III. TEKNIK PEWARNAAN GRAM IDENTIFIKASI BAKTERI

Tujuan:

1. Mempelajari cara menyiapkan olesan bakteri dengan baik sebagai

prasyarat untuk memeplajari teknik pewarnaan

2. Mempelajari cara melakukan pewarnaan sederhana bakteri untuk

mengamati bagian atau struktur bakteri

3. Mempelajari prosedur pewarnaan gram, memahami tahapan prosedur dan

reaksi kimiawi yang terlibat dalam prosedur

Pendahuluan

Bakteri berukuran sangat kecil dan tipisa sehingga sukar dilihat struktur

tubuhnya walaupun dengan bantuan mikroskop. Untuk melihat morfologi bakteri

secara lebih jelas dikembangkan teknik pewarnaan bakteri. Prinsip pewarnaan

bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna dengan ion protoplasma sel.

Ada dua kelompok zat pewarna bakteri.(1) bersifat asam, berupa anion dan

umum digunakan dalam bentuk garam natrium. (2) bersifat alkalis, berupa kation

dan umum digunakan dalam bentuk klorida. Selain zat warna diperlukan zat

tambahan yang berfungsi untuk mengendapkan hasil rekasi zat warna dengan

komponen dinding sel bakteri. Zat tersebut dikenal dengan istilah zat pematek

yang akan melekatkan zat warna pada plasma sel. Contoh zat pematek adalah:

Amonium, fenol, Yodium, Asam tanat, Garam-garam Aluminium, Besi, Timah,

Seng, Tembaga, Chrom, dll. Pematek dapat ditambahkan sebelum pewarnaan,

ditambahkan ke dalam larutan zat warna atau saat diatara pewarnaan

menggunakan dua zat warna. Umumnya larutan zat warna dibuat dalam

konsentrasi kurang dari 1% untuk meningkatkan daya lekat warna pada dinding

sel bakteri.

Teknik pewarnaan bakteri dapat dibagi menjadi:

Pewarnaan sedehana atau tunggal, dengan menggunakan satu macam zat

warna seperti: Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.

Pewarnaan diferensial dengan menggunakan dua atau lebih zat warna.

Prosedur

1. Pewarnaan Sederhana

Bersihkan kaca objek dengan alkohol sehingga bebas dari lemak.

Kemudian panaskan diatas lampu spirtus.

Buat sediaan preparat dalam bentuk suspensi. Jika sampel berbentuk padat

gunakan NaCl fisiologis untuk membuat suspensi.

Pijarkan ose lalu dinginkan. Celupkan ose ke dalam suspensi bakteri dan

goreskan pada kaca objek. Jika bakteri yang akan diperiksa terdapat pada

medium padat(media agar), maka teteskan NaCl Fisiologis terlebih dahulu

pada kaca preparat kemudian goreskan bakteri tersebut dengan ose.

Keringkan preparat dengan mengangin-anginkan pada suhu ruang atau

dekat hawa hangat api, kemudian lalukan preparat diatas api bunsen

sebanyak 3 x.

Dinginkan preparat kemudian beri 5 tetes zat warna diatas suspensi yang

telah mengering dan diamkan selama 1-2 menit.

Zat warna yang berlebih dituang dari preparat dan dicuci dengan air yang

telah disediakan dalam botol semprot

Preparat dikeringkan dengan kertas saring atau dekat nyala api

Preparat kemudian ditetesi dengan sedikit minyak imersi pada bagian yang

akan diamati

Hasil yang diamati dicatat dan digambar

Hasil pewarnaan:

Dengan air fucshin sel bakteri berwarna merah

Dengan kristal violet sel bakteri berwarna violet

Dengan biru metilen sel bakteri berwarna biru

Hasil pengamatan:

1. Gambarkan bentuk sel bakteri yang saudara lihat

2. Apa tujuan pemanasan diatas nyala api

2. Pewarnaan Diferensial

Pewarnaan digunakan untuk mengetahui morfologi dan identifikasi jenis bakteri.

Pewarna yang digunakan dua atau lebih. Contoh pewarnaan diferensial adalah

pewarnaan Gram, pewarnaan Spora, pewarnaan kapsul, dll.

Pewarnaan Gram

Cara kerja

Siapkan preparat sampel dalam bentuk suspensi diatas kaca objek dan

keringkan dengan mengangin-anginkan atau meletakkannya dekat api.

Setelah itu lalukan di atas api sebnayak 3x.

Tetesi preparat tersebut dengan zat warna Karbol Gentian Violet. Diamkan

selama 30 detik. Buang zat warna berlebih.

Tambahkan zat pematek Lugol (Iodium : Kalium Iodium : Aquades = 1 :

2 : 300), selama 30 detik. Kemudian cuci dengan air

Bilas preparat dengan alkohol 96% selama 2 detik hingga zat warna larut

kemudian bilas dengan akuades.

Tetesi preparat dengan pewarna kedua. Diamkan selama 30 detik. Buang

kelebihan zat warna. Bilas dengan akuades.

Keringkan preparat dan diatasnya diberi satu tetes minyak imersi untuk

menghindarkan perbedaan indek bias. Amati di bawah mikroskop.

Catat hasil pengamatan.

Hasil :

Bakteri gram positif berwarna ungu dan

Bakteri negatif berwarna merah

Beberapa perbedaan bakteri gram positif dan negatif

Bakteri gram positif

Mangandung Mg Ribonukleat

Sangat sensitif terhadap zat warna trifenilmetan

Sensitif terhadap penisilin

Tahan basa, tidak larut dalam KOH 1%

Kisaran isoelelektrik pH 2,5 – 4

Biasanya berbentuk kokus atau batang pembentuk

Lactobacillus dan Cyanobacterium

spora kecuali

Dapat bersifat tahan asam

Contoh : Staphylococcus albus, Bacillus subtilis

Bakteri gram negatif

Tidak mengandung Mg ribonukleat

Kurang sensitif terhadap zat warna trifenilmetan

Sensitif terhadap streptomisin

Sensitive basa, larut dalam KOH 1%

Kisaran isoelektrik pH 4,5 – 5,5

Biasanya berbentuk batang non spora kecuali neisseria

Tidak tahan asam

Contoh : Salmonella thypii

Escericia coli

Pewarnaan Gram

Hasil dan pengamatan

1. Jelaskan bentuk sel, rangkaan dan warnanya

2. klasifikasikan mikroorganisme tersebut berdasarkan reaksi gram

3. apa keuntungan pewarnaan digerensial di bandingkan pewarnaan tunggal

3. Pewarnaan Negatif

Pewarnaan ini bertujuan untuk mengetahui morfologi bakteri yang tidak

dapat diwarnai dengan teknik sederhana. Sesuai namanya, yang diwarnai pada

teknik ini adalah latar belakang suspensi preparat menggunakan tinta cina,

sehingga mikroorganisme terlihat transparan diantara medan yang gelap.

Tujuannya adalah melihat morfologi bakteri.

Cara kerja :

1. Sediakan dua buah kaca objek yang bersih dan bebas dari lemak

2. Teteskan setetes tinta cina pada salah satu ujung kaca objek

3. Letakkan suspensi bakteri di samping tinta cina dengan menggunakan

kawat ose steril.

4. Dengan kaca objek yang kedua, kedua tetesan tersebut dicampurkan dan

diratakan dengan posisi 45o terhadap kaca objek dibawahnya. Selanjutnya

kaca objek tersebut didorong menuju ujung sebelahnya (diapus) sehingga

membentuk sebuah lapisan film yang tipis

5. Keringkan kaca objek tersebut, amati dibawah mikroskop

Hasil Pewarnaan

Bakteri berupa bagian bening pada latar yang gelap

a. Bakteri kotoran gigi

b. Menggunakan pewarna tinta cina

Pewarnaan Negatif

Gambarkan hasil pengamatan saudara