Validasi Metode dan Kualifikasi InstrumenOleh: Athina Mardatillah

Validasi

• Suatu tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa setiap bahan, proses, prosedur kegiatan, sistem, perlengkapan atau mekanisme yang digunakan dalam produksi dan pengawasan akan senantiasa mencapai hasil yang diinginkan (CPOB)

• Merupakan bagian penting dari program Penjaminan Mutu (Quality Assurance)• Sebagai upaya untuk memberikan jaminan terhadap khasiat, kualitas dan keamanan

produk-produk industri farmasi

Validasi Metode Analisis

• DefinisiProses penilaian terhadap parameter analitik tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi syarat untuk tujuan penggunaanya.

Tujuan Validasi Metode analisis

1. Memperoleh hasil analisis yang absah/valid, dapat dipercaya dan dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah

2. Memperoleh hasil analisis yang dapat menunjukkan kesesuaian dengan tujuan pengujian

Karakteristik Validasi Metode Analisis• Spesifitas (selektivitas)• Linieritas• Rentang (range)• Batas deteksi (LOD = Limit of Detection)• Batas kuantitasi (LOQ = Limit of Quantitation)• Akurasi (ketepatan/kecermatan)• Presisi (keseksamaan)• Rugeddness• Robustness

Spesifitas (Selektivitas)

• DefinisiSpesifitas : kemampuan metode analisis mengukur secara akurat & spesifik suatu analit dengan adanya komponen lain dalam matriks sampelSelektifitas :kemampuan metode analisis memberikan signal pada campuran analit dalam sampel tanpa adanya interaksi antar analit.

Spesifitas (Selektivitas)

Cara PenetapanDibandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil degradasi produk dengan sampel tanpa komponen di atas. Spesifitas dinyatakan sebagai derajat bias/penyimpangan perbedaan hasil analisis tersebut

Linieritas

• Definisi : Kemampuan metode analisis menunjukkan respon/hasil uji secara langsung atau matematis berbanding lurus dengan konsentrasi analit dalam sampel pada rentang tertentu.

Range (Rentang)• Definisi : Interval antara konsentrasi tertinggi dan terendah analit dalam sampel dari

suatu metode analisis yang memiliki akurasi , presisi, dan linieritas pada tingkat sesuai.

• Rentang Dinamik Linier (RDL) : batas linier yang dibatasi oleh konsentrasi terendah sampai konsentrasi tertinggi yang linier terhadap respon instrumen.

• Kriteria 1. Nilai kemiringan garis (b) selalu tetap (berubah sedikit) pada setiap titik tertentu2. Koefisien korelasi mendekati 0,999 atau 1,00

Cara Penetapan

1. Ditetapkan terhadap minimum 6 konsentrasi pada rentang minimum 50% - 150% dari kadar analit.

2. Dihitung regresi liniernya :

y = bx + a

y = respon (co: serapan, luas puncak)

x = konsentrasi analit

b = slope/kemiringan

a = intersept/perpotongan

3. Dihitung koefisien korelasinya (r) dilanjutkan dengan uji t untuk menunjukkan adanya hubungan linier yang signifikan antara x dan y.

Linieritas dinyatakan dengan koefisien korelasi ( r ). Nilai yang dapat diterima :r ≥ ±0,997 (bahan aktif obat)r ≥ ±0,98 ( cemaran/impurity)

Dimana rumus r adalah :

Sensitifitas

Definisi : respon analit dalam kadar tertentu. Dibagi 2, yaitu :1. LOD(limit of detection/batas deteksi) : konsentrasi analit terendah yang masih

dapat terdeteksi.2. LOQ (limit of quantitation/batas kuantitasi) : konsentrasi terendah analit dengan

presisi dan akurasi yang dapat diterima.

Sensitifitas• Cara Penetapan :1. Prosedur non instrument (co: titrasi)

Analisis sampel dengan konsentrasi yang diketahui dan ditetapkan LOD dan LOQ melalui evaluasi visual.

2. Prosedur instrument (spektrofotometri UV, KCKT)- Rasio signal to noise ( S/N) untuk alat yang mempunyai “baseline”

S/N = 3 : 1 ( untuk LOD)S/N = 10 : 1 (untuk LOQ)

- Berdasarkan simpangan baku respon blanko (σ ) dan slope kurva kalibrasi (S)

LOD = 3,3 σ/S LOQ = 10 σ/S

• Cara Penentuan BD & BK1. Dengan Mengukur respon blangko sebanyak 20 x

BD = 3 Sbl/b BK = 10 Sbl/b Sbl= simpangan baku blangko

b = arah garis regresi linier2.Diperoleh dari kurva kalibrasi BD = 3 Sy/x/b BK = 10 Sy/x/b

Sy/x = √Σ(y-ŷ)2/n-2

Akurasi (Ketepatan/kecermatan)

• DefinisiUkuran kedekatan hasil uji terhadap nilai sebenarnya yang dapat diterima.Akurasi dinyatakan dengan menentukan persentase perolehan kembali (% recovery).% recovery = persentase nilai terukur/persentase nilai sebenarnya

Akurasi (Ketepatan/kecermatan) Metode Penetapan1. “Spiked placebo recovery method” mencampurkan analit dalam jumlah tertentu

dalam bahan pembantu tertentu. Digunakan biasanya untuk sampel yang dapat diperkirakan konsentrasinya.

2. Metode penambahan baku (standard addition method) menambahkan sejumlah analit ke dalam sampel yang mengandung analit yang sama yang akan ditentukan. Digunakan untuk sampel yang tidak dapat ditentukan matriksnya dan kandungannya.

3. Metode perbandingan hasil pengujian MA yang divalidasi terhadap hasil pengujian MA yang absah/valid.

Akurasi (Ketepatan/kecermatan)

Cara Penetapan- Ditetapkan minimal 9 kali penetapan- 3 konsentrasi berbeda (rentang 80 -120% dari nilai sebenarnya)- 3 replikasi- 3 x 3 = 9

Akurasi (Ketepatan/kecermatan) Kriteria

Tergantung jumlah analit dalam matriks sampel

AOAC manual for the Peer-Verified Methods program

Contoh penetapan akurasi

• Metode Spiked Placebo recovery :plasebo : bahan pembawa /eksipien / matriks biologiBahan obat digunakan : standard reference material (SRM), Certified reference material (CRM), Baku Pembanding Farmakope Indonesia (BPFI)Bila tidak ada BPFI diganti dengan bahan memiliki derajat kemurnian tinggi.

Contoh penetapan akurasi• Akurasi intrinsik : menunjukkan adanya penyimpangan disebabkan oleh matrik

sampel dan penyiapan sampel. Co: Pada HPLC1. Dibuat 3 seri larutan baku pembanding (tanpa matrik) dengan replikasi 3 kali

dengan rentang 50%-150% dari kadar analit dalam sampel ditentukan luas puncak tiap seri

2. Dibuat 3 seri larutan baku pembanding dengan matriks dengan replikasi 3 kali pada konsentrasi yang sama dengan 1 ditentukan luas puncak tiap seri

3. % recovery dihitung dengan membandingkan luas puncak dari masing-masing konsentrasi 1 & 2

Contoh penetapan akurasi

Contoh penetapan akurasi• Akurasi keseluruhan (Overall acuracy) : Menunjukkan penyimpangan yang

disebabkan secara keseluruhan, tidak hanya kesalahan disebabkan matriks sampel dan penyiapan sampel, tetapi juga kesalahan dalam perhitungan, misalnya intersept-y.

• Hampir sama dengan akurasi intrinsik, yaitu dibuat 3 seri larutan baku pembanding (standar) dengan matriks dengan replikasi 3 kali dengan rentang 50%-150% dari kadar analit dalam sampel ditentukan luas puncak tiap seri berdasarkan kurva kalibrasi larutan baku pembanding tanpa matriks.

• Akurasi = % kadar perhitungan/ % kadar teoritis x 100%

Presisi (Keseksamaan)• Definisi

Derajat kesesuaian dari sekelompok hasil pengujian secara individual, jika suatu MA digunakan berulangterhadap beberapa sampel homogen.

Presisi (Keseksamaan)

Ukuran presisi1. Presisi/repeatabilitas sistem mengetahui kesalahan karena sistem, tdk

bergantung penyiapan sampel.2. Presisi/repeatabilitas metode ukuran dari variabilitas intrinsik, termasuk

kesalahan karena penyiapan sampel.

Presisi (Keseksamaan)Tingkatan Presisi1. Repeatabilitas (repeatability) Variasi analisis pada kondisi yang sama dan waktu

yang pendek (within-assay, intra-assay).Minimum 6 x penetapan pada kadar 100%.2. Presisi antara (intermediated precission) variasi karena pengaruh efek acak

tambahan dalam laboratorium, misalnya perbedaan hari, analis, atau alat. Merupakan bagian dari parameter Ruggedness dalam USP

3. Reprodusibilitas (reproducibility) variasi terjadi karena perbedaan laboratorium (studi kolaborasi). Dipakai untuk standarisasi prosedur analisis.

• Cara Penetapan 1. Presisi Sistem penyuntikan berulang minimal 6 kali dari larutan sampel

homogen untuk menunjukkan kinerja alat pada kondisi pengujian & hari pengujian

2. Presisi metode - Minimal 9 kali penetapan, 3 konsentrasi berbeda (rentang 80 - 120% dari nilai sebenarnya) & 3 replikasi- Minimal 6 penetapan pada konsentrasi pengujian 100%

• Cara Penetapan Presisi dinyatakan dengan :- Simpangan baku = standard deviation (SD) SD = √[Σ(Xi – X)2/n-1]- Simpangan baku relatif = relatif standard deviation (RSD) = koefisien variasi (KV)

RSD = [SD/X] . 100%X = nilai rata-rata n pengukuranXi = nilai hasil pengukuran individual

Kriteria1. Umum RSD ≤ 1,0% (bahan baku obat)

RSD ≤ 2,0% (sediaan obat)RSD ≤ 5,0% (cemaran/impurity)

• Kriteria2. Berdasarkan Konsentrasi Analit dalam Sampel

No. % Analit dalam Matrik Sampel

Rentang % Rata-rata Recovery

1. 100 g/kg 22. 10 g/kg 33. 1 g/kg 44. 100 mg/kg 55. 10 mg/kg 76. 1 mg/kg 117. 100 μg/kg 158. 10 μg /kg 219. 1 μg /kg 30

10. 0,1 μg/kg 43

AOAC manual for the Peer-Verified Methods program

Robustness

• Definisi: Kemampuan metode analisis untuk tidak terpengaruh oleh perubahan/variasi kecil parameter

metode. Menunjukkan indikasi kehandalan dalam penggunaan normal

• Penetapan: Membandingkan hasil pada kondisi berbeda dengan pada kondisi normal.

• Variasi dapat meliputi: stabilitas of larutan analit, variasi pH dalam fase gerak, perbedaan kolom

(lot/supplier), temperatur, laju alir.

Validasi atau Kualifikasi

• Suatu sistem harus dikualifikasi agar berfungsi dalam proses yang tervalidasi• Suatu sistem dan / atau alat harus dikualifikasi• Suatu proses harus divalidasi

Kualifikasi dan Validasi• Kualifikasi adalah bagian dari Validasi

Kualifikasi• Untuk mesin, peralatan produksi dan sarana penunjang.• Ada 4 tingkatan : 1. Kualifikasi Rancang Bangun ( Design Qualification/DQ) 2. Kualifikasi Instalasi (Installation Qualification/IQ) 3. Kualifikasi Operasional (Operational Qualification/OQ) 4. Kualifikasi Kinerja (Performance Qualification/PQ)• Masing-masing Kualifikasi harus dilakukan secara berturutan.

Kualifikasi Rancang Bangun

• Ditujukan untuk menjamin dan mendokumentasikan bahwa sistem atau peralatan atau bangunan yang akan dipasang atau dibangun sesuai dengan ketentuan atau spesifikasi yang diatur dalam ketentuan CPOB dan peraturan/persyaratan lain yang berlaku.

Kualifikasi Rancang Bangun(target /sasaran)

Kualifikasi Instalasi

• Tujuan : untuk menjamin dan mendokumentasikan bahwa sistem atau peralatan yang diinstalasi sesuai dengan spesifikasi yang tertera pada dokumen pembelian, manual alat ybs dan pemasangannya dilakukan memenuhi spesifikasi yang telah ditetapkan

Kualifikasi Instalasi(target/sasaran)

Kualifikasi Operasi

• Tujuan : untuk menjamin dan mendokumentasikan bahwa sistem atau peralatan yang telah diinstalasi beroperasi sesuai dengan spesifikasi yang diinginkan

Kualifikasi Operasi(target/sasaran)

Kualifikasi Kinerja

Tujuan : untuk menjamin dan mendokumentasikan bahwa sistem atau peralatan yang telah diinstalasi beroperasi sesuai dengan spesifikasi yang diinginkan dengan cara menjalankan sistem sesuai dengan tujuan penggunaannya.

Kualifikasi Kinerja(sasaran/target)

TERIMA KASIH