PENGARUH PENAMBAHAN BAKTERI ASAM LAKTATrepository.ub.ac.id/132210/1/050803169.pdf · UJI DAYA...
97
UJI DAYA HAMBAT BAKTERI ASAM LAKTAT (Lactobacillus sake, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Pediacoccus pentosaceus, Pediacoccus acidilactici) TERHADAP PERTUMBUHAN Escherichia coli SECARA IN VITRO SKRIPSI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN Oleh : BOIMIN 9901080125 – 83 TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN FAKULTAS PERIKANAN MALANG 2006
Transcript of PENGARUH PENAMBAHAN BAKTERI ASAM LAKTATrepository.ub.ac.id/132210/1/050803169.pdf · UJI DAYA...
UJI DAYA HAMBAT BAKTERI ASAM LAKTAT
(Lactobacillus sake, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum,
Pediacoccus pentosaceus, Pediacoccus acidilactici)
TERHADAP PERTUMBUHAN Escherichia coli SECARA
IN VITRO
SKRIPSI
TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN
Oleh :
BOIMIN
9901080125 – 83
TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN
FAKULTAS PERIKANAN
MALANG
2006
LEMBAR PERSETUJUAN
SKRIPSI
TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN
UJI DAYA HAMBAT BAKTERI ASAM LAKTAT
(Lactobacillus sake, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum,
Pediacoccus pentosaceus, Pediacoccus acidilactici)
TERHADAP PERTUMBUHAN Escherichia coli SECARA
IN VITRO
Oleh :
BOIMIN
NIM. 9901080125 – 83
MENYETUJUI, DOSEN PENGUJI I DOSEN PEMBIMBING I
( Ir. BAMBANG B. S., MS ) (Ir. HAPPY NURSYAM, MS ) TANGGAL : __________ TANGGAL : __________
DOSEN PENGUJI II DOSEN PEMBIMBING II
(Ir. Hartati K. N., MS) ( Ir. YAHYA, MP) TANGGAL: TANGGAL : ____________
ii
KATA PENGANTAR
Puji syukur saya panjatkan kehadirat Allah Tuhan semesta alam, hanya
dengan rahmat dan hidayah-Nyalah penulisan laporan skripsi ini dapat terselesaikan.
Laporan ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana
perikanan Fakultas Perikanan Universitas Brawijaya.
Atas terselesaikannya laporan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada:
Bapak Ir. Happy Nursyam, MS. selaku Dosen Pembimbing I
Bapak Ir. Yahya, MP. selaku Dosen Pembimbing II
Atas segala petunjuk dan bimbingannya sejak penyusunan usulan penelitian sampai
dengan selesainya penyusunan laporan skripsi ini.
Ibu Ir. Hartati Kartikaningsih, MS. dan Bapak Sunardi selaku Ketua dan
Laboran Laboratorium Mikrobiologi Dasar Fakultas Perikanan Universitas
Brawijaya serta Bapak Slamet selaku Laboran Laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, yang telah memberikan bantuan
fasilitas selama penelitian.
Semua pihak yang telah memberikan dorongan dan bantuan sehingga laporan
skripsi ini dapat terselesaikan.
Akhirnya penulis berharap semoga karya tulis ini bermanfaat dan dapat
memberikan informasi bagi semua pihak yang berminat dan memerlukan.
Malang, Juni 2006
Penulis
iii
DAFTAR ISI
Halaman
RINGKASAN .................................................................................................. i
KATA PENGANTAR ..................................................................................... ii
DAFTAR ISI ................................................................................................... iii
DAFTAR TABEL............................................................................................ v
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................... viii
1. PENDAHULUAN.............................................................................................. 1
1.1 Latar Belakang........................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ..................................................................................... 3
1.3 Tujuan Penelitian....................................................................................... 4
1.4 Kegunaan................................................................................................... 5
1.5 Tempat dan Waktu .................................................................................... 6
2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................... 7
2.1 Keamanan Pangan Produk Perikanan........................................................ 7
2.2 Cemaran Mikrobia Pada Produk Perikanan .............................................. 8
2.3 Eschericia coli ........................................................................................... 10
2.4 Probiotik .................................................................................................... 14
2.5 Bakteri Asam Laktat.................................................................................. 15
2.5.1 Lactobacillus plantarum ............................................................... 16
2.5.2 Lactobacillus casei........................................................................ 17
2.5.3 Lactobacillus sake......................................................................... 19
2.5.4 Pediococcus acidilactici ............................................................... 21
2.5.5 Pediococcus pentosaceus .............................................................. 22
2.6 Bakteri Asam Laktat Sebagai Probiotik .................................................... 23
2.7 Aktivitas Antimikroba ............................................................................... 25
2.8 Uji EfektivitasAntimikroba in vitro........................................................... 28
iv
3. METODE PENELITIAN ................................................................................. 30
3.1 Materi ........................................................................................................ 30
3.1.1 Bahan ............................................................................................ 30
3.1.2 Alat ............................................................................................... 30
3.2 Metode Penelitian...................................................................................... 31
3.2.1 Variabel Penelitian........................................................................ 31
3.3 Kerangka Konsep dan Prosedur Penelitian ............................................... 36
3.3.1 Kerangka Konsep Penelitian......................................................... 36
3.3.2 Prosedur Penelitian ....................................................................... 37
3.3.3 Optimalisasi Pertumbuhan Bakteri Uji Escherichia coli............... 39
3.3.4 Optimalisasi Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat.......................... 39
3.3.5 Pengujian Anti Bakteri dengan Metode Cakram ......................... 40
3.4 Parameter Uji............................................................................................. 42
3.5 Prosedur Analisa Parameter Uji ................................................................ 42
3.5.1 Daya Hambat Bakteri Asam Laktat Terhadap Bakteri Patogen ... 42
3.5.2 Pengamatan Molekul Protein dari Bakteri Asam Laktat .............. 43
3.5.3 Penentuan Konsentrasi Asam Laktat dari Bakteri Asam Laktat... 46
4. Hasil dan Pembahasan...................................................................................... 48
4.1 Daya Hambat Bakteri Asam Laktat........................................................... 48
4.2 Daya Hambat Metabolit Bakteri Asam Laktat ......................................... 51
4.3 Daya Hambat Kombinasi Metabolit BAL................................................. 54
4.4 Daya Anti Mikroba BAL........................................................................... 58
4.5 Fraksi Protein dari Bakteri Asam Laktat ................................................... 61
5. Kesimpulan dan Saran ..................................................................................... 65
5.1 Kesimpulan................................................................................................ 65
5.2 Saran .......................................................................................................... 66
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 67
LAMPIRAN............................................................................................................. 73
v
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Tipe probiotik dan bakteri probiotik yang biasa digunakan .................... 24
Tabel 2. Model analisa Rancangan Acak Lengkap (RAL)................................... 34
Tabel 3. Kolom pembacaan zona hambat pada uji cakram .................................. 41
Tabel 4. Diameter zona hambat BAL pada masing-masing perlakuan....................... 48
Tabel 5. Rangkuman hasil variansi BAL............................................................. 49
Tabel 6. Diameter zona hambat metabolit BAL pada masing-masing
perlakuan............................................................................................... 51
Tabel 7. Rangkuman hasil variansi metabolit BAL ............................................. 52
Tabel 8. Diameter zona hambat kombinasi metabolit BAL pada masing-
masing perlakuan................................................................................... 55
Tabel 9. Rangkuman hasil variansi kombinasi metabolit BAL ............................ 56
Tabel 10. Diameter metabolit BAL sebelum dan sesudah dikombinasi ............... 58
Tabel 11. Kandungan asam laktat BAL (Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Pediacoccus
acidilactici, Pediacoccus pentosaceus).................................................. 59
Tabel 12. Berat Molekul dari Protein Standart (Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake,
Pediacoccus acidilactici, Pediacoccus pentosaceus) ............................. 62
vi
Tabel 13. Band-band protein BAL (Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Pediacoccus
acidilactici, Pediacoccus pentosaceus).................................................. 63
Tabel 14. Berat molekul dan pendugaan komponen protein bakteri asam
laktat dengan elektroforesis ...................................................................
vii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Bakteri E. coli (a) cwx.prenhall.com, (b)
www.ehagroup.com ............................................................................. 10
Gambar 2. Lactobacillus plantarum (www.genome.jgi-psf.org) ........................... 17
Gambar 3. Lactobacillus casei (www.genome.jgi-psf.org) .................................... 18
Gambar 4. Lactobacillus sake (www.genome.jgi-psf.org)..................................... 20
Gambar 5. Pediococcus acidilactici (www.genome.jgi-psf.org)............................ 22
Gambar 6. Pediococcus pentosaceus (www.genome.jgi-psf.org) .......................... 22
Gambar 7. Kerangka konsep penelitian................................................................. 36
Gambar 8. Prosedur persiapan bakteri Escherichia coli ........................................ 37
Gambar 9. Prosedur persiapan bakteri asam laktat (BAL)..................................... 37
Gambar 10. Prosedur uji daya hambat................................................................... 38
Gambar 11. Hasil elektroforesis BAL ................................................................... 61
viii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Data dan perhitungan BAL................................................................ 73
Lampiran 2. Data dan perhitungan metabolit BAL................................................ 77
Lampiran 3. Data dan perhitungan kombinasi metabolit BAL............................... 81
Lampiran 4. Hasil uji asam laktat.......................................................................... 85
Lampiran 5. Gambar uji tantang, data dan grafik pertumbuhan diameter zona hambat
BAL, metabolit BAL, dan kombinasi metabolit BAL ....................... 88
Lampiran 6. Gambar hasil pewarnaan gram bakteri Escherichia coli dan bakteri
asam laktat (Lactobacillus sake, Lactobacillus casei,
Lactobacillus plantarum, Pediacoccus pentosaceus, Pediacoccus
acidilactici) ..................................................................................... 91
i
BOIMIN. Uji Daya Hambat Bakteri Asam Laktat (Lactobacillus sake, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Pediacoccus pentosaceus, Pediacoccus acidilactici) Terhadap Pertumbuhan Escherichia coli Secara In Vitro (di bawah bimbingan Ir HAPPY NURSYAM, MS dan Ir YAHYA, MP).
RINGKASAN
Keamanan pangan (food safety) adalah keadaan pangan yang bebas dari resiko kesehatan disebabkan oleh kerusakan, pemalsuan dan kontaminasi baik oleh mikroba maupun senyawa kimia serta memenuhi kebutuhan spiritual. Akhir-akhir ini banyak terjadi peningkatan gangguan kesehatan saluran pencernaan (gastrointestinal maupun enterocolitis) akibat keracunan bahan pangan yang disebabkan oleh mikroorganisme patogenik yang termakan bersama bahan pangan yang tercemar. Salah satu bakteri yang sering mencemari perairan, menyebabkan kerusakan bahan pangan dan penyakit adalah Escherichia coli.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian bakteri asam laktat terhadap pertumbuhan E. coli secara in vitro dan untuk mengetahui kombinasi bakteri asam laktat yang mempunyai daya hambat terbesar.
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif dengan melakukan uji tantang (challenge test); bio-assay antara bakteri E. coli dan bakteri asam laktat.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian baktri asam laktat (BAL) berpengaruh sangat nyata terhadap pertumbuhan bakteri E. coli secara in vitro. Perlakuan yang mempunyai daya hambat terbesar adalah perlakuan Q; kombinasi metabolit Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus casei dengan rata-rata diameter zona hambat 0.900 ± 0.065 cm.
Berdasarkan hasil penelitian ini perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai dosis pengkombinasian yang tepat. Perlu penganalisaan yang lebih mendalam pada band protein dari bakteri asam laktat yang diduga berperan terhadap penghambatan pertumbuhan E. coli. Selain itu, juga perlu dilakukan pengkajian lebih lanjut mengenai kemampuan bakteri asam laktat dalam menghambat bakteri patogen lainnya serta pemanfaatan/aplikasinya pada produk pangan ikan.
ii
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Keamanan pangan (food safety) adalah keadaan pangan yang bebas dari resiko
kesehatan disebabkan oleh kerusakan, pemalsuan dan kontaminasi baik oleh mikroba
maupun senyawa kimia serta memenuhi kebutuhan spiritual (Wiranatakusumah, 1994).
Akhir-akhir ini banyak terjadi peningkatan gangguan kesehatan saluran pencernaan
(gastrointestinal maupun enterocolitis) akibat keracunan bahan pangan yang disebabkan
oleh mikroorganisme patogenik yang termakan bersama bahan pangan yang tercemar
(Buckle et al, 1985).
Air di alam mengandung cukup zat makanan untuk pertumbuhan populasi
kelompok-kelompok jasad renik khusus. Beberapa diantaranya menyebabkan penyakit
pada manusia; adanya kuman-kuman patogen dalam air menandakan suatu kontaminasi
dari tanah atau pembuangan tinja yang disengaja (Jawetz et al, 1986). Berbagai mikroba
patogen sering kali ditularkan melalui air yang tercemar sehingga dapat menimbulkan
penyakit kepada manusia maupun hewan (Lay, 1994).
Salah satu bakteri yang sering mencemari perairan, menyebabkan kerusakan
bahan pangan dan penyakit adalah Escherichia coli. Bakteri E. coli banyak ditemukan
pada produk perikanan karena produk perikanan memiliki kandungan protein yang
relatif tinggi, dengan kandungan air 50-80% yang menyebabkan produk perikanan
sangat rentan terhadap kerusakan mikrobiologis (Herawati, 2002). Sedangkan menurut
Sikorski et al (1998), Enterobacteriaceae sering ditemukan pada ikan yang berkadar air
tinggi.
2
E. coli dapat menyebabkan penyakit pada manusia antara lain yaitu Entero
Pathogenic Escherichia coli (EPEC), Entero Toxigenic Escherichia coli (ETEC) yang
dapat menghasilkan enterotoxin dalam usus kecil dan menyebabkan penyakit kolera, dan
Entero Invasive Escherichia coli (EIEC) dimana sel-sel E. coli mampu memembus
dinding usus dan menimbulkan colitis (radang usus besar) atau gejala seperti desentri
(Nurwantoro dan Siregar, 1997).
Untuk mengatasi penyakit tersebut biasanya diberikan antibiotika. Secara
sempit, antibiotik adalah zat kimia yang secara alamiah dihasilkan oleh organisme hidup
yang mampu menghambat organisme lain. Namun, kata ini sekarang sering digunakan
untuk menyebut semua obat kemoterapik antimikroba; baik yang diproduksi secara
alamiah, senyawa sintetik, atau antibiotik semi sintetik yang diciptakan dengan
memodifikasi obat-obat alami (misalnya klolisasilin dan ampisilin dihasilkan dari asam-
asam amino penisilat). Pada tahun 1998, Departemen Kesehatan menerbitkan
rekomendasi untuk dokter mengenai penggunaan antibiotik. Hal itu dilakukan karena
pemakaian/peresapan antibiotik yang tidak tepat sangat membahayakan; akan membantu
terbentuknya strain bakteri yang resisten terhadap antibiotik dan dapat menimbulkan
beberapa efek samping negatif (Davis, 1994 dalam Gould dan Brooker, 2003).
Cara lain yang digunakan untuk mengatasi penyakit yang disebabkan oleh E. coli
yaitu dengan penggunaan probiotik. Pada tahun 1989, Fuller mendefinisikan probiotik
(friendly bacteria) sebagai suplemen makanan yang berisi mikroba hidup yang
berpengaruh positif pada host dengan memperbaiki keseimbangan mikroba usus
(Yuniati, 2001). Menurut Conway (1996), golongan bakteri asam laktat (BAL) biasanya
dimanfaatkan sebagai probiotik.
3
Bakteri asam laktat terdiri dari setidaknya enam genus yang dibedakan ke dalam
empat genus. Genus-genus awal seperti Lactobacillus, Leuconostoc, Pediacoccus, dan
Streptococcus telah diperluas meliputi Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus dan
Vagococcus. Carnobacterium mempunyai strain yang diklasifikasikan sebagai
Lactobacilli dan tiga genus lain mempunyai strain yang diklasifikasikan sebagai
Streptococci (Jay, 1992). Berdasarkan hasil penelitian Kristianto (2005), salah satu jenis
bakteri yang memungkinkan dihambat pertumbuhannya oleh bakteri asam laktat adalah
E. coli.
Indonesia kaya akan produk-produk fermentasi yang dapat dipakai sebagai
sumber bakteri asam laktat. Sebelum digunakan sebagai probiotik, sebaiknya terhadap
isolat bakteri asam laktat dilakukan uji tantang (challenge test) dengan bakteri penyebab
penyakit. Dengan demikian akan diperoleh informasi bakteri unggul yang dapat
digunakan sebagai probiotik (Irianto dan Murniyati, 1999).
1.2 Rumusan masalah
Akhir-akhir ini banyak terjadi peningkatan gangguan kesehatan saluran
pencernaan (gastrointestinal maupun enterocolitis) akibat keracunan bahan pangan yang
disebabkan oleh mikroorganisme patogenik yang termakan bersama bahan pangan yang
tercemar. Salah satu bakteri yang sering mencemari perairan, menyebabkan kerusakan
bahan pangan dan penyakit adalah Escherichia coli.
Penggunaan obat-obatan dimasa krisis sangat tidak ekonomis karena harganya
yang relatif mahal, sehingga perlu dicari alternatif lain yang secara preventif mampu
mengatasi masalah penyakit bakterial yang disebabkan oleh Escherichia coli dengan
memanfaatkan bakteri probiotik, yakni bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat selain
4
menghasilkan asam laktat juga mempunyai kemampuan untuk menghasilkan senyawa-
senyawa tertentu yang menghambat pertumbuhan bakteri lain. Dari uraian di atas
muncul beberapa permasalahan yakni:
Apakah penambahan bakteri asam laktat (Lactobacillus casei, Lactobacillus
sake, Lactobacillus plantarum, Pediacoccus acidilactici dan Pediacoccus
pentosaceus) berpengaruh terhadap pertumbuhan Escherichia coli secara in
vitro?
Perlakuan bakteri asam laktat manakah yang mempunyai daya hambat paling
besar terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli secara in vitro?
1.3 Tujuan penelitian
Untuk mengetahui pengaruh penambahan bakteri asam laktat (Lactobacillus
casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum, Pediacoccus acidilactici dan
Pediacoccus pentosaceus) terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli secara
in vitro.
Untuk megetahui perlakuan bakteri asam laktat yang mempunyai daya hambat
terbesar terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli secara in vitro.
1.4 Kegunaan
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi awal mengenai
aktivitas antibakteri dari bakteri asam laktat (Lactobacillus casei, Lactobacillus sake,
Lactobacillus plantarum, Pediacoccus acidilactici dan Pediacoccus pentosaceus) dalam
menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli, serta dapat digunakan sebagai dasar
bagi penelitian selanjutnya.
5
1.5 Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Perikanan
Universitas Brawijaya Malang pada bulan Februari 2006.
7
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Keamanan Pangan Produk Perikanan
Keamanan pangan (food Safety) adalah keadaan pangan yang bebas dari
resiko kesehatan, pemalsuan, dan kontaminasi baik oleh mikroba atau senyawa
kimia serta memenuhi kebutuhan spiritual (Wiranatah kusumah, 1994).
Sedangkan menurut PP No. 28 Tahun 2004, keamanan pangan adalah kondisi dan
upaya yang diperlukan untuk mencegah pangan dari kemungkinan cemaran
biologis, kimia dan benda lain yang dapat mengganggu, merugikan dan
membahayakan kesehatan manusia. Persyaratan keamanan pangan adalah standar
dan ketentuan-ketentuan lain yang harus dipenuhi untuk mencegah pangan dari
kemungkinan adanya bahaya, baik karena cemaran biologis, kimia dan benda lain
yang dapat mengganggu, merugikan dan membahayakan kesehatan manusia
(Anonymous, 2004a).
Pada dekade terakhir ini, para konsumen mulai memperhatikan mutu dari
produk pangan sehingga faktor kesehatan dan keamanan pangan menjadi prioritas
utama (Anonymous, 2002a). Makanan adalah kebutuhan pokok manusia yang
secara langsung berperan meningkatkan kesehatan sehingga kita mampu
melakukan kegiatan sehari-hari dengan baik. Untuk itulah, higienisitas dan
keamanan pangan menjadi sangat penting agar tidak menimbulkan gangguan
kesehatan (Anonymous, 2000a).
Mikroorganisme juga merupakan salah satu penyebab kerusakan pangan.
Menurut Ray (1996), kerusakan bahan pangan ditandai dengan terjadinya
perubahan baik tekstur, akumulasi oleh gas, dan hilangnya cairan yang terkandung
8
dalam bahan pangan tersebut. Semua perubahan itu terjadi seiring dengan
pertumbuhan mikroorganisme pada bahan makanan tersebut.
Menurut Pelczar (1988), kandungan mikroorganisme pada suatu spesimen
pangan memberikan keterangan yang mencerminkan bahan mentahnya, keadaan
sanitasi pada pengolahan pangan tersebut, serta keefektifan metode
pengawetannya. Kebanyakan bahan makanan merupakan media yang baik untuk
pertumbuhan mikrobia. Pada keadaan fisik yang menguntungkan, terutama pada
kisaaran suhu 7o-60oC, organisme akan tumbuh dan menyebabkan terjadinya
perubahan dalam penampilan, rasa, bau serta sifat-sifaat lain pada bahan makanan.
Flora mikroba pada tiram, remis, ikan dan hasil perikanan lainnya
sebagian besar mencerminkan kualitas mikrobial perairan tempat ditangkapnya
hewan-hewan tersebut. Produk pangan yang berasal dari perairan yang tercemar
mikroorganisme, bila pengolahannya kurang sempurna dapat menyebabkan
infeksi bila dimakan (Pelczar, 1988).
2.2 Cemaran Mikrobia Pada Produk Perikanan
Aspek mikrobia mempunyai peranan yang sangat penting dalam penilaian
mutu produk pangan. Secara umum adanya mikrobia dalam produk pangan tidak
selalu merugikan atau membahayakan. Meskipun demikian, adanya kandungan
mikrobia dalam produk pangan haruslah dihadapi dengan waspada dan perlu
disadari arti pentingnya penanganan produk selanjutnya, agar infeksi penyakit dari
bahan pangan dapat dihindari (Soekarto, 1990).
Menurut Afrianti (2004), penyakit yang ditularkan melalui makanan akan
muncul setelah memakan makanan yang tercemar oleh mikroorganisme patogen.
Soekarto (1990) mengemukakan bahwa mikrobia pada produk perikanan terdiri
9
dari dua golongan besar yaitu mikrobia patogenik dan non patogenik. Mikrobia
patogenik sangat penting dalam kaitannya dengan mutu produk perikanan.
Mikrobia patogenik ini dapat dibagi menjadi tiga kelompok, yaitu: mikrobia fekal,
mikrobia yang berasal dari sampah rumah tangga, dan mikrobia non fekal.
Mikrobia yang banyak dijumpai pada produk perikanan dapat mengkontaminasi
pangan melalui tiga jalur, yaitu:
1. Kontaminasi mikrobia dari air dimana ia tinggal.
2. Kontaminasi dari bahan-bahan pembantu selama proses pengolahan
produk perikanan.
3. Kontaminasi dari manusia yang mengolah produk perikanan tersebut.
Koliform merupakan salah satu mikrobia yang dominan dalam produk
perikanan. Koliform dapat menyebabkan sakit perut dengan gejala spesifik yaitu
mencret, panas dan badan lemah. Koliform sering terdapat dalam saluran
pencernaan manusia tanpa menyebabkan yang bersangkutan sakit, orang yang
demikian disebut pembawa kuman, mereka menjadi reservoir koliform dan juga
sumber penularan atau pencemaran. Orang yang daya tahan tubuhnya menurun,
akan menjadi rentan terhadap koliform jika terkena infeksi melalui makanan
(Soekarto, 1990).
Sampah rumah tangga juga dapat menjadi sumber pencemaran mikrobia
pada produk perikanan (Connell, 1995). Produk-produk perairan seperti ikan,
udang, kerang dan sebagainya mempunyai potensi besar sebagai penyebab
keracunan makanan. Meskipun makanan-makanan hasil laut langsung dikonsumsi
setelah ditangkap, tetapi kontaminasi oleh bakteri patogen dapat terjadi selama
penangkapan, penanganan, dan pengolahan. Beberapa cemaran mikrobia yang
10
patut dicurigai antarra lain: Salmonella sp., Shigella sp., dan E. coli (Fardiaz,
1992).
2.3 Escherichia coli
Escherichia coli termasuk famili enterobactericeae merupakan gram
negatip yang berbentuk batang, fakultatif aerobik, tidak berspora, peritric flagella,
dan tidak motil. Bakteri ini dapat tumbuh cepat dengan waktu regenerasi rata-rata
29 menit pada kisaran suhu 30-40oC, pH 7.0-7.5 dan aW 0.96, tumbuh lambat pada
suhu 44-45oC dan tidak tumbuh pada suhu 10oC dan 45.5oC selama 48 jam
(Radiati, 2002).
1 (a) 1 (b)
Gambar 1. Bakteri E. coli (a) cwx.prenhall.com, (b) www.ehagroup.com
Sedangkan menurut Fardiaz (1992), bakteri E. coli termasuk dalam
enterobactericeae, berbentuk batang dan tidak membentuk spora. E. coli mampu
memfermentasi laktosa dengan memproduksi asam dan gas, mereduksi nitrat
menjadi nitrit, bersifat katalase positif dan oksidasi negatif.
Banyak jenis mikrobia yang mempunyai habitat pada saluran pencernaan.
Beberapa diantaranya termasuk patogen, yaitu: Escherichia, Proteus, Salmonella,
Shigella, Staphylococcus. Dalam jumlah yang lebih kecil, mikrobia ini tidak
menyebabkan gangguan penyakit yang gawat. Akan tetapi jika jumlah dalam
11
tubuh manusia besar, maka akan menyebabkan penyakit, seperti gangguan perut
dan pencernaan lainnya (Soekarto, 1990).
Menurut Jawetz et al (2001), Escherichia coli diklasifikasikan sebagai
berikut:
Kingdom : Prokaryotae
Divisi : Gracilicutes
Klas : Scotobacteria
Ordo : Eubacteriales
Famili : Enterobactericeae
Genus : Escherichia
Spesies : Escherichia coli
Meski sebagai penghuni normal usus manusia atau hewan, ada juga
beberapa E. coli yang bersifat patogen. Tetapi keberadaannya sangat kecil
dibandingkan dengan total populasi E. coli (Ahmed, et al., 1995). Menurut Silk, et
al (1997), jenis-jenis E. coli patogen terbagi atas empat kelompok besar, yaitu:
a. Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)
Paling banyak ditemukan pada bayi dan kejadian yang paling tinggi
pada tempat yang memiliki sanitasi rendah. Sumber terbesar adalah air dan
makanan yang terkontaminasi serta pembawa bakteri tersebut. Kebutuhan
menginfeksi 106 sampai 109 sel yang nampak serta sensitif terhadap pH
rendah. Gejala utama adalah gastroentritis dengan serangan awal terjadi pada
saat 72 jam dan durasi rata-rata berkisar 24 jam.
12
b. Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)
Merupakan penyebab diare pada bayi dan anak-anak di pemukiman
yang bersanitasi rendah. Penyebarannya melalui air dan makanan
terkontaminasi. Kebutuhan untuk menginfeksi sebanyak 106 sampai 109 sel
yang nampak serta sensitif terhadap pH rendah. Gejala seperti kholera ringan
dengan serangan awal terjadi pada 48 jam dan durasi rata-rata serangan tiga
hari atau lebih. Memproduksi toksin serta adanya faktor-faktor adhesif
(spesifik pada manusia).
c. Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC)
Jenis ini membawa faktor-faktor invasif khususnya manusia, dimana
sel-selnya mampu mempenetrasi dan merusak jaringan mukosa.
Penyebarannya melalui air dan makanan yang terkontaminasi dan karier.
Kebutuhan untuk menginfeksi sebanyak 106 sel yang hidup dan sensitif pada
pH rendah. Gejalanya adalah seperti desentri Shigella ringan (tanpa
pendarahan). Durasi waktu serangan berkisar antara 3 sampai 7 hari.
d. Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)
Kelompok ini menyebabkan diare pendarahan berat (hemorrhagic
colitis) dan HUS (Hemorrhagic Urenic Syndrome) pada manusia. Insiden
utama oleh jenis E.coli O157:H7, yang memproduksi racun SLTs (Shiga Like
Toxins). Toksin tersebut dapat merusak usus besar sehingga terjadi
pendarahan dan juga merusak pembuluh darah pada ginjal. Dosis infeksinya
10 sampai 100 sel hidup. Gejalanya terjadi 1-2 hari.
Menurut Soekarto (1990), koliform adalah jasad renik yang biasa tinggal
dan berbiak dalam sistem pencernaan manusia/hewan. Mikrobia ini tetap berbiak
13
dalam alam bebas, terbawa oleh air yang mengandung kotoran/tercemar oleh
kotoran manusia. Koliform dapat pula terbawa dalam cairan kotoran rumah tangga
(sewage system). Dengan demikian koliform dapat digunakan sebagai petunjuk
adanya pencemaran / polusi yang berasal dari kotoran manusia.
Koliform sering digunakan sebagai indikator sanitasi makanan, sebab
makanan dikatakan bersih dan sehat jika sanitasinya bagus dan terbebas dari jenis
bakteri koliform yang sifatnya patogen (Brock et al., 1994).
Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam
pangan menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh
kotoran manusia. Bakteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah bakteri yang
lazim terdapat dan hidup pada usus manusia. Jadi, adanya bakteri tersebut pada air
atau makanan menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan air
atau makanan pernah menggalami kontak dengan kotoran yang berasal dari usus
manusia, oleh karenanya mungkin mengandung bakteri patogen lain yang
berbahaya. Sampai saat ini ada tiga jenis bakteri yang dapat digunakan untuk
menunjukkan adanya masalah sanitasi, yaitu: E. coli, kelompok Streptococcus
(Enterococcus) fekal, dan Clostridium perferingens (Pelczar and Chan, 1986).
Ciri penting suatu organisme indikator menurut menurut Pelczar and Chan
(1988), adalah:
a. Terdapat dalam air tercemar dan tidak ada dalam air tidak tercemar.
b. Berkolerasi jumlahnya dengan kadar polusi.
c. Mempunyai kemampuan bertahan hidup lebih besar daripada patogen.
d. Mempunyai sifat yang seragam dan mantap.
e. Tidak berbahaya bagi manusia dan hewan.
14
f. Terdapat dalam jumlah yang lebih banyak dari bakteri patogen.
g. Mudah dideteksi dengan teknik-teknik laboratorium yang sederhana.
2.4 Probiotik
Konsep probiotik sudah dikenal sejak lama, akan tetapi baru awal abad ke-
19 probiotik dibuktikan secara ilmiah oleh Ellie Metchnikoff, seorang ilmuwan
Rusia yang bekerja di Institut Pasteur, Paris (Anonymous, 2001). Probiotik
pertama kali dicetuskan oleh Lily dan Stiwel pada tahun 1965, untuk menyatakan
efek stimulasi pertumbuhan dari suatu organisme terhadap mikroorganisme lain
(Hoover, 1993). Lily dan Stiwel mendeskripsikan probiotik sebagai suatu
protozoa yang merangsang pertumbuhan bakteri yang lain dengan kata lain
melawan antibiotik (Soeharsono, 1998). Tahun 1974, Parker mendefinisikan
probiotik sebagai pelengkap makanan yang berisi organisme dan zat kimia disini
tidak termasuk suplemen kimia seperti antibiotik. Pada tahun 1989, Fuller kembali
mendefinisikan probiotik sebagai suplemen makanan yang berisi mikroba yang
hidup yang berpengaruh positif pada host dengan memperbaiki keseimbangan
mikroba usus. Probiotik atau yang sering disebut friendly bacteria dapat
ditemukan di mulut, usus dan vagina (Yuniati, 2001).
Selain probiotik, juga dikenal prebiotik dan synbiotik. Prebiotik adalah
karbohidrat yang dapat dicerna oleh bakteri; seperti serat pangan, yang
merangsang pertumbuhan atau aktivitas probiotik dalam kolon. Prebiotik
merupakan makanan atau nutrisi yang diperlukan oleh bakteri tertentu yang
ditambahkan ke dalam makanan agar bakteri dapat tumbuh dan berkembang biak
di usus, sehingga keseimbangan flora di usus tetap terjaga. Contohnya
penambahan karbohidrat khusus seperti oligosakarida atau inulin pada diet
15
normal, maupun meningkatkan Bifidobacterium ditractus intestinal. Sedangkan
synbiotik adalah makanan yang berisi mikroorganisme probiotik dan prebiotik.
Kemampuan untuk tetap hidup, bereproduksi dan tumbuh suatu mikroorganisme
dirangsang oleh prebiotik. Synbiotik mempunyai pengaruh positif pada host;
dengan memperbaiki kelangsungan hidup probiotik di gastrointestinal atau
merangsang pertumbuhan / aktivitas metabolisme bakteri bermanfaat, sehingga
mampu menyejahterakan host (Anonymous, 2000b).
2.5 Bakteri Asam Laktat.
Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri dimana metabolisme
karbohidratnya menghasilkan produk utama asam laktat, tidak mereduksi nitrit
menjadi nitrat, suhu optimum pertumbuhan antara 20-40oC. Sifat-sifat khusus
bakteri asam laktat adalah mampu tumbuh pada kadar gula tinggi (sampai 55-60%
untuk Leuconostoc mesentroides), tumbuh pada pH 3,8-8,0 serta mampu
menfermentasi berbagai monosakarida dan disakarida (Frazier dan Weshoff,
1978; Stamer, 1979).
Sifat umum bakteri asam laktat adalah mikroorganisme berbentuk batang
dan bulat yang mempunyai karakteristik umum misalnya reaksi gram positif, tidak
membentuk spora, biasanya non motil, tidak memproduksi pigmen, memberikan
reaksi katalase negatif dan memproduksi asam laktat sebagai produk akhir dari
fermentasi karbohidrat. Umumnya bakteri asam laktat membutuhkan nutrisi
lengkap dan pertumbuhannya anaerobik atau mikroaerofilik. Bakteri ini bersifat
anaerob tetapi aerotoleran.
16
Menurut Djafar (1997) dikutip dari Irianto dan Murniyati (1999), berdasar
morfologinya bakteri asam laktat dibedakan atas dua familia, yaitu
Lactobacillaceae yang berbentuk batang dan Stretococaceae yang berbentuk
bulat. Familia Lactobacillaceae terdiri atas dua genus Streptococcus,
Leuconostoc, dan Pediococcus. Sedangkan secara fisiologis bakteri asam laktat
dibagi menjadi dua golongan yaitu homofermentatif dan heterofermentatif.
Bakteri asam laktat yang bersifat mampu mengkonversi glukosa menjadi asam
laktat lebih dari 85% dari total asam. Sedangkan bakteri asam laktat yang bersifat
heterofermentatif hanya menghasilkan asam laktat sebanyak 50% dari total asam.
Disamping itu bakteri asam laktat heterofermentatif juga menghasilkan produk
akhir berupa alkohol, asam asetat dan gas CO2.
Potensi bakteri asam laktat yang lain adalah kemampuan untuk
menghasilkan senyawa-senyawa tertentu selain asam laktat yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri lain yang tidak dikehendaki.
2.5.1 Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum merupakan bakteri berbentuk batang, gram
positif dan sering membentuk pasangan dan rantai-rantai dari selnya. Jenis ini
umumnya lebih tahan terhadap keadaan asam daripada jenis Pseudococcus atau
Streptococcus. L. plantarum yang ditumbuhkan diatas media selektif pada kondisi
pH 6 dapat menghasilkan kultur filtrat antibiotik yang bersifat bakterisidal
(Schrooder et al, 1987 dalam Happy dkk, 2001).
L. plantarum biasanya tidak terdapat pada perairan laut. Bakteri ini
kemungkinan dapat tumbuh di ikan atau kerang-kerangan yang busuk pada
kondisi anaerobik. L. plantarum diketahui dapat menghambat pertumbuhan
17
bakteri perusak dan patogen dalam bahan pangan. Penghambatan tersebut
disebabkan produksi sejumlah senyawa anti mikroba oleh bakteri asam laktat,
seperti asam laktat, hydrogen peroksida dan bakteriosin (Lindgreen dan Dobrogos,
1990 dalam Happy et al, 2001).
Menurut Dwijoseputro (1998), klasifikasi bakteri Lactobacillus plantarum
adalah sebagai berikut:
Divisio : Prothopyta
Class : Schizomycetes
Ordo : Eubacteriales
Famili : Lactobacillaceae
Genus : Lactobacillus
Species : Lactobacillus plantarum
Gambar 2. Lactobacillus plantarum (www.genome.jgi-psf.org)
2.5.2 Lactobacillus casei
Lactobacillus casei merupakan bakteri gram positif, anaerob fakultatif,
non motil tidak membentuk spora, berbentuk batang (sel berukuran antara 0,7-1,1
x 2,0-4,0 mikrometer). L. casei tahan asam, menghasilkan asam laktat sebagai
hasil akhir fermentasi. L. casei merupakan organisme fakultatif homofermentatif
yang memproduksi asam laktat dari heksosa melalui jalur Embden Meyer Houff
dan merombak pentosa melalui jalur fosfoglukonat/fosfoketolase. L. casei telah
18
diisolasi dari produk-produk susu, produk tanaman segar maupun fementasi dan
juga dari saluran pencernaan dan beberapa hewan. Dalam industri, L. casei telah
diaplikasikan sebagai probiotik, sebagai kultur starter produksi asam untuk susu
fermentasi dan khususnya sebagai agen penguat flavour dalam beberapa varietas
keju (Anonymous, 2004).
Bakteri ini tumbuh baik pada suhu 15-41oC pada pH 3,5 atau lebih rendah.
Kondisi pertumbuhan optimum pada suhu 37oC dan pH 6,8 dan apabila digunakan
dala produk susu fermentasi, waktu inkubasi yang diperlukan adalah 24 jam pada
suhu tersebut (Ferrero et al, 1986).
Menurut Dwijoseputro (1998), klasifikasi bakteri Lactobacillus casei
adalah sebagai berikut:
Divisio : Prothopyta
Class : Schizomycetes
Ordo : Eubacteriales
Famili : Lactobacillaceae
Genus : Lactobacillus
Species : Lactobacillus casei
Gambar 3. Lactobacillus casei (www.genome.jgi-psf.org)
Yamaguci (2001) dalam Yuniati (2001), mengemukakan bahwa L. casei
mempunyai tiga peranan yaitu:
19
• Membantu menormalkan keseimbangan mikroflora intestinal
• Membantu mengatur gerakan peristaltik usus besar
• Membantu mereduksi produksi zat yang merugikan oleh bakteri patogen
L. casei juga memproduksi zat antagonistik yang menghambat tumbuhnya
mikroba lain. Zat-zat tersebut diantaranya asam laktat, H2O2, diasetil, nissin dan
bakteriosin (Yuki, 2001).
2.5.3 Lactobacillus sake
Kelompok bakteri Lactobacillus mempunyai ciri-ciri; selnya batang
panjang dan tipis, kadang-kadang batang lengkung sampai pendek, tidak bespora,
merupakan gram positif, metabolisme fermentasi adalah asam laktat,
mikroaerofilik, reduksi nitrat, katalase dan sitokrom negatif, kebutuhan nutrisi
lengkap (asam amino, peptida, derivat asam nokleat, vitamin, garam, asam
lemak), suhu pertumbuhan 2-53oC dan suhu optimal 30-40oC, pH optimal 5,5-6,2
kadang-kadang pH 5 atau lebih rendah, terdapat pada susu, produk ikan, wine, bir,
air buah, juice buah, pikle sayuran, sauerkraut, silase, obligat heterofermentatif,
obligat homofermentatif dan fakultatif heterofermentatif (Sneath et al, 1986).
Dalam Fardiaz (1992), spesies jenis Lactobacillus banyak yang dapat
mensintesis vitamin sehingga digunakan dalam analisa vitamin, dan banyak yang
bersifat termodurik yaitu tahan suhu pateurisasi. Lactobacillus sering ditemukan
pada makanan, misalnya sayuran (berperan dalam fermentasi pickel) dan pada
susu serta produk susu. Lactobacillus mempunyai sifat-sifat yang menjadikan
bakteri ini penting dalam mikrobiologi pangan yaitu:
• Dapat memfermentasi gula dengan menghasilkan asam laktat sehingga
dapat digunakan dalam produksi makanan-makanan fermentasi.
20
• Lactobacilli heterofermentatif memproduksi gas dan senyawa-senyawa
volatile lainnya yang penting sebagai pembentuk cita rasa dalam makanan-
makanan fermentsi.
• Ketidakmampuan untuk mensintesis vitamin-vitamin yang dibutuhkan
menyebabkan bakteri ini tidak dapat tumbuh pada makanan-makanan yang
kandungan vitaminnya rendah.
• Sifat ketahanan panas atau termodurik dari kebanyakan spesies
Lactobacilli yang tumbuh pada suhu tinggi menyebabkan bakteri ini tahan
terhadap proses pasteurisasi.
Menurut Dwijoseputro (1998), klasifikasi bakteri Lactobacillus sake
adalah sebagai berikut:
Divisio : Prothopyta
Class : Schizomycetes
Ordo : Eubacteriales
Famili : Lactobacillaceae
Genus : Lactobacillus
Species : Lactobacillus sake
Gambar 4. Lactobacillus sake (www.genome.jgi-psf.org)
21
2.5.4 Pediococcus acidilactici
Pediococcus merupakan bakteri gram positif, katalase, berbentuk bulat dan
oksidase negatif. Pediococcus rentan terhadap penicillin dan ampicillin juga
resisten terhadap vancomycin. Pediococcus sering ditemukan pada fermentasi
sayur, beer dan silase. Pediococcus acidilactici tumbuh dalam media MRS (De
Man, Rogosa and Sharpe) broth yang termodifikasi dengan komposisi 2,0%-5,0%
glukosa, dimana produksi asam yang tertinggi diperoleh dari MRS broth yang
mempunyai pH konstan yaitu pada kisaran pH 5 (Anna and Torres,1998) .
Menurut Dwijoseputro (1998), klasifikasi bakteri Pediococcus acidilactici
adalah sebagai berikut:
Divisio : Prothopyta
Class : Schizomycetes
Ordo : Eubacteriales
Famili : Lactobacillaceae
Genus : Pediococcus
Species : Pediococcus acidilactici
Pediocin yang dihasilkan Pediococcus acidilactici merupakan suatu zat
antimikroba yang dipengaruhi suhu dan lebih aktif pada kisaran pH 5. Dimana
pediocin tidak efektif dalam mempengaruhi makanan tapi dimungkinkan dapat
mempengruhi proteolyne dan komponen makanan seperti garam, asam, protein
dan lemak. Optimasi pertumbuhan P. acidilactici pada suhu 37oC selama 18 hari
dalam MRS broth (Annonymous, 2000).
22
Gambar 5. Pediococcus acidilactici (www.genome.jgi-psf.org)
2.5.5 Pediococcus pentosaceus
Pediococcus pentosaceus merupakan bakteri gram positif, fakultatif
anaerobik, non motil dan tidak membentuk spora. Termasuk dalam anggota
bakteri asam laktat untuk kepentingnan industri. Seperti bakteri asam laktat
lainnya, P pentosaceus toleran terhadap asam, tidak mensintesis porphyrins dan
memiliki metabolisme fermentasi yang cepat dengan asam laktat sebagai hasil
akhir dari metabolisme utama. P. pentosaceus merupakan organisme fakultatif
homofermentatif yang memproduksi asam laktat dari heksosa melalui jalur
Embden Meyer Houff dan merombak pentosa melalui jalur
fosfoglukonat/fosfoketolase. Optimasi pertumbuhan bakteri P. pentosaceus pada
suhu 40oC diantara pH 4,5-8,0 dalam 9-10% NaCl, mampu menghidrolisa
arginine dan memanfaatkan maltosa juga memproduksi pseudokatalase
(Anonymous,2006).
Gambar 6. Pediococcus pentosaceus (www.genome.jgi-psf.org)
23
Menurut Dwijoseputro (1998), klasifikasi bakteri Pediococcus acidilactici
adalah sebagai berikut:
Divisio : Prothopyta
Class : Schizomycetes
Ordo : Eubacteriales
Famili : Lactobacillaceae
Genus : Pediococcus
Species : Pediococcus pentosaceus
P. pentosaceus diisolasi dari bermacam-macam material tumbuhan dan
bakteri pembuat keju. Merupakan bakteri yang digunakan sebagai awal produksi
asam laktat dalam fermentasi kecap, mentimun, kacang hijau dan silase. P.
pentosaceus merupakan jenis mikroflora non starter dan digunakan dalam varietas
keju dalam proses fermentasi (Anonymous, 2004).
2.6 Bakteri Asam Laktat Sebagai Probiotik
Bakteri Assam laktat (BAL) berdasarkan metabolisme dan produk
akhirnya digolongkan menjadi dua yaitu heterofermentatif dan homofermentatif,
bersifat katalase negatif, membutuhkan nutrisi dan karbohidrat, asam amino,
derivat asam nukleat, peptida dan vitamin, tahan terhadap asam, tidak dapat
mereduksi nitrat, hidup dalam kondisi mikroaerofilik sampai anaerobik dan hidup
pada temperatur 15oC - 45oC (Brock et al., 1994). Pada Tabel 1. disajikan
berbagai macam tipe probiotik dan bakteri probiotik yang umum digunakan.
24
Tabel 1. Tipe probiotik dan bakteri probiotik yang umum digunakan.
Probiotik Bakteri Produk-produk susu fermentasi (yogurt, buttermilk, susu asidofilus, dan lain-lain)
Lab. Bulgaricus, Str. Thermophilus, Leu. Mesenteroides, Lab. Acidophilus, Lab. Casei, Bifidobacteria spp., Lab. reuteri
Pangan yang disuplementasi (susu pasteurisasi, minuman-minuman)
Lab. Reuteri, Bifidobacteria spp., Lab. Acidophilus, Str. Thermophilus, Lab. bulgaricus
Pharmaceuticals (tablet, kapsul, granula)
Lab. Bulgaricus, Lab. Acidophilus, Bifidobacteria spp.
Produk-produk health food (cairan, kapsul, bubuk)
Lab. Acidophilus, Bifidobacteria spp., Lactobacillus spp.
Sumber: Prangdimurti (2001)
Golongan bakteri asam laktat yang dimanfaatkan sebagai probiotik
biasanya berasal dari genus Lactobacillus sp, Bifidibacterium sp, Enterococcus sp,
Streptococcus sp, dan jamur yaitu dari golongan Saccharomyces sp (Conway,
1996).
Sebagai probiotik, BAL mempunyai beberapa keuntungan antara lain:
1. BAL menghasilkan antibiotik seperti acidhopilin dan lactocidin pada L.
acidophilus, lactocin pada L. plantarum dan diniplococcin pada
streptococci serta lactoperoxidase tyocyanate pada L. lactis yang bersififat
menghambat aktivitas dari mikroorganisme patogen seperti Salmonella,
Shigella, Enteropathoggenic E. coli dan Staphylococcus (Fox, 1988).
2. BAL menghasilkan hydrogen peroksida (H2O2) yang mematikan bakteri
patogen (Fuller, 1992). Hidrogen peroksida dapat menghambat
pertumbuhan bakteri dengan berbaagai cara yaitu melalui pemecahan
struktur dasar molekul-molekul asam nukleat atau protein sel (Jin, et al.,
1996).
3. Metabolisme BAL membuat lingkungan saluran pencernaan tetap dalam
kondisi pH rendah karena kemampuannya dalam menghasilkan asam
25
organik (Nousiainen dan Setela, 1993), sehingga secara ekologis akan
menggeser mikroorganisme yang tidak menguntungkan yang tidak tahan
asam (Ostling et al., 1993).
4. BAL memberikan efek positif terhadap pertumbuhan dan kesehatan karena
kemampuannya dalam mengatur pertumbuhan bakteri patogen dengan
sifat antagonisnya (Gilliand, 1989).
Selain itu, dalam metabolismenya BAL juga efektif dalam pengaturan
metabolisme kolesterol melalui produksi anti kolesterik, pengaturan asam
lambung dan mereduksi komponen berbahaya dalam usus dan BAL juga dapat
melengkapi endegenous flora di dalam usus sehingga meningkatkan
immunoglobin dan aktivitas terhadap bakteri patogen (Nousiainen dan Setela,
1993).
Keuntungan penggunaan BAL untuk industri menurut Vuyust dan
Vandamme (1994) adalah sifatnya yang non patogenik, tidak membentuk toksin
atau memproduksi toksin, mikroaerofilik dan aerotoleran sehingga membutuhkan
proses fermentasi yang sederhana, dapat tumbuh dengan cepat, dapat
memfermentasi berbagai substrat yang murah dan pertumbuhannya mampu
mencegah pembusukan dan kontaminasi oleh mikroba lain serta dapat
memproduksi bakteriosin.
2.7 Aktivitas Antimikroba
Kehadiran bahan antimikroba pada permulaan abad ke 20 memberikan
andil dalam memperpanjang dan memperbaiki kualitas hidup manusia. Obat
antimikroba banyak digunakan di negara berkembang dimana angka infeksi masih
sangat tinggi ditemukan. Obat antimikroba membunuh dan menghambat
26
pertumbuhan mikrobiologi yang membahayakan tanpa merusak sel host (Ryan,
1994).
Menurut Firegold dan Baron (1986), antibiotik merupakan substansi atau
zat yang diproduksi oleh mikroorganisme (seperti bakteri, jamur actinomycetes)
yang dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme lain dan pada akhirnya
membunuh mikroorganisme tersebut. Antibiotik adalah suatu bahan antimikrobial
yang dihasilkan mikrorganisme hidup (Lay, 1994).
Aktivitas mikroba dari bakteri asam laktat berkaitan dengan adanya asam
organik (asam laktat, asam asetat dan asam formiat), hydrogen peroksida dan
bakteriosin yang dihasilkan, antibakteri ini dapat menghambat pertumbuhan
berbagai spesies bakteri perusak maupun bakteri patogen pada makanan seperti
Listeria monocytogenesis, Staphylococu aureus, dan Clostridium botulinum
(Marrug, 1991 dikutip dari Irianto dan Murniyati, 1999). Bakteriosin diproduksi
oleh bakteri asam laktat yang secara intensif telah dipelajri dalam grup N-
Streptococcus spp dan Lactobacillus spp. Ada beberapa bukti dari kemampuan
untuk menghambat bakteri patogen (Carminatt et al, 1989 dikutip dari Yahya,
1996).
Menurut Pelczar dan Chan (1986), mekanisme kerja antimikroba dapat
ditinjau melalui struktur serta komposisi sel bakteri sehingga akan terjadi
kerusakan dari salah satu situs yang dapat mengawali terjadinya perubahan-
perubahan yang menuju pada matinya sel. Perubahan-perubahan tersebut antara
lain:
27
• Kerusakan pada dinding sel
Dinding sel merupakan penutup lindung bagi sel dan juga ikut berpartisipasi
dalam proses fisiologis tertentu. Struktur dinding sel dapat dirusak dengan
cara menghambat pembentukannya atau mengubahnya setelah selesai
terbentuk.
• Perubahan permeabilitas sel
Membran sitoplasma mempertahankan bahan-bahan tertentu didalam sel
serta mengatur aliran keluar masuknya bahan-bahan lain. Membran
memelihara integritas komponen-komponen selular. Kerusakan pada
membran ini mengakibatkan peningkatan permeabilitas dan terjadi
kebocoran sel yang diikuti dengan keluarnya materi seluler sehingga dapat
menyebabkan terhambatnya pertumbuhan sel atau matinya sel.
• Perubahan molekul protein dan asam nukleat
Hidupnya suatu sel bergantung pada terpeliharanya molekul-molekul protein
dan asam nukleat dalam keadaan alamiyah. Suatu kondisi atau substansi
yang mengubah keadaan ini, yaitu mendenaturasikan protein dan asam-asam
nukleat dapat merusak sel tanpa dapat diperbaiki kembali. Suhu tinggi dan
konsentrasi yang pekat juga dapat mengakibatkan koagulasi irreversibel
komponen-komponen selular sel ini.
• Penghambatan sintesis asam nukleat dan protein
DNA, RNA dan protein memegang peranan penting didalam proses
kehidupan normal sel. Hal itu berarti bahwa gangguan apapun yang terjadi
pada pembentukan atau pada fungsi zat-zat tersebut dapat mengakibatkan
kerusakan total pada sel.
28
Sedangkan menurut Jawetz et al (2001), penghambatan yang dilakukan zat
antimikroba meliputi 5 hal yaitu: merusak DNA, denaturasi protein, gangguan
dinding dan membran sel., pemindahan kelompok-kelompok sulfidril bebas, serta
antagonisme kimia.
2.8 Uji efektifitas Antimikroba in vitro
In vitro merupakan suatu kegiatan pengujian pertumbuhan bakteri atau
mikroorganisme dalam suatu media yang telah dikondisikan sesuai dengan tujuan
pengamatan. Menurut Volk dan Wheeler (1993), in vitro berasal dari bahasa
Yunani yang berarti dalam gelas dan jika diartikan adalah suatu pengujian
mikrobiologis dalam tabung uji atau wadah gelas lainnya yang telah diberi media
atau perlakuan tertentu.
Aktivitas anti jasad renik diukur in vitro agar dapat ditentukan potensi
suatu zat antijasad renik dalam larutan konsentrasinya dalam cairan badan dan
jaringan, dan kepekatan suatu jasad renik terhadap konsentrasi-konsentrasi obat
yang dikenal (Jawetz et al, 1986).
Kerentanan suatu mikroorganisme terhadap antibiotik dan zat
kemoterapeutik lain dapat ditentukan dengan teknik “pengenceran tabung” (tube
dilution) atau dengan teknik cawan “piringan kertas” (paper disk plate) (Pelczar et
al., 1986).
Pada penelitian uji daya hambat pada bakteri Escherichia coli
menggunakan teknik cawan “piringan kertas”. Dimana metode cawan piringan
kertas merupakan teknik yang paling umum dipakai untuk menetapkan kerentanan
mikroorganisme terhadap zat kemoterpeutik (Pelczar et al, 1986).
29
Uji ini diperkenalkan oleh Willian Kirby dan Alfred Bauer pada tahun
1966. Pada uji lempengan agar disemai dengan mikroorganisme penguji. Cakram
yang berisi zat antimikroba diletakkan diatas lempengan agar yang telah disemai
dengan mikroorganisme penguji. Penghambatan pertumbuhan mikroorganisme
oleh zat anti mikroba terlihat jelas sebagai wilayah jernih disekitar cakram (Lay,
1994).
Besar hambatan yang terbentuk akan terlihat sebagai daerah yang tidak
memperlihatkan adanya pertumbuhan kuman disekitar kertas cakram. Lebar
daerah hambatan tergantung pada daya serap obat ke dalam agar dan kepekaan
kuman terhadap obat tersebut (Bonang dan Koeswardono, 1982).
Menurut Pelczar dan Reid (1958), antibiotik yang berpotensi untuk
menghambat pertumbuhan mikroorgaisme dapat diketahui secara kimia, biologi,
dan fisika. Pada metode chemical assay antibiotik yang digunakan dalam bentuk
kimia murni yang dapat diketahui kekuatan penghambatannya dalam mikrogram
pada tiap kimia murni per miligram spesimen. Chemical assay cenderung
digunakan dalam menguji antibiotik sintetis atau zat kemoterapeutika. Selain itu,
terdapat metode bio-assay dimana potensi antibiotik diukur berdasarkan
mikrogram dikurangi unit determinasi dengan membandingkan jumlah bakteri
yang terbunuh atau efek bakteriostatik dari organisme tersebut dengan standart
yang digunakan dalam kontrol. Adapun kelebihan dari chemical assay adalah
lebih akurat dan waktu yang diperlukan tidak lama dibandingkan dengan bio-
assay tetapi kurang sensitif karena dapat meyebabkan degradasi produk yang pada
akhirnya dapat merusak produk tersebut.
30
3.MATERI DAN METODE PENELITIAN
3.1 Materi
3.1.1 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain biakan murni
bakteri Escherichia coli IFO 3301 (Institute of Fermentation Osaka) Jepang, biakan
murni bakteri asam laktat Lactobacillus casei NRRL B-1922 (ARS Culture
Collection, Northern Regional Research) Amerika, Lactobacillus sake FNCC 246
(Food and Nutrition Culture) Inter University Center of Food and Nutrition Gadjah
Mada University, Yogyakarta, Lactobacillus plantarum JCM 1149 (Japan Collection
of Microorganism) Jepang, Pediococcus acidilactici 0110 < -TAT-1 (Djaafar, 1994,
egg plant pickle-asinan terong), dan P. pentosaceus 0094 < -TGA-3 ( Djaafar, 1994,
fermented dried cassava-gatot) yang dibeli dari Laboratorium Pusat Antar
Universitas (PAU) Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Bahan yang digunakan sebagai media pertumbuhan adalah NB (Nutrient
Broth), BHI (Brain Head Infusion), MRS (De Man Rogosa and Sharpe), MRS broth,
EMB (Eosin Methylen Blue). Bahan-bahan lain yang digunakan yaitu kertas cakram,
kapas, tisu, plastik, aquades, spiritus dan alkohol 70%.
3.1.2 Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian yakni: petridish, tabung reaksi, rak
tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, pipet tetes, jarum ose, bunsen, inkubator,
autoclave, lemari pendingin, mikroskop, pipet ukur, jangka sorong, pinset, karet
penghisap, timbangan elektrik, dan sebagainya.
31
3.2 Metode penelitian
Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode
deskriptif. Metode deskriptif menurut Nazir (1988), adalah suatu metode dalam
meneliti suatu kelompok, suatu kondisi, suatu sistem/kelas peristiwa pada masa
sekarang. Tujuan metode ini adalah untuk menggambarkan secara sistematis, faktual,
dan akurat mengenai fakta-fakta, sifat-sifat hubungan antara fenomena-fenomena
yang diselidiki.
Penelitian deskriptif adalah penelitian yang berupaya untuk mengungkapkan
suatu masalah dan keadaan sebagaimana adanya sehingga hanya mengungkapkan
fakta-fakta, serta tidak menggunakan dan tidak melakukan pengujian hipotesa.
Penelitian yang bersifat deskriptif bertujuan untuk menggambarkan secara tepat sifat-
sifat suatu individu, keadaan, gejala atau kelompok tertentu, untuk menentukan
frekuensi atau penyebaran suatu gejala (Koentjoroningrat, 1986).
3.2.1 Variabel Penelitian
Variabel penelitian adalah sesuatu hal yang berbentuk apa saja yang
ditetapkan oleh peneliti untuk dipelajari sehingga diperoleh informasi tentang hal
tersebut, kemudian ditarik kesimpulannya Sugiyono (1999).
Menurut Koentjaraningrat (1983), variabel adalah faktor yang mengandung
lebih dari satu nilai dalam metode statistik. Variabel penelitian ini dibedakan menjadi
variabel bebas dan variabel terikat. Variabel bebas adalah faktor yang menyebabkan
suatu pengaruh, sedangkan variabel terikat adalah faktor yang diakibatkan oleh
pengaruh tadi.
32
Pada penelitian ini ada dua variabel yang digunakan yaitu
1. Variabel bebas; perbedaan spesies dari BAL.
2. Variabel terikat; besarnya zona hambat.
Penelitian ini terdiri dari dua tahap: Tahap I, bertujuan untuk mengetahui tipe
zat antibakteri yang dihasilkan oleh BAL terdiri dari 2 percobaan; percobaan 1 terdiri
dari 5 perlakuan BAL (bakteri + metabolit) dan 1 kontrol yang diulang 5 kali yaitu:
1. A (Lac. Plantarum)
2. B (Lac. Casei)
3. C (Lac. Sake)
4. D (Ped. Pentosaceus)
5. E (Ped. Acidilactici)
6. K (Kontrol)
dan percobaan 2 terdiri dari 5 perlakuan metabolit BAL dan 1 kontrol yaitu:
1. F (Metabolit Lac. Plantarum)
2. G (Metabolit Lac. Casei)
3. H (Metabolit Lac. Sake)
4. I (Metabolit Ped. Pentosaceus)
5. J (Metabolit Ped. Acidilactici) dan
6. K (Kontrol)
Pada Tahap II, penelitian ini menggunakan 1 percobaan dengan 5 perlakuan
yang diulang 5 kali; 4 perlakuan kombinasi metabolit BAL serta 1 kontrol. Kelima
perlakuan itu adalah:
33
1. P (Metabolit Lac. Plantarum + Ped. Acidilactici)
2. Q (Metabolit Lac. Plantarum + Lac. Casei)
3. R (Metabolit Ped. Acidilactici + Lac. Casei)
4. S (Metabolit Lac. Plantarum + Ped. Acidilactici+ Lac. Casei)
5. K (Kontrol)
Kepadatan bakteri asam laktat dan bakteri Escherichia coli yang digunakan dalam
penelitian ini adalah 108 cfu/ml.
34
3.3 Kerangka Konsep dan Prosedur Penelitian
3.3.1 Kerangka Konsep Penelitian
INPUT BAL
E.coli
OUTPUT (Daya hambat BAL terhadap E. coli)
Uji tantang (Challenge test)
Zat Anti Mikroba
E.coli Mati
Antagonisme kimia (cdds.georgetown.edu)
Dinding sel rusak (www.plaquex.ch)
Denaturasi protein (www.uccs.edu)
DNA rusak (www.meds.case.edu)
Gambar 7. Kerangka Konsep Penelitian
35
3.3.2 Prosedur Penelitian
Escherichia coli
Escherichia coli
Ditumbuhkan pada media BHI (Brain Head Infusion) pada suhu 37oC
selama 24-48 jam
Stock Escherichia coli
Gamar 8. Prosedur persiapan bakteri Escherichia coli
Bakteri Asam Laktat (BAL)
Bakteri Asam Laktat (BAL)
Ditambahkan pada media MRS Broth steril
Diinkubasi pada suhu 30oC selama 24-48 jam
Disentrifuge dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit
Supernatan/metabolit Endapan/bakteri
Gambar 9. Prosedur persiapan bakteri asam laktat (BAL)
36
Uji Daya Hambat
Siapkan media EMB steril suhu 45-50oC dan dituangkan pada cawan petri sebanyak 15 ml
a) Media EMB dibiarkan sampai
memadat
c) Letakkan kertas saring steril dengan
diameter 0.5 cm dengan pinset streil
b) Tambahkan Escherichia coli
sebanyak 0.2 % ke dalam media EMB
Ditetesi metabolit BAL sebanyak ± 10 μl pada
kertas saring
Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam
Diamati diameter zona hambat yang berwarna
bening
Ditetesi BAL (metabolit+BAL) sebanyak ± 10 μl pada kertas saring
Gambar 10. Prosedur uji daya hambat
37
3.3.3 Optimalisasi Pertumbuhan Bakteri Uji Escherichia coli
Isolat murni dari bakteri uji E. coli yang didapatkan ditumbuhkan pada media
cair BHI (Brain Head Ifusion) pada suhu 37oC selama 24 jam. Pertumbuhan bakteri
ini dapat diketahui pada saat media yang digunakan berubah menjadi keruh tidak
seperti warna semula dari media yang digunakan / bening (Muliani et al, 2000).
Setelah itu, bakteri ditumbuhkan pada media selektif pertumbuhan E. coli
yaitu EMB (Eosin Methylen Blue) kemudian diinkubasi selama 24 jam sampai
tumbuh koloni yang mengkilap seperti logam pada suhu 30-40oC. Hal itu dilakukan
karena menurut Radiati (2002), E. coli dapat tumbuh dengan cepat dengan waktu
regenerasi rata-rata 29 menit pada suhu 30 - 40oC.
3.3.4 Optimalisasi Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat dalam bentuk serbuk yang ditempatkan dalam ampul
ditumbuhkan pada media MRS Broth (De Man Rogosa and Shape) steril kemudian
diinkubasi pada suhu 30oC selama 24-48 jam. Perumbuhan bakteri ditunjukkan
dengan perubahan media menjadi keruh (Anonymous, 1988).
Bakteri yang sudah tumbuh dibiakkan pada media MRS agar dan diinkubasi
pada suhu 30oC selama 24-48 jam. Hal itu dilakukan karena menurut Sneath et al
(1986), suhu optimum pertumbuhan bakteri asam laktat berkisar antara 30-40oC dan
menurut Widyastuti dan Ratna Komala (1997) masing-masing bakteri asam laktat
diinkubasi selama 1-4 hari sampai koloni tumbuh, kemudian hasil biakan disimpan
dalam lemari pendingin.
38
3.3.5 Pengujian antibakteri dengan Metode Cakram (Lay, 1994)
Bakteri asam laktat dengan kombinasi spesies yang berbeda diuji kemampuan
antibakterinya terhadap bakteri uji. Pengujian ini menggunakan kertas cakram yang
telah dicelupkan dalam bakteri asam laktat dan metabolit dari bakteri asam laktat
dengan spesies yang berbeda yaitu Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei,
lactobacillus sake, Pediacoccus acidilactici dan Pediacoccus pentosaceus, dan
kombinasi metabolit dari ketiga spesies P. acidilactici + L. plantarum, P. acidilactici
+ P. pentosaceus, L. plantarum + P. pentosaceus, P. acidilactici + L. plantarum + P.
pentosaceus. Dosis kombinasi metabolit BAL tersebut adalah 50% P. acidilactici +
50% L. plantarum, 50% P. acidilactici + 50% P. pentosaceus, 50% L. plantarum +
50% P. pentosaceus, dan 33% P. acidilactici + 33% L. plantarum + 33% P.
pentosaceus. Kepadatan bakteri yang dipakai adalah 108 cfu/ml. Untuk mendapatkan
kepadatan bakteri 108 cfu/ml, kepadatan bakteri diamati menggunakan alat
spektrofotometer.
Media yang digunakan dalam pengujian bakteri ini adalah media EMB (Eosin
Methylen Blue) yang dituangkan dalam cawan Petri. Dimana setiap cawan dituangkan
media EMB sebanyak 15 ml, kemudian didiamkan selama ± 15 menit sampai media
EMB memadat. Dilakukan penginfeksian bakteri uji kedalam media yang telah
disiapkan; bakteri E. coli diambil dengan menggunakan cotton swab kemudian
dioleskan pada media agar dengan bentuk seperti ular (zig-zag) dengan catatan tidak
boleh terjadi penumpukan bakteri yang dioleskan, dan selanjutnya dibiarkan selama 5
menit sampai mengering. Langkah selanjutnya kertas cakram yang berisi bakteri
39
asam laktat diletakkan pada media yang telah diinfeksi bakteri uji (E. coli). Kertas
cakram diletakan menggunakan pinset pada permukaan agar, sehingga terdapat
kontak yang baik antara cakram dengan agar. Kertas cakram tidak perlu ditekan kuat-
kuat sehingga tidak merusak permukaan agar. Kemudian diinkubasi selama 48 jam
dan dengan suhu 37oC. Penghambatan pertumbuhan E. coli oleh bakteri asam laktat
terlihat sebagai zona jernih disekitar cakram. Kemudian diameter zona jernih yang
muncul diukur. Kolom uji cakram dapat dilihat pada Tabel 3. sebagai berikut:
Tabel 3. Kolom pembacaan daerah hambat pada uji cakram
No Perlakuan Rata-Rata Diameter daya hambat (cm)
1 2 3 4 5
A B C D E
Cara peletakan kertas cakram dalam petridisk harus memenuhi kaidah-kaidah
sebagai berikut:
• Jarak kertas dengan tepi petridish tidak boleh kurang dari 15 mm
• Saat meletakkan kertas cakram tidak boleh ada pergeseran sedikitpun, karena
mengurangi validitas pengukuran
• Pengukuran berdasarkan diameter daerah hambatan dalam milimeter
Hambatan akan tampak sebagai daerah bening di sekeliling cakram yang
menunjukkan bahwa pada daerah bening tersebut tidak ditumbuhi bakteri. Lebar
daerah hambatan tergantung pada daya resap obat ke dalam agar dan tingkat
resistensi bakteri terhadap dosis obat (Bonang dan Koeswardono, 1982).
40
3.4 Parameter Uji
Parameter yang digunakan dalam penelitian ini adalah parameter kualitatif, yaitu
data yang diperoleh merupakan hasil pengukuran diameter daerah hambat dari bakteri
asam laktat maupun metabolit bakteri tersebut, yaitu terlihat daerah bening disekitar
cakram dalam satuan mm sebagai parameter utama. Sedangkan parameter penunjang
dalam penelitian ini adalah pengamatan molekul protein yang dominan dari bakteri
asam laktat yang digunakan dengan metode elektroforesis serta pengamatan
kandungan asam laktat pada Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sake,
Lactobacillus casei, Pediacoccus acidilactici dan Pediacoccus pentosaceus dengan
menggunakan metode HPLC.
3.5 Prosedur Analisa Parameter Uji
3.5.1 Daya Hambat Bakteri Asam Laktat Terhadap Bakteri Patogen (Lay,1994)
Untuk mengukur tingkat kerentanan suatu bakteri patogen oleh suatu antimikroba
disini digunakan suatu metode yaitu metode cakram atau dapat disebut sebagai teknik
cawan “piringan kertas” (paper disk plate).
Daya hambat dari bakteri penghambat atau antimikrobia dapat dilihat pada
luas diameter daerah hambatannya yang ditunjukkan oleh zona jernih yang terdapat
disekitar kertas cakram. Menurut Kirby-Bauer diameter zona hambat dari zat
antimikrobia atau antibiotik mempunyai standar atau parameter yang digunakan
untuk menentukan kepekaan suatu bakteri; apakah bakteri tersebut bersifat resisten,
intermediet atau sensitif terhadap antimikroba atau antibiotik yang digunakan. Bakteri
uji dikatakan resisten jika diameter zona hambatnya ≤ 9 mm, intermediet jika
41
diameter zona hambatnya 9 mm ≤ ø ≤ 11 mm, dan dikatakan sensitif jika diameter
zona hambatnya 11 mm ≤ ø ≤ 15 mm atau ≥ 15 mm.
Daya hambat dari zat antimikroba atau anti biotik yang biasa digunakan
seperti: ampisilin, tetrasiklin, kanamisin, khloramfenikol, dan sebagainya berkisar
antara 11-18 mm. Akan tetapi bakteri E. coli belum bisa dikatakan sebagai bakteri
yang resisten, intermediet atau sensitif terhadap bakteri asam laktat. Hal itu
dikarenakan belum ada penelitian tentang resistensi bakteri E. coli terhadap bakteri
asam laktat, sehingga belum ada standart parameter yang bisa dugunakan untuk
menetukan kepekaan bakteri tersebut; apakah bersifat resisten, intermediet atau
sensitif.
3.5.2 Pengamatan Molekul Protein dari Bakteri Asam Laktat (Sumitro et al.,
1994)
Elektroforesis merupakan suatu cara memisahkan fraksi-fraksi dari zat
berdasarkan atas pergerakan partikel koloid yang bermuatan melalui suatu gel
dibawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis dapat digunakan untuk menentukan
berat molekul dari suatu protein.
Proses elektroforesis yang dilakukan adalah jenis elektroforesis gel dengan
menggunakan media penyangga gel poliakrilamid. Separasi gel dilakukan pada
kondisi kontinu dengan dua jenis gel yaitu gel pemisah (separating gel) dan gel
pengumpul (stacking gel). Perbedaan dari kedua jenis gel adalah pada kadar
akrilamid yang digunakan. Prosedur pengujian elektroforesis melalui beberapa
tahapan yaitu:.
42
• Persiapan sampel
Sampel bakteri asam laktat yang digunakan sebagai bakteri penghambat
disentrifuge, dari perlakuan ini akan dihasilkan residu dan metabolit. Hasil metabolit
ditambahkan etanol dingin dan dibiarkan semalam pada suhu 4oC untuk presipitasi.
Sampel yang telah dipresipitasi kembali disentrifuge kemudian proses
selanjutnya sampel dimasukkan dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan dengan
RSB (Resolving Sample Buffer) dengan perbandingan antara sampel dan RSB 1:1.
Setelah itu sampel dipanaskan pada suhu 100oC selama 10 menit dengan tujuan untuk
mendenaturasi struktur protein.
• Persiapan separating gel (gel pemisahan sampel) dan stacking gel (gel
pengumpulan sampel)
Plate atau pelat gel disusun dengan merangkai dua pelat kaca dengan jarak 1
mm. Gel dibuat dua lapis yaitu gel sebagai media pemisah protein (separating gel)
dan gel pengumpul sampel (stacking gel). Dalam separating gel komposisi yang
dipakai akrilamid-bis, 1 M tris pH 8,8, SDS (Sodium Dodecil Sulfate) serta
aquabides. Kemudian ammonium persulfat dan TEMED ditambahkan secara
berurutan dan dihomogenkan. Selanjutnya segera dituangkan larutan kedalam plate
pembentuk gel menggunakan pipet (dijaga jangan sampai terbentuk gelembung
udara) sampai tiga perempat tinggi plate. Perlahan dituangkan air diatas larutan gel
agar permukaan gel tidak bergelombang. Dibiarkan memadat selama kurang lebih 30
menit. Setelah itu air yang menutup separating gel dibuang.
43
Selama menunggu separating gel memadat, stacking gel disiapkan dengan
cara mencampurkan stok akrilamid-bis dengan 1 M tris pH 6,8 dan SDS serta aquabis
kedalam erlenmeyer. Setelah itu ditambahkan ammonium persulfat dan TEMED
kemudian dihomogenkan semua larutan. Selanjutnya segera dituangkan larutan
kedalam plate pembentuk gel menggunakan pipet sampai plate penuh. Perlahan
diselipkan sisir pembentuk sumur sampel kedalam stacking gel segera setelah
dituang. Setelah gel memadat sekitar 30 menit, sisir diangkat.
• Injeksi (memasukkan) sampel pada sumur gel
Plate yang sudah berisi gel dimasukkan dalam chamber elektroforesis.
Running buffer dituang sampai bagian atas dan bawah gel terendam. Bila terbentuk
gelembung udara pada dasar gel atau diantara sumur sampel, harus dihilangkan.
Selanjutnya sampel sebanyak 10-20 μl dimasukkan secara hati-hati kedalam dasar
sumur gel menggunakan syringe. Kemudian syringe dibilas sampai 3 kali dengan air
atau running buffer sebelum dipakai untuk injeksi sampel yang berbeda pada sumur
gel berikutnya.
• Running sampel
Untuk memulai running perangkat elektroforesis dihubungkan dengan power
supplay. Running dilakukan pada constant voltage 200 V selama kurang kurang lebih
40-50 menit atau sampai tracking dye mencapai jarak 0,5 cm dari dasar gel. Setelah
selesai, running buffer dituang dan gel diambil dari plate.
44
• Pewarnaan gel
Untuk tahap ini diperlukan larutan staining untuk mewarnai protein pada gel
dan larutan destaining untuk menghilangkan warna pada gel dan memperjelas band
protein yang terbentuk. Tahap awal yaitu dengan merendam gel dalam kotak yang
berisi 20 ml staining solution sambil digoyang selama ± 15 menit. Setelah itu larutan
staining dituang kembali pada wadahnya. Selanjutnya gel direndam dalam 50 ml
destaining solution sambil digoyang selama ± 30 menit atau sampai band protein
terlihat jelas.
3.5.3 Penentuan Konsentrasi Asam Laktat dari Bakteri Asam Laktat
Pada sistem HPLC (High Performance Liquid Chromatography) terdapat
bebrapa komponen berupa pompa, detektor, kolom, kolom pengering, fase bergerak
dan sistem manajemen data dimana pada sebagian komponen tersebut mempunyai
tombol pengontrol masing-masing tapi operator pada saat akan menjalankan sistem
tersebut melalui komputer utama sebagai pengontrol dari kesemua komponen pada
sistem HPLC.
Kromatograf yang dipakai dilengkapi dengan kolom ion eksklusi aminex
HPX-87H berukuran 300 x 7,8 mm dan guard column berupa catridge yang berisi
resin ion eksklusi yang sama (Bio radiation laboratories, berkeley, CA); pompa
pengatur aliran Beckman model 110A (Beckman Instrument, Inc, Berkeley, CA); fase
bergerak asam sulfat 0,048N; kecepatan aliran pelarut 0,80 ml/menit; detektor ISCO
model 1840 (Instrument Specialities Co, Lincoln, NE); Volum sampel 20 μl.
45
Tahapan pada sistem ini yang pertama adalah preparasi sistem, menjalankan
pompa, mengatur panajang gelombang dari detektor, memulai aliran fase bergerak,
menyuntikkan sample dan memulai pencatatan sistem data. Setelah berjalan
kemudian sistem data pusat diberhentikan dan detektor, pompa serta komponen
lainnya dimatikan, lalu dibilas residu dari sampel pada suntikan. Kromatogram
sampel yang keluar dapat dikonsultasikan dengan kromatogram standart asam laktat
yang telah diketahui jenis dan kadarnya. Standart diijeksikan sebelum dan setelah 3-4
kali injeksi sampel. Untuk mengtahui banyaknya asam laktat dapat membandingkan
antara luasan puncak sampel dengan standart.
3.6 Jadwal Penelitian
No Kegiatan Waktu
1.
2.
3.
4.
Persiapan
Pelaksanaan
Analisa data
Penyusunan laporan
2 hari
8 hari
14 hari
14 hari
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Daya Hambat Bakteri Asam Laktat (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Pediacoccus acidilactici, Pediacoccus pentosaceus)
Pemeriksaan daya anti bakteri dari Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei,
Lactobacillus sake, Pediacoccus acidilactici, dan Pediacoccus pentosaceus terhadap
Escherichia coli dengan metode cakram menunjukkan bahwa bakteri tersebut mampu
menghambat pertumbuhan E.coli. Hal itu ditandai dengan terlihatnya daerah hambatan;
zona bening disekitar kertas cakram.
Tabel 4. Diameter zona hambat BAL pada masing-masing perlakuan.
Perlakuan
(Bakteri Asam Laktat)
Rata-rata Diameter Zona Hambat (cm)
K : Kontrol
A : L. plantarum
B : L. casei
C : L. sake
D : P. acidilactici
E : P. pentosaceus
0.000 ± 0.000
0.815 ± 0.049
0.744 ± 0.030
0.782 ± 0.053
0.833 ± 0.103
0.795 ± 0.095
Besarnya diameter zona hambat BAL terhadap E. coli berkisar antara 0.744 ± 0.030
cm sampai 0.833 ± 0.103 cm. Jacobsen (1999) dalam Elida (2002) menetapkan daerah
bening / daerah penghambatan untuk aktivitas anti mikroba BAL minimum 1mm, positif
(+) bila daerah bening antara 2-5 mm dan aktivitas penghambatan kuat (++) bila lebih
dari 5 mm.
Dari Tabel 4 untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh pemberian BAL terhadap
pertumbuhan E. coli, disajikan lengkap pada Tabel 5 dan Lampiran 1.
49
Tabel 5. Rangkuman hasil variansi BAL.
Sumber
Variasi
dk Jumlah
Kuadrat
Rata-Rata
Kuadrat
F Hitung F Tabel 5% F Tabel 1%
Antar
Kelompok
6 - 1 2.645 0.530 122 2.62 3.90
Dalam
Kelompok
30 - 6 0.104 4.333x10-3
Total 30 - 1 2.753
Berdasarkan Tabel 5 dapat diketahui bahwa pemberian BAL berpengaruh sangat
nyata terhadap besarnya diameter zona hambat. Hal itu bisa dilihat dari F hitung > F
tabel 1%.
Besarnya rata-rata diameter zona hambat metabolit BAL (Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Pediacoccus acidilactici, Pediacoccus
pentosaceus) terhadap E. coli dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 6. Diameter zona hambat metabolit BAL pada masing-masing perlakuan.
Perlakuan
(Metabolit BAL)
Rata-rata Diameter Zona Hambat (cm)
K : Kontrol
E : L.plantarum
F : L. casei
G : L. sake
H : P. acidilactici
I : P. pentosaceus
0.000 ± 0.000
0.777 ± 0.037
0.792 ± 0.058
0.799 ± 0.081
0.807 ± 0.038
0.784 ± 0.054
Dari Tabel 6, besarnya diameter zona hambat metabolit BAL terhadap
pertumbuhan E. coli berkisar antara 0.777 ± 0.037 cm sampai 0.807 ± 0.038 cm. Untuk
50
mengetahui pengaruh pemberian metabolit BAL terhadap pertumbuhan E. coli, disajikan
lengkap pada Tabel 7 dan Lampiran 2.
Tabel 7. Rangkuman hasil variansi metabolit BAL.
Sumber
Variasi
dk Jumlah
Kuadrat
Rata-Rata
Kuadrat
F Hitung F Tabel 5% F Tabel 1%
Antar
Kelompok
6 - 1 2.620 0.524 217 2.62 3.90
Dalam
Kelompok
30 - 6 0.058 2.417x10-3
Total 30 - 1 2.678
Berdasarkan Tabel 7 dapat diketahui bahwa pemberian metabolit BAL berpengaruh
sangat nyata terhadap besarnya diameter zona hambat. Hal itu bisa dilihat dari F hitung
> F tabel 1%.
Zat anti bakteri menurut Jawetz et al (2001) bisa dikelompokkan menjadi dua
yaitu eksotoksin dan endotoksin. Eksotoksin mempunyai beberapa karakteristik antara
lain: diekskresikan oleh sel hidup, diproduksi oleh bakteri gram positif dan negatif,
polipeptida dengan berat molekul 10.000-900.000, antigenik lebih tinggi; menstimulasi
pembentukkan titer antitoksin yang tinggi, anti toksin menetralkan toksin, diubah
menjadi toksoid. Toksoid digunakan untuk imunisasi, biasanya tidak menghasilkan
demam dan sebagainya.
Endotoksin mempunyai karakteristik sebagai berikut: merupakan bagian integral
dari dinding sel. Dilepas seluruhnya pada bakteri yang mati dan sebagian selama
pertumbuhan. Kemungkinan tidak dilepas untuk aktivitas biologis, ditemukan hanya
pada bakteri gram negatif, tidak diubah menjadi toksoid, biasanya menghasilkan demam
pada tubuh inang dengan melepas interleukin-1 dan mediator lain (Jawetz et al., 2001).
51
Berdasarkan penelitian tahap I diketahui bahwa pemberian BAL dan metabolit
BAL sama-sama mempunyai pengaruh yang sangat berbeda nyata terhadap
pertumbuhan E. coli secara in vitro. Aktivitas antimikrobia terhadap bakteri patogen E.
coli terbesar terdapat pada bakteri Pediococcus acidilactici; perlakuan BAL + metabolit
BAL mempunyai rata-rata diameter zona hambat 0.833 ± 0.103 cm, dan perlakuan
metabolit BAL mempunyai rata-rata diameter zona hambat 0.807 ± 0.038 cm. Menurut
Bhunia et al (1987&1988) dan Motlagh et al (1992) dalam Yahya (1996), bahwa
Pediococcus acidilactici menghasilkan bakteriosin (pediosin AcH) yang aktif
menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Berdasarkan informasi tersebut, perlakuan
pada penelitian tahap II menggunakan perlakuan kombinasi metabolit BAL. Metabolit
BAL yang dikombinasikan dalam penelitian ini adalah metabolit BAL yang memiliki
rata-rata diameter zona hambat tertinggi (Pediacoccus acidilactici), sedang
(Lactobacillus casei), dan terendah (Lactobacillus plantarum).
Tabel 8. Diameter zona hambat kombinasi metabolit BAL pada masing-masing perlakuan.
Perlakuan
(Kombinasi Metabolit BAL)
Rata-rata Diameter Zona Hambat
(cm)
K : Kontrol
P : L. plantarum + P. acidilactici
Q : L. plantarum + L. casei
R : P. acidilactici+ L. casei
S : L. plantarum + P. acidilactici+ L. casei
0.000 ± 0.000
0.846 ± 0.056
0.900 ± 0.065
0.825 ± 0.067
0.845 ± 0.074
Dari Tabel 8, besarnya diameter zona hambat kombinasi metabolit BAL terhadap
pertumbuhan E. coli berkisar antara 0.825 ± 0.067cm sampai 0.900 ± 0.065 cm. Untuk
52
mengetahui ada tidaknya pengaruh pepemberian kombinasi metabolit BAL terhadap
pertumbuhan E. coli, disajikan lengkap pada Tabel 9 Lampiran 3.
Tabel 9. Rangkuman hasil variansi kombinasi metabolit BAL.
Sumber
Variasi
dk Jumlah
Kuadrat
Rata-Rata
Kuadrat
F Hitung F Tabel 5% F Tabel 1%
Antar
Kelompok
5 - 1 2.933 0.733 212 2.87 3.43
Dalam
Kelompok
25 - 5 0.069 3.450x10-3
Total 25 - 1 3.002
Berdasarkan Tabel 9 dapat diketahui bahwa pemberian kombinasi metabolit BAL
berpengaruh sangat nyata terhadap besarnya diameter zona hambat. Hal itu bisa dilihat
dari F hitung > F tabel 1%.
4.2 Daya Anti Mikroba BAL (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Pediacoccus acidilactici, Pediacoccus pentosaceus)
Menurut Anonymous (1997), pertumbuhan bakteri tertentu dapat mempengaruhi
pertumbuhan bakteri lain sehingga terjadi efek bakteriostatik dan bakteriosidik. Hal ini
disebut sebagai antibiosis (antagonisme). Tetapi dapat juga terjadi pengaruh saling
menguntungkan dalam pertumbuhannya. Hal ini disebut simbiosis mutualisme
(sinergisme). Sampai saat ini belum ada panduan baku tentang bagaimana menentukan
bentuk simbiosis dari sebuah kombinasi bakteri. Biasanya, bentuk simbiosis kombinasi
bakteri ditentukan dengan cara membandingkan nilai rata-rata diameter zona hambat
bakteri setelah dikombinasikan (Y) dengan nilai rata-rata diameter zona hambat bakteri
sebelum dikombinasikan (X). Jika Y>X berarti bentuk simbiosis kombinasi bakteri
53
tersebut adalah simbiosis mutualisme (sinergisme), tetapi jika sebaliknya (Y<X) berarti
bentuk simbiosisnya adalah antibiosis (antagonisme).
Tabel 10. Diameter metabolit BAL sebelum dan sesudah dikombinasikan.
Nilai Rata-Rata Zona Hambat
Kombinasi Metabolit BAL
No.
Kombinasi
Metabolit BAL
Sebelum (X) Sesudah (Y)
Bentuk
Simbiosis
1. P (0.777+0.807)/2 = 0.792 0.846 Sinergisme
2. Q (0.777+0.792)/2 = 0.785 0.900 Sinergisme
3. R (0.807+0.792)/2 = 0.799 0.825 Sinergisme
4. S (0.777+0.807+0.792) = 0.792 0.845 Sinergisme
Dari Tabel 10 dapat disimpulkan bahwa bentuk simbiosis kombinasi metabolit
BAL adalah sinergisme. Menurut Freeman yang dikutip dalam Muliani (2002), hal itu
disebabkan oleh adanya sifat dari suatu mikroorganisme yang dapat berkomunikasi antar
spesies untuk bekerjasama dalam menghadapi mikroorganisme lain, sifat ini disebut
quorum sensing. Selain itu dapat juga dikarenakan kombinasi dari spesies tersebut dapat
menghasilkan asam laktat sebagai komponen anti mikroba yang tinggi karena gabungan
keduanya. Berdasarkan Tabel 10 kita juga dapat menyimpulkan bahwa kombinasi
metabolit yang mempunyai daya hambat terbesar adalah kombinasi metabolit
(Lactobacillus plantarum + Lactobacillus casei) yaitu dengan rata-rata diameter zona
hambat 0.9 ± 0.065 cm.
Hasil pengecekan kandungan asam laktat dengan menggunakan metode HPLC di
Laboratorium Kimia Fisika Terpadu Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dapat dilihat
pada Tabel 11.
54
Tabel 11. Kandungan asam laktat dari bakteri asam laktat (L. plantarum, L. casei, L. sake, P. acidilactici, dan P. pentosaceus)
Bakteri Asam Laktat Waktu (Menit) Konsentrasi (%)
Lactobacillus plantarum 8,930 58.1295
Lactobacillus casei 8,915 48.4495
Lactobacillus sake 8,912 48.4121
Pediacoccus acidilactici 8,895 49.0328
Pediacoccus pentosaceus 8,913 67.1422
Berdasarkan hasil HPLC kita dapat mengetahui bahwa asam laktat yang
dikeluarkan oleh kelima BAL tersebut optimum pada menit ke 9 sebesar 48.4121 % -
67.1422 % dan pada menit-menit selanjutnya mengalami penurunan. Hasil uji asam
laktat menggunakan HPLC disajikan lengkap di Lampiran 4.
Sutoyo (1998) menyebutkan bahwa senyawa antimikroba mempunyai fase
pertumbuhan exponensial dimulai setelah 2 jam inkubasi dan diproduksi setelah
kultur 6 jam, kemudian meningkat mencapai fase exponensial. Produktivitas
senyawa antimikroba menjadi stabil pada saat pertumbuhan sel memasuki fase
stasioner dan tetap berproduksi sampai akhir fase stasioner, setelah itu produksinya
menurun pada saat memasuki fase kematian sel. Informasi tersebut sesuai dengan
grafik pertumbuhan diameter zona hambat BAL, metabolit BAL, dan kombinasi
metabolit BAL yang diamati setiap 12 jam sekali selama 2 hari (Lampiran 5).
Menurut Salminen dan Wright dalam Netty K (2002), pengaruh antagonistik
bakteri asam laktat terhadap mikroba patogen disebabkan karena kemampuan
bakteri asam laktat untuk mengasilkan asam-asam organik, hidrogen peroksida,
reuterin dan bakteriosin.
55
Dari pengecekan dengan pewarnaan gram terhadap bakteri yang digunakan
dalam penelitian ini, diketehui bahwa Escherichia coli merupakan bakteri gram
negatif sedangkan kelima BAL yang lain adalah gram positif. Gambar hasil
pewarnaan gram dapat dilihat pada lampiran 6.
Produksi asam laktat oleh kelima BAL memilki hubungan erat dalam
penghambatan bakteri patogen E. coli. Menurut Evanikastri (2003) menyebutkan
bahwa mikroorganisme mempunyai toleransi terhadap asam yang berbeda-beda.
Bakteri asam laktat tidak hanya dapat mentoleransi asam lipofilik, tapi juga
memproduksinya sebagai produk akhir dari metabolismenya. Asam laktat
merupakan produk akhir dari metabolisme karbohidrat oleh BAL berasal dari
piruvat yang diubah oleh enzim- enzim asam laktat dehidrogenase. Penumpukkan
asam menyebabkan pH turun dan berakibat pada penghambatan pertumbuhan
bakteri Gram negatif yakni E. coli.
4.3 Fraksinasi Protein dari Bakteri Asam Lakat ( L. plantarum, L. casei, L. sake, P. acidilactici dan P. pentosaceus).
Fraksinasi protein ini dilakukan untuk mengetahui protein-protein yang
dihasilkan bakteri asam laktat yang digunakan sebagai bakteri penghambat. Menurut
Yahya (2000), protein yang terlibat dalam proses biokimiawi dimana sebagian besar
terdiri dari enzim memiliki peranan dalam mengubah karbohidrat menjadi asam
laktat sebagai hasil metabolismenya. Protein akan menentukan ukuran dan struktur
sel, serta sebagai komponen utama dari sistem komunikasi antar sel serta sebagai
katalis didalam sel.
56
Elektroforesis dengan kondisi protein yang sudah terdisosiasi dapat dipakai
untuk memperkirakan berat molekul suatu protein. Berat molekul tersebut dapat
ditentukan dengan mengukur mobilitas molekul protein dalam gel poliakrilamid
(yang mengandung SDS) berdasarkan pada kurva standar berat molekul dari protein
standart. Protein standar yang diketahui berat molekulnya dapat dielektroforesis dan
mobilitasnya pada gel poliakrilamid yang diukur. Jenis marker protein standart
beserta berat molekulnya disajikan pada Tabel 12 sebagai berikut :
Tabel 12. Berat Molekul dari Protein Standart
Marker BM (kDa) Rf (x)
Myosin 205 0.117647059
B-Galaktosidase 120 0.2
Bovine Serum Albumin 84 0.270588235
Ovalbumin 52.2 0.341176471
Carbonic anhidrase 36.3 0.458823529
Soybean trypsin inhibitor 30.2 0.670588235
Lysozym 21.9 0.823529412
Aprotinin 7.4 0.976470588
Jenis-jenis protein dari bakteri asam laktat yang digunakan dapat dipisahkan dengan
menggunakan metode elektroforesis, hasil dari elektroforesis disajikan pada Gambar 11.
dan Tabel 13.
57
Gambar 11. Hasil Elektroforesis Bakteri Asam Laktat
Tabel 13. Band-band protein Bakteri Asam Laktat
Band Fraksi Protein Kode Berat molekul (kDa)
L.Casei P.Pento L.Plant L.Sake P.Aci A 120.6 B 90.2 C 69.3 D 52.1 E 45.5 F 39.1 G 36.8 H 34.1 I 32.3 J 31.4 K 30.4 L 28.5 M 26.2 N 21.5 O 7.4
Dari masing-masing protein dapat ditentukan berat molekul masing-masing
protein dengan persamaan regresi antara Log Mr dari berat molekul protein marker
sebagai variabel tetap (sumbu Y) dan hubungan Rf marker (sumbu X) sehingga
58
didapatkan grafik dan persamaan linier yang dapat dilihat pada lampiran 3 bersama
perhitungan dari berat molekul masing-masing protein. Berat molekul dan
pendugaan komponen protein bakteri asam laktat dengan elektroforesis disajikan
pada tabel 14.
Tabel 14. Berat molekul dan pendugaan komponen protein bakteri asam laktat dengan elektroforesis
Kode Berat Molekul (kDa) Protein Standar A 120.6 β-Galaktosidase B 90.2 Phosphorylase-β C 69.3 Bovine serum albumin D 52.1 Ovalbumin E 45.5 Fumarase F 39.1 β-Lactoglobulin G 36.8 Carbonic anhydrase H 34.1 Lactate dehydrogenase I 32.3 Tidak teridentifikasi J 31.4 Tidak teridentifikasi K 30.4 Soybean tripsin inhibitor L 28.5 Trypsinogen M 26.2 Chymotrypsinogen N 21.5 Lysozym O 7.4 Aprotinin
Berdasarkan ilustrasi elektroforegram dapat diketahui bahwa komponen
protein yang ditemukan pada bakteri L. casei sebanyak 14 jenis dengan kisaran berat
molekul 120.6-7.4 kDa, P. pentosaceus sebanyak 15 jenis dengan kisaran berat
molekul 120.6-7.4 kDa, L. plantarum sebanyak 12 jenis dengan kisaran berat
molekul 90.2-7.4 kDa, L. sake sebanyak 5 jenis dengan kisaran berat molekul 69.3-
28.5 kDa dan P. acidilactici sebanyak 5 jenis dengan kisaran berat molekul 69.3-
28.5 kDa. Komponen protein yang terbanyak terdapat pada bakteri P. pentosaceus,
59
hal ini sesuai dengan hasil konsentrasi asam laktat pada bakteri P. pentosaceus yang
memiliki konsentrasi tertinggi yaitu 67.1422%.
Pada Tabel 14. didapatkan bahwa kelima bakteri asam laktat tersebut
memiliki kesamaan band protein, yaitu setara dengan band protein Bovine serum
albumin dengan berat molekul 69.3 kDa, protein β-Lactoglobulin dengan berat
molekul 39.1 kDa, protein Carbonic anhydrase dengan berat molekul 36.8 kDa, dan
protein Trypsinogen dengan berat molekul 28.5 kDa. Sedangkan band protein bakteri
asam laktat yang sama dengan band marker protein standar yaitu pita yang setara
dengan marker β-Galaktosidase dengan berat molekul 120 kDa, marker Ovalbumin
dengan berat molekul 52.2 kDa, marker Carbonic anhidrase dengan berat molekul
36.3 kDa, marker Lysozym dengan berat molekul 21.9 kDa dan marker Aprotinin
dengan berat molekul 7.4 kDa.
5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian, kita dapat mengambil beberapa kesimpulan
antara lain:
1. Penambahan bakteri asam laktat (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
casei, Lactobacillus sake, Pediacoccus acidilactici, Pediacoccus
pentosaceus) berpengaruh sangat nyata terhadap pertumbuhan E. coli akan
tetapi perbedaan spesies bakteri asam laktat (BAL) tidak berbeda nyata
pengaruhnya terhadap pertumbuhan E. coli secara in vitro. Rata-rata
diameter zona hambat BAL berkisar antara 0.744 ± 0.033 cm sampai 0.833
± 0.103 cm.
2. Penambahan metabolit bakteri asam laktat berpengaruh sangat nyata
terhadap pertumbuhan E. coli, akan tetapi perbedaan spesies dari metabolit
bakteri asam laktat (BAL) tidak berbeda nyata pengaruhnya terhadap
pertumbuhan E. coli secara in vitro. Rata-rata diameter zona hambat
metabolit BAL berkisar antara 0.777 ± 0.037 cm sampai 0.807 ± 0.038 cm.
3. Penambahan kombinasi metabolit bakteri asam laktat (BAL) berpengaruh
sangat nyata terhadap pertumbuhan E. coli, akan tetapi perbedaan spesies
dari kombinasi metabolit bakteri asam laktat tidak berbeda nyata
pengaruhnya terhadap pertumbuhan E. coli secara in vitro. Rata-rata
diameter zona hambat kombinasi metabolit BAL berkisar antara 0.825 ±
0.067 cm sampai 0.900 ± 0.065 cm.
66
4. Perlakuan bakteri asam laktat (BAL) yang mempunyai daya hambat
terbesar terhadap pertumbuhan E. coli secara in vitro adalah perlakuan Q;
perlakuan kombinasi metabolit bakteri L. plantarum dengan L. casei
dengan diameter zona hambat 0.900 ± 0.065 cm.
5.2 Saran
Dari hasil penelitian yang dilakukan ada beberapa hal yang perlu untuk
ditindak lanjuti antara lain:
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai besarnya dosis yang tepat
dalam mengkombinasikan metabolit bakteri asam laktat (BAL).
2. Perlu dilakukan pengkajian lebih mendalam mengenai jenis-jenis protein
hasil elektroforesis dari bakteri asam laktat yang berperan terhadap
penghambatan pertumbuhan E. coli secara in vitro.
3. Perlu dilakukan penelitian tentang kemampuan zat anti mikroba BAL
dalam menghambat bakteri patogen lain yang berkaitan erat dengan
keamanan pangan produk perikanan, seperti: Clostridium botullinum,
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, dan sebagainya.
4. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai aplikasi/pemanfaatan
bakteri asam laktat tersebut pada produk pangan ikan.
67
DAFTAR PUSTAKA
Anna, Ernani S. Sant and Torres, Regina Couli. 1998. Growth of Pediococcus acidilactici on Sugar Cane Blackstrap Molasses. http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S000137141998000300011
Afrianti, L. H. 1994. Penyebab Keracunan Makanan. www.pikiranrakyat.com/cakrawala/iptek/2004. Tanggal akses 6 Juli 2005.
Ahmed, N. M., D. E. Conner and D. L. Huffman. 1995. Heat Resistance of E. coli 0157: 57 in Meat and Poultry as Affected by Product Composition. Jouranal of Food Science Vol. 60. No. 03. Page: 606-610.
Anonymous. 1988. Culture Media Hand Book. MERCK. Federal Republik of Germany.
. 1997. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Kedokteran. Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta.
. 2000a. Bahaya Kontaminasi Logam Berat Pada Makanan. www.sedapsekejap.com. Tanggal akses 23 Maret 2005
b. Probiotic. A Yogurt With Many Qualities, In Nutrition, Health and Well Being. Nestle.
c. Antibacterial Activity of the Bakteriocin Produced by Pediococcus acidilactic ITV 26 in Model Food System. http://www.jvetunud.com/archives/9/.
. 2001. Yoghurt and Other Fermented Milk Product. Food Science (http://www.pjbs. Org/pjbs.new/journal/htm).
. 2002a. Chemical Qualities of Water That Contribute to Human Health in Positive Way. www.magnesium.com/themagnesiumwebsite.htm. Tanggal akses 16 Februari 2005.
b. Probiotik dan Prebiotik Untuk Kesehatan. (http:// www.kompasonline)
c. Hati-Hati Pilih Yogurt. (http://www.jawaposonline)
d. Friendly Bacteria (http://www.yogurt.co.uk/product/faq.asp)
.2004a. Peraturan Pemerintah No. 28 Tahun 2004. Sekretaris Negara Republik Indonesia. Jakarta.
68
b.Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnosus. http://genome.jgi-psf.org/draftmikrobes/lasca.home.
. 2006a. Pediococcus acidilactici and Pediococcus pentosaceus strains. http://genome.jgi-psf.org/draft_microbes/pedpe/pedpe.home.html.
b. Chemical Antagonism. http//cdds.georgetown.edu.
c. Membrane Cell. http//www.plaquex.ch.
d. DNA Damage and Repair. http// www.meds.case.edeu.
e. Protein Denaturation. http// www.uccs.edu.
Austin, B dan D. A. Austin. 1987. Bacterial Fish Patogens: Disease in Farmed adnd Wild Fish. John Wiley and Sons Ltd. England.
Bonang, G. dan E. S. Koeswardono. 1982. Mikrobiologi Kedoterran PT. Gramedia. Jakarta.
Brock, T. D., Moligan, M. T., and Parker, J. 1994. Biology of Microorganism. Seventh Edition. Prentice Hall. New Jersey.
Bryan, M. C. 1973. Antibiotic and Their Laboratory Control. 2nd edition.Butter Word and Co. Publ. Ltd. London.
Connell, J. J. 1995. Control of Fish Quality. Fourth Edition. Fishing News Book. Victoria.
Conway, P. 1996. Selection Criteria for Probiotics Organism. Asia Pacific. J Clin Nutr.
Buckle, K. A., R. A. Edwards., G. H Fleet., M. Wotton. 1985. Ilmu Pangan. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta.
Davies, J. 1994. Antibiotic Resistance and The Dissemination of Resistance Genes. Sciene 264 (5157); 375-82.
Dwijoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.
Dwi, S. 2005. Diktat Mata Kuliah Sanitasi Industri. Fakultas Perikanan Universitas Brawijaya. Malang.
Elida, M. 2002. Profil Bakteri Assam Laktat dari Dadih yang Difermentasi Dalam Berbagai Jenis Bambu dan Potensinya Sebagai Probiotik. Tesis. Institut Pertanian Bogor.
Evanikastri. 2003. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Dari Sampel Klinis yang Berpotensi Sebagai Probiotik. Tesis. Institut Pertanian Bogor.
69
Fardiaz, S. R., Dewanti, S. Budianto. 1992. Polusi Air dan Udara. Kanisius. Yogyakarta.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. PAU Pangan dan Gizi IPB. Penerbit Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT. Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Ferrero, G. J, B. R Funke and C. L case. 2001. Microbiology An Introduction. Addison Wesley Longman Inc. New York.
Firegold, S. M, Baron, J. E. 1986. Bailley and Scott’s Diagnostic Microbiology 7th
edition. Mosby Company. St. Louis.
Frazier, W. C. dan D. C. Westhoff. 1978. Food Microbiology 3th edition. Tata Mc Graw Hill Publising Co. Ltd. New Delhi.
Fox, M. S. 1988. Probiotic: Intestinal Inoculant For Production Animal. Veternary Medicine. USA. August: 506-511.
Fuller, R. 1992. Probiotic: The Scientific Basis. Chapman Hall. New York. Tokyo. Melbourne. Madras.
Furqon. 2004. Statistika Terapan Untuk Penelitian. Penerbit ALFABETA. Bandung.
Gilliand, S.E. 1989. Achidophilus Milk Products: A Review of Potential Benefits to Consumers. J. Dairy Sci. 72: 2483-2494.
Gould,D. dan Brooker, C. 2003. Mikrobiologi Terapan Untuk Perawat. EGC Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.
Heruwati, E.S. 2002. Pengolahan Ikan Secara Tradisional: Prospek dan Peluang Pengembangan. Jurnal Litbang Pertanian No 13, Vol. 3, Hal. 92-99.
Holt and N. R. Krieg. 1984. Berge’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1. The Williams and Wilkins Co., Baltimore.
Hoover, D. G. 1993. Bifidobacteria: Activity and Potential Benefits. Journal Food Technology. 43 (6): 120-124.
Irianto, H. E dan Murniyati. 1999. Bakteri Asam Laktat Sebagai Probiotik Pada Ikan. Instalansi Penelitian Perikanan Laut Slipi.
Jawetz, E., J. L. Melnick, E. A. Adelberg. 1986. Mikrobiologi Untuk Profesi Kesehatan. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.
Jay, J. M. 1992. Modern Food Microbiology.Wayne State University. Chapman and Hall. New York.
70
Jin, L. Z., Ho, Y. W., Abdullah, N., Ali, M. E. Jalaludin, S. 1996. Antagonistic Effect of Intestinal Lactobacillus Isolates on Pathogen of Chicken. Appl. Mikrobiology. 23: 67-71.
Koentjaraningrat. 1983. Metode-metode Penelitian Masyarakat. Gramedi. Jakarta.
Kristianto, Deddy. 2005. Studi Viabilitas Bakteri Asam Laktat dan Keamanan Mikrobiologi Produk Yogurt yang Bereddar di Kota Madya Malang. Skripsi. Jurusan Teknologi Hasil Pertanian. Fakultas Teknologi Pangan. Universitas Brawijaya Malang.
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba Di Laboratorium. PT. Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Nazir, M. 1988. Metode Penelitian. Ghalia Indonesia. Jakarta.
Ndhara, T. 1987. Disain Riset dan Teknik Penyusunan Karya Tulis Ilmiah. PT. Bina Aksara. Jakarta.
Nousiainen, J. Dan Setala, J. 1993. Lactic Acid Bacteria Animal Probiotic. In: Lactic Acid Bacteria Edition. Seppo salen and Atte Van Wright. P. 315-356.
Nursyam, Happy, Mahmudi M., Priyadi, Bambang Murniyati, Basmal, Jamal. 2001. Pemanfaatan Lambung Ikan Tuna (Thunnus sp) Dalam Rangka Penyediaan Preparat Lactobacillus plantarum Sebagai Penghasil Antibiotik Untuk Bakterisida Pada Pemeliharaan Larva Udang Windu. Lembaga Penelitian Universitas Brawijaya. Malang.
Nurwantoro dan Siregar, D. Abbas. 1997. Mikrobiologi Pangan Hewani-Nabati. Cettakan I. Penerbit Kanisius. Jakarta.
Ostling, E. C. dan Lingdren, S. E. 1993. Inhibition of Enterobacteria and Lysteria Growth by Lactic Acid and Formic Acid. Journal of Applied Bacteriology. 75: 18-24.
Pelczar, M. J. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid I. Terjemahan: Hadioetomo. Radja Grafindo. Jakarta.
Pelczar, M. J and Chan C. E. S. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jilid II. Universitas Indonesia Press. Jakarta.
Pelczar, M. J. and R. D. Reid. 1958. Micrbiology. Mc Graw Hill Book. International Edition. New York. USA.
Prangdimurti, E. 2001. Probiotik dan Efek Perlindungan Terhadap Kanker Kolon. (http://rudyct.tripod.com/sem1102/endangprangdimurti.htm)
71
Purwandhani, S. N., Endang S. R., Eni H. 2000. Isolasi Lactobacillus yang Berpotensi Sebagai Kandidat Probiotik. Seminar Nasional Industri Pangan.
Rahayu, E. S., T. F. Djafaar. D. Wibowo, and S. Sudarmadji. 1996. Lactic Acid Bacteria from Indegenous Fermented Food and Their Antimikrobial Activity. Journal Indonesian Food and Nutrition Progress.
Ray, B. 1996. Fundamental Food Microbiology. CRC Press Boca Raton. New York.
Ryan, K. J. 1994. Sherring Medical Microbiology an Introduction to Infection Yeast 3rd edition. Williams and Wilkins. USA.
Santosa, P. B. dan Ashari. 2005 Analisis Statistik dengan MS EXCEL dan SPSS. Penerbit ANDI Yogyakarta.
Schlagel, H. G. dan K. Scmidt. 1994. Mikrobiologi Umum. Alih Bahasa: Tedjo Baskoro. Edisi Enam. UGM Press. Yogyakarta.
Short. 1998. Function of Food, The Consumer, The Product and The Evidence. The Royal Society of Chemistry. UK.
Sikorski, Z., N. Haard, T. Motohiro, and B. S. Pan. 1998. Quality in Fish Smoking and Drying; Production and Quality. P. E. Doe (ed), Technomic Publising USA. P. 89-115.
Silk, T. M. E. T. Ryser and C. W. Donnely. 1997. Comparisson of Methods for Determaining Coliform and Escherichia coli Levels in Apple Cider. Journal of Food Protection. Vol. 60. No. 11.
Sneath, H. A. P., S. N Mair, E. M Sharpe and G. J Holt. 1986. Bergey’s Manual Of Systematic Bacteriology. William and Wilkins Publishing. London.
Soeharsono. 1998. Alternatif Pengganti Antibiotik Dalam Bidang Peternakan. Laboratorium Fisiologi dan Biokimia. Fakultas Peternakan. Universitas Padjajaran Bandung.
Soekarto, T. S. 1990. Dasar-Dasar Pengawasan dan Standarisasi Mutu Pangan. PAU Pangan dan Gizi. Institut Pertania Bogor. Bogor.
Stamer, J. R. 1979. The Lactic Acid Bacteria Microbes of Diversity. Food Technology.
Sudarisman, T. 1997. Makanan Probiotik, Apa Itu? Warta Konsumen.
Sugiyono. 1999. Metode Penelitian Bisnis. C. V. Alfabeta. Bandung.
Sugandi, E dan Sugiarto. 1993. Rancangan Percobaan Teori dan Aplikasi. Penerbit Andi Offset. Yogyakarta.
72
Sugiyono. 1999. Metode Penelitian Bisnis. CV. Alfabeta. Bandung.
Sumitro, S. B., S. Rahayu, Fatchiyah, S. Widyarti, E. L. Arumningtyas. 1996. Kursus Teknik-Teknik Dasar Analisa Protein dan DNA. Jurusan Biologi. Fakultas MIPA. Universitas Brawijaya. Malang.
Supardi, I dan Sukamto. 1999. Mikrobiologi Dalam Pengolahan Keamanan Pangan. Penerbit Alumni. Bandung.
Surahmad, W. 1985. Pengantar Penelitian. Penerbit Tarsito. Bandumg.
Suryabrata, S. 1989. Metodologi Penelitian. Rajawwali. Jakarta.
Sutoyo. 1998. Penapisan Bakteri Asam Laktat yang Asal Berbagai Sumber Hewani dan Nabati dalam Menghasilkan Bakteriosin. Tesis. Institut Pertanian Bogor.
Volk, W. A dan M. F Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Alih Bahasa: Markham. Edisi Ke-5. Jilid 1. Erlangga. Jakarta.
Vuyust, L. De, and Vandamme, E. J. 1994.Antimicrobial Potential of Lactic Acid Bacteria. In: Vuyust, L. De, and Vandamme, E. J. Bacteriocin of Lactic Acid Bacteria: Microbilogy, Genetic, and Application. Blackie Academic & Profesional. London.
Wiranatakusumah. 1994. Keamanan Pangan. Risalah Widya Karya Pangan dan Gizi V. LIPI. Jakarta.
Wongsosoepantio, S. 1992. Elektroforesis Gel Protein. Pusat Antar Universitas Bioteknologi UGM. Yogyakarta.
Yahya. 1996. Karakteristik Bakteri Asam Laktat Dan Perubahan Kimia Pada Fermentasi “Bekasam” Ikan Mujaer (Tilapia mosambica). Tesis Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Yuki, M. 2001. Lactobacillus casei Strain Shirrota. http://www.phototour. Minneapolis.mn.us/candida/shirrota.htm.
Yuniati. 2001. Penerapan Probiotik Dalam Mengontrol Mikroba Patogen Usus. Skripsi. Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
Zubay, G. L. 1989. Biochemistry. Second Edition. Mc millan Publishing Co. New York.
73
Lampiran 1.
KERANGKA LAPORAN SEMENTARA
RINGKASAN
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
1.2 Rumusan Masalah
1.3 Tujuan Penelitian
1.4 Kegunaan
1.5 Hipotesis
1.6 Tempat dan Waktu
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Keamanan Pangan Produk Perikanan
2.2 Cemaran Mikrobia Pada Produk Perikanan
2.3 Eschericia coli
2.4 Probiotik
2.5 Bakteri Asam Laktat
2.5.1 Lactobacillus plantarum
2.5.2 Lactobacillus casei
2.5.3 Lactobacillus sake
2.5.4 Pediococcus acidilactici
2.5.5 Pediococcus pentosaceus
2.6 Bakteri Asam Laktat Sebagai Probiotik
74
2.7 Aktivitas Antimikroba
2.8 Uji EfektivitasAntimikroba in vitro
3. METODE PENELITIAN
3.1 Materi
3.1.1 Bahan
3.1.2 Alat
3.2 Metode Penelitian
3.2.1 Variabel Penelitian
3.2.2 Rancangan Percobaan
3.3 Kerangka Konsep dan Prosedur Penelitian
3.3.1 Kerangka Konsep Penelitian
3.3.2 Prosedur Penelitian
3.3.3 Optimalisasi Pertumbuhan Bakteri Uji Escherichia coli
3.3.4 Optimalisasi Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat
3.3.5 Pengujian Anti Bakteri dengan Metode Cakram
3.4 Parameter Uji
3.5 Prosedur Analisa Parameter Uji
3.5.1 Daya Hambat Bakteri Asam Laktat Terhadap Bakteri Patogen
3.5.2 Pengamatan Molekul Protein dari Bakteri Asam Laktat
3.5.3 Penentuan Konsentrasi Asam Laktat dari Bakteri Asam Laktat
4. Hasil dan Pembahasan
4.1 Daya Hambat Bakteri Asam Laktat
4.2 Daya Hambat Metabolit Bakteri Asam Laktat
4.3 Daya Hambat Kombinasi Metabolit BAL
4.4 Daya Anti Mikroba BAL
4.5 Fraksi Protein dari Bakteri Asam Laktat
75
5. Kesimpulan dan Saran
5.1 Kesimpulan
5.2 Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
Lampiran 1. Data dan Perhitungan Bakteri Asam Laktat (BAL)
Tabel Data Hasil Pengamatan Diameter Zona Hambat Bakteri Asam Laktat (BAL)
Kontrol A B C D E
No X No X No X No X No X No X
1. 0 1. 0.800 1. 0.775 1. 0.850 1. 0.850 1. 0.700
2. 0 2. 0.800 2. 0.750 2. 0.745 2. 0.740 2. 0.900
3. 0 3. 0.775 3. 0.750 3. 0.720 3. 0.775 3. 0.700
4. 0 4. 0.900 4. 0.745 4. 0.820 4. 1.000 4. 0.800
5. 0 5. 0.800 5. 0.700 5. 0.775 5. 0.800 5. 0.875
Jumlah 0 Jumlah 4.075 Jumlah 3.720 Jumlah 3.910 Jumlah 4.165 Jumlah 3.975
Rata-rata 0 Rata-rata 0.815 Rata-rata 0.744 Rata-rata 0.782 Rata-rata 0.833 Rata-rata 0.795
Perhitungan
Standar Deviasi (S)
( )
2
1 1
2
2
1−
⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛−
=∑ ∑− −
nn
XiXnS
n
i
n
ii
S2 (A) = (5 (3.331) – (4..075)2) / 5 (4)
= (16.655 -16.606) / 20
= 0.00245
2SS =
S (A) = 0.049
S (B) = 0.033
S (C) = 0.053
S (D) = 0.103
S (E) = 0.095
Jumlah Kuadrat Dalam Kelompok ( Sum Squares Within Group / SSW)
∑∑
∑=
=
=
⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
−=k
j j
nj
jijN
jijW n
XXSS
1
2
1
1
2
SSW = ((0)2+.....+(0.800)2+(0.800)2+.....+(0.875)2) –
((02/5)+.....+(4.0752/5)+.....+(3.9752/5))
= (15.880) – (15.776)
= 0.104
Jumlah Kuadrat Antar Kelompok ( Sum Squares Between Group / SSB)
∑∑∑
=
==⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
=k
j
n
iij
j
n
iij
B N
X
n
XSS
ii
1
2
1
2
1
SSB = 15.776 – ((0+.....+4.075+.....+3.975)2 / 30))
= 15.776 – 13.127
= 2.649
Jumlah Kuadrat Total Rata-Rata Jumlah Kuadrat Dalam Kelompok ( Sum Squares Total / SST) (Mean Squares Within Groups/MSB)
MSW = 0.104/6(5-1)
N
XXSS
N
iijN
iijT
2
1
1
2⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛
==∑
∑ =
=
= 0.104/24
= 4.333 x 10 -3
SST = 15.880 – 13.127 Rata-Rata Jumlah Kuadrat Antar Kelompok
= 2.753 (Mean Squares Between Groups/MSW)
MSB = 2.649/(6-1)
= 2.649/ 5
= 0.530
F = 0.530 / 4.333 x 10 -3
= 122
85
Lampiran 4. Hasil Uji Asam Laktat
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus acidilactici
86
Lactobacillus pentosaceus
Lactobacillus sake
87
Lactobacillus casei
88
Lampiran 5. Gambar Uji tantang, Data dan Grafik Pertumbuhan Diameter Zona Hambat BAL, Metabolit BAL dan Kombinasi Metabolit BAL
B
A
KD
C
E
Gambar Uji Tantang BAL
Data Pertumbuhan Diameter Zona Hambat BAL Waktu (Jam)
L.plantarum (cm)
L.casei (cm)
L.sake (cm)
P.acidilactici (cm)
P.pentosaceus(cm)
0 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 12 0.700 0.640 0.680 0.700 0.700 24 0.780 0.700 0.720 0.780 0.760 36 0.795 0.744 0.782 0.830 0.815 48 0.795 0.744 0.782 0.830 0.815
Grafik Pertumbuhan Diameter Zona Hambat BAL
00.20.40.60.8
1
0 10 20 30 40 50 60
Waktu (jam)
Rata
-Rat
a Di
amet
er
Zona
Ham
bat (
cm)
L. pantarum
L. casei
L. sake
P. acidilactici
P. pentosaceus
Grafik Pertumbuhan Diameter Zona Hambat BAL
89
K
I J
G
F H
Gambar Uji Tantang Metabolit BAL
Data Pertumbuhan Diameter Zona Hambat Metabolit BAL
Waktu (Jam)
L.pantarum (cm)
L.casei (cm)
L.sake(cm)
P.acidilactici (cm)
P.pentosaceus (cm)
0 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 12 0.700 0.705 0.660 0.700 0.700 24 0.731 0.725 0.760 0.802 0.775 36 0.777 0.792 0.790 0.807 0.784 48 0.777 0.792 0.790 0.807 0.784
Grafik Pertumbuhan Diameter Zona Hambat Metabolit BAL
0
0.5
1
0 20 40 60
Waktu (jam)
Rata
-Rat
a Di
amet
er Z
ona
Ham
bat (
cm)
L. pantarum
L. casei
L. sake
P. acidilactici
P. pentosaceus
Grafik Pertumbuhan Diameter Zona Hambat Metabolit BAL
90
H K P
QR
S
S
R Q
P
Gambar Uji Tantang Kombinasi Metabolit BAL
Data Pertumbuhan Diameter Zona Hambat Kombinasi Metabolit BAL
Waktu (Jam)
L.plantarum+ P.acidilactici
(cm)
L.plantarum+L.casei (cm)
P.acidilactici+L.casei
(cm)
L.plantarum+ P.acidilactici+
L.casei (cm)
0 0.000 0.000 0.000 0.000 12 0.814 0.878 0.840 0.782 24 0.820 0.890 0.845 0.804 36 0.846 0.900 0.845 0.825 48 0.846 0.900 0.845 0.825
Grafik Aktivitas Kombinasi Metabolit BAL
00.20.40.60.8
1
0 20 40 60
Waktu (jam)
Rata
-Rat
a Di
amet
er
Zona
Ham
bat (
cm) L. plantarum+P.
acidilactici
L. plantarum+L. casei
P. acidilactici+L.casei
L. plantarum+P.acidilactici+L. casei
Grafik Pertumbuhan Diameter Zona Hambat Kombinasi Metabolit BAL
Lampiran 2. Data dan Perhitungan Metabolit Bakteri Asam Laktat
Tabel Data Hasil Pengamatan Diameter Zona Hambat Metabolit Bakteri Asam Laktat
Kontrol F G H I J
No X No X No X No X No X No X
1. 0 1. 0.775 1. 0.725 1. 0.800 1. 0.800 1. 0.845
2. 0 2. 0.775 2. 0.800 2. 0.745 2. 0.800 2. 0.700
3. 0 3. 0.760 3. 0.875 3. 0.850 3. 0.760 3. 0.800
4. 0 4. 0.750 4. 0.800 4. 0.900 4. 0.825 4. 0.800
5. 0 5. 0.825 5. 0.760 5. 0.700 5. 0.850 5. 0.775
Jumlah 0 Jumlah 3.885 Jumlah 3.960 Jumlah 3.995 Jumlah 4.035 Jumlah 3.920
Rata-rata 0 Rata-rata 0.777 Rata-rata 0.792 Rata-rata 0.799 Rata-rata 0.807 Rata-rata 0.784
Perhitungan
Standar Deviasi (S)
( )
2
1 1
2
2
1−
⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛−
=∑ ∑− −
nn
XiXnS
n
i
n
ii
S2 (F) = (5 (3.024) – (3.885)2) / 5 (4)
= (15.120 -15.093) / 20
= 1.35 x 10-3
2SS =
S (F) = 0.037
S (G) = 0.058
S (H) = 0.081
S (I) = 0.038
S (J) = 0.054
Jumlah Kuadrat Dalam Kelompok ( Sum Squares Within Group / SSW)
∑∑
∑=
=
=
⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
−=k
j j
nj
jijN
jijW n
XXSS
1
2
1
1
2
SSW = ((0)2+.....+(0.775)2+(0.775)2+.....+(0.775)2) –
((02/5)+.....+(3.8852/5)+.....+(3.9202/5))
= (15.739) – (15.681)
= 0.058
Jumlah Kuadrat Antar Kelompok ( Sum Squares Between Group / SSB)
∑∑∑
=
==⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
=k
j
n
iij
j
n
iij
B N
X
n
XSS
ii
1
2
1
2
1
SSB = 15.681 – ((0+.....+3.885+.....+3.920)2 / 30))
= 15.681 – 13.061
= 2.620
Jumlah Kuadrat Total Rata-Rata Jumlah Kuadrat Dalam Kelompok ( Sum Squares Total / SST) (Mean Squares Within Groups/MSW)
MSW = 0.058/6(5-1)
N
XXSS
N
iijN
iijT
2
1
1
2⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛
==∑
∑ =
=
= 0.058/24
= 2.417 x 10 -3
SST = 15.739 – 13.061 Rata-Rata Jumlah Kuadrat Antar Kelompok
= 2.678 (Mean Squares Between Groups/MSB)
MSB = 2.620/(6-1)
= 2.620/ 5
= 0.524
F = 0.524 / 2.417 x 10 -3
= 217
91
Lampiran 6. Gambar Hasil Pewarnaan Gram Bakteri: Escherichia coli, Lac. Plantarum, Lac. Casei, Lac. Sake, Ped. Acidilactici, Ped. Pentosaceus
Escherichia coli Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacillus sake Pediacoccus acidilactici Pediacoccus pentosaceus
Lampiran 3. Data dan Perhitungan Kombinasi Metabolit Bakteri Asam Laktat
Tabel Data Hasil Pengamatan Diameter Zona Hambat Kombinasi Metabolit Bakteri Asam Laktat
Kontrol P Q R S
No X No X No X No X No X
1. 0 1. 0.925 1. 0.975 1. 0.825 1. 0.750
2. 0 2. 0.825 2. 0.800 2. 0.825 2. 0.800
3. 0 3. 0.800 3. 0.925 3. 0.750 3. 0.850
4. 0 4. 0.880 4. 0.900 4. 0.925 4. 0.900
5. 0 5. 0.800 5. 0.900 5. 0.800 5. 0.925
Jumlah 0 Jumlah 4.230 Jumlah 4.500 Jumlah 4.125 Jumlah 4.225
Rata-rata 0 Rata-rata 0.846 Rata-rata 0.900 Rata-rata 0.825 Rata-rata 0.845
Perhitungan
Standar Deviasi (S)
( )
2
1 1
2
2
1−
⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛−
=∑ ∑− −
nn
XiXnS
n
i
n
ii
S2 (P) = (5 (3.591) – (4.230)2) / 5 (4)
= (17.955 -17.893) / 20
= 3.1 x 10-3
2SS =
S (P) = 0.056
S (Q) = 0.065
S (R) = 0.067
S (S) = 0.074
Jumlah Kuadrat Dalam Kelompok ( Sum Squares Within Group / SSW)
∑∑
∑=
=
=
⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
−=k
j j
nj
jijN
jijW n
XXSS
1
2
1
1
2
SSW = ((0)2+.....+(0.925)2+(0.825)2+.....+(0.925)2) –
((02/5)+.....+(4.2302/5)+.....+(4.2252/5))
= (14.671) – (14.602)
= 0.069
Jumlah Kuadrat Antar Kelompok ( Sum Squares Between Group / SSB)
∑∑∑
=
==⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
=k
j
n
iij
j
n
iij
B N
X
n
XSS
ii
1
2
1
2
1
SSB = 14.602 – ((0+.....+4.230+.....+4.225)2 / 25))
= 14.602 – 11.669
= 2.933
Jumlah Kuadrat Total Rata-Rata Jumlah Kuadrat Dalam Kelompok ( Sum Squares Total / SST) (Mean Squares Within Groups/ MSW)
MSW = 0.069/5(5-1)
N
XXSS
N
iijN
iijT
2
1
1
2⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛
==∑
∑ =
=
= 0.069/20
= 3.450 x 10 -3
SST = 14.671 – 11.669 Rata-Rata Jumlah Kuadrat Antar Kelompok
= 3.002 (Mean Squares Between Groups/MSB)
MSB = 2.933/(5-1)
= 2.933/4
= 0.733
F = 0.733 / 3.45 x 10 -3
= 212
