 menit, denaturasi dsDNA selama 30 detik 94oC, annealing pada suhu 56oC selama 30 detik, dan Extention/amplification pada suhu 72oC selama 45 detik. 2. Kenapa untuk mendeteksi seseorang terkena HIV atau bukan menggunakan RT PCR bukan PCR? Dalam pendeteksian penyakit HIV digunakan metode RT PCR karena jenis virus HIV adalah RNA. Sehingga perlu dilakukan pembentukan DNA komplemen untuk dapat dilanjutkan ssesuai dengan proses PCR. 3. Sebutkan urutan primer yang digunakan untuk RT PCR? Urutan primer yag digunakan pada percobaan ini ada dua macam, yaitu: Hi-976C (3’- TCT GCA GCT TCC TCA TTG ATG G- 5’) Hi-853F (3’- CAG CAT TAT CAG AAG GAG CCA C- 5’)
-
Upload
muhammad-ridlo -
Category
Documents
-
view
218 -
download
2
description
tugas bioteknologi
Transcript of PCR
HASIL DISKUSIKelompok 4Anggota:Ayunda Nur Hidayatiningsih132210101014Muhammad Ridlo132210101038Yuli Antika W.132210101072Rizki Putri Aulia132210101098
1. Apa yang Dimaksud dengan RT PCR?RT-PCR (reverse transcription) merupakan metode deteksi alternatif berdasarkan adanya RNA secara kulitatif dan kuantitatif, RNA pertama-tama di transkrip balik menjadi DNA komplemen (complementary DNA, ataucDNA) menggunakan enzim reverse transcriptase, dan cDNA yang dihasilkan akan digandakan sepertihalnya PCR.Tahapan yang perlu dilakukan dalam melakukan RT PCR ada beberapa tahap, yaitu Reverse Transcription (RT) selama 30 menit pada suhu 37oC, initial PCR activation step 95oC selama 15 menit, denaturasi dsDNA selama 30 detik 94oC, annealing pada suhu 56oC selama 30 detik, dan Extention/amplification pada suhu 72oC selama 45 detik.2. Kenapa untuk mendeteksi seseorang terkena HIV atau bukan menggunakan RT PCR bukan PCR?Dalam pendeteksian penyakit HIV digunakan metode RT PCR karena jenis virus HIV adalah RNA. Sehingga perlu dilakukan pembentukan DNA komplemen untuk dapat dilanjutkan ssesuai dengan proses PCR.
3. Sebutkan urutan primer yang digunakan untuk RT PCR?Urutan primer yag digunakan pada percobaan ini ada dua macam, yaitu:Hi-976C (3- TCT GCA GCT TCC TCA TTG ATG G- 5) Hi-853F (3- CAG CAT TAT CAG AAG GAG CCA C- 5)4. Daerah manakah yang diamplifikasi RT PCR? Kenapa dipilih daerah tersebut?Daerah yang digunakan sebagai daerah amplifikasi adalah daerah gag genom HIV-1. Gag genom tersebut merupakan suatu gen yang menyandi protein nukleokapsid HIV) berasal dari 8 strain HIV. Daerah tersebut diamplifikasi karena dianggap dapat mewakili setiap tipe.5. Apabila anda diminta untuk merancang primer yang digunakan untuk deteksi penyakit apa saja yang perlu diperhitungkan untuk mendapatkan primer yang spesifik mengenai sumber penyakit tersebut? Pengaturan suhu optimum (Tm/ Temperature melting) pada setiap tahap yakni Denaturing 94oC 30-60 sec, Annealing 54oC 30-60 sec dan Extension 72oC 30-90 sec Mengandung guanine dan sitosin 40% - 60% Karena ikatan Guanin Sitosin lebih kuat dari ikatan Timin Adenin. Dengan ikatan yang lebih kuat akan meningkatkan kemampuan melekatnya primer pada daerah implifikasi. Selisih antara Tm untuk primer forward dan primer reverse tidak boleh lebih dari 5 % . Jika selisih Tm terlalu besar maka akan mempengaruhi jalannya proses extension karena primer tidak melekat pada waktu yang relatif sama. Primer terdiri dari 18-20 nukleotida , jika < 15 maka spesifitas primer kurang dan kemungkinan primer akan menempel tidak pada daerah yang diinginkan. Namun jika nukleotida > 40 maka akan menurunkan aktivitas DNA dan memakan banyak biaya. Hindari urutan nukleotida yang berturut-turut karena dapat mengurangi spesifitas primer.
