New UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA EFEK IRADIASI GAMMA … · 2015. 2. 12. · UIN SYARIF...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

EFEK IRADIASI GAMMA TERHADAP AKTIVITAS

ANTI INFLAMASI KITOSAN SECARA IN VITRO

SKRIPSI

DIAS PRAKATINDIH

NIM : 1110102000022

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

September 2014

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

EFEK IRADIASI GAMMA TERHADAP AKTIVITAS

ANTI INFLAMASI KITOSAN SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

DIAS PRAKATINDIH

NIM : 1110102000022

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

September 2014

iiUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri,

dan semua sumber yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

iiiUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Dias Prakatindih

NIM : 1110102000022

Program Studi : Farmasi

Judul : Efek Iradiasi Gamma Terhadap Aktivitas Anti

inflamasi Kitosan Secara In Vitro

ivUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh :


NIM : 1110102000022


Judul Skripsi : Efek Iradiasi Gamma Terhadap Aktivitas Anti inflamasi

Kitosan Secara In Vitro

Telah berhasil mempertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima

sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar sarjana

Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

vUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Dias PrakatindihProgram Studi : FarmasiJudul : Efek Iradiasi Gamma Terhadap Aktivitas Anti Inflamasi Kitosan

Secara In Vitro

Kitosan merupakan salah satu biopolimer yang berasal dari laut yang palingbanyak ditemukan. Kitosan berasal dari hasil deasetilasi kitin. Derajat deasetilasi danberat molekul merupakan parameter utama yang mempengaruhi karakteristik kitosan.Fernandes (2010) menyebutkan bahwa kitosan memiliki aktivitas anti inflamasisecara in vivo. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh iradiasigamma terhadap derajat deasetilasi, berat moleku, serta aktivitas anti inflamasinya.Hasil pengamatan menunjukan bahwa kitosan non iradiasi mempunyai DDA96,658% dan kitosan radiasi 94,073%. Radiasi juga menyebabkan penurunan beratmolekul kitosan, semakin besar dosis radiasi semakin rendah berat molekul yangdihasilkan. Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas anti inflamasi kitosan noniradiasi dan kitosan radiasi dengan 3 dosis radiasi yang berbeda masing-masing 50,100, dan 150 kGy yang dibandingkan dengan Na diklofenak sebagai kontrol positif.Telah diketahui persentase stabilisasi membran sel darah merah kitosan 0 kGy(25,05%), kitosan 50 kGy (36,27%), kitosan 100 kGy (55,87%), dan kitosan 150 kGy(39,92%). Berdasarkan kemampuannya dalam menstabilkan membran sel darahmerah, kitosan 100 kGy mempunyai aktivitas anti inflamasi yang tertinggi dan jugasebanding dengan Na diklofenak. Selain itu, hasil uji analisis statistik ANOVAmenunjukan bahwa kitosan 100 kGy berbeda secara bermakna dengan kitosan 0, 50,dan 150 kGy tetapi identik dengan Na diklofenak. Hasil ini mebuktikan bahwakitosan 100 kGy dapat dijadikan sebagai referensi obat anti inflamasi.

Kata kunci : kitosan, derajat deasetilasi, berat molekul, anti inflamasi, Na diklofenak,sel darah merah manusia, stabilisasi membran

viUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Dias PrakatindihProgram Study : PharmacyTittle : The Effect of Gamma Irradiation on the In Vitro Anti-

Inflammatory Activity of Chitosan

Chitosan is one of the most abundant marine-based biopolymers. Chitosan isthe product of deacetylation of chitin. The main parameters influencing thecharacteristics of chitosan are its degree of deacetylation and molecular weight.Fernandes (2010) reported that chitosan had in vivo anti inflammatory effect. The aimof this research is to determine the influence of gamma irradiation on the degree ofdeacetylation, molecular weight, and its anti inflammatory activity. The results ofdegree deacetylation showed that unirradiated and iiradiated chitosan have 96,658%and 94,073%, respectively. Irradiation caused the reduction of molecular weight ofchitosan, the higher doses of irradiation resulted in lower molecular weight. In thisexperiment the anti inflammatory activity of uniiradiated and irradiated chitosan inthree irradiation doses 50, 100, and 150 kGy was compared with sodium diclofenacas a positive control. The result showed that the percentage membrane stabilizationof red blood cell of chitosan 0, 50, 100, and 150 kGy are 25,05%, 36,27%, 55,87%and 39,92%, respectively. The ability to stabilize the membranes of red blood cell,chitosan irradiated with 100 kGy has the higher anti inflammatory activity and alsohas the same anti inflammatory effect with sodium diclofenac. Moreover, thestatistical analysis ANOVA showed that chitosan irradiated with 100 kGy has thesignificant different with chitosan 0, 50, and 150 kGy but comparable to sodiumdiclofenac. This result indicated that chitosan irradiated with 100 kGy has a potencyto develop as anti inflammatory drug.

Keyword : chitosan, degree of deacetylation, molecular weight, anti inflammatory,sodium diclofenac, human red blood cell, membrane stabilization

viiUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Dengan Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas

berkat dan rahmatNya saya dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Penulisan skripsi

ini dilakukan dalam rangka untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari

masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini sangatlah sulit bagi saya untuk

menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak Dr. Darmawan Darwis, Apt. selaku pembimbing pertama dan Bapak

Yardi, M.Si., Ph.D., Apt. selaku pembimbing kedua, yang memiliki andil besar

dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini, semoga segala

bantuan dan bimbingan bapak mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya.

2. Bapak Prof. DR. (hc) dr. M.K Tadjudin, Sp. And., selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan , Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3. Bapak Drs. Umar Mansur, M.Si., Apt. selaku Ketua Jurusan Program Studi

Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri

(UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak dan Ibu dosen yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan hingga

penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Kepada Ibu Dewi, Ibu Susi, Ibu Ayu, dan Ibu Ilin yang telah memberikan

masukan kepada penulis selama penelitian di BATAN.

6. Kepada Kak Rani, Kak Lisna, Kak Tiwi, Kak Eris, Kak Liken, dan Kak

Rahmadi yang telah memberikan banyak bantuan kepada penulis selama

penelitian di kampus.

7. Kepada kedua orang tua saya, Ayahanda H. Abdul Ghozi dan Ibunda Hj. Suparti

Adik-adikku Felisa Angularsih dan David Pamungkas, dan semua keluarga besar

viii

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

yang selalu memberikan dorongan moril, materil, spiritual, hingga selesainya

skripsi ini.

8. Untuk sahabat-sahabatku “Ngocol”, Syarifatul Mufidah, Afifah Nurul Izzah,

Diah Azizah, Melia Puspitasari, Jaga Paramudita, Zakiya Kamila, Desi Syifa

Nurmillah, dan Fatmah Syafiqoh yang selalu setia memberikan masukan, tak

bosan memberikan dukungan doa dan semangat, serta mendengarkan keluhan,

tangisan, dan teriakan penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

9. Teman-teman seperjuangan ANDALUSIA dari Farmasi 2010 yang sama-sama

berjuang bersama selama 4 tahun untuk menyelesaikan pendidikan ini.

10. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut

membantu menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna. Oleh

karena itu, kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan guna

tercapainya kesempurnaan skripsi ini.

Akhirnya dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil

penelitian ini dapat bermanfaat bagi kalangan akademis, khususnya bagi mahasiswa

farmasi, masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan.

Ciputat, September 2014

Penulis

ixUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR

UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai sivitas akademi Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, Saya yang bertanda tangan di bawah ini :


NIM : 1110102000022


Fakultas : Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK)

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmi pengetahuan, saya menyetujui skripsi/ karya ilmiah

saya dengan judul

EFEK IRADIASI GAMMA TERHADAP AKTIVITAS ANTI INFLAMASI

KITOSAN SECARA IN VITRO

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai Undang – Undang Hak Cipta.

Dengan demikian persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di: Ciputat

Pada Tanggal : 1 September 2014

Yang Menyatakan,

xUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................ iii

HALAMAN PENGESAHAN ..............................................................................iv

ABSTRAK ............................................................................................................ v

ABSTRACT ......................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR ........................................................................................ vii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .................... ix

DAFTAR ISI.......................................................................................................... x

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiii

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xiv

DAFTAR ISTILAH ............................................................................................ xv

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xvi

BAB 1 PENDAHULUAN ..................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................. 3

1.3 Tujuan Penelitian................................................................................... 4

1.4 Manfaat penelitian................................................................................. 4

1.5 Hipotesis................................................................................................ 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA............................................................................ 5

2.1 Kitosan ................................................................................................. 5

2.1.1 Sumber Kitosan............................................................................ 5

2.1.2 Karakteristik Kitosan ................................................................... 6

2.1.3 Proses Pembuatan Kitosan ........................................................... 7

2.2 Radiasi ................................................................................................... 9

2.2.1 Macam-macam Radiasi ............................................................... 9

2.2.2 Fungsi Radiasi............................................................................ 10

2.3 Metode Perhitungan Berat Molekul .................................................... 11

2.3.1 Viskometer ................................................................................. 11

xi


2.4 Inflamasi.............................................................................................. 12

2.4.1 Definisi....................................................................................... 12

2.4.2 Mekanisme Inflamasi Akut ........................................................ 13

2.4.3 Penyebab Inflamasi .................................................................... 15

2.4.4 Tipe Inflamasi ............................................................................ 16

2.4.5 Mediator Inflamasi ..................................................................... 17

2.5 Obat Anti Inflamasi............................................................................. 22

2.5.1 Obat Anti Inflamasi Steroid ....................................................... 22

2.5.2 Obat Anti Inflamasi Non Steroid ............................................... 22

2.6 Uji Aktivitas Anti Inflamasi Metode Stabilisasi Membran Eritrosit... 22

2.7 Spektrofotometri UV-VIS ................................................................... 24

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 26

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................. 26

3.2 Bahan................................................................................................... 26

3.2.1 Bahan Uji .................................................................................. 26

3.2.2 Bahan Kimia............................................................................... 26

3.3 Alat ...................................................................................................... 26

3.4 Prosedur Kerja..................................................................................... 27

3.4.1 Penyiapan Kitosan...................................................................... 27

3.4.2 Iradiasi........................................................................................ 27

3.4.3 Perhitungan Derajat Deasetilasi ................................................. 27

3.4.4 Perhitungan Berat Molekul ...................................................... ..27

3.4.5 Uji Aktivitas Anti Inflamasi Metode Stabilisasi Membran

Eritrosit....................................................................................... 28

3.4.6 Analisa Data ............................................................................. ..31

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 32

4.1 Hasil .................................................................................................... 32

4.1.1 Hasil Derajat Deasetilasi (DDA) Kitosan .................................. 32

4.1.2 Hasil Berat Molekul Kitosan...................................................... 33

xii


4.1.3 Hasil Uji Efek Stabilisasi Membran Sel Darah Merah Kitosan

Hasil Iradiasi dan Non Radiasi................................................... 35

4.1.4 Hasil Analisa Statistik ................................................................ 37

4.2 Pembahasan ......................................................................................... 38

4.2.1 Derajat Deasetilasi (DDA) Kitosan............................................ 38

4.2.2 Berat Molekul Kitosan ............................................................... 39

4.2.3 Stabilisasi Membran Sel Darah Merah ...................................... 40

BAB 5 PENUTUP................................................................................................ 44

5.1 Kesimpulan.......................................................................................... 44

5.2 Saran.................................................................................................... 44

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 45

LAMPIRAN......................................................................................................... 50

xiiiUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel 1.1 Derajat Deasetilasi (DDA) Kitosan............................................................. 33

Tabel 1.2 Tabel Waktu Alir Rata – Rata Tiap Konsentrasi Larutan ........................... 33

Tabel 1.3 Tabel Viskositas Spesifik dari Berbagai Dosis Radiasi .............................. 34

Tabel 1.4 Tabel Viskositas Intrinsikdan Berat Molekul ............................................ 34

Tabel 1.5 Efek Stabilisasi Membran SDM dari Larutan Uji dan Kontrol Positif

Terhadap Induksi Panas&Larutan Hipotonik Pada Konsentrasi 100 ppm . 36

Tabel 1.6 Nilai Persen Rata-Rata Stabilitas Membran SDM Kitosan dan Natrium

Diklofenak Pada Konsentrasi 100 ppm ...................................................... 38

xivUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Struktur Kitin.......................................................................................... 5

Gambar 2 Struktur Kitosan ..................................................................................... 6

Gambar 3 Reaksi Deasetilasi Kitin dengan Basa Kuat Menjadi Kitosan ............... 8

Gambar 4 Skema Mekanisme Inflamasi Akut ...................................................... 15

Gambar 5 Diagram Metabolisme Asam Arakidonat............................................. 20

Gambar 6 Efek Utama yang Ditimbulkan oleh IL-1 & TNF pada Inflamasi ....... 21

Gambar 7 Grafik Hubungan Dosis Radiasi dengan Berat Molekul Kitosan ........ 35

Gambar 8 Stabilisasi Membran SDM dari Larutan Uji & Kontrol Positif Terhadap

Induksi Panas dan Larutan Hipotonik ................................................. 37

xvUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH

BM : Berat Molekul

COX : Cyclooxygenase

DDA : Degree of Deacetylation

HRBC : Human Red Blood Cell

Ig : Imunoglobulin

IL : Interleukin

kGy : Kilogray

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

PAF : Platelet Activating Factor

PGE/F : Prostaglandin

PGI : Prostasiklin

TNF : Tumor Necrosis Factor

TXA : Tromboksan

xviUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Kerangka Penelitian................................................................................. 50

Lampiran 2 Pengukuran Berat Molekul Kitosan ........................................................ 51

Lampiran 3 Uji Aktivitas Anti Inflamasi Kitosan Pada Konsentrasi 100 ppm........... 52

Lampiran 4 Pembuatan Larutan Uji dan Standar ........................................................ 53

Lampiran 5 Perhitungan Pembuatan Buffer Asetat dan Buffer Posfat ....................... 54

Lampiran 6 Spektrum 1H NMR Kitosan 0 kGy dan Kitosan 75 kGy ........................ 56

Lampiran 7 Perhitungan Derajat Deasetilasi (DDA) Kitosan..................................... 60

Lampiran 8 Hasil Pengukuran Waktu Rata – Rata Kitosan 0, 50, 100, dan 150 kGy

pada Konsentrasi 0,1%, 0,2%, 0,3%, dan 0,4% ...................................... 61

Lampiran 9 Hasil Perhitungan Viskositas Spesifik Kitosan 0, 50, 100, dan 150 kGy

pada Konsentrasi 0,1%, 0,2%, 0,0%, dan 0,4% ...................................... 63

Lampiran 10 Nilai Viskositas Intrinsik Kitosan 0, 50, 100, dan 150 kGy pada

Konsentrasi 0,1%, 0,2%, 0,3%, dan 0,4%.............................................. 66

Lampiran 11 Penentuan Berat Molekul Kitosan ......................................................... 67

Lampiran 12 Nilai Absorbansi Larutan Uji Kitosan 0, 50, 100, 150 kGy, dan Na

Diklofenak.............................................................................................. 68

Lampiran 13 Nilai Absorbansi Kontrol Larutan Uji dan Kontrol Negatif .................. 69

Lampiran 14 Penentuan Stabilitas Membran SDM Terhadap Kitosan 0, 50, 100, &

150 kGy pada Konsentrasi 100 ppm ...................................................... 70

Lampiran 15 Hasil Uji Statistik Persen Stabilitas Kitosan 0, 50, 100, 150 kGy dan Na

Diklofenak pada Konsentrasi 100 ppm ................................................ 72

Lampiran 16 Lembar Pernyataan Kesediaan Menjadi Sukarelawan .......................... 77

Lampiran 17 Gambar Kitosan Sebelum dan Sesudah Radiasi.................................... 78

Lampiran 18 Foto-Foto Alat Penelitian ...................................................................... 79

Lampiran 19 Foto Proses Uji Aktivitas....................................................................... 80

1UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Indonesia mempunyai keanekaragaman hayati laut yang melimpah dan

beragam. Sumber daya kelautan Indonesia yang melimpah itu dapat berpotensi

sebagai obat, contohnya alga, rumput laut, bulu babi, udang, dan lain-lain. Salah

satu komoditas laut Indonesia yang mempunyai nilai ekonomi tinggi adalah

udang. Dewasa ini pengembangan dan penelitian mengenai udang terus

dilakukan, terutama dalam bidang aktivitas farmakologisnya, salah satunya

sebagai anti inflamasi (Fernandes et al., 2010).

Udang merupakan salah satu komoditas andalan dari sektor perairan

Indonesia yang terus mengalami peningkatan produksi, baik diperoleh dari usaha

penangkapan di alam ataupun dari hasil budidaya. Selama ini potensi udang

Indonesia rata-rata meningkat sebesar 7,4% per tahunnya. Data tahun 2001

menunjukkan potensi udang nasional mencapai 633.681 ton. Udang juga

merupakan salah satu sumberdaya perikanan dengan nilai ekspor terbesar selain

dari hasil perikanan lainnya dan umumnya diekspor dalam bentuk beku. Dari

proses pembekuan udang untuk ekspor, 60 - 70% dari berat total udang menjadi

limbah (kulit udang) sehingga diperkirakan akan dihasilkan limbah kulit udang

sebesar 510.266 ton (Darmawan et al., 2007). Namun, proses pengolahan limbah

kulit udang tersebut belum dilakukan secara optimal di Indonesia.

Limbah kulit udang mengandung 16,9% protein, 23,5% kitin, dan 24,8%

kalsium (Sossrowinoto, 2007). Berdasarkan data tersebut, kulit udang merupakan

sumber potensial sebagai bahan baku pembuatan kitin yang selanjutnya dapat

menghasilkan kitosan. Kitosan adalah senyawa turunan kitin hasil proses

deasetilasi yang mempunyai ikatan (1-4) 2-amido-2-deoksi-β-D-glukosa serta

mempunyai karakteristik fisika kimia yang lebih baik dibandingkan dengan kitin.

Saat ini kitosan banyak digunakan dalam farmasi sebagai bahan tambahan untuk

2


memperbaiki sistem penghantaran obat, mempunyai aktivitas sebagai anti

mikroba, anti tumor, anti hiperlipidemia, dan anti inflamasi (Xia et al., 2011).

Proses peradangan (inflamasi) merupakan suatu respon perlindungan

normal terhadap kerusakan jaringan dan merupakan suatu proses yang kompleks

disertai dengan aktivasi enzim, pelepasan mediator, ekstravasasi cairan, dan

migrasi sel. Mediator-mediator kimia juga berperan sebagai pemberi respon

terjadinya inflamasi, mediator tersebut dapat berikatan pada reseptor yang

spesifik pada sel target dan dapat meningkatkan permeabilitas pembuluh darah

dan kemotaksis neutrofil, merangsang kontraksi otot polos, memiliki aktivitas

enzimatik secara langsung, menginduksi rasa nyeri atau stress oksidatif (Kumar et

al., 2010). Stress oksidatif ini telah terbukti berkaitan dengan jalur patogenesis

beberapa penyakit seperti aterosklerosis, kanker, kerusakan hati, artritis rematoid

dan gangguan syaraf (Kumar, 2011).

Aktivitas biologis dari kitosan dipengaruhi oleh berat molekulnya.

Proses pemutusan rantai molekul kitosan dapat dilakukan dengan cara kimia,

enzimatik, dan radiasi. Proses radiasi selain digunakan untuk memutus rantai

molekul, juga dapat digunakan sebagai proses sterilisasi yang berguna untuk

membunuh mikroba. Selain itu, pemutusan rantai molekul kitosan dengan cara

radiasi tidak meninggalkan residu seperti pada proses kimia dan enzimatik. Proses

radiasi juga tidak menyebabkan bahan yang diradiasi menjadi radioaktif sehingga

obat yang dihasilkan dapat dikonsumsi dengan aman. Akhir-akhir ini proses

radiasi mendapatkan perhatian yang lebih dalam bidang teknologi karena

beberapa faktor diantaranya mempunyai realiabilitas yang baik, dapat

diaplikasikan pada produk skala besar, dan lebih ekonomis (Tahtat et al., 2012).

Penelitian yang dilakukan oleh Matsuhashi dan Kume 1997 menunjukkan bahwa

terdapat peningkatan aktivitas antimikroba dari kitosan yang telah diiradiasi. Hal

ini menunjukkan bahwa iradiasi dapat meningkatkan aktivitas biologis dari

kitosan.

3


Kitosan mempunyai sifat sukar larut dalam air dan pelarut organik lain.

Hal ini menyebabkan aplikasi penggunaannya menjadi terbatas. Berbagai cara

dilakukan untuk meningkatkan kelarutan dari kitosan. Salah satu cara yang dapat

dilakukan adalah iradiasi, karena iradiasi dapat memperkecil berat molekul

kitosan. Semakin rendah berat molekulnya maka kelarutan kitosan semakin

meningkat. Kitosan dengan berat molekul yang lebih rendah disebut oligokitosan.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Fernandes et al., 2010, oligokitosan

memiliki aktivitas anti inflamasi lebih tinggi daripada indometasin. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa oligokitosan dapat menghambat kerja enzim

siklooksigenase dan mengurangi produksi prostaglandin. Penelitian lainnya juga

menunjukkan bahwa kitosan dapat digunakan sebagai anti inflamasi dengan

menghambat ekspresi protein prostaglandin E2 (PGE2) dan kerja enzim

cyclooxygenase-2 (COX-2) (Chou et al., 2003). Berdasarkan hasil penelitian

tersebut maka kitosan mempunyai potensi yang besar sebagai alternatif obat anti

inflamasi baru yang selektif terhadap COX-2.

Sel darah merah (eritrosit) manusia telah banyak digunakan sebagai

model studi interaksi obat dengan membran. Obat seperti anestesi dan obat anti

inflamasi non steroid (OAINS) dapat mencegah lepasnya hemoglobin (Hb) dari

sel darah merah (eritrosit) ketika terjadi kondisi hipotonik. Teori ini digunakan

sebagai metode yang sangat berguna untuk menilai aktivitas anti inflamasi dari

bermacam-macam senyawa secara in vitro (Kumar, 2011). Melihat adanya

potensi yang tinggi pada kitosan hasil iradiasi sebagai anti inflamasi, maka pada

penelitian ini akan dilakukan uji aktivitas anti inflamasi kitosan hasil iradiasi

secara in vitro dengan metode stabilisasi membran HRBC (Human Red Blood

Cell).

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang diatas, maka dirumuskan masalah penelitian

sebagai berikut :

1. Bagaimana pengaruh iradiasi terhadap berat molekul kitosan?

4


2. Apakah kitosan yang telah diiradiasi memilki aktivitas anti inflamasi

secara in-vitro dilihat dari kemampuannya dalam menstabilkan membran

sel darah merah?

3. Adakah peningkatan aktivitas anti inflamasi dari kitosan hasil iradiasi

dibandingkan dengan kitosan tanpa iradiasi?

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Mengetahui pengaruh iradiasi terhadap berat molekul kitosan.

2. Mengetahui apakah kitosan yang telah diiradiasi memilki aktivitas anti

inflamasi secara in-vitro dilihat dari kemampuannya dalam menstabilkan

membran sel darah merah.

3. Mengetahui ada atau tidaknya peningkatan aktivitas anti inflamasi dari

kitosan hasil iradiasi dibandingkan dengan kitosan tanpa iradiasi

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah :

1. Sebagai informasi ilmiah bagi peneliti lanjutan tentang aktivitas anti

inflamasi yang terdapat pada kitosan hasil iradiasi.

2. Sebagai pengetahuan dalam bidang ilmu kimia bahan alam dan bidang

industri farmasi dalam upaya pengembangan obat anti inflamasi yang

dihasilkan dari kitosan hasil iradiasi.

1.5 Hipotesis

Kitosan hasil iradiasi yang diproduksi oleh BATAN mempunyai aktivitas

anti inflamasi lebih tinggi dibandingkan dengan kitosan tanpa radiasi, dilihat dari

kemampuannya dalam menstabilkan membran sel darah merah.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kitosan

2.1.1 Sumber Kitosan

Kitosan (poli-β-(1,4)-D-glukosamin) merupakan makromolekul

biologi yang dapat diperoleh dari proses deasetilasi kitin yang banyak

ditemukan pada cangkang kepiting, kulit udang dan cangkang serangga.

Kitin (poli-β-(1,4)-N-asetil-D-glukosamin) merupakan biopolimer alami

kedua terbanyak di alam setelah selulosa (Dutta et al., 2004). Kitin dan

kitosan memiliki struktur yang mirip dengan selulosa. Perbedaannya

terletak pada posisi C2 dimana pada kitin posisi C2 adalah gugus

asetamida dan pada kitosan posisi C2 adalah gugus amina. Setiap tahun

sekitar 100 milyar ton kitin diproduksi dari krustasea, kerang, rajungan,

serangga, jamur dan organisme lainnya (Kim, 2011).

Akhir-akhir ini, kitosan banyak digunakan diberbagai bidang,

misalnya, kosmetik, obat-obatan, makanan tambahan dan pertanian.

Selain itu, kitosan juga digunakan sebagai komponen dari pasta gigi,

krim, sampho, penurun kadar kolesterol, anti mikroba, anti koagulan,

sebagai pembawa obat, bahan untuk produksi lensa kontak, atau perban

mata, dan lain-lain (Prashanth, 2007).

Gambar 1 Struktur Kitin (Abreu et al., 2005)

6


Gambar 2 Struktur Kitosan (Yin et al., 2009)

2.1.2 Karakteristik Kitosan

Kitin dan kitosan merupakan polimer alami yang banyak

ditemukan, bersifat biodegradabel, biokompatibel, dan tidak toksik.

Dalam proses reaksi, kitosan jauh lebih fleksibel dibandingkan dengan

selulosa karena kitosan memiliki gugus NH2. Ikatan 1-4

anhidroglukosidik pada kitin juga dimiliki oleh selulosa, namun tidak

semua sifat karakteristik kitin/ kitosan dimiliki oleh selulosa. Kitin

sangat hidrofobik, tidak larut dalam air dan sebagian besar pelarut

organik, larut dalam heksafluoroisopropanol, heksafluoroaseton, dan

kloroalkohol. Kitosan mempunyai kelarutan yang lebih baik daripada

kitin.

Kitosan merupakan poli-(β-1, 4-D-glukosamin) yang berasal

dari N-deasetilasi kitin. Kitosan larut dalam asam asetat, asam laktat,

asam malat, asam format dan asam suksinat encer. Kitin dapat

sepenuhnya atau sebagian mengalami N-deasetilasi, tetapi tingkat

asetilasi biasanya kurang dari 0,35. Rasio asetilasi dapat dideteksi

dengan berbagai metode, seperti kromatografi gas, kromatografi

permeasi gel, spektroskopi ultra violet (UV), spektrometri masa,

spektroskopi X-ray, spektroskopi inframerah (IR), dan spektroskopi

NMR (Kumirska, 2010). Kitosan bersifat polikationik pada pH < 6 dan

mudah berinteraksi dengan molekul bermuatan negatif, seperti protein,

polisakarida anionik (misalnya, alginat dan karagenan), asam lemak,

asam empedu dan fosfolipid. Meskipun demikian, kitosan juga bersifat

7


selektif terhadap kelat ion logam seperti besi, tembaga, kadmium dan

magnesium (Shahidi, 1999).

Secara umum kitosan mempunyai bentuk fisik berupa padatan

amorf berwarna putih dengan struktur kristal yang tidak berubah dari

bentuk kitin. Kitosan mempunyai karakteristik kimia dan biologi sebagai

berikut (Dutta, 2004):

Karakteristik Kimia :

Memiliki gugus amino reaktif

Memiliki gugus hidroksil reaktif

Mampu mengkelat logam-logam transisi

Karakteristik Biologi :

Biokompatibel (polimer alami, biodegradabel didalam tubuh

manusia, aman, dan tidak toksik)

Mampu berikatan dengan sel mamalia dan mikroba dengan kuat

Mempercepat pembentukan osteoblas yang bertanggung jawab

untuk pembentukan tulang

Hemostatik

Fungistatik dan spermisid

Antitumor dan antikolesterol

Mempercepat pembentukan tulang

Depresan sistem saraf pusat

Immunoadjuvant

2.1.3 Proses Pembuatan Kitosan

Kitosan dihasilkan dari kulit udang yang diperoleh dari proses

deasetilasi (penghilangan gugus asetil) senyawa kitin. Kitin dalam

cangkang udang terdapat sebagai mukopolisakarida yang berikatan

dengan garam-garam anorganik, terutama kalsium karbonat (CaCO3),

protein dan lipida termasuk pigmen-pigmen. Oleh karena itu untuk

8


memperoleh kitin dari cangkang udang diperlukan pemisahan protein

(deproteinasi) dan pemisahan mineral (demineralisasi). Sedangkan untuk

mendapatkan kitosan dilanjutkan dengan proses deasetilasi. Reaksi

pembentukan kitosan dari kitin merupakan reaksi hidrolisa suatu amida

oleh suatu basa. Kitin bertindak sebagai amida dan NaOH sebagai

basanya. Mula-mula terjadi reaksi adisi, dimana gugus OH- masuk ke

dalam gugus NHCOCH3 kemudian terjadi eliminasi gugus CH3COO-

sehingga dihasilkan suatu amida yaitu kitosan. Reaksi pembentukan

kitosan dari kitin adalah sebagai berikut :

Gambar 3 Reaksi deasetilasi kitin dengan basa kuat menjadi

kitosan (Nugroho, 2011)

Proses deasetilasi umumnya dilakukan dengan perendaman kitin

di dalam larutan NaOH berkonsentrasi tinggi disertai pemanasan.

Senyawa kitosan banyak digunakan dalam berbagai bidang seperti

bidang pangan, pertanian, pengolahan limbah, biomedis, dan juga

bioteknologi. Sifat-sifat kitosan seperti kelarutan, bobot molekul yang

relatif besar, dan juga viskositas yang tinggi menyebabkan kendala

dalam aplikasinya. Oleh karena itu dibutuhkan turunan kitosan yang

memiliki kelarutan dalam air dan viskositas yang rendah. Sifat-sifat

9


tersebut dimiliki oleh oligomer dari kitosan (oligokitosan). Oligokitosan

merupakan senyawa hasil hidrolisis kitosan, baik secara kimiawi

(dengan asam kuat), secara enzimatis (dengan enzim kitosanase), dan

menggunakan iradiasi.

2.2 Radiasi

2.2.1 Macam-macam Radiasi

Ada tiga jenis radiasi yang sering kali dipancarkan dari inti

radioaktif yaitu radiasi alfa, beta, dan gamma.

1. Partikel Alfa

Radiasi alfa terbentuk oleh partikel zat yang terdiri dari dua

proton dan dua neutron. Jadi, partikel alfa sama dengan inti

Helium yang kehilangan dua buah elektron. Di dalam udara

partikel alfa terdapat dalam rentang kira-kira 5 cm, tetapi di dalam

jaringan kurang dari 100µ (Leswara, 2008).

2. Partikel Beta

Radiasi beta ada dua jenis, oleh karena itu kita mengenal dua

jenis elektron yaitu negatron (elektron bermuatan negatif) dan

positron (elektron bermuatan positif). Positron dan negatron adalah

sama, kecuali dalam hal muatannya yaitu +1 dan -1. Elektron –

elektron ini dipancarkan dari inti radioaktif yang disebut partikel

beta. Partikel beta mempunyai rentang lebih dari 3 meter di dalam

udara dan kira-kira 1 mm di dalam jaringan (Leswara, 2008).

3. Radiasi Gamma

Radiasi gamma adalah gelombang elektromagnetik sedangkan

radiasi alfa dan beta adalah partikel. Sinar gamma dipancarkan

sebagai foton atau kuantum energi dengan kecepatan c = 3,0 x 1010

cm/det. Perbedaan radiasi gamma dengan sinar X dan sinar UV,

sinar tampak dan sinar lainnya hanya dalam panjang gelombang

atau frekuensinya. Sinar gamma mempunyai penetrasi yang paling

10


besar diantara radiasi – radiasi yang dipancarkan oleh radioisotop

(kecuali netrino) dan dapat dengan mudah menembus jaringan

lebih dari 30 cm dan timbal (Pb) dengan ketebalan beberapa inci

(Leswara, 2008).

2.2.2 Fungsi Radiasi

Proses radiasi saat ini banyak digunakan dalam berbagai

bidang seperti sterilisasi alat-alat kedokteran, pengawetan bahan

makanan, serta digunakan juga untuk diagnosa maupun terapi suatu

penyakit yang dalam hal ini digunakan suatu radionuklida. Selain itu

radiasi juga dapat berfungsi sebagai salah satu metode untuk memutus

bobot molekul suatu senyawa. Proses radiasi adalah metode yang

paling menjanjikan, karena prosesnya yang sederhana, dapat dilakukan

pada suhu kamar dan tidak ada pemurnian produk yang diperlukan

setelah pengolahan. Proses radiasi juga tidak menyebabkan perubahan

struktur utama dari suatu senyawa yang diputus berat molekulnya

(Chmielewski, 2010).

Sinar radiasi yang umunya digunakan saat ini adalah radiasi

sinar gamma. Daya tembus dari sinar gamma memiliki banyak aplikasi

dalam kehidupan manusia, dikarenakan sinar gamma dapat menembus

beberapa bahan, dan sinar gamma tidak akan membuatnya menjadi

radioaktif. Sejauh ini ada tiga radionuklida pemancar gamma yang

paling sering digunakan yakni cobalt-60, cesium-137 dan technetium-

99m.

1. Cesium -137 digunakan dalam perawatan kanker, mengukur dan

mengontrol aliran fluida pada beberapa proses industri,

menyelidiki subterranean strata pada oil wells, dan memastikan

level pengisian yang tepat untuk paket makanan, obat – obatan dan

produk yang lain.

11


2. Cobalt-60 bermanfaat untuk: sterilisasi peralatan medis di rumah

sakit, pasteurize beberapa makanan dan rempah, sebagai terapi

kanker, dan mengukur ketebalan logam dalam stell mills.

3. Tc-99m adalah isotop radioaktif yang paling banyak digunakan

secara luas untuk studi diagnosa sebagai radiofarmaka.

(Technetium-99m memiliki waktu paruh yang lebih singkat).

Radiofarmaka ini digunakan untuk mendiagnosa otak, tulang, hati

dan juga mampu menghasilkan pencitraan yang dapat digunakan

untuk mendiagnosa aliran darah pasien

2.3 Metode Perhitungan Bobot Molekul

2.3.1 Viskometer (Hwang et al., 1997)

Viskositas merupakan ukuran yang menyatakan kekentalan

suatu larutan polimer. Perbandingan antara viskositas larutan polimer

terhadap viskositas pelarut murni dapat dipakai untuk menentukan

massa molekul nisbi polimer. Keunggulan dari metode ini adalah lebih

cepat, lebih mudah, alatnya murah serta perhitungannya lebih

sederhana. Alat yang digunakan adalah viskometer Ostwald.

Berat molekul kitin dan kitosan diukur berdasarkan viskositas

intrinsik (ƞ). Sejumlah kitosan dilarutkan dalam 0,05, 0,1, 0,2, dan 0,3

M NaCl/ 0,1 M CH3COOH lalu dimasukkan ke dalam viskometer.

Kemudian 10 mL pelarut dimasukkan ke dalam tabung viskometer

Ostwald dalam media air pada suhu 25°C. Data yang diperoleh

dipetakan pada grafik ƞsp /C terhadap C. Viskositas intrinsik adalahtitik pada grafik yang menunjukkan nilai C=0. Berat molekul

ditentukan berdasarkan persamaan Mark-Houwink yaitu:

12


[ƞ] = kMα

Keterangan:

[ƞ] = viskositas intrinsik

k = konstanta pelarut

α = konstanta

M = berat molekul

2.4 Inflamasi

2.4.1 Definisi

Inflamasi adalah reaksi tubuh terhadap adanya infeksi, iritasi

atau zat asing, sebagai upaya mekanisme pertahanan tubuh. Pada

reaksi inflamasi akan terjadi pelepasan histamin, bradikinin,

prostaglandin, ekstravasasi cairan, migrasi sel, kerusakan jaringan dan

perbaikannya yang ditujukan sebagai upaya pertahanan tubuh dan

biasanya respon ini terjadi pada beberapa kondisi penyakit yang serius,

seperti penyakit kardiovaskular, gangguan inflamasi dan autoimun,

kondisi neurodegeneratif, infeksi dan kanker (Kumar et al., 2010 &

Chippada et al., 2011).

Ada empat tanda klinis terjadinya inflamasi yaitu rubor

(kemerahan), tumor (pembengkakan), kalor (panas), dolor (rasa nyeri),

dan functio laesa (kehilangan fungsi). Kemerahan terjadi pada tahap

pertama dari inflamasi. Darah berkumpul pada daerah cedera jaringan

akibat pelepasan mediator kimia tubuh (kinin, prostaglandin, dan

histamin). Pelepasan histamin menyebabkan dilatasi arteriol.

Pembengkakan merupakan tahap kedua dari inflamasi, dimana plasma

masuk ke dalam jaringan interstitial pada tempat cedera. Kinin

mendilatasi arteriol dan meningkatkan permeabilitas kapiler. Rasa

panas pada tempat inflamasi disebabkan oleh bertambahnya

pengumpulan darah dan mungkin juga dapat disebabkan oleh pirogen

(substansi yang menimbulkan demam) yang mengganggu pusat

13


pengatur panas pada hipotalamus. Adanya pembengkakan serta

pelepasan mediator-mediator kimia menyebabkan timbulnya rasa

nyeri. Rasa nyeri dan terjadinya penumpukan cairan pada tempat

cedera jaringan dapat menyebabkan gangguan mobilisasi pada daerah

yang terkena (Kee & Hayes, 1993).

2.4.2 Mekanisme Inflamasi Akut

Ada dua fase yang terjadi dalam mekanisme inflamasi akut

yaitu fase perubahan vaskular dan fase reaksi selular. Fase perubahan

vaskular terjadi pada pembuluh darah. Mula-mula akan terjadi

vasokonstriksi yaitu penyempitan pembuluh darah terutama pembuluh

darah kecil (arteriol). Proses ini dapat berlangsung beberapa detik

sampai beberapa menit tergantung pada kerasnya jejas. Kemudian

akan terjadi vasodilatasi yang dimulai dari pembuluh arteriol yang

tadinya menyempit lalu diikuti oleh bagian lain pembuluh darah itu.

Akibat dilatasi ini, maka aliran darah akan bertambah sehingga

pembuluh darah akan penuh terisi darah dan tekanan hidrostatiknya

meningkat, yang selanjutnya dapat menyebabkan keluarnya cairan

plasma dari pembuluh darah itu. Setelah itu, aliran darah melambat

karena permeabilitas kapiler juga bertambah. Sehingga cairan darah

dan protein akan keluar dari pembuluh darah dan mengakibatkan darah

menjadi kental. Proses tersebut dikenal dengan proses eksudasi.

Keseluruhan proses ini terjadi akibat adanya zat kimia yang

menyerupai histamin dan prostaglandin (Pringgoutomo, 2002).

Setelah fase vaskuler selesai, terjadi reaksi seluler pada daerah

yang mengalami inflamasi. Fase ini dimulai setelah sel darah putih

dalam darah berpindah ke tempat cedera atau infeksi. Sel - sel darah

putih dan trombosit tertarik ke daerah tersebut oleh zat - zat kimia

yang dihasilkan dari sel yang cedera, sel mast, melalui pengaktifan

komplemen, dan pembentukan sitokinin yang terjadi setelah antibodi

14


berikatan dengan antigen. Tertariknya sel darah putih ke area cedera

disebut kemotaksis. Ketika berada di area tersebut, berbagai stimulant

menyebabkan sel endotel kapiler dan sel darah putih, terutama

neutrofil dan monosit menghasilkan molekul adhesi komplementer.

Neutrofil merupakan sel pertama yang tiba di daerah yang mengalami

inflamasi. Neutrofil bekerja dengan memfagositosis, mendegradasi sel

debris, serta membunuh mikroba. Neutrofil dapat membunuh

mikroorganisme melalui dua cara yaitu menggunakan enzim lisosomal

pencernaan dan memproduksi okigen bebas radikal (Corwin &

Elizabeth, 2008)

Urutan proses yang terjadi pada leukosit terdiri atas penepian

(marginasi), pelekatan (sticking), diapedesis (emigrasi), dan

fagositosis. Proses marginasi adalah proses ketika sel darah putih

melekat pada sel endotel, sehingga sel darah putih bergerak ke perifer

kapiler. Proses ini ditandai dengan terjadinya emigrasi sel darah putih

disepanjang kapiler yang kemudian mengelilingi dan memfagositosis

sel yang rusak. Trombosit yang memasuki area tersebut merangsang

pembekuan untuk mengisolasi infeksi dan mengontrol perdarahan. Sel

– sel yang tertarik ke daerah cedera akhirnya akan berperan melakukan

penyembuhan (Corwin & Elizabeth, 2008)

15


Gambar 4 Skema Mekanisme Inflamasi Akut (Pringgoutomo, 2002)

2.4.3 Penyebab Inflamasi

Penyebab yang paling umum dari proses peradangan antara

lain :

1. Infeksi mikrobial (bakteri piogenik, virus)

2. Agen fisik (trauma, radiasi pengion, panas, dan dingin)

3. Cedera kimiawi (korosif, asam, basa, agen pereduksi, dan toksin

bakteri)

Jejas

StimulasiSaraf

Kerusakan Jaringan

Mediator

Permeabilitas meningkatDilatasipembuluh

darah

Protein keluar (koloid osmotik darah menurun)

Eksudasi (koloid osmotik diluar pembuluh darah meningkat)

Retardasi marginasi

Statis Emigrasi leukosit

Trombosis Enzim proteolitik

PUSNekrosis

Kemotaksis

16


4. Jaringan nekrosis misalnya infark iskemik

5. Reaksi hipersensitivitas misalnya parasit dan basil tuberkolosis

(Underwood, 1999).

2.4.4 Tipe Inflamasi

Berdasarkan waktu kejadiannya inflamasi diklasifikasikan menjadi :

1. Inflamasi akut, yaitu inflamasi yang terjadi dalam waktu yang

segera dan hanya dalam waktu yang tidak lama terhadap cedera

jaringan. Karakteristik utamanya adalah adanya eksudasi cairan

(edema) dan emigrasi sel polimorfonuklear (neutrofil).

2. Inflamasi kronis, yaitu inflamasi yang terjadi dalam waktu dan

durasi yang lebih lama dengan melibatkan limfosit serta makrofag

dan menimbulkan proliferasi pembuluh darah serta pembentukan

jaringan parut.

Berdasarkan pada karakteristik utama inflamasi kronik dan akut, dapat

dibedakan menurut jenis eksudat dan variabel morfologi :

a. Inflamasi serosa

Inflamasi serosa dicerminkan oleh akumulasi cairan dalam

jaringan dan menunjukkan sedikit peningkatan permeabilitas

vaskuler. Pada peritoneum, pleura, dan perikardium keadaan ini

dinamakan efusi, namun dapat juga ditemukan ditempat lain

(misalnya lepuh karena luka bakar pada kulit).

b. Inflamasi fibrinosa

Inflamasi fibrinosa merupakan keadaan meningkatnya

permeabilitas vaskular yang lebih nyata, disertai eksudat yang

mengandung fibrinogen dalam jumlah besar. Fibrinogen tersebut

akan diubah menjadi fibrin melalui sistem koagulasi. Keterlibatan

permukaan serosa (misalnya perikardium atau pleura) disebut

dengan istilah perikarditis fibrinosa atau pleuritis fibrinosa.

17


c. Inflamasi supuratif atau purulen

Pola ini ditandai oleh eksudat purulen (pus atau nanah) yang terdiri

atas leukosit dan sel – sel nekrotik. Istilah abses mengacu kepada

kumpulan inflamasi purulen setempat yang disertai dengan

nekrosis likuefaksi (misalnya abses stafilokokus).

d. Ulkus

Ulkus merupakan erosi lokal pada permukaan epitel yang

ditimbulkan oleh jaringan nekrotik yang mengelupas atau

mengalami inflamasi (misalnya ulkus lambung) (Richard, et.al

2006).

2.4.5 Mediator Inflamasi

Selama berlangsungnya proses inflamasi banyak mediator

kimia yang dilepaskan dari plasma, sel atau jaringan yang rusak.

Mediator inflamasi dibagi dalam beberapa kelompok :

1. Amin vasoaktif : histamin dan serotonin

2. Protein plasma : komplemen, kinin, dan sistem pembekuan

3. Metabolit asam arakidonat : prostaglandin, leukotrien, dan lipoksin

4. Platelet-Activating Factor (PAF)

5. Sitokin dan kemokin

6. Nitrogen oksida

7. Konstituen lisosom pada leukosit

8. Radikal bebas yang berasal dari oksigen

9. Neuropeptida dan mediator lainnya

Beberapa mediator inflamasi yang penting antara lain :

a. Histamin dan Serotonin

Histamin dan serotonin merupakan dua dari beberapa

mediator pertama dalam proses inflamasi. Pelepasan histamin dan

serotonin menyebabkan vasodilatasi dan peningkatan

18


permeabilitas vaskuler. Kedua mediator ini berasal dari sel mast,

basofil, dan trombosit. Beberapa faktor yang menyebabkan

pelepasan amin dari sel mast adalah sebagai berikut :

1. Adanya agen fisik (trauma atau panas)

2. Reaksi imun yang melibatkan Ig E

3. Fragmen komplemen C3a serta C5a (anafilatoksin)

4. Sitokin (IL 1 serta IL 8)

5. Faktor –faktor pelepasan histamin yang berasal dari leukosit.

b. Komplemen C3a dan C5a

C3a dan C5a disebut juga sebagai anafilatoksin.

Anafilatoksin mampu memicu degranulasi pada sel endotelial,

mastosit, dan fagosit yang lebih lanjut memicu respon peradangan.

C3a dan C5a merupakan polipeptida yang berfungsi

layaknya sitokin yang hanya dilepaskan pada area peradangan.

C3a dan C5a akan menstimulasi pelepasan histamin dari sel mast

dan dengan demikian terjadi peningkatan permeabilitas vaskular

dan vasodilatasi. C5a juga mengaktifkan metabolisme arakidonat

sehingga terjadi pelepasan mediator inflamasi tambahan.

c. Bradikinin

Pelepasan bradikinin menyebabkan timbulnya rasa nyeri,

vasodilatasi dan edema/ pembengkakan yang terjadi dalam proses

inflamasi. Bradikinin bukan merupakan zat kemotaksis. Bradikinin

dihasilkan dari pemecahan protein plasma kininogen oleh enzim

protease spesifik (kalikrein). Kalikrein juga memiliki aktivitas

kemotaktik dan menyebabkan agregasi neutrofil.

19


d. Prostaglandin

Prostaglandin merupakan golongan asam lemak rantai

panjang turunan dari asam arakidonat dan disintesis oleh berbagai

jenis sel. Prostaglandin dihasilkan melalui jalur siklooksigenase.

Terdapat beberapa jenis prostaglandin antara lain prostaglandin I2

(prostasiklin) dan prostaglandin E2 yang menyebabkan

vasodilatasi. Selain itu prostaglandin E2 juga dapat meningkatkan

sensitivitas terhadap rangsangan nyeri dan dapat memediasi

demam (Richard et al., 2006).

Prostaglandin memiliki sejumlah efek fisiologi dan

farmakologi luas, antara lain terhadap otot polos (dinding

pembuluh, rahim, bronchi, dan lambung – usus), agregasi

trombosit, produksi hormon, lipolisis di depot lemak dan SSP.

Senyawa ini terbentuk bila membran sel mengalami kerusakan

oleh suatu rangsangan kimiawi, fisik atau mekanis, maka enzim

fosfolipase diaktifkan untuk mengubah fosfolipida yang terdapat di

daerah tersebut menjadi asam arakidonat yang kemudian

sebagiannya diubah oleh enzim siklooksigenase menjadi asam

enderoperoksida dan seterusnya menjadi zat – zat prostaglandin.

Bagian lain dari arakidonat diubah oleh enzim lipoksigenase

menjadi zat-zat leukotrien (Tjay & Rahardja, 2007).

20


Gambar 5 Diagram metabolisme asam arakidonat

(Tjay dan Rahardja, 2007)

e. TNF dan IL-1

TNF dan IL-1 merupakan sitokin utama yang memediasi

inflamasi. Kedua sitokin ini terutama diproduksi oleh sel-sel

makrofag aktif. Kerjanya yang paling penting dalam proses

inflamasi meliputi efek pada endothelium, leukosit, dan induksi

reaksi sistemik fase akut. Sekresi TNF dan IL-1 distimulasi oleh

endotoksin, kompleks imun, toksin, jejas fisik, dan berbagai

produk inflamasi. TNF dan IL-1 menginduksi aktivasi endotel

yang meliputi induksi molekul adhesi endotel dan mediator kimia

(sitokin lainnya seperti IL-6, IL-8, faktor pertumbuhan, PGI2, PAF

Fosfolipidamembran sel

Lipooksigenase

Asam arakidonat

Siklooksigenase

Asamhidroperoksida

Endoperoksida

LeukotrienPeradangan,

vasokonstriksi,dan

permeabilitasmeningkat

COX - 1 COX - 2

Tromboksan(TXA2)

Vasokonstriksi,bronko -

konstriksi, danagregasi

meningkat

Prostasiklin(PGI2)

Proteksilambung,

vasodilatasi,dan

antiagregasi

Prostaglandin(PGE2/ PGF2)Peradangan

21


dan nitrit oksida). Kedua sitokin ini juga menginduksi enzim-

enzim yang berkaitan dengan remodeling matriks dan peningkatan

trombogenisitas endotel.

IL-1 dan TNF menginduksi respon fase akut sistemik yang

menyertai infeksi atau jejas seperti demam, anoreksia, letargi,

neutrofilia, pelepasan kortikotropin serta kortikosteroid, dan efek

hemodinamik akibat oleh syok septik-hipotensi, penurunan

resistensi vaskular, peningkatan frekuensi jantung serta asidosis.

Gambar 6 Berbagai efek utama yang ditimbulkan oleh IL-1

dan TNF pada inflamasi (Richard, 2006)

Produk bakteri,kompleks imun,

toksin, jejas fisik,sitokin lainnya

AKTIVASIMAKROFAG

(dan sel lainnya)

IL-1 / TNF

Reaksi Fase AkutDemam, tidur, seleramakan, protein fase akutmeningkat, efekhemodinamik (syok),neutrofilia

Efek EndotelialDaya rekat leukosit, sintesisPGI, aktivitas prokoagulanmeningkat, aktivitasantikoagulan menurun, IL-1,IL-8, IL-16, PDGFmeningkat

Efek FibroblasProliferasi, sintesis kolagen,kolagenase, protease,sintesis PGE meningkat

Efek LeukositSekresi sitokin meningkat

22


2.5 Obat Anti Inflamasi

2.5.1 Obat Anti Inflamasi Steroid

Kortikosteroid seperti deksametason, prednison, prednisolon,

seringkali digunakan sebagai obat anti inflamasi. Kelompok obat ini

dapat mengendalikan anti inflamasi dengan menekan atau mencegah

banyak komponen dari proses inflamasi pada tempat cedera.

Kortikosteroid disintesis secara alami di korteks adrenal dan

merupakan hasil biosintesis dari kolesterol. Mekanisme kerja anti

inflamasi steroid adalah mengambat berbagai sel yang memproduksi

faktor-faktor penting untuk membangkitkan respon radang (Gilman,

2008).

2.5.2 Obat Anti Inflamasi Non Steroid

Obat – obat yang termasuk dalam golongan ini adalah

indometasin, asam mefenamat, ibu profen, asam salisilat, diklofenak,

dan fenilbutazon. Mekanisme kerja dari obat ini adalah menghambat

sintesis prostaglandin atau siklooksigenase, dimana enzim tersebut

mengkatalisis pembentukan asam arakidonat menjadi prostaglandin

dan tromboksan (Gilman, 2008).

2.6 Uji Aktivitas Anti inflamasi Metode Stabilisasi Membran Eritrosit

Berbagai metode dapat digunakan untuk menguji aktivitas anti

inflamasi dari suatu obat, kandungan kimia, maupun herbal. Metode yang

dapat dilakukan secara in vivo antara lain pembentukan edema buatan,

eritema, iritasi dengan panas, pembentukan kantong granuloma, iritasi pleura,

dan penumpukan kristal sinovitis (Vogel, 2002 & Turner, 1965). Selain itu,

metode in vitro juga dapat dilakukan unutk menguji aktivitas anti inflamasi,

antara lain pelepasan fosforilasi oksidatif (ATP), menghambat denaturasi

protein, stabilisasi membran eritrosit, stabilisasi membran lisosomal,

pengujian fibrinolitik dan agregasi platelet (Oyedapo et al., 2010).

23


Sel darah merah manusia (eritrosit) telah digunakan sebagai suatu

model untuk mempelajari interaksi antara obat dengan membran. Obat-obatan

seperti anastetik transquilisers dan obat anti inflamasi non steoid dapat

menstabilkan eritrosit untuk melawan terjadinya haemolisis hipotonik pada

konsentrasi rendah. Ketika sel darah merah mengalami stress hipotonik,

pelepasan hemoglobin (Hb) dari sel darah merah dapat dicegah oleh agen anti

inflamasi (Kumar, 2011).

Membran sel darah merah merupakan analog dari membran lisosomal.

Enzim lisosomal yang dilepaskan selama inflamasi menyebabkan berbagai

gangguan pada jaringan, kerusakan makromolekul, dan peroksidasi lipid yang

dianggap dapat bertanggung jawab pada kondisi patologis tertentu seperti

serangan jantung, syok septik, rheumatoid artritis, dan lain - lain. Aktivitas

ekstraseluler dari enzim ini dianggap berhubungan pada inflamasi akut dan

kronik (Chippada et al., 2011).

Stabilisasi dari membran lisosomal merupakan hal yang sangat penting

pada respon inflamasi dengan menghambat pelepasan konstituen lisosomal

yang mengaktifkan neutrofil seperti enzim, bakterisidal, dan protease, yang

dapat menyebabkan peradangan pada jaringan dan kerusakan selama extra

cellular release atau dengan menstabilkan membran lisosomal (Kumar et al.,

2011).

Kerusakan pada membran lisosomal biasanya memicu pelepasan

fosfolipase A2 yang menyebabkan hidrolisis fosfolipid untuk memproduksi

mediator inflamasi. Stabilisasi membran pada sel ini menghambat lisis dan

pelepasan isi dari sitoplasma yang ikut membatasi kerusakan jaringan dan

eksaserbasi dari respon inflamasi. Oleh karena itu, diharapkan senyawa

dengan aktivitas penstabil membran dapat memberikan perlindungan secara

signifikan pada membran sel dalam melawan pelepasan zat-zat penyebab luka

(Karunanithi, 2012).

24


2.7 Spektofotometri UV-Vis

Metode spektrofotometri ultraviolet dan sinar tampak telah banyak

diterapkan untuk penetapan senyawa-senyawa organik yang umumnya

dipergunakan untuk penentuan senyawa dalam jumlah yang sangat kecil.

Prinsip kerjanya berdasarkan pada penyerapan cahaya atau energi radiasi oleh

suatu larutan. Jumlah cahaya atau energi radiasi yang diserap memungkinkan

pengukuran jumlah zat penyerap dalam larutan secara kuantitatif (Triyati,

1985).

Spektrum elektromagnetik pada spektrofotometri UV-Vis adalah 200-

750 nm. Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang 200-400 nm,

sementara sinar tampak mempunyai panjang gelombang 400 - 750 nm

(Gholib, 2007).

Metode spektrofotometri ultraviolet dan sinar tampak didasarkan pada

penggunaan hukum Lambert-Beer. Hukum tersebut menyatakan bahwa

jumlah radiasi cahaya tampak, ultraviolet dan cahaya-cahaya lain yang diserap

atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari

konsentrasi zat dan tebal larutan (Triyati, 1985). Hubungan antara intensitas,

tebal medium dan konsentrasi zat digambarkan dengan persamaan yang sesuai

dengan Hukum Lambert-Beers, yakni :

Keterangan :

A : Absorban

a : absorptivitas

b : tebal kuvet (cm)

c : konsentrasi

A = a . b . c

25


Mekanisme kerja spektrofotometer UV –Vis dapat diuraikan sebagai

berikut :

1. suatu sumber cahaya dipancarkan melalui monokromator.

2. Monokromator menguraikan sinar yang masuk dari sumber cahaya

tersebut menjadi pita-pita panjang gelombang yang diinginkan untuk

pengukuran suatu zat tertentu, yang menunjukkan bahwa setiap gugus

kromofor mempunyai panjang gelombang maksimum yang berbeda.

3. Dari monokromator tadi cahaya/energi radiasi diteruskan dan diserap

oleh suatu larutan yang akan diperiksa di dalam kuvet.

4. Kemudian jumlah cahaya yang diserap oleh larutan akan menghasilkan

signal elektrik pada detektor, yang mana signal elektrik ini sebanding

dengan cahaya yang diserap oleh larutan tersebut.

5. Besarnya signal elektrik yang dialirkan ke pencatat dapat dilihat sebagai

angka (Triyati, 1985).


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat Dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari-Agustus 2014 di

Laboratorium Kelompok Bahan Kesehatan, Bidang Proses Radiasi, Pusat

Aplikasi Isotop dan Radiasi (PAIR), Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN)

Jalan Lebak Bulus Raya No.9 Pasar Jumat Jakarta Selatan serta di Laboratorium

Pharmacy Sterile Technology (PST). FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2 Bahan

3.2.1 Bahan Uji

Bahan uji yang digunakan adalah kitosan yang diproduksi oleh

(Badan Tenaga Nuklir Nasional) BATAN, Pusat Aplikasi Isotop dan

Radiasi (PAIR) dan sel darah merah manusia.

3.2.2 Bahan Kimia

Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah

NaCl (Merck), dapar posfat pH 7,4 (0,15 M), natrium diklofenak (P.T

Indofarma), asam asetat (Merck), natrium asetat (Merck), natrium

hidroksida, alkohol, dan aquades.

3.3 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari Iradiator gamma

IRKA, Spektrofotometer UV-Vis (U 2910), sentrifugator, tabung EDTA,

tabung sentrifus, autoklaf (All American), spuit, gelas ukur, timbangan analitik

(Acculab BL-2015), pH meter, water bath, gelas kimia, labu ukur, labu

erlemeyer, mikropipet, tips, pipet tetes, batang pengaduk, spatula, termometer,

viskometer Ostwald (Cannon P 865), laminar air flow, NMR (Jeol JNM ECA-

500), kuvet, dan kaca arloji.

27


3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Penyiapan Kitosan

Kitosan yang akan digunakan, diproduksi oleh BATAN.

Kitosan ini berasal dari limbah kulit udang yang diambil bagian

punggungnya. Selanjutnya diproses secara kimiawi melalui proses

deproteinasi, demineralisasi, dan deasetilasi.

3.4.2 Iradiasi

Pada proses ini dilakukan iradiasi terhadap kitosan. Sumber

radiasi menggunakan radiasi gamma 60Co dengan berbagai dosis

iradiasi. Kitosan dikemas dalam 3 (tiga) kantong plastk klip dan masing-

masing diberi label 50, 100, dan 150 kGy. Kemudian kitosan yang telah

dikemas tersebut di masukan kedalam iradiator. Iradiasi dilakukan

dengan kecepatan dosis 10 kGy/jam.

3.4.3 Perhitungan Derajat Deasetilasi

Derajat deasetilasi diukur menggunakan instrument 1H NMR.

Kitosan dilarutkan dalam D2O dan asam asetat D2O. Kemudian kitosan

yang telah dilarutkan diinjeksikan kedalam insterumen 1H NMR (Jeol

JNM ECA-500).

3.4.4 Perhitungan Bobot Molekul

Dibuat larutan kitosan dari setiap dosis iradiasi dengan

konsentrasi 0,1%, 0,2%, 0,3%, dan 0,4% dalam larutan buffer asetat pH

4,3. Kemudian didiamkan selama 24 jam. Setelah itu sebanyak 10 mL

pelarut dimasukkan ke dalam tabung viskometer Ostwald dalam media

air pada suhu 25°C. Lalu cairan dihisap dengan menggunakan pushball

sampai melewati 2 batas. Kemudian siapkan stopwatch, lalu kendurkan

cairan sampai batas pertama lalu mulai penghitungan. Hasil yang

diperoleh dicatat. Pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali. Langkah

28


yang sama juga dilakukan pada masing-masing larutan kitosan.

Viskositas spesifik dihitung dengan persamaan dibawah ini :

ƞsp=dimana ƞsp adalah viskositas spesifik, t2 adalah waktu alir untuk larutan

dan t1 adalah waktu alir untuk pelarut Viskositas intrinsik diperoleh

dengan memplotkan hasil ƞsp/C terhadap C. Kemudian bobot molekul

kitosan dihitung dengan menggunakan persamaan Mark-Houwink.

[ƞ] = kMvα

Keterangan:

[ƞ] = viskositas intrinsic (mL/gr)

Mv= berat molekul viskositas rata-rata

k dan α = tetapan khas untuk polimer dan pelarutnya

( k = 1,181 x 10-3 & α = 0,93 pada suhu 25°C )

(Hwang et al., 2000)

3.4.5 Uji Aktivitas Anti inflamasi Metode Stabilisasi Membran Eritrosit

3.4.5.1 Pembuatan Larutan yang Dibutuhkan

a. Pembuatan Dapar Posfat (0,15 M pH 7,4)

Sebanyak 2,67 gram dinatrium hydrogen posfat

dihidrat (Na2HPO4. 2H2O) dilarutkan dalam 100 mL

aquades. Kemudian sebanyak 2,07 gram natrium

dihidrogen posfat monohidrat (NaH2PO4 . H2O) dilarutkan

dalam 100 mL aquades. Kemudian 81 mL larutan

Na2HPO4. 2H2O (0,15 M) dicampurkan dengan 19 mL

larutan NaH2PO4 . H2O (0,15 M) pada suhu ruang (Ruzin,

1999). Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf

121°C selama 15 menit.

29


b. Pembuatan Larutan Isosalin

Sebanyak 0,85 gram NaCl dilarutkan dalam dapar

posfat 0,15 M pH 7,4 kemudian di add hingga volumenya

100 mL (Kumar et al., 2011 dan Oyedapo et al., 2010).

Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf 121°C

selama 15 menit.

c. Pembuatan Larutan Hiposalin

Sebanyak 0,25 gram NaCl dilarutkan dalam dapar

posfat 0,15 M pH 7,4 kemudian di add hingga volumenya

100 mL (Kumar et, al., 2011 dan Oyedapo et al., 2010).

Kemudian di sterilisasi menggunakan autoklaf 121°C

selama 15 menit.

d. Penyiapan Konsentrasi Sampel Uji Dan Na Diklofenak

5 mg kitosan dari masing-masing dosis radiasi

dilarutkan dalam 0,5 mL asam asetat lalu diencerkan

dengan aquades sampai 50 mL (100 ppm) pada suhu ruang.

Kemudian 5 mg Na diklofenak dilarutkan dalam 0,5 mL

NaOH lalu diencerkan dengan aquades sampai 50 mL

(100 ppm) pada suhu ruang.

3.4.5.2 Pembuatan Suspensi Sel Darah Merah

Sel darah manusia dikumpulkan dari volunteer yang

tidak mengonsumsi NSAID selama 2 minggu. Sel darah merah

tersebut di masukan kedalam tabung EDTA, kemudian

didiamkan selama 24 jam. Supernatan yang diperoleh

dipisahkan, kemudian residu yang diperoleh dipindahkan

kedalam tabung sentrifus dan ditambahkan isosalin hingga 8

mL. Sentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit pada suhu

27°C. Supernatan yang dihasilkan dipisahkan, kemudian residu

yang dihasilkan dicuci kembali dengan menggunakan larutan

30


isosalin dan disentrifugasi kembali. Proses tersebut diulangi

sebanyak 3 kali hingga larutan isosalin berwarna jernih. Lalu

dibuat suspensi sel darah merah 10% dengan mencampurkan

sejumlah volume sel darah dan diresuspensi menggunakan

larutan isosalin (Oyedapo et al., 2010)

3.4.5.3 Pengujian Aktivitas Anti Inflamasi Kitosan Terhadap

Stabilisasi Membran Eritrosit

a. Pembuatan Larutan Uji

Dibuat larutan uji dengan mencampurkan 1 ml

larutan sampel, 1 ml dapar posfat, 2 ml hiposalin dan 0,5

ml suspensi 10% sel darah merah.

b. Pembuatan Larutan Kontrol Positif

Dibuat dengan mencampurkan 1 ml larutan Na

diklofenak, 1 ml dapar posfat, 2 ml hiposalin, dan 0,5 ml

suspensi 10% sel darah merah.

c. Pembuatan Larutan Kontrol Larutan Uji

Dibuat dengan mencampurkan 1 ml larutan

sampel, 1 ml dapar posfat, 2 ml hiposalin, dan 0,5 ml

larutan isosalin sebagai pengganti suspensi sel darah

merah.

d. Pembuatan Kontrol Negatif

Dibuat dengan mencampurkan 1 ml aquades

sebagai pengganti larutan sampel, 1 ml dapar posfat, 2 ml

hiposalin, dan 0,5 ml suspensi 10% sel darah merah.

Setiap larutan kemudian diinkubasi pada suhu 56°C selama 30

menit dan disentrifugasi kembali pada 5000 rpm selama 10

menit. Cairan supernatan yang diperoleh mengandung

hemoglobin, cairan tersebut diambil dan diukur absorbansinya

31


pada panjang gelombang 560 nm dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis. Hasilnya kemudian dimasukan ke

dalam rumus dibawah ini :

%= 100 − { − x 100%}(Oyedapo et al., 2010)

3.4.6 Analisa Data

Data yang diperoleh dianalisis dengan uji Saphiro Wilk untuk

melihat distribusi data dan dianalisis dengan uji Levene untuk melihat

homogenitas data. Jika data terdistribusi normal dan homogenitas maka

dilanjutkan dengan uji Analisis of Varians (ANOVA) satu arah dengan

taraf kepercayaaan 95% sehingga dapat diketahui apakah perbedaan

yang diperoleh bermakna atau tidak. Jika terdapat perbedaan bermakna,

dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) dengan metode LSD

(Santoso, 2008).


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

4.1.1. Hasil Derajat Deasetilasi Kitosan

Kitosan dihasilkan dari kulit udang yang diperoleh dari proses

deasetilasi (penghilangan gugus asetil) senyawa kitin. Kitosan produksi

BATAN yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari kulit udang yang

diambil bagian punggungnya saja. Kulit udang tersebut kemudian diproses

menjadi kitin melalui dua tahapan yaitu pemisahan protein (deproteinasi) dan

pemisahan mineral (demineralisasi). Proses deproteinasi dan demineralisasi

yang dilakukan masing –masing menggunakan NaOH 1 N dan HCl 1 N. Setelah

melalui dua tahapan tersebut dilakukan proses deasetilasi untuk menghasilkan

kitosan. Proses deasetilasi yang dilakukan menggunakan NaOH dengan

konsentrasi 50% selama 8 jam sambil dipanaskan pada suhu 95°C.

Untuk mengetahui berapa banyak kitosan yang telah terbentuk maka

dilakukan pengukuran derajat deasetilasi. Spektroskopi NMR merupakan salah

satu metode yang paling akurat untuk mengukur derajat deasetilasi. Pada

penelitian ini digunakan dua sampel kitosan, kitosan non radiasi dan kitosan

yang diiradiasi dengan dosis 75 kGy. Lampiran 6 menunjukkan spektrum NMR

dari kitosan hasil iradiasi dan non radiasi. Derajat deasetilasi dapat dihitung

dengan menggunakan integral dari peak proton H1 N-glukosamin, peak proton

H1 N-Asetilglukosamin, dan peak dari tiga proton pada gugus asetil (H-Ac).

Hasil perhitungan Derajat Deasetilasi (DDA) dari kitosan iradiasi dan

non radiasi dapat dilihat pada tabel 1.1.

33


Tabel 1.1 Derajat Deasetilasi (DDA) Kitosan Radiasi dan Non Radiasi

Dosis Radiasi

(kGy)

Integral ProtonDDA (%)

IH1-GlcN IH1-GlcNAc

0 0,839 0,029 96,66

75 1 0,063 94,07

dimana IH1-GlcN adalah integral H dari N-Glukosamin dan IH1-GlcNAc adalah

integral H dari N-Asetilglukosamin. Derajat deasetilasi kitosan non radiasi

sebesar 96,66% dan kitosan radiasi sebesar 94,07%.

4.1.2. Hasil Berat Molekul Kitosan

Berat molekul kitosan diukur menggunakan viskometer Otswald Cannon

P 865. Setiap konsentrasi larutan uji diukur pada suhu 25°C. Setelah dilakukan

pengukuran diperoleh nilai pada tabel 1.2.

Tabel 1.2 Tabel Waktu Alir Rata-Rata Tiap Konsentrasi Larutan

Dosis Radiasi

(kGy)

Waktu Alir Rata-Rata (detik) Tiap Konsentrasi

0,1% 0,2% 0,3% 0,4%

0 78,99 168,86 295,65 497,69

50 51,73 70,42 94,76 126,16

100 38,44 46,18 53,92 62,12

150 37,39 43,25 50,09 57,42

Pada tabel diatas dapat dilihat bahwa semakin tinggi dosis radiasi maka semakin

cepat waktu yang dibutuhkan oleh masing-masing larutan untuk mengalir pada

pipa kapiler dengan jarak tertentu. Hasil menunjukan bahwa semakin besar

konsentrasi larutan uji maka semakin lama waktu yang dibutuhkan untuk

mengalir pada pipa kapiler. Hasil yang diperoleh pada tabel diatas kemudian

diukur viskositas spesifiknya. Hasil perhitungan viskositas spesifik dapat dilihat

pada tabel 1.3

34


Tabel 1.3 Tabel Viskositas Spesifik dari Berbagai Dosis Radiasi

Dosis Radiasi

(kGy)

Ƞsp dari Masing-Masing Konsentrasi Larutan

0,1% 0,2% 0,3% 0,4%

0 1,464 4,269 8,225 14,528

50 0,614 1,197 1,957 2,936

100 0,199 0,441 0,682 0,938

150 0,167 0,349 0,563 0,792

Ƞsp = 2 − 11dimana t1 adalah waktu yang dibutuhkan pelarut untuk mengalir pada pipa

kapiler yaitu 32,053 detik dan t2 adalah waktu yang dibutukan masing-masing

larutan untuk mengalir pada pipa kapiler. Dari hasil perhitungan dapat diperoleh

hasil bahwa semakin tinggi dosis radiasi maka semakin kecil nilai viskositas

spesifik dimana nilai viskositas spesifik semakin meningkat dengan

meningkatnya konsentrasi larutan. Nilai viskositas spesifik yang diperoleh

kemudian diplotkan dalam grafik Ƞsp/C dan diperoleh nilai viskositas intrinsik

seperti pada tabel dibawah ini.

Tabel 1.4 Tabel Viskositas Intrinsik dan Berat Molekul

Dosis Radiasi

(kGy)α K [Ƞ]

Mv

(Da)

0 0,93 1,181x10-3 11,4 19.256,405

50 0,93 1,181x10-3 4,9 7.767,204

100 0,93 1,181x10-3 2,1 3.123,135

150 0,93 1,181x10-3 1,6 2.362,672

[Ƞ] = K x Mvα

dimana α dan K adalah konstanta yang ditentukan berdasarkan pelarut yang

digunakan, yaitu α = 0,93 dan K = 1,181x10-3. Hubungan dosis radiasi dengan

berat molekul dapat dilihat dengan jelas pada grafik dibawah ini.

35


Gambar 7. Grafik Hubungan Dosis Radiasi dengan Berat Molekul Kitosan

Berdasarkan grafik diatas dapat dilihat bahwa kitosan non radiasi mempunyai

berat molekul viskositas (Mv) sebesar 19.256,405 dalton sedangkan kitosan

hasil radiasi mempunyai berat molekul yang lebih rendah. Hal ini menunjukan

bahwa radiasi dapat menyebabkan pemutusan pada rantai utama kitosan dan

menyebabkan penurunan berat molekul kitosan. Semakin tinggi dosis radiasi

yang digunakan maka semakin rendah berat molekul yang dihasilkan.

4.1.3. Hasil Uji Efek Stabilisasi Membran Sel Darah Merah (SDM)

Kitosan Hasil Iradiasi dan Non Radiasi

Stabilisasi membran sel darah merah merupakan salah satu metode

yang digunakan sebagai metode untuk mengetahui aktivitas anti inflamasi

secara invitro. Pengukuran dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis

dimana absorbansi diukur pada λ 560 nm. Panjang gelombang 560 nm

digunakan karena pada panjang gelombang tersebut dapat terukur serapan

hemoglobin yang terdapat dalam larutan uji. Dari hasil pengamatan dan

perhitungan yang telah dilakukan, didapatkan persen stabilitas membran sel

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

0 50 100 150

Bera

t Mol

ekul

(Da)

Dosis Radiasi (kGy)

36


darah merah pada tabel 1.5 dan gambar 8 serta perhitungannya pada lampiran

14.

Tabel 1.5 Efek Stabilisasi membran SDM dari larutan uji dan kontrolpositif terhadap induksi panas dan larutan hipotonik padakonsentrasi 100 ppm.

Larutan A Larutan A % SRata-rata

% S

Uji I

(Kitosan 0 kGy)

1,067Kontrol

Lar.Uji I

0,011 24,83

25,051,091 0,010 23,06

1,032 0,010 27,25

Uji II

(Kitosan 50 kGy)

0,971Kontrol

Lar.Uji II

0,010 31,60

36,270,811 0,011 43,06

0,933 0,008 34,16

Uji III

(Kitosan 100 kGy)

0,627Kontrol

Lar.Uji III

0,012 56,22

55,870,647 0,013 54,87

0,622 0,011 56,51

Uji IV

(Kitosan 150 kGy)

0,898Kontrol

Lar.Uji IV

0,011 36,86

39,920,897 0,012 37,01

0,771 0,011 45,90

Uji V

(Na Diklofenak)

0,622Kontrol

Lar.Uji V

0,002 55,87

55,580,685 0,003 51,45

0,572 0,002 59,43

Keterangan :

A : Absorbansi

%S : Persentase Stabilitas Membran SDM

Persentase stabilitas membran sel darah merah dihitung dengan rumus dibawah

ini :% = 100 − { − x 100%}

37


Gambar 8. Stabilisasi membran SDM rata-rata dari larutan uji dan kontrol

positif terhadap induksi panas dan larutan hipotonik.

Berdasarkan perhitungan hasil uji aktivitas anti inflamasi dengan

menggunakan metode stabilisasi membran sel darah merah manusia,

menunjukkan bahwa kitosan hasil iradiasi dengan dosis 100 kGy mempunyai

aktivitas tertinggi sebagai anti inflamasi. Hal ini juga ditunjang dengan analisa

secara statistik, yang menunjukkan bahwa kitosan hasil iradiasi 100 kGy

berbeda secara bermakna terhadap larutan uji yang lain namun identik terhadap

Na diklofenak sebagai kontrol positif.

4.1.4. Hasil Analisa Statistik

Data persen stabilitas membran sel darah merah kitosan 0 kGy, 50

kGy, 100 kGy,dan 150 kGy pada konsentrasi 100μg/ml dilakukan uji

persyaratan yaitu uji normalitas dan uji homogenitas. Hasil uji normalitas

Shapiro-Wilk dan uji homogenitas Levene menunjukkan bahwa data nilai persen

stabilitas membran sel darah merah terdistribusi normal dan homogen (p≥0,05).

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

Kito 0% Stabilitas 25.05

Pers

enta

se S

tabi

litas

(%)

37

















Kito 0 Kito 50 Kito 100 Kito 150 Na Diklo25.05 36.28 55.87 39.93 55.59

37

















Na Diklo55.59

Kito 0

Kito 50

Kito 100

Kito 150

Na Diklo

38


Tabel 1.6 Nilai Persen Rata-Rata Stabilitas Membran Sel Darah Merah

Kitosan dan Natrium Diklofenak pada Konsentrasi 100 ppm

Sampel Uji % Rata-rata Stabilitas

Natrium Diklofenak 55,58

Kitosan 0 kGy 25,05

Kitosan 50 kGy 36,27



Hasil analisa statistik ANOVA menunjukkan bahwa persen stabilitas

berbeda secara bermakna (p

39


(%) = x 100 (1)(%) = [1 − x 100 (2)(%) = x 100 (3)

Formula (1) dan (2) tidak dapat digunakan karena peak pada H-Ac mengalami

overlapping dengan asam asetat pada sampel (Lavertu, 2003). Oleh karena itu

perhitungan DDA hanya dapat dihitung dengan menggunakan formula (3). Dari

hasil pengamatan diperoleh DDA kitosan non radiasi sebesar 96,658% dan

DDA kitosan hasil iradiasi sebesar 94,073%. Hasil ini menunjukkan bahwa

proses deasetilasi kitin menjadi kitosan yang dilakukan oleh BATAN telah

mampu menghasilkan kitosan dengan derajat deasetilasi yang tinggi. Proses

deasetilasi kitin menjadi kitosan yang dilakukan menggunakan NaOH dengan

konsentrasi 50% selama 8 jam sambil dipanaskan pada suhu 95°C.

Derajat deasetilasi yang tinggi menunjukan semakin banyak gugus asetil

yang diubah menjadi gugus amino. Gugus amino bebas dalam bentuk NH2

maupun dalam keadaan terprotonasi NH3+ dapat berpengaruh terhadap aktivitas

biologis yang dimiliki oleh kitosan. Beberapa penelitian menunjukan bahwa

derajat deasetilasi yang tinggi dapat meningkatkan aktivitas biologis yang

dimiliki kitosan (Park et.al.,2011). Berdasarkan hasil ini juga dapat dilihat

bahwa radiasi tidak menyebabkan peningkatan derajat deasetilasi kitosan karena

radiasi tidak menyebabkan pemutusan pada gugus asetil pada stuktur kitin.

4.2.2. Berat Molekul Kitosan

Berat molekul dapat mempengaruhi karakteristik fisika dari suatu

polimer seperti kitosan. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk mengukur

berat molekul kitosan adalah metode viskometer menggunakan viskometer

40


Cannon. Metode ini mempunyai beberapa keuntungan yaitu lebih mudah, lebih

cepat, dan cara perhitungannya yang sederhana.

Prinsip pengukuran dengan menggunakan metode ini adalah dengan

mengukur waktu yang dibutuhkan oleh sejumlah cairan tertentu untuk mengalir

pada pipa kapiler pada jarak tertentu dan gaya yang disebabkan oleh berat cairan

itu sendiri. Dari tabel 1.4 terlihat bahwa kitosan yang tidak diradiasi mempunyai

berat molekul viskositas (Mv) sebesar 19.256,405 dalton. Iradiasi dengan dosis

50, 100, dan 150 kGy menyebabkan penurunan berat molekul kitosan menjadi

masing-masing 7.767,204 Da, 3.123,135 Da, dan 2.362,672 Da. Hal ini

menunjukan bahwa semakin tinggi dosis radiasi yang digunakan maka semakin

kecil berat molekul yang dihasilkan. Hal tersebut disebabkan karena radiasi

menyebabkan pemutusan rantai utama kitosan pada ikatan 1,4 glikosida sehingga

menjadi kitosan dengan rantai yang lebih pendek. Semakin pendek jumlah rantai

polimer maka semakin kecil berat molekulnya. Polimer dengan jumlah rantai

yang panjang mempunyai berat molekul yang besar dan viskositas yang besar

pula.

4.2.3. Stabilisasi Membran Sel Darah Merah

Stabilisasi membran sel darah merah merupakan salah satu metode yang

dapat digunakan untuk menguji aktivitas anti inflamasi secara invitro. Hal ini

disebabkan karena membran sel darah merah manusia analog dengan membran

lisosom yang dapat mempengaruhi proses inflamasi. Stabilitas membran lisosom

ini dapat membatasi respon inflamasi yang terjadi dengan cara mencegah

pelepasan isi dari lisosom yang dapat mengaktifkan neutrofil seperti enzim dan

protease yang dapat menyebabkan kerusakan pada jaringan dan cairan

ekstraseluler. Oleh karena itu stabilitas membran sel darah merah yang diinduksi

dengan panas dan larutan hipotonik dapat digunakan sebagai ukuran untuk

mengetahui stabilitas membran lisosom (Chippada et.al,. 2011).

Kestabilan sel darah merah manusia dapat dilihat ketika sel darah merah

diinduksi oleh panas maupun stress hipotonik. Hal tersebut menyebabkan

41


terbentuknya stress oksidatif yang dapat menggangu kestabilan biomembrannya.

Stress oksidatif dapat menyebabkan oksidasi lipid dan protein sehinggu memicu

kerusakan membran yang ditandai dengan terjadinya hemolisis. Besar kecilnya

hemolisis yang terjadi pada membran sel darah merah yang diinduksi panas dan

larutan hipotonik dijadikan sebagai ukuran untuk mengetahui aktivitas anti

inflamasi dari kitosan (Kumar, 2011).

Aktivitas anti inflamasi dari kitosan dapat dilihat dari adanya penurunan

absorbansi pada campuran larutan uji. Semakin kecil nilai absorbansi yang

dihasilkan maka semakin kecil hemolisis yang terjadi, sehingga semakin besar

aktivitas anti inflamasi yang dimiliki oleh sampel. Pengukuran absorbansi

dilakukan pada panjang gelombang 560 nm dengan Na diklofenak sebagai kontrol

positif. Na diklofenak digunakan sebagai kontrol positif karena Na diklofenak

merupakan obat anti inflamasi non steroid yang bekerja dengan cara mencegah

pelepasan mediator anti inflamasi sehingga dapat menghambat sintesis

prostaglandin atau siklooksigenase (Gilman et al., 1985). Selain itu Na diklofenak

dipilih karena Na diklofenak merupakan OAINS yang banyak digunakan untuk

mengobati inflamasi serta mudah didapatkan. Dari hasil pengamatan yang

dilakukan pada kitosan 0, 50, 100, dan 150 kGy pada konsentrasi 100 ppm,

kitosan 100 kGy memiliki aktivitas anti inflamasi yang lebih besar. Konsentrasi

100 ppm dipilih karena berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Yousef et.al,.

2012 konsentrasi 100 ppm dapat menekan induksi bakteri lipopolisakarida (LPS)

dan sitokin TNF-α yang dapat berpengaruh pada jalur patogenesis penyakit

radang usus.

Hasil persentase stabilitas kitosan 0 kGy sebesar 25,05%, kitosan 50

kGy sebesar 36,27%, kitosan 100 kGy sebesar 55,87%, dan kitosan 150 kGy

sebesar 39,92%. Kitosan 100 kGy mempunyai aktivitas anti inflamasi yang paling

besar, dimana hasil ini juga sebanding dengan persen stabilitas Na diklofenak

yaitu sebesar 55,58%. Hal ini juga ditunjang dengan analisa statistik dimana

kelompok perlakuan kitosan 100 kGy mempunyai nilai signufikansi yang lebih

42


dari 0,05 dibandingkan dengan kitosan 0, 50, dan 150 kGy, namun sebanding

dengan nilai signifikansi Na diklofenak sebagai kontrol positif.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Leelaprakash dan Mohan

2010, Na diklofenak pada konsentrasi 100 ppm mampu menghambat hemolisis

sel darah merah sebesar 51%. Penelitian lain yang dilakukan oleh Mittal et.al

,.2013 juga menyebutkan bahwa Na diklofenak pada konsentrasi 100 ppm

mempunya

New UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA EFEK IRADIASI GAMMA … · 2015. 2. 12. · UIN SYARIF...

Documents

Transcript of New UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA EFEK IRADIASI GAMMA … · 2015. 2. 12. · UIN SYARIF...