OPTIMASI MEDIA PRODUKSI Lactobacillus plantarum TSD-10

DENGAN RESPONSE SURFACE METHODOLOGY (RSM)

SEBAGAI PROBIOTIK SAPI

AGUSTINA TRI PUSPITA SARI

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Optimasi Media

Produksi Lactobacillus plantarum TSD-10 dengan Response Surface

Methodology (RSM) Sebagai Probiotik Sapi adalah benar karya saya sebagai

bagian dari kegiatan penelitian di Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor dengan arahan dari komisi

pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi

mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan

maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan

dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, Oktober 2016

Agustina Tri Puspita Sari

NIM G84120023

ABSTRAK

AGUSTINA TRI PUSPITA SARI. Optimasi Media Produksi Lactobacillus

plantarum TSD-10 dengan Response Surface Methodology (RSM) Sebagai

Probiotik Sapi. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan RONI RIDWAN.

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan salah satu mikroorganisme yang

sudah umum digunakan sebagai probiotik. Bakteri ini membutuhkan media

kompleks untuk tumbuh seperti medium MRS (de Man Rogosa and Sharpe).

Media produksi menggunakan MRS biayanya sangat tinggi, diperlukan media

alternatif yang efisien dan optimum untuk pertumbuhan probiotik. Tujuan

penelitian ini untuk mendapatkan media optimum untuk produksi probiotik

Lactobacillus plantarum TSD-10 menggunakan metode Response Surface

Methodology (RSM), mengukur viabilitas probiotik, dan menguji aktivitas

penghambatan probiotik terhadap Eschericia coli dan Staphylococcus aureus.

Kondisi optimum media produksi L. plantarum dengan jumlah sel sebesar 10.56

109

CFU/mL (CFU = colony forming unit) adalah konsentrasi glukosa 1.48%

(w/v), molase 3.72% (v/v), mineral mix 0.34% (w/v), dan protein mix 7.69%

(v/v). Viabilitas probiotik pada suhu ruang sangat rendah hanya mampu disimpan

selama 2 minggu. Penyimpanan pada refrigerator dapat mempertahankan

viabilitas probiotik selama 6 minggu. Aktivitas penghambatan probiotik terhadap

E. coli lebih besar dibanding aktivitas penghambatannya terhadap S. aureus.

Kata kunci: antibakteri, Lactobacillus plantarum TSD-10, media produksi, RSM,

viabilitas,

ABSTRACT

AGUSTINA TRI PUSPITA SARI. Optimization of Lactobacillus plantarum

TSD-10 Production Medium using Response Surface Methodology (RSM) as

Probiotic Cows. Supervised by MARIA BINTANG and RONI RIDWAN.

Lactic acid bacteria (LAB) is microorganism that are commonly used as

probiotics. These bacteria require complex media to grow, such as MRS (de Man

Rogosa and Sharpe) medium. MRS as medium production takes highly cost,

alternative media are efficient and optimum required for the growth of probiotics.

The objective of this research was to get medium production for probiotic of

Lactobacillus plantarum TSD-10 using Response Surface Methodology (RSM),

measuring the viability of probiotic, and examine inhibitory activity of probiotics

against Eschericia coli and Staphylococcus aureus. The optimum conditions of

production L. plantarum were used concentration 1.48% (w/v) glucose, 3.72%

(v/v) molasses, 0.34% (w/v) mineral mix, and 7.69% (v/v) protein mix, with

number of cell was 10.56 109

CFU/mL (CFU = colony forming unit). Probiotic

that storage at room temperature is able to preserve viability for 2 weeks. Storage

in the refrigerator can maintain viability of probiotic for 6 weeks. Inhibitory

activity of probiotic against E. coli greater than S. aureus.

Keywords: antibacterial, Lactobacillus plantarum TSD-10, medium production,

RSM, viability

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Biokimia

OPTIMASI MEDIA PRODUKSI Lactobacillus plantarum TSD-10

DENGAN RESPONSE SURFACE METHODOLOGY (RSM)

SEBAGAI PROBIOTIK SAPI

AGUSTINA TRI PUSPITA SARI

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

PRAKATA

Segala puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan

karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul

“Optimasi Media Produksi Lactobacillus plantarum TSD-10 dengan Response

Surface Methodology (RSM) Sebagai Probiotik Sapi” sebagai salah satu syarat

dalam memperoleh gelar Sarjana Sains Biokimia.

Penulis berterima kasih atas segala bimbingan Prof Dr drh Maria Bintang, MSi

selaku dosen pembimbing I. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr Roni

Ridwan, MSi selaku pembimbing II untuk segala bimbingan, dan kesempatan yang

diberikan kepada penulis untuk ikut serta dalam proyek penelitian ini, serta kepada

Puslit Bioteknologi LIPI yang telah mendanai penelitian ini. Penulis mengucapkan

terima kasih atas bimbingan dan arahan Rohmatussolihat, SSi, MSi, serta semua

staf dan teknisi laboratorium mikrobiologi terapan yang telah membantu selama

proses penelitian. Tidak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada Jerri H.

Manalu, A.A. Win Ariga B., Eka S., Lilis Riyanti, Mas Joni, dan Mbak Mira dan

teman-teman Biokimia angkatan 49 yang telah memberikan dukungan serta

membantu penulis selama penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan

kepada ayah, ibu, serta keluarga atas doa dan kasih sayangnya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Oktober 2016

Agustina Tri Puspita Sari

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

PENDAHULUAN 1

METODE 2

Alat dan Bahan 2

Metode Penelitian 2

HASIL 5

Optimasi Media Produksi L. Plantarum TSD-10 5

Viabilitas Probiotik Selama Masa Penyimpanan 7

Aktivitas Antibakteri Probiotik 8

PEMBAHASAN 9

Optimasi Media Produksi L. Plantarum TSD-10 9

Viabilitas Probiotik Selama Masa Penyimpanan 11

Aktivitas Antibakteri Probiotik 12

SIMPULAN DAN SARAN 13

Simpulan 13

Saran 14

DAFTAR PUSTAKA 14

LAMPIRAN 18

RIWAYAT HIDUP 22

DAFTAR TABEL

1 Kombinasi empat variabel dan lima tingkat kombinasi percobaan dengan

Central Composite Design (CCD) 4 2 Data hasil analisa respon pada optimasi media produksi menggunakan

central composite design (CCD) 5 3 ANOVA untuk model response surface kuadratik media produksi L.

plantarum TSD-10 6 4 Nilai diameter zona hambat probiotik terhadap bakteri uji 8

DAFTAR GAMBAR

1 Response surface plots (a) bentuk tiga dimensi dan (b) bentuk contour

yang menggambarkan pengaruh konsentrasi protein mix dan molase

terhadap jumlah sel L. plantarum 7 2 Response surface plots (a) bentuk tiga dimensi dan (b) bentuk contour

yang menggambarkan pengaruh konsentrasi protein mix dan glukosa

terhadap jumlah sel L. plantarum 7 3 Perubahan jumlah bakteri selama 8 minggu penyimpanan 8 4 Mekanisme plantarisin merusak dinding sel bakteri dengan model barrel-

slave (Jorgenrud 2009) 13 5 Mekanisme plantarisin merusak dinding sel bakteri dengan model carpet

(Jorgenrud 2009) 13

DAFTAR LAMPIRAN

1 Bagan alir penelitian 18 2 Koefisien regresi dan signifikansi dari model Response Surface Quadratic 18

3 Data uji viabilitas probiotik selama 8 minggu 19 4 Analisis statistik viabilitas probiotik selama penyimpanan 19 5 Kurva standar diameter zona hambat tetracycline HCl 20

PENDAHULUAN

Peningkatan produktivitas sapi merupakan salah satu upaya yang dilakukan

untuk memenuhi kebutuhan daging sapi nasional dan menurunkan angka impor.

Produktivitas sapi dapat ditingkatkan dengan menjaga kesehatan ternak dan

menghindari infeksi saluran pencernaan. Probiotik merupakan salah satu bahan

aditif hidup yang digunakan untuk meningkatkan produktivitas ternak (Astuti et

al. 2007). Peningkatan produktivitas sapi dapat dilihat dari beberapa parameter,

diantaranya pertambahan bobot badan (PBB) sapi dan kecernaan pakan di dalam

rumen. Ngadiyono et al. (2001) menyatakan bahwa pemberiaan probiotik pada

sapi Madura dapat meningkatkan PBB harian sebesar 0.61 kg. Pemberian

probiotik pada sapi Bali juga meningkatkan PBB sebesar 0.55 kg (Ella et al. 2004

dalam Riswandi et al. 2015). Penelitian Ngadiyono dan Baliarti (2001)

menunjukkan bahwa pemberian probiotik meningkatkan PBB pada sapi Bali

sebesar 0.98 kg.

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan salah satu mikroorganisme yang

sering ditambahkan ke dalam pakan atau diberikan secara langsung sebagai

probiotik bagi ternak. Salah satu spesies BAL yang digunakan dalam produksi

probiotik adalah Lactobacillus plantarum. Bakteri L. plantarum merupakan jenis

bakteri anaerob fakultatif yang dapat hidup pada berbagai habitat di alam, seperti

pada tanaman maupun saluran pencernaan. Bakteri ini dapat mengendalikan

pertumbuhan mikrob patogen dengan memproduksi asam organik, hidrogen

peroksida, diasetil dan bakteriosin (Januarsyah 2007).

Biaya media produksi merupakan hal yang penting dalam produksi skala

besar probiotik sapi. Komponen biaya utama dalam produksi probiotik adalah

harga media pertumbuhan BAL. Bakteri asam laktat tumbuh dengan baik pada

medium yang kaya akan nutrisi. Media MRS (de Man Rogosa and Sharpe)

merupakan media yang umum digunakan untuk menumbuhkan BAL. Penggunaan

media MRS untuk produksi skala besar akan mengakibatkan tingginya biaya

produksi sehingga kurang efisien dan sulit dijagkau oleh peternak. Hal ini yang

menyebabkan perlunya dilakukan pengembangan media alternatif yang dapat

menurunkan biaya produksi tersebut.

Ketahanan hidup (viabilitas) bakteri probiotik juga menjadi hal yang perlu

diperhatikan dalam produksi probiotik. Viabilitas probiotik penting untuk

mengetahui umur simpan probiotik. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa

bakteri mungkin tidak dapat mempertahankan jumlah yang cukup jika berada dalam

berbagai kondisi penyimpanan (Candramouli et al. 2004; Sultana et al.2000). Probiotik harus disimpan pada kondisi yang sesuai sehingga jumlah populasi

bakteri di dalamnya dapat tetap terjaga. Dengan demikian diharapkan dapat

ditentukan kondisi penyimpanan yang sesuai untuk probiotik sehingga dapat

mempertahankan jumlah populasi bakteri di dalamnya. Uji aktivitas antibakteri

perlu dilakukan untuk melihat efektivitas produk probiotik dalam menghambat

bakteri pathogen, seperti Eschericia coli dan Staphylococcus aureus.

Optimasi pada penelitian ini menggunakan metode RSM dengan rancangan

Central Composite Design (CCD). Response Surface Methodology (RSM)

merupakan teknik statistik dan matematik yang digunakan untuk pengembangan,

perbaikan, dan optimasi proses produksi dengan cara memperkirakan hubungan

2

antara variabel bebas dengan hasil (respon) yang diamati sehingga mendapatkan

informasi optimum variabel-variabel bebas yang mempengaruhi respon (Carley et

al. 2004). Central Composite Design merupakan salah satu rancangan RSM yang

terdiri dari rancangan faktorial tingkat dua level (tertinggi dan terendah), dan

ditambah beberapa titik (starting point dan center point) yang memungkinkan

untuk meramal adanya efek interaksi antar faktor yang dicoba. Starting point

merupakan matriks bujur sangkar yang diagonal utamanya bernilai ± 2k/4

, dengan

k adalah jumlah faktor yang dioptimasi. (Palamakula et al. 2004).

Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan media produksi untuk probiotik

dari L. plantarum TSD-10 menggunakan metode Response Surface Methodology

(RSM), mengukur viabilitas probiotik yang disimpan pada suhu ruang dan

refrigerator, dan menguji aktivitas penghambatan probiotik terhadap E.coli dan S.

aureus. Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam pengembangan media

produksi L. plantarum untuk produksi probiotik sapi dalam skala besar. Penelitian

ini juga diharapkan dapat memberikan dorongan dalam mencari inovasi baru

terkait penelitian dalam penembangan media alternatif untuk produksi probiotik

menggunakan BAL.

METODE

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Erlenmeyer, autoklaf,

inkubator, sentrifus, mikropipet (ukuran 100 L dan 1000 L), refrigerator, gelas

ukur, Laminar air flow, neraca analitik, magnetic stirrer, penangas, kompor gas,

panci, pipet Mohr, vorteks dan gelas ukur. Bahan yang digunakan adalah kultur

koleksi Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Lactobacillus plantarum TSD-10,

akuades, bakteri uji (Escherichia coli BTCCB609 dan Streptococcus aureus

BTCCB611), media MRS, media NB (nutrient broth), glukosa, bacto pepton, lab

lemco, yeast ekstrak, K2HPO4, natrium asetat, CaCO3, diamonium sitrat,

MgSO4.7H2O, MnCl2.2H2O, Tween 80, agar, molase, mineral mix, tepung ikan,

bungkil kelapa, meat bone meal (MBM), corn gluten meal (CGM), soy bean meal

(SBM), akuades, tetrasiklin HCl, aluminium foil, botol plastik, kapas, cawan

Petri, tabung corning, sudip, tip (ukuran 100 L dan 1000 L), kain kasa, panci,

pipet Mohr, dan cakram.

Metode Penelitian

Pembuatan Protein Mix (Protokol Laboratorium Mikrobiologi Terapan-

LIPI)

Bahan yang digunakan untuk membuat protein mix adalah tepung ikan,

bungkil kelapa, meat bone meal (MBM), corn gluten meal (CGM), dan soy bean

meal (SBM). Masing-masing bahan ditimbang dengan komposisi 5% dalam 2 L

akuades. Campuran tersebut dimasak sampai mendidih, sambil terus diaduk

3

selama 60 menit (dihitung dari waktu mendidih). Dilakukan penyaringan

menggunakan kain kasa 4 lapis dan diambil filtratnya.

Optimasi media produksi L. plantarum TSD-10 (Liew et al. 2005; Wanmeng

et al. 2009)

Optimasi media pada penelitian ini menggunakan metode RSM, sebuah

metodologi yang memungkinkan untuk memperoleh penjelasan menyeluruh mulai

dari desain penelitian, analisis data dan hasil optimasi. Optimasi RSM meliputi:

penentuan faktor optimum besaran campuran dan respon optimasi, pencampuran

kombinasi level faktor yang diberikan RSM, serta pencarian solusi terbaik

(kombinasi optimum). Desain faktorial dilakukan untuk menentukan kondisi yang

optimum untuk media produksi L. plantarum TSD-10. Pengunaan metode RSM

untuk dapat mengetahui model empirik yang menyatakan hubungan antara

variabel-variabel independen dengan variabel respon, serta dapat diketahui nilai-

nilai variabel independen yang dapat menyebabkan nilai variabel respon menjadi

optimal. Adanya beberapa tahapan dalam RSM intinya adalah untuk mencari

fungsi yang menyatakan hubungan antara variabel respon dan variabel

independen, mengestimasi parameter-parameter dari fungsi aproximasi yang

diperoleh dengan metode kuadrat terkecil, dan analisis ketidak tepatan model.

Karakteristik metode RSM digunakan untuk menentukan titik stasioner

maksimum, minimum, atau titik pelana.

Tahap awal optimasi diawali dengan pengamatan dan pengukuran respon

untuk menentukan nilai tengah (level 0) dari variabel yang akan diuji. Setelah

didapatkan nilai tengah yang sesuai, dilakukan pembuatan rancangan percobaan

dengan software Design Expert 7 (Stat-Ease, Inc., USA, 2009). Desain

eksperimen yang digunakan pada penelitian ini adalah CCD, suatu rancangan

dengan tiga taraf faktor yang dikodekan dari selang konsentrasi untuk tiap faktor

dan level konsentrasi tiap faktor sebelum dikodekan. Pengujian ini dilakukan

untuk mengetahui secara jelas bentuk atau pola permukaan responnya. Percobaan

ini terdiri dari suatu rancangan faktorial 23, yang diperbesar dengan 8 starting

point, dan 5 center point. Parameter yang dibuat terdiri atas empat faktor, yaitu

glukosa (X1), molase (X2), protein mix (X3), dan mineral mix (X4). Setiap variabel

dipelajari pada 5 kode level (-1.682, -1, 0, +1, +1.682) (Tabel 1). Model yang

digunakan adalah response surface mengikuti persamaan:

∑ i

k

i

i ∑ ii

k

i

i

∑

∑ ij

k

i j

i j

Respon Y adalah jumlah sel bakteri L. plantarum, sedangkan 0 merupakan

koefisien intersep, i(k) adalah koefisien untuk efek linier, ij(k) adalah koefisien

untuk efek interaksi, dan ii(k) adalah koefisien untuk efek kuadratik. Xi, Xj,...., Xk

merupakan variabel independen yang diuji. Kombinasi variabel dan tingkat

kombinasi yang digunakan pada percobaan dapat dilihat pada Tabel 1.

Kultur L. plantarum diinokulasikan ke dalam 25 mL media MRS cair,

kemudian diinkubasi pada suhu 30°C selama 24 jam dan selanjutnya dipakai

sebagai inokulum. Sebanyak 5% inokulum diinokulasi ke 25 mL media produksi

yang bervariasi berdasarkan desain eksperimen menggunakan RSM, kemudian

diinkubasi pada suhu 30 °C selama 24 jam. Masing-masing sampel diencerkan

4

berseri dari 10-1

hingga 10-8

menggunakan pengencer air akuades. Hasil

pengenceran 10-4

hingga 10-8

masing-masing dipindahkan sebanyak 100 µL ke

dalam cawan Petri dan ditambahkan dengan media MRS agar yang sudah

dilarutkan, kemudian diinkubasi pada suhu 30°C selama 24 jam. Jumlah koloni

dihitung menggunakan metode total plate count (TPC). Verifikasi terhadap

kondisi optimum dilakukan dengan menginokulasikan 5% inokulum L. plantarum

ke dalam 25 mL media produksi optimum. Data yang diperoleh dianalisis

menggunakan Software Statistic Design-ExpertR 7.

Tabel 1 Kombinasi empat variabel dan lima tingkat kombinasi percobaan dengan

Central Composite Design (CCD)

Uji Viabilitas (BAM 2001) Sebanyak 5 % inokulum L. plantarum diinokulasi ke 4.8 L media produksi

komposisi optimum, lalu diinkubasi pada suhu 30 °C selama 24 jam. Selanjutnya,

probiotik dipindahkan ke dalam botol plastik berukuran 100 mL masing-masing

diisi sebanyak 60 mL. Sebagian jumlah botol disimpan pada suhu ruang, dan

sisanya disimpan dalam refrigerator. Uji viabilitas bakteri asam laktat dilakukan

dengan metode total plate count (TPC). Masing-masing sampel diencerkan berseri

dari 10-1

- 10-8

menggunakan air pengencer air akuades. Hasil pengenceran 10-4

-

10-8

masing-masing dipindahkan sebanyak 100 µL ke dalam cawan Petri dan

ditambahkan dengan media MRS agar yang sudah dilarutkan, kemudian

diinkubasi pada suhu 30 °C selama 24 jam. Jumlah koloni dihitung dan

dinyatakan dalam CFU/mL. Pengujian dilakukan pada minggu ke-0 sampai

minggu ke-8 penyimpanan. Setiap pengujian dilakukan pengulangan triplo, dan

pengambilan sampel dari botol yang berbeda.

Uji Aktivitas Antibakteri (Bromberg et al. 2004; Rahayuningtyas 2011)

Sebanyak 1 mL probiotik dimasukkan ke dalam Eppendorf, lalu disentrifus

dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil untuk uji

antibakteri. Media NA (nutrient agar) dituang dalam cawan Petri sebanyak 15 mL

sebagai lapisan dasar (bottom layer) dan 5 mL lapisan pembenihan (top layer).

Lapisan pembenihan mengandung biakan bakteri uji (sebanyak 0.1% untuk

Staphylococcus aureus dan 0.2% untuk Eschericia coli). Sampel yang diuji yaitu:

probiotik (tanpa sentrifugasi) dan supernatan bebas sel. Masing-masing dipipet

sebanyak 60 µL pada kertas cakram, didiamkan hingga kering. Setelah itu cakram

diletakkan pada cawan yang telah berisi medium dan bakteri uji, kemudian cawan

tersebut dimasukkan ke dalam refrigerator selama 30 menit. Kontrol negatif yang

digunakan adalah akuades, sedangkan kontrol positif menggunakan tetracycline

HCl dan dibuat kurva standar dengan konsentrasi 0, 5, 10, 15, dan 20 µg/mL.

Inkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam. Zona bening (clear zone) yang terbentuk

disekitar kertas cakram diamati dan diukur dua kali menggunakan jangka sorong.

Faktor Level

-1.682 -1 0 1 1.682

Glukosa (%) 0.159 0.500 1.000 1.500 1.841

Molase (%) 0.000 2.000 5.000 8.000 10.045

Mineral Mix (%) 0.000 0.100 0.250 0.400 0.502

Protein mix (%) 0.000 2.000 5.000 8.000 10.045

5

HASIL

Komposisi Optimum Media Produksi L. Plantarum TSD-10

Lactobacillus plantarum TSD-10 ditumbuhkan pada media produksi

dengan beberapa variabel dan level konsentrasi. Variabel yang dipilih yaitu

glukosa, molase, mineral mix, dan protein mix. Pengaruh variabel-variabel tersebut

dianalisis menggunakan response surface methodology (RSM). Hasil penghitungan

jumlah bakteri yang tumbuh ditampilkan pada Tabel 2. Banyaknya bakteri yang

tumbuh pada media produksi berbeda pada setiap komposisi media produksi.

Jumlah bakteri yang dihasilkan berkisar antara 1.094 CFU/mL hingga 10.455

CFU/mL. Jumlah total bakteri terendah dihasilkan oleh media nomor 11 dengan

komposisi glukosa 1%, molase 0%, mineral mix 0.25%, dan protein mix 5%.

Jumlah total bakteri tertinggi dihasilkan oleh media nomor 16 dengan komposisi

glukosa 1%, molase 5%, mineral mix 0.25%, dan protein mix 10.045%. Data

Tabel 2 juga menunjukkan bahwa media yang dan media yang tidak mengandung

protein mix (nomor 15) cenderung menghasilkan bakteri dalam jumlah sedikit.

Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan software Design-Expert 7.

Tabel 2 Hasil analisis respon pada optimasi media produksi menggunakan central

composite design (CCD)

Sampel

Faktor perlakuan Jumlah bakteri

(109 CFU/mL)

Glukosa

(%)

Molase

(%)

Mineral mix

(%)

Protein mix

(%)

1 1.5 8 0.4 2 5.000

2 1.5 8 0.1 2 2.390

3 1.5 2 0.4 8 9.500

4 0.5 8 0.1 8 8.200

5 1.5 2 0.1 8 8.200

6 0.5 2 0.4 2 2.610

7 0.5 8 0.4 8 7.450

8 0.5 2 0.1 2 2.130

9 0.159 5 0.25 5 1.202

10 1.841 5 0.25 5 10.000

11 1 0 0.25 5 1.094

12 1 10.045 0.25 5 3.000

13 1 5 0 5 4.400

14 1 5 0.502 5 6.000

15 1 5 0.25 0 1.190

16 1 5 0.25 10.045 10.455

17 1 5 0.25 5 5.940

18 1 5 0.25 5 5.000

19 1 5 0.25 5 5.000

20 1 5 0.25 5 7.353

21 1 5 0.25 5 5.020

6

Hasil analisis ragam anova (Tabel 3) menunjukkan faktor yang

berpengaruh nyata terhadap produksi L. plantarum TSD-10 adalah glukosa,

molase, protein mix, serta interaksi antara molase dan protein mix. Berdasarkan

tabel ANOVA dan koefisien regresi, model regresi terbaik dengan nilai regresi

(R2) sebesar 0.95 adalah Y = 5.373 + 2.616 X1 + 2.755 X4 + 2.028 X2X4 0.956

X22. Variabel X1, X2, X4 masing-masing menunjukkan konsentrasi glukosa,

molase, dan protein mix, dan Y jumlah sel bakteri L. plantarum. Merujuk pada

Tabel 3, model yang diperoleh telah signifikan dengan lack of fit (LOF) tidak

signifikan yang menunjukkan model telah cukup menggambarkan data. Kondisi

optimal untuk produksi Lactobacillus plantarum adalah 1.48% glukosa, 3.72%

molase, 0.34% mineral mix, dan 7.69% protein mix. Berdasarkan kondisi tersebut,

perhitungan dari persamaan yang diperoleh jumlah sel L. plantarum yaitu sebesar

10.56 109

CFU/mL.

Hasil grafik divisualisasikan dalam bentuk tiga dimensi dan plot contour,

ditampilkan pada Gambar 1 dan Gambar 2. Peningkatan konsentrasi protein mix

dan molase, serta interaksinya berpengaruh terhadap peningkatan jumlah sel

bakteri L. plantarum (Gambar 1). Peningkatan konsentrasi glukosa dan protein

mix juga berpengaruh terhadap jumlah sel bakteri L. plantarum (Gambar 2).

Tabel 3 ANOVA untuk model response surface kuadratik media produksi L.

plantarum TSD-10

Sumber

Jumlah

kuadrat

total

Derajat

bebas

Mean

Square Nilai F

Nilai P

Prob > F Keterangan

Model 167.218 14 11.944 7.77 0.0094 Signifikan

X1-Glukosa 38.702 1 38.702 25.19 0.0024

X2-Molase 1.816 1 1.816 1.18 0.3187

X3-Mineral mix 2.935 1 2.935 1.91 0.2162

X4-Protein mix 42.920 1 42.920 27.93 0.0019

X1X2 0.034 1 0.034 0.02 0.8858

X1X3 2.184 1 2.184 1.42 0.2782

X1X4 0.801 1 0.801 0.52 0.4974

X2X3 0.001 1 0.001 0.00 0.9825

X2X4 13.631 1 13.631 8.87 0.0247

X3X4 0.806 1 0.806 0.52 0.4960

X12

1.334 1 1.334 0.87 0.3874

X22

13.708 1 13.708 8.92 0.0244

X32

0.368 1 0.368 0.24 0.6418

X42

2.125 1 2.125 1.38 0.2841

Sisa 9.219 6 1.537

Lack of Fit 4.994 2 2.497 2.36 0.2101 Tidak signifikan

Pure Error 4.225 4 1.056

Cor Total 176.437 20

Keterangan:

Cetak tebal dipergunakan dalam pengembangan model regresi untuk produksi

L.plantarum

7

Gambar 1 Response surface plots (a) bentuk tiga dimensi dan (b) bentuk contour

yang menggambarkan pengaruh konsentrasi protein mix dan molase

terhadap jumlah sel L. plantarum

Gambar 2 Response surface plots (a) bentuk tiga dimensi dan (b) bentuk contour

yang menggambarkan pengaruh konsentrasi protein mix dan glukosa

terhadap jumlah sel L. plantarum

Viabilitas Probiotik Selama Masa Penyimpanan

Viabilitas probiotik dilihat dari jumlah sel bakteri yang hidup dalam produk

probiotik tersebut. Viabilitas diukur selama delapan minggu penyimpanan pada

suhu ruang dan refrigerator. Data perubahan jumlah bakteri selama penyimpanan

disajikan pada Gambar 3. Berdasarkan data tersebut, penyimpanan probiotik pada

suhu ruang dan refrigerator menyebabkan terjadinya penurunan jumlah sel

probiotik seiring dengan lamanya waktu penyimpanan. Penurunan jumlah bakteri

(a) (b)

(a) (b)

8

lebih signifikan pada probiotik yang disimpan di suhu ruang dibanding probiotik

yang disimpan dalam refrigerator. Berdasarkan hasil analisis ragam terhadap total

bakteri, lama penyimpanan probiotik berpengaruh nyata terhadap total bakteri

yang terkandung di dalamnya (p<0.05).

Aktivitas Antibakteri Probiotik

Aktivitas antibakteri diuji terhadap dua jenis bakteri, yaitu Escherichia coli

dan Staphylococcus aureus. Hasil pengukuran diameter zona hambat ditampilkan

pada Tabel 4. Sampel probiotik tanpa sentrifugasi menunjukkan aktivitas

penghambatan terhadap E. coli dan S. aureus, dengan zona hambat masing-

masing sebesar 7.65 mm dan 6.59 mm. Zona hambat yang terbentuk pada E. coli

dan S. aureus dari supernatan bebas sel masing-masing sebesar 9.30 mm dan 6.34

mm. Berdasarkan hasil tersebut dapat diketahui bahwa probiotik menghambat E.

coli lebih baik dibangding dengan S. aureus.

Kontrol positif yang digunakan pada percobaan ini adalah tetrasiklin HCL,

yang dibuat dalam konsentrasi 5, 10, 15, dan 20 g/mL kemudian diukur zona

hambatnya terhadap E. coli dan S. aureus. Berdasarkan persamaan linier dari

kurva standar zona hambat tetrasiklin, diperoleh hasil bahwa aktivitas

penghambatan sampel probiotik terhadap E. coli sebanding dengan 6.97 g/mL

tetrasiklin. Aktivitas penghambatan sampel probiotik terhadap S. aureus

sebanding dengan 3.57 g/mL tetrasiklin. Supernatan bebas sel memiliki aktivitas

penghambatan terhadap E. coli yang sebanding dengan 8.76 g/mL tetrasiklin,

sedangkan aktivitas penghambatannya terhadap S. aureus sebanding dengan 3.40

g/mL tetrasiklin.

Tabel 4 Nilai diameter zona hambat probiotik terhadap bakteri uji (mm)

Sampel Bakteri uji

Escherichia coli Staphylococcus aureus

Probiotik 7.65 6.59

Supernatan Bebas Sel 9.30 6.34

Keterangan: Diameter cakram 6 mm (termasuk ke dalam zona hambat)

Gambar 3 Perubahan jumlah bakteri selama 8 minggu penyimpanan

9

PEMBAHASAN

Komposisi Optimum Media Produksi L. Plantarum TSD-10

Media produksi harus mengandung nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroba.

Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang sulit tumbuh selain pada media

kompleks (Zacharof dan Lovitt 2012). Sumber karbon dan nitrogen merupakan

bahan utama yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba. Sumber karbon

berfungsi menyediakan kebutuhan energi untuk mikroba dan dapat berfungsi

sebagai substrat untuk enzim yang diperlukan oleh mikroba (Riadi 2007). Oleh

karena itu, sumber karbon dalam media harus mencukupi untuk pertumbuhan

bakteri. Sumber karbon yang digunakan pada percobaan ini adalah glukosa dan

molase. Menurut Mandenius (2011), molase termasuk media komplek karena

selain mengandung gula yang cukup tinggi, molase juga memiliki kandungan

mineral seperti Mg, Ca, Fe dan Zn yang dibutuhkan oleh mikroba. Sumber

nitrogen berfungsi untuk menyediakan asam amino dan protein untuk proses

pertumbuhannya (Riadi 2007). Sumber nitrogen yang digunakan pada percobaan

ini, yaitu meat bone meal (MBM), corn gluten meal (CGM), soy bean meal

(SBM), tepung ikan, dan bungkil kelapa. Bahan-bahan tersebut merupakan hasil

dari limbah pertanian yang memiliki kadar protein cukup tinggi. Pemilihan bahan

tersebut sebagai sumber protein pada media produksi, bertujuan memanfaatkan

dan mengurangi jumlah limbah pertanian yang ada di masyarakat. Media produksi

juga ditambahkan mineral mix untuk mencukupi kebutuhan mineral bagi

pertumbuhan bakteri.

Pembuatan media produksi menggunakan komposisi media MRS sebagai

acuan. Sumber karbon pada media MRS diperoleh dari glukosa 2%. Sumber

karbon pada media produksi menggunakan glukosa konsentrasi optimum sebesar

1%, serta molase dengan konsentrasi optimum sebesar 5%. Penelitian Todorov

(2004) dan Jenie (2000) menunjukkan bahwa konsentrasi glukosa sebanyak 2%

pada media mencukupi untuk pertumbuhan BAL. Pernyataan ini didukung oleh

Pramono et al. (2003) yang menyatakan bahwa konsentrasi glukosa 1.5-2% dalam

MRS cair mencukupi untuk pertumbuhan L. plantarum. Sumber nitrogen pada

media MRS diperoleh dari pepton 1%, lab lemco 0.8%, dan yeast ekstrak 0.4%.

Sumber nitrogen tersebut digantikan oleh meat bone meal (MBM), corn gluten

meal (CGM), soy bean meal (SBM), tepung ikan, dan bungkil kelapa yang

terkandung dalam protein mix. Mikroorganisme membutuhkan lebih dari 15%

(b/b) nitrogen untuk sintesis protein struktural dan fungsional serta untuk sintesis

asam nukleat. Kebutuhan tersebut dapat terpenuhi dengan menambahkan nitrogen

ke media dengan konsentrasi 1-2 g/L (Waites et al. 2001). Menurut Ogunbanwo

(2003) sumber N sebanyak 0.1-0.3% pada media, mencukupi untuk pertumbuhan

Lactobacillus.

Penelitian ini menggunakan RSM dengan rancangan CCD yang merupakan

salah satu desain RSM dengan sebuah desain fraksional dan nilai tengah (center

point) yang diperbesar dengan sekelompok start point yang memungkinkan

penentuan titik lengkung kurva. Rancangan CCD juga membutuhkan batas bawah

(-1) dan batas atas (+1). Perbedaan yang stabil antar batas bawah (-), titik pusat

(0), dan batas atas (+1) pada model diperlukan untuk memperoleh orde yang

10

bagus dalam menghasilkan nilai respon. Rancangan CCD diawali dengan

pengamatan dan pengukuran respon untuk menentukan nilai tengah (level 0) dari

variabel yang akan diuji dengan rancangan acak lengkap (RAL). Respon yang

diamati adalah jumlah total bakteri (CFU/mL), sedangkan variabel yang diuji

adalah konsentrasi glukosa, molase, protein mix, dan mineral mix. Kombinasi

perlakuan (variabel) dan level yang tertinggi dalam menghasilkan bakteri L.

plantarum TSD-10 pada rancangan RAL tersebut akan menjadi nilai tengah atau

titik pusat (0) dalam rancangan CCD.

Hasil analisis produksi L. plantarum TSD-10 pada rancangan RAL

menunjukkan kombinasi 1% glukosa, 5% molase, 0.25% mineral mix, dan 5%

protein mix agar menghasilkan L. plantarum TSD-10 dalam jumlah yang tinggi.

Kombinasi ini selanjutnya digunakan sebagai titik pusat (0) untuk rancangan

RSM. Melalui kombinasi tersebut juga ditentukan batas atas (+1) dan batas bawah

(-1) untuk masing-masing faktor. Respon yang dianalisis adalah jumlah total

bakteri yang dinyatakan dalam CFU/mL. Data yang telah didapatkan kemudian

diolah menggunakan software Design Expert. Hasil yang diperoleh akan

diterjemahkan ke dalam model persamaan fungsi respon terhadap variabel bebas.

Data yang diolah nantinya juga akan menunjukkan berpengaruh atau tidaknya

variabel bebas yang dipilih terhadap respon dan interaksi antar respon.

Produksi L. plantarum TSD-10 dievaluasi dengan metode RSM melalui 21

percobaan yang dilakukan dengan 5 ulangan pada titik pusat (center point).

Analisis pemilihan model dilakukan berdasarkan jumlah kuadrat dari urutan

model, pengujian ketidaktepatan model (Lack of Fit) dan ringkasan model secara

statistika. Model yang terpilih untuk menjelaskan respon (jumlah sel bakteri

CFU/mL) berdasarkan hasil analisis ialah model kuadratik. Model yang

digunakan dengan nilai p (prob>F) signifikan terhadap respon (jumlah sel

bakteri), artinya model dapat diterima untuk melihat perkiraan pengaruh setiap

peubah dan interaksi faktor independen dengan respon. Pengujian ketidaktepatan

model lack of fit dilakukan untuk melihat ketidakcocokkan antara model dengan

rancangan kuadratik. Hasil yang diperoleh menunjukkan data lack of fit yang tidak

signifikan dengan nilai p (prob>F) lebih dari taraf nyata α 0.05, artinya model

yang diperoleh memiliki kecocokkan dengan rancangan kuadratik.

Analisis ragam memperlihatkan bahwa konsentrasi glukosa dan protein mix

pada efek linier berpengaruh nyata terhadap produksi L. plantarum. Hasil ini

sesuai dengan Pramono et al. (2003) yang menyatakan bahwa konsentrasi glukosa

berpengaruh terhadap pertumbuhan L. plantarum. Grafik permukaan respon dan

kontur plot menunjukkan bahwa kenaikan konsentrasi glukosa dan protein mix

berpengaruh terhadap jumlah sel L. plantarum yang dihasilkan. Konsentrasi

glukosa di atas 1% (b/v) level (0) dan konsentrasi protein mix di atas 5% (v/v)

level (0) menyebabkan peningkatan jumlah sel bakteri. Interaksi antara glukosa

dan protein mix tidak berpengaruh nyata terhadap jumlah sel bakteri (p=0.4974).

Efek kuadratik molase dan interaksinya dengan protein mix juga

berpengaruh nyata terhadap produksi L. plantarum. Nurjannah (2012)

menyebutkan penambahan molase ke dalam media produksi dapat mempengaruhi

pertumbuhan bakteri. Grafik permukaan respon dan kontur plot menunjukkan

bahwa kenaikan konsentrasi molase dan protein mix berpengaruh terhadap jumlah

sel L. plantarum yang dihasilkan. Konsentrasi molase di atas 5% (v/v) level (0)

dapat menurunkan jumlah sel L. plantarum, dan konsentrasi protein mix di atas

11

5% (v/v) level (0) menyebabkan peningkatan jumlah sel bakteri. Interaksi antara

molase dan protein mix berpengaruh nyata terhadap jumlah sel bakteri

(p=0.0247). peningkatan konsentrasi molase dan protein mix secara bersamaan

dapat meningkatkan jumlah sel L. plantarum.

Kondisi optimum pada media produksi diperkirakan dapat menghasilkan

jumlah sel bakteri L. plantarum sebesar 10.56 109

CFU/mL. Kondisi optimum

yang telah diperoleh selanjutnya diverifikasi ulang sebanyak 5 kali. Verifikasi

kondisi optimum media produksi diperoleh jumlah sel L. plantarum sebesar 10.45

109

CFU/mL. Jumlah tersebut mencapai 98.94% dari hasil yang diprediksi oleh

model. Xu et al. (2008) menyebutkan bahwa hasil verifikasi prediksi model

dengan ketepatan pengulangan lebih besar dari 90% menyatakan penggunaan

model untuk optimasi sudah sesuai, dan selebihnya dipengaruhi oleh variabel lain

dalam media produksi yang tidak diteliti (Spolaore et al. 2006). Variabel lain pada

penelitian ini yang dapat mempengaruhi respon antaralain pH media, lama waktu

inkubasi, serta suhu inkubasi. Hal ini dapat disiasati dengan cara melakukan

optimasi terhadap faktor atau variabel-variabel tersebut sehingga diperoleh

kondisi optimum berupa pH, lama waktu dan suhu inkubasi yang sesuai untuk

produksi probiotik.

Viabilitas Probiotik Selama Masa Penyimpanan

Pengukuran jumlah sel dalam produk probiotik dilakukan untuk mengetahui

perubahan jumlah sel selama penyimpanan pada suhu ruang dan refrigerator.

Pengujian viabilitas dilakukan dengan metode TPC. Prinsip dari metode ini adalah

menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup pada media agar. Koloni bakteri

yang muncul akibat pertumbuhan mikroorganisme, diasumsikan berasal dari satu

sel bakteri (Waluyo 2008). Viabilitas probiotik dapat dipengaruhi oleh beberapa

faktor yaitu kondisi fermentasi (media fermetasi, pH dan keasaman, suhu, dan

kadar oksigen), pengemasan dan kondisi penyimpanan, serta agen pelindung

(bahan pengawet) (Tripathi dan Giri 2014).

Probiotik yang disimpan dalam refrigerator memiliki viabilitas yang lebih

tinggi dibanding probiotik yang disimpan pada suhu ruang. Hal ini sesuai dengan

pernyataan Gardiner et al. (2000) bahwa viabilitas bakteri probiotik selama

penyimpanan berbanding terbalik dengan suhu penyimpanan. Suhu penyimpanan

3-4 C dapat mengontrol terjadinya over acidity oleh BAL dan suhu yang lebih

rendah dapat merusak sel (Adhikari et al. 2000). Gardiner (2000) menyatakan hasil

penelitian sebelumnnya menunjukkan ketahanan hidup probiotik paling lambat

mengalami penurunan pada probiotik dengan suhu penyimpanan 4°C dibandingkan

dengan penyimpanan pada suhu 15°C dan 30°C. Lama penyimpanan berpengaruh

nyata terhadap viabilitas probiotik. Semakin lama waktu penyimpanan

menyebabkan bertambahnya kematian sel sehingga jumlah populasi probiotik

menurun. Kematian sel probiotik dapat disebabkan oleh beberapa faktor yaitu

berkurangnya ketersediaan nutrisi pada media, energi cadangan dalam sel habis,

serta adanya penumpukan asam laktat dan metabolit lainnya. Perubahan pH

medium karena penumpukan asam laktat dapat menghambat pertumbuhan bakteri,

selain itu akumulasi hasil-hasil metabolisme dapat membahayakan bagi viabilitas

bakteri karena dapat bersifat racun (Vinderolla et al. 2002).

12

Viabilitas menunjukkan kemampuan hidup BAL dalam probiotik selama

penyimpanan. Jumlah BAL hidup harus dipertahankan di atas standar yaitu 107

CFU/mL selama penyimpanan (Davidson et al. 2000). Vinderolla et al. (2000)

juga menyatakan bahwa probiotik untuk ternak dan manusia, minimal

mengandung mikroba sebanyak 106

-108 CFU/mL atau 10

8 -10

10 CFU/gram.

Menurut Suscovic et al. (2001), probiotik harus mempunyai viabilitas atau jumlah

sel bakteri hidup di atas 106. Berdasarkan standar tersebut, penyimpanan probiotik

pada suhu ruang dapat mempertahankan viabilitas probiotik sampai 2 minggu

dengan jumlah sel bakteri sebesar 3.28 107

CFU/mL. Penyimpanan pada

refrigerator mampu mempertahankan viabilitas probiotik selama 7 minggu

dengan jumlah sel bakteri sebesar 3.86 106

CFU/mL. Cara yang dapat

dilakukan untuk meningkatkan viabilitas dari probiotik ini adalah dengan

melakukan enkapsulasi dan freeze-dry sehingga produk probiotik dapat disimpan

lebih lama.

Aktivitas Antibakteri Probiotik

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap sampel probiotik dan

supernatan bebas sel. Keduanya menunjukkan adanya aktivitas penghambatan

terhadap E. coli dan S. aureus. Hasil ini sesuai dengan Hadiyana (2013) dan

Supriatna (2012) yang menyatakan bahwa L. plantarum memiliki aktivitas

antimikrob yang dapat menghambat pertumbuhan E. coli dan S. aureus. Omemu

dan Faniran (2011) juga menyatakan bahwa supernatant bebas sel dari L.

plantarum mampu menghambat bakteri pathogen. Jika dilihat dari diameter zona

hambat yang dihasilkan, probiotik dan supernatannya memiliki aktivitas

penghambatan yang sedang terhadap bakteri uji. Hasil ini sejalan dengan

Supriatna (2012) yang menyatakan bahwa aktivitas penghambatan bakteri

dikategorikan sedang apabila zona hambat yang dihasilkan berkisar 5-10 mm.

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk batang

pendek lurus, biasanya tidak berkapsul, tidak membentuk spora, penghuni normal

usus, dan mudah tumbuh pada media pertumbuhan sederhana (Pelczar and Chan

2008). Bakteri Gram negatif memiliki membran luar pada dinding selnya.

Membran luar tersebut berperan sebagai barrier permeabel. Membran ini

bertanggung jawab untuk mencegah masuknya molekul seperti antibiotik,

deterjen, enzim pencernaan, ke dalam membran sitoplasma (Parada et al 2007).

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk bola (kokus)

yang menghasilkan staphylococcal enterotoksin yaitu agen penyebab sindrom

keracunan dalam makanan (Purnomo 2006). Bakteri ini memiliki dinding sel yang

mengandung dua komponen utama yaitu peptidoglikan dan asam tekoat yang

berkaitan dengannya (Pelczar & Chan 2008). Peptidoglikan yang tebal pada

dinding sel tersebut membentuk suatu struktur yang kaku (Jawetz et al. 2001). Hal

ini menyebabkan senyawa aktif dari L. plantarum sulit untuk merusak sel bakteri.

Bakteri L. plantarum menghasilkasn senyawa aktif bakteriosin yang disebut

dengan plantarisin. Plantarisin merusak membran sel bakteri melalui dua

mekanisme, yaitu barrel-stave dan carpet (Jorgenrud 2009). Mekanisme barrel-

stave diawali dengan penempelan bagian hidrofobik plantarisin ke permukaan

membran sel bakteri. Selanjutnya, plantaricin akan bergabung dan membentuk

13

pori-pori pada membran sel yang mengakibatkan kebocoran sel (Gambar 4).

Kebocoran ini menyebabkan keluarnya materi sel dari dalam membrane sehingga

terjadi kematian sel. Perusakan membrane sel dengan mekanisme carpet diawali

dengan interaksi antara bagian hidrofobik pada plantarisin dengan fosfolipid

bilayer pada membran sel bakteri. Plantarisin akan membentang pada permukaan

membran sel seperti karpet, hal ini akan mengganggu permeabilitas membran sel

dan menyebabkan lisis (Gambar 5). Kerusakan pada membran sel akan

menyebabkan komponen di dalam sel terlepas keluar, dan berakibat pada

kematian sel.

Gambar 4 Mekanisme plantarisin merusak dinding sel bakteri dengan model

barrel-slave (Jorgenrud 2009)

Gambar 5 Mekanisme plantarisin merusak dinding sel bakteri dengan model

carpet (Jorgenrud 2009)

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Metode Optimasi menggunakan RSM menunjukkan kondisi optimum media

produksi probiotik L. plantarum yaitu konsentrasi glukosa 1.48% (w/v), molase

3.72% (v/v), mineral mix 0.34% (w/v), dan protein mix 7.69% (v/v) dengan

menghasilkan jumlah sel sebesar 10.56 109

CFU/mL. Penyimpanan probiotik di

14

refrigerator viabilitasnya tiga kali lebih tinggi dibanding penyimpanan pada suhu

ruang. Probiotik L. plantarum memiliki aktivitas terhadap E. coli 1.16-1.47 kali

lebih besar dibanding aktivitas penghambatannya terhadap S. aureus.

Saran

Perlu dilakukan optimasi dengan faktor dan variabel berbeda, seperti

konsentasi inokulum, pH media, dan lama inkubasi. Senyawa antimikrob dari

probiotik L. plantarum TSD-10 perlu dikarakterisasi dan purifikasi, untuk

menentukan senyawa yang berperan dalam menghambat mikrob patogen. Umur

simpan produk probiotik perlu ditingkatkan dengan melakukan enkapsulasi

menggunakan teknik spray drying atau freeze drying.

DAFTAR PUSTAKA

[BAM] Bacteriological Analytical Manual. 2001. Bacteriological Analytical

Manual Chapter 3: Aerobic plate count. U.S. Food and Drug [terhubung

berkala]

Administration.www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMetho

ds/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm063346.htm [3 Agustus 2016]

Adhikari K, Mustapha A, Grun IU, Fernando L. 2000. Viability of

microencapsulated bifidobacteria in set yoghurt during refrigerated storage.

J Dairy Sci. 83:1946-1951.

Aritama RD. 2013. Viabilitas kandidat probiotik pada berbagai konsentrasi awal

dan mutu togurt tepung pisang uli modifikasi sinbiotik selama penyimpanan

[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Astuti WD, Ridwan R, Tappa B. 2007. Penggunaan probiotik dan kromium

organik terhadap kondisi lingkungan rumen in vitro. JITV. 12(4): 262-267.

Bromberg R, Moreno I, Zaganini CL, Delboni RR, Oliveira J. 2004. Isolation of

bacteriocin producing lactic acid bacteria from meat and meat products and

its spectrum of inhibitory activity. Braz J Microbiol. 35 (1-2): 137-144.

Carley KM, Kamneva NY, Reminga J. 2004. Response Surface Methodology.

Pittsburgh (US): Carnegie Mellon University.

Carvalho AS, Joana S, Peter H, Paula T, Malcata FX, Paul G. 2004. Relevan

factor for the preparation of freeze-dried lactic acid bacteria. International

Diary Journal. 14: 835-847.

Chandramouli V, Kailasapathy K, Peiris P, Jones M. 2004. An improved method

of microencapsulation and its evaluation to protect Lactobacillus spp. In

simulated gastric conditions. J of Microbiol Methods. 56: 27-35.

Davidson RH, Duncan SE, Hackey CR, Eigel WN, Boling W. 2000. Probiotic

culture survival and implications in fermented frozen yogurt characteristic. J

Dairy Sci. 83:666-673.

15

Gardiner GE, O’Sullivan E, Kelly J, Auty MA, Fitzgerald GF, Collins JK, Ross

RP, Stanton C. 2000. Comparative survival rates of human-derived probiotic

Lactobacillus paracasei and L. salivarius strains during heat treatment and

spray drying. Applied and Environmental Microbiology. 66: 2605-2612.

Hadiyana N. 2013. Pengaruh suhu produksi terhadap aktivitas ekstrak kasar

bakteriosin dari berbagai galur Lactobacillus sp dalam menghambat

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus [skripsi] Bogor (ID): Institut

Pertanian Bogor.

Januarsyah T. 2007. Kajian aktivitas hambat bakteriosin dari bakteri asam laktat

galur SCG 1223 [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Jawetz E. 2001. Mikrobiologi untuk Kesehatan. Jakarta (ID): EGC.

Jenie BSL. 2000. Pengembangan produk makanan tradisional rendah garam

berbasis ikan melalui aplikasi bakteri asam laktat penghasil bakteriosin

[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Jorgenrud BM. 2009. Construction of a heterologous expression vector for

plantaricin F one of the peptides constituting the two peptides bacteriocin

plantaricin EF. [Thesis]. Oslo (NO). University of Oslo.

Liew SL, Ariff AB, Raha AR, Ho YW. 2005. Optimization of medium

composition for the production of a probiotics microorganism, Lactobacillus

rhamnosus, using response surface methodology. International Journal of

Food Microbiology. 102: 137-142.

Mandenius CF, Brundin A, Lepholin G. 2008. Bioprocess optimization using

design of experiment methodology. J. Biotechnol. 24: 1191-1203.

Ngadiyono N, Baliarti E. 2001. Laju pertumbuhan dan produksi karkars sapi

peranakan Ongole jantan degan penambahan probiotik starbio pada

pakannya. Media Peternakan. 24(2): 63-67.

Ngadiyono N, Hartadi H, Winugroho M, Siswansyah DD, Ahmad SN. 2001.

Pengaruh pemberian bioplus terhadap kinerja sapi Madura di Kalimantan

Tengah. JITV. 6(2): 69-75.

Nurjannah L. 2012. Tetes tebu sebagai alternative sumber karbon untuk produksi

asam laktat oleh Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus [skripsi].

Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Ogunbanwo ST, Sanni AT, dan Unilude AA. 2003. Influence of cultural condition

on the production of bacteriosin by Lactobacillus bevis OG1. African J

Biotech. 2(7): 179-184.

Omemu AM, Faniran OW. 2011. Assessment of the antimicrobial activity of

lactic acid bacteria isolated from two femented maize products-ogi and

kunnu-zaki. Mal. J. Microbiol. 7(3): 124-128.

Palamakula K, Nutan S, Khan MA. 2004. Response surface methodology for

optimation and characterization of limonene-based coenzyme Q1O

selfnanoemulsified cap suledosage form. Apps. Pharm. Sci. Tech. 5(4): 1-8.

16

Parada JL, Caron CR, Medeiros ABP, Soccol CR. 2007. Bacteriocin from lactic

acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives. Bracilli.

Arch. J. Biol. Technol. 50 (3): 521-542.

Pelczar MJ, Chan ECS. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi 2. Jakarta (ID): UI

Press.

Pramono YB, Harmayani E, Utami T. 2003. Kinetika pertumbuhan Lactobacillus

plantarum dan Lactobacillus sp. pada media MRS cair. Jurnal Teknol dan

Industri Pangan. 14 (1): 46-50.

Rahayuningtyas N. 2011. Uji aktivitas antibakteri isolat Lactobacillus plantarum

dari buah-buahan tropis dan kaitannya dengan ekspresi gen plantaricin.

[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Riadi MM. 2007. Production of glucoamylase by marine endophytic aspergillus

sp. jan-25 under optimized solid-state fermentation conditions on agro

residues. Australian .J. Basic. Applied. Sci. 6: 41-54.

Riswandi, Muhakka, Lehan M. 2015. Evaluasi nilai kecernaan secara in vitro

ransum ternak sapi Bali yang disuplementasi dengan probiotik bioplus. J

Peternakan Sriwijaya. 4(1): 35-46.

Spolaore P, Claire JC, Elie D, Arsene I. 2006. Optimization of Nannochloropsis

oculata growth using the response surface methodology. J. Chem. Technol.

Biotechnol. 81:1049–1056.

Sultana K, Godward G, Reynolds N, Arumugaswamy R, Peiris P, Kailasapathy K.

2000. Encapsulation of probiotic bacteria with alginate-starch and

evaluation of survival in simulated gastro intestinal condition and in yogurt.

Int J Food Microbiology. 62: 47-55

Supriatna D. 2012. Stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin asal galur

Lactobacillus plantarum terhadap ph alkali [skripsi] Bogor (ID): Institut

Pertanian Bogor.

Suskovic J, Kos B, Goreta J, Matosic S. 2001. Role of lactic acid bacteria and

Bifidobacteria in cynbiotic effect. Food technol Biotechnol. 39:227-235.

Todorov SD, Leon MT. 2004. Influence of growth condition on the production of

a bacteriosin by Latobacillus lactis ST34BR, a stain isolated from barley

beer. J Basic Microbiol. 44(4):305-316.

Tripathi MK, Giri SK. 2014. Probiotic functional foods: survival of probiotics

during processing and storage. J of Functional Food. 9: 225-241.

Vinderolla CG, Mocchutti P, Reinheimer JA. 2002. Interactions among lactic acid

starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products. J Dairy Sci.

85: 721-729.

Waites MJ, Morgan NL, Rockey JS, Higton G. 2001. Industrial Microbiology: An

Introduction. UK: Blackwell Science Ltd.

Waluyo L. 2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang (ID):

UMM Press.

17

Wanmeng M, Chao C, Xinfeng L, Tao Z, Bo J. 2009. Optimization of culture

medium for the production of phenyllactic acid by Lactobacillus sp. SK007.

Bioresource Technology. 100: 1366-1370.

Xu YX, Yan LI, Shao CX, Yong L, Xin W, Jiangwu T. 2008. Improvement of

xylanase production by Aspergillus niger XY-1 using response surface

methodology for optimizing the medium composition. J. Zhejiang. Univ.Sc.

9(7): 558-566.

Zacharof MP, Lovitt RW. 2012. Bacteriocins produced by lactic acid bacteria, a

review article. APCBEE Procedia. 2: 50-56.

18

Lampiran 1 Bagan alir penelitian

Lampiran 2 Koefisien regresi dan signifikansi dari model Response Surface

Quadratic

Faktor Coefficient

Estimate db

Standard

Error

95% CI

(Low)

95% CI

(High)

Intercept 5.373 1 0.531 4.075 6.672

X1-Glukosa 2.616 1 0.521 1.340 3.891

X2-Molase 0.567 1 0.521 -0.709 1.842

X3-Mineral mix 0.464 1 0.335 -0.357 1.284

X4-Protein mix 2.755 1 0.521 1.479 4.030

X1X2 0.102 1 0.681 -1.564 1.768

X1X3 0.523 1 0.438 -0.550 1.595

X1X4 0.492 1 0.681 -1.175 2.158

X2X3 0.010 1 0.438 -1.062 1.082

X2X4 2.028 1 0.681 0.362 3.694

X3X4 -0.318 1 0.438 -1.390 0.755

X12

0.299 1 0.321 -0.486 1.083

X22

-0.958 1 0.321 -1.742 -0.173

X32

0.157 1 0.321 -0.628 0.942

X42

0.377 1 0.321 -0.408 1.162

Kultur L. plantarum TSD-10

Optimasi media produksi

dengan RSM

Uji viabilitas

Uji aktivitas antibakteri

19

Lampiran 3 Data uji viabilitas probiotik selama 8 minggu

Minggu ke- Jumlah bakteri (CFU/mL) Log CFU/mL

Suhu ruang Refrigerator Suhu ruang Refrigerator

0 7.26E+09 7.26E+09 9.861 9.861

1 6.90E+09 2.35E+10 9.839 10.372

2 3.28E+07 4.91E+09 7.516 9.691

3 8.19E+05 4.60E+09 5.913 9.663

4 5.10E+03 2.59E+08 3.708 8.414

5 1.90E+03 3.22E+07 3.279 7.508

6 1.49E+02 5.91E+06 2.174 6.772

7 0.00 3.86E+06 - 6.587

8 0.00 4.96E+05 - 5.696

Lampiran 4 Analisis statistik viabilitas probiotik selama penyimpanan

a. Tabel analisis ragam ( = 0.05) viabilitas probiotik selama penyimpanan

20

Lanjutan Lampiran 4 Analisis statistik viabilitas probiotik selama penyimpanan

b. Tabel uji lanjut Duncan ( = 0.05) viabilitas probiotik selama

penyimpanan

Lampiran 5 Kurva standar diameter zona hambat tetracycline HCl

a. Kurva standar diameter zona hambat tetracycline HCl terhadap E. coli

y = 0.92x + 1.24 R² = 0.9818

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25

Zon

a B

enin

g (m

m)

Konsentrasi (g/mL)

21

Lanjutan Lampiran 5 Kurva standar diameter zona hambat tetracycline HCl

b. Kurva standar diameter zona hambat tetracycline HCl terhadap S. aureus

y = 1.5134x + 1.19 R² = 0.9869

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25

Zon

a B

enin

g (m

m)

Konsentrasi (g/mL)

22

RIWAYAT HIDUP

Agustina Tri Puspita Sari, lahir di Pati pada tanggal 23 Agustus 1995.

Merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara pasangan Tugimin Mintarjo dan

Naomi Supiyati (alm). Penulis memulai pendidikan di TK PKK Kelet Kab.

Jepara-Jawa Tengah, SDN 01 Kelet Kab. Jepara-Jawa Tengah, SMP Negeri 1

Tayu Kab. Pati-Jawa Tengah, dan pada tahun 2012 penulis lulus dari SMA Negeri

1 Tayu Kab. Pati-Jawa Tengah dan pada tahun yang sama berhasil lulus masuk

IPB melalui Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN) jalur

undangan. Penulis memilih mayor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam kegiatan pelayanan

UKM PMK IPB di Komisi Pelayanan Anak (KPA PMK IPB) dan pada organisasi

mahasiswa derah (OMDA). Penulis juga mengikuti kegiatan kepanitiaan

antaralain, anggota divisi Danus dan Sponsorship Lomba Karya Ilmiah Populer

2014, MPD Departemen Biokimia tahun 2014, Seminar Nasional kesehatan 2014,

Retreat Komisi Pelayanan Anak tahun 2014 dan 2015, dan Retreat Kelompok Pra-

Alumni (Kopral) PMK tahun 2016. Penulis pernah melaksanakan Praktik Lapang

di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Pusat Penelitian Bioteknologi

bidang Mikrobiologi Terapan, Cibinong-Jawa Barat dengan judul Optimasi Media

Produksi Lactobacillus plantarum TSD-10 dengan Response Surface

Methodology (RSM).