Makalah Whitening Cream

MAKALAH TEKNOLOGI HERBAL

Obat Herbal sebagai Komoditas Ekonomi

Face Whitening Cream Bengkuang

Disusun oleh :

Angela Susanti / 1206247303

Devi / 1206243601

Nindya Bestari / 1206255122

DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA

FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA

DEPOK

2014

i

Universitas Indonesia

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang Maha

Esa karena atas berkat dan anugerah-Nya, penulis dapat menyelesaikan

makalah ini tepat pada waktunya. Makalah Teknologi Herbal : Face

Whitening Cream Bengkuang ini dibuat sebagai tugas akhir untuk mata

kuliah Teknologi Herbal.

Makalah ini pun tidak akan terealisasi tanpa adanya bantuan

dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis juga tidak lupa

menyampaikan terima kasih kepada,

1. Dr. Eny Kusrini, S.Si. dan Ir. Dewi Tristantini, M.T., Ph.D. selaku dosen pembimbing untuk mata kuliah Teknologi Herbal

2. Tommy Martinus selaku asisten dosen untuk mata kuliah Teknologi Herbal

3. Pihak pihak lain yang turut membantu penulis, baik secara langsung maupun secara tidak langsung, dalam proses penyelesaian

makalah ini

Ada pepatah berbunyi, tak ada gading yang tak retak. Begitu pula dengan makalah ini, masih banyak kekurangan dikarenakan

keterbatasan kemampuan yang penulis miliki, kurangnya sarana dan

prasarana dalam praktikum, dan lain sebagainya. Namun dibalik semua

kekurangan yang ada, penulis tetap berharap bahwa makalah ini dapat

bermanfaat bagi banyak pihak untuk memperkaya wawasan mengenai

berbagai obat herbal yang dapat dijadikan komoditas ekonomi.

Depok , 9 Desember 2014

Penulis

ii


ABSTRAK

Bengkuang mengandung senyawa flavonoid yang menunjukkan

aktivitas penghambatan kerja tirosinase, yang berperan dalam

biosintesis melanin. Penghambatan enzim tirosinase merupakan

aktivitas yang berperan penting dalam proses pemutihan kulit. Daun

saga mengandung flavonoid, polifenol, -karoten, dan asam askorbat yang berperan sebagai antioksidan melalui mekanisme scavenging, serta

mengandung gliserizin yang memberikan efek sejuk / mendinginkan

pada kulit. Ekstrak bengkuang dan daun saga diformulasi menjadi krim

M/A (minyak dalam air). Karakterisasi zat aktif dilakukan melalui liquid

chromatography maupun berdasarkan data spektroskopik termasuk data

UV, spektra IR, spektra 1H NMR (400,13 MHz), spektra

13C NMR

(100,61 MHz), spektra massa. Uji kestabilan dilakukan dengan

penyimpanan pada tiga variasi suhu (72C; 272C; dan 402C),

cycling test, dan centrifugal test. Uji sitotoksik dapat dilakukan dengan

metode DPPH, BST, dan MTT Assay. Besar biaya yang dibutuhkan

untuk memproduksi sebuah whitening cream 5 g beserta kemasan

adalah Rp 1540,97.

Kata kunci : aktivitas penghambatan tirosinase, ekstrak bengkuang

(Pachyrhizus erosus), ekstrak daun saga (Abrus

precatorius), krim M/A, stabilitas fisik

iii


ABSTRACT

Pachyrhizus erosus contains some of flavonoids which show tyrosinase

inhibition activity, which involved in melanin biosynthesis. Tyrosinase

inhibition is an essential activity in skin whitening. Abrus precatorius

leaves contains flavonoid, polyphenol, -carothen, and ascorbic acid, which have a role as antioxidant by scavenging mechanism. Abrus

precatorius also contains glycyrrhezin, which gives soothing effect to

the skin. Pachyrhizus erosus and Abrus precatorius extract are

formulated into O/W (oil in water) cream. Characterization of active

constituent can be done by using liquid chromatography and

spectroscopic data, including UV data, IR spectra, 1H NMR spectra

(400,13 MHz), 13

C NMR spectra (100,61 MHz), and mass spectra.

Stability test was conducted by storing the cream at three different

temperatures (72C; 272C; dan 402C), cycling test, and centrifugal

test. Cytotoxic test was performed by using some methods, such as :

DPPH, BST, dan MTT Assay. The total cost that was needed to produce

5 g whitening cream (including the package) was Rp 1540,97.

Keywords : tyrosinase inhibition activity, Pachyrhizus erosus extract,

Abrus precatorius extract, O/W cream, physical stability

iv


DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ...................................................................... i

ABSTRAK ....................................................................................... ii

ABSTRACT ..................................................................................... iii

DAFTAR ISI .................................................................................... iv

DAFTAR GAMBAR ........................................................................ vi

DAFTAR TABEL ............................................................................ vii

BAB 1. PENDAHULUAN .............................................................. 1

1.1 Latar Belakang ............................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .......................................................... 2

1.3 Tujuan Pembuatan ......................................................... 2

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................... 3 2.1 Bahan Aktif dan Bahan Tambahan ................................ 3

2.1.1 Bengkuang ............................................................ 3

2.1.2 Daun Saga ............................................................. 6

2.2 Cara Kerja ...................................................................... 8

2.2.1 Skin Whitening ...................................................... 8

2.2.2 Efek Antioksidan pada Kulit ................................ 13

2.3 Ekstraksi ........................................................................ 14

2.4 Krim ............................................................................... 15

2.4.1 Asam Stearat ......................................................... 16

2.4.2 Setil Alkohol ......................................................... 17

2.4.3 Gliseril Monostearat ............................................. 17

2.4.4 Metil Paraben ........................................................ 17

2.5 Stabilitas Krim ............................................................... 18

BAB 3. METODE PEMBUATAN ................................................ 22

3.1 Diagram Alir Pembuatan ............................................... 22

3.1.1 Ekstraksi Pachyrizus erosus ................................. 22

3.1.2 Ekstraksi Abrus precatoris ................................... 22

3.1.3 Pembuatan Emulsi Whitening Cream ................... 22

3.2 Alat Alat ..................................................................... 23 3.3 Bahan ............................................................................. 24

3.4 Metode Pembuatan ........................................................ 25

3.4.1 Ekstraksi Pachyrizus erosus ................................. 25

3.4.2 Ekstraksi Abrus precatoris .................................. 25

3.4.3 Proses Pembentukan Whitening Cream ............... 25

3.5 Pengawet ........................................................................ 26

v


3.6 Pewarna ......................................................................... 26

3.7 Rencana Kemasan ........................................................... 26

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................... 27 4.1 Karakterisasi Struktur, Komposisi, Morfologi, serta

Kandungan Zat Akif ...................................................... 27

4.1.1 Bengkuang ............................................................ 27

4.1.2 Daun Saga ............................................................. 29

4.2 Uji Stabilitas Produk ...................................................... 30

4.3 Uji Sitotoksik ................................................................. 32

4.3.1 Bengkuang ............................................................ 32

4.3.2 Daun Saga ............................................................. 34

4.3.3 Asam Stearat ......................................................... 36

4.3.4 Setil Alkohol ......................................................... 37

4.3.5 Gliseril Monostearat ............................................. 40

4.3.6 Metilparaben ......................................................... 40

4.4 Analisis Ekonomi ........................................................... 43

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................... 45

5.1 Kesimpulan .................................................................... 45

5.2 Saran .............................................................................. 46

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................... 47

vi


DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Umbi Pachyrizus erosus (bengkuang)........................ 3

Gambar 2.2 Struktur dasar flavonoid ............................................ 5

Gambar 2.3 Biosintesis flavonoid ................................................. 6

Gambar 2.4 Tanaman saga ............................................................ 7

Gambar 2.5 Anatomi kulit ............................................................. 9

Gambar 2.6 Biosintesis melanin .................................................... 10

Gambar 2.7 Struktur asam stearat ................................................. 16

Gambar 2.8 Struktur setil alkohol ................................................. 17

Gambar 2.9 Struktur gliseril monostearat ..................................... 17

Gambar 2.10 Struktur metil paraben ............................................... 18

Gambar 3.1 Diagram alir ekstraksi Pachyrhizus erosus ............... 22

Gambar 3.2 Diagram alir ekstraksi Abrus precatoris .................... 22

Gambar 3.3 Diagram alir pembuatan emulsi whitening cream ..... 22

Gambar 3.4 Contoh kemasan whitening cream ............................. 26

vii


DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Kandungan bengkuang .............................................. 4

Tabel 3.1 Komposisi Face whitening cream M/A .................... 24

Tabel 4.1 Toksisitas Inhalasi Akut ............................................ 37

Tabel 4.2 Toksisitas Oral Akut .................................................. 37

Tabel 4.3 Toksisitas Dermal Akut ............................................. 38

Tabel 4.4 Iritasi Kulit ................................................................ 38

Tabel 4.5 Iritasi Ocular ............................................................. 39

Tabel 4.6 Kalkulasi Harga Komponen Whitening Cream ......... 43

viii


1


BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Manusia terutama wanita tercipta dengan naluri untuk selalu

tampil cantik dalam berbagai kesempatan dan ingin menjadi pusat

perhatian bagi orang-orang di sekelilingnya. Hal ini menjadi alasan bagi

wanita untuk terus melengkapi dan mempercantik diri dengan

menggunakan berbagai jenis kosmetik. Kondisi ini menjadi pendorong

berkembangnya industri kosmetik di seluruh dunia, termasuk Indonesia.

Perkembangan industri kosmetik di Indonesia ditandai dengan

meningkatnya penjualan kosmetik sebesar 14% dari tahun 2011 ke

tahun 2012. Menurut data Kementrian Perindustrian, total penjualan

kosmetik pada tahun 2011 mencapai 8,5 triliun rupiah sedangkan pada

tahun 2012 terjadi peningkatan hingg mencapai 9,76 triliun rupiah.

Peningkatan ini terus berlangsung hingga saat ini. Persatuan Perusahaan

Kosmetika Indonesia (Perkosmi) memperkirakan bahwa tahun ini

penjualan kosmetik akan naik sebesar 15% dari tahun 2012, mencapai

total penjualan 11,2 triliun rupiah. Selain itu, dari sisi ekspor, industri

kosmetik ditaksir tumbuh 20% menjadi US$ 406 juta.

Salah satu jenis kosmetik yang meningkat permintaannya dari

tahun ke tahun di Indonesia adalah produk whitening cream. Wanita

Asia, termasuk Indonesia memiliki suatu stigma bahwa cantik identik

dengan memiliki kulit putih bersih. Hal ini ditunjukkan melalui berbagai

iklan kosmetik yang menampilkan model iklan berkulit putih. Berbagai

usaha dilakukan oleh para wanita untuk mendapatkan kulit yang

demikian. Bahkan, seringkali mereka rela membayar harga mahal untuk

mendapatkannya melalui berbagai produk kosmetik. Sayangnya, tidak

semua produk kosmetik yang beredar di pasaran saat ini aman untuk

digunakan. Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM), pada razia

tanggal 12 Desember 2012 di Jakarta, berhasil menyita 20 merk

kosmetik yang mengandung senyawa berbahaya, yaitu merkuri.

Kandungan merkuri ini didapatkan pada produk-produk whitening

cream, eye shadow, lipstik dan sebagainya.

Berdasarkan realita di atas, penulis berinisiatif untuk membuat

suatu produk kosmetik whitening cream berbahan dasar herbal yang

aman bagi kesehatan pengguna dan lingkungannya. Salah satu bahan

2


pemutih alami yang terdapat secara melimpah di Indonesia adalah

Pachyrizus erosus yang lebih dikenal dengan nama bengkuang. Selama

ini, tanaman ini umumnya hanya dimanfaatkan sebagai makanan,

khususnya sebagai salah satu bahan dalam pembuatan rujak, serta

sebagai acar atau asinan. Padahal, menurut data, kota Padang mampu

menghasilkan bengkuang sebanyak 192 kuintal/hektar dan kota

Kebumen mampu menghasilkan 5.020 -7.030 ton per tahun (Winarto,

2009). Jumlah produksi yang cukup besar ini dapat dimanfaatkan untuk

menghasilkan produk berbahan dasar bengkuang, yang memiliki nilai

jual lebih tinggi. Salah satunya adalah dengan mengolahnya menjadi

whitening cream.

Bengkuang mengandung senyawa aktif yang mampu

mengabsorpsi dan memantulkan radiasi ultra violet yang berasal dari

matahari. Sinar ultra violet merupakan salah satu faktor yang

menyebabkan kulit terlihat lebih gelap. Selain itu, radiasi oleh sinar ini

menyebabkan berbagai penyakit, seperti kanker kulit, kelainan pigmen

kulit, kerutan dan sebagainya. Zat aktif dalam bengkuang mampu

mencegah aktivitas enzim polimerase oksidatif yang memicu

pembentukan pigmen melanin (pemberi warna coklat) pada kulit.

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah yang diperoleh berdasarkan latar belakang

adalah sebagai berikut.

Zat apakah yang terkandung dalam bengkuang yang dapat dimanfaatkan sehingga membuat kulit tampak lebih putih?

Bagaimana mekanisme kerja dari zat tersebut dalam proses pemutihan kulit?

Bagaimana proses pembuatan face whitening cream dengan menggunakan bengkuang sebagai bahan dasar atau bahan

aktifnya?

Berapa komposisi face whitening cream berbahan dasar bengkuang yang optimal dan aman bagi konsumen?

1.3 Tujuan Pembuatan

Tujuan pembuatan face whitening cream ini adalah membuat

sebuah obat herbal dengan memanfaatkan susbtansi yang terdapat dalam

bahan aktif berupa bengkuang yang dapat membuat kulit, khususnya

bagian wajah, tampak lebih putih serta aman digunakan oleh konsumen.

3


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bahan Aktif dan Bahan Tambahan

2.1.1 Bengkuang

Klasifikasi ilmiah dari bengkuang adalah sebagai berikut.

Kingdom : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Fabales

Famili : Fabaceae

Subfamili : Faboideae

Genus : Pachyrhizus

Spesies : Pachyrhizus erosus

Gambar 2.1 Umbi Pachyrhizus erosus (bengkuang) [Sumber : http://www.emilybeautycenter.co

m/foto_portfolio/63bengkoang.jpg]

Tanaman bengkuang tumbuh sebagai tanaman merambat atau

menjalar yang ketinggiannya dapat mencapai 4-5 m jika diberikan

penyokong yang sesuai. Akar bengkuang memiliki panjang mencapai 2

m dan memiliki berat hingga 2 kg. Berbeda dengan bagian akarnya yang

dapat dikonsumsi, bagian lain dari tanaman bengkuang sangat beracun,

misalnya bijinya yang mengandung rotenon, yang sangat beracun dan

biasanya digunakan untuk membunuh serangga (sebagai pestisida) atau

untuk menangkap ikan. Beberapa substansi yang terkandung dalam akar

(khususnya umbi akar) bengkuang terangkum dalam Tabel 2.1

4


Tabel 2.1 Kandungan bengkuang

No. Substansi Struktur Keterangan / Fungsi

1. Air (86-

90%) Memberi efek

pendingin

2. Oligofrukto

-sa

Memberi rasa manis pada umbi akar

Tidak dapat dicerna tubuh manusia sehingga

baik untuk penderita

diabetes atau untuk

program diet rendah

kalori

3. Adenin

Membentuk nukleotida dari asam nukleat (salah

satu basa nukleotida

purin)

4. Kolin Melindungi organ hati dan meningkatkan

fungsi memori

Di samping keempat senyawa di atas, bengkuang juga mengandung

saponin dan flavonoid. Saponin dan flavonoid bertindak sebagai tabir

surya alami yang dapat mencegah kerusakan kerusakan yang disebabkan oleh rangsangan radikal bebas sebagai hasil absorpsi sinar

ultra-violet (UV) (Sandler, 2005). Oleh karena itu, sangat mungkin jika

umbi akar bengkuang dapat digunakan sebagai material atau bahan

dasar tabir surya. Selain itu, bengkuang juga mengandung berbagai

senyawa fenolik. Senyawa fenolik dapat digunakan sebagai agen

depigmentasi karena struktur kimianya yang serupa dengan tirosin,

substrat dari tirosinase. Enzim tirosinase merupakan salah satu enzim

5


yang memiliki peranan penting dalam sintesis melanin (Wang et al.,

2006). Substansi dalam bengkuang yang diharapkan dapat membantu

proses pemutihan kulit, khususnya bagian wajah, adalah flavonoid.

2.1.1.1 Flavonoid

Flavonoid mewakili sebuah kelas yang terdiri dari beraneka

metabolit tanaman sekunder dengan 9000 struktur yang telah

teridentifikasi hingga saat ini. Senyawa senyawa ini biasanya ditemukan pada tanaman vaskular juga beberapa jenis lumut (Harborne

dan Baxter, 1999; Williams dan Grayer, 2004). Flavonoid menunjukkan

beragam sifat fisiologis, biokimia, dan ekologis, beberapa contohnya

adalah perlindungan sinar UV, pewarnaan bunga, interaksi interspesies

dan pertahanan tanaman (Martens, 2005).

Flavonoid merupakan kata benda kolektif yang dulunya digunakan untuk menggambarkan beberapa kelas senyawa yang

memiliki kerangka flavon C6-C3-C6 yang serupa (Cavaliere et al.,

2007).

Gambar 2.2 Struktur dasar flavonoid [Sumber : Martens, 2005]

Flavonoid merupakan sebuah produk yang berasal dari sebuah

unit awal cinnamoyl-CoA, dengan ekstensi rantai menggunakan tiga

molekul dari malonyl-CoA (Dewick, 2002). Jalur biosintesis dari

flavonoid dapat dilihat pada Gambar 2.3. Reaksi biosintesis yang paling

penting dalam rangkaian proses tersebut adalah kondensasi dari tiga

molekul malonyl-CoA dengan satu molekul p-coumaryl-CoA menuju

intermediet kalkon (Martens, 2005). Beberapa kelas besar dari flavonoid

adalah flavon, isoflavon, flavonol, flavanon, antosianin, katekin, dan

kalkon (Cavaliere et al., 2007).

6


Kalkon dan dihidrokalkon merupakan kelas kelas flavonoid yang terdiri dari dua gugus fenol yang terhubung oleh tiga karbon. Kelas

flavonoid berupa flavonon, yang terdiri dari tiga cincin, dapat diperoleh

dari struktur kalkon. Dari kelas kelas flavonon tersebut, kelas kelas flavonoid lainnya dapat diperoleh, termasuk isoflavon, flavanol,

antosianida, flavonol, dan flavon (Martens, 2005). Kelas flavonoid

terakhir ditandai dengan adanya ikatan ganda antara C2 dan C3 dalam

kerangka heterosiklik dari flavan. Flavon dapat diklasifikasikan kembali

ke dalam beberapa subkelompok berdasarkan kehadiran suatu substituen

dan kelarutan dari flavon dalam air (Harborne dan Baxter, 1999;

Williams dan Grayer, 2004)

Gambar 2.3 Biosintesis flavonoid [Sumber : Martens, 2005]

2.1.2 Daun Saga

Klasifikasi ilmiah dari tanaman saga adalah sebagai berikut.

Kingdom : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

7


Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Fabales

Famili : Fabaceae

Subfamili : Faboideae

Genus : Abrus

Spesies : Abrus precatorius

Gambar 2.4 Tanaman saga [Sumber : http://ff.unair.ac.id/sito/index.php?search=Abrus+precatorius

&p=1&mode=search&more=true&id=193]

Abrus precatorius, yang juga dikenal sebagai Rosary pea atau

Saga di Indonesia, merupakan tanaman kayu menjalar yang memiliki

biji merah beracun dengan tanda hitam di dasar bijinya. Daun tanaman

saga memiliki bentuk yang serupa dengan daun asam jawa, serta

memiliki 20 40 pucuk daun. Tanaman ini berasal dari India, biasanya terletak pada ketinggian 1 200 m. Namun, saat ini tanaman saga sudah banyak ditemukan di negara negara tropis. Tanaman saga awalnya digunakan dalam pengobatan tradisional

untuk mengobati tetanus, dan mencegah rabies. Tanaman ini juga dapat

digunakan untuk mengobati goresan dan luka yang disebabkan oleh

anjing, kucing dan, tikus, dan juga digunakan dengan bahan lain untuk

mengobati leukoderma. Daun dari tanaman digunakan untuk

menyembuhkan demam, batuk, dan flu (Garaniya dan Bapodra, 2014).

Daun saga mengandung beberapa konstituen kimia seperti

abrusosida A, abrusosida B, abrusosida C, abrusosida D, galaktosa,

xilosa, kolin, dan glisirizin (Garaniya dan Bapodra, 2014). Glisirizin

dapat menunjukkan aktivitas sebagai demulcent, atau memberikan efek

8


sejuk pada kulit (Kataria et.al., 2013). Selain itu, daun saga juga kaya

akan polifenol, flavonoid, -karoten, dan asam askorbat. Berbagai tanaman telah menjadi sumber antioksidan alami seperti tocopherol,

karotenoid, dan senyawa fenolik (Palvai et.al., 2014).

2.2 Cara Kerja

2.2.1 Skin Whitening

2.2.1.1 Biosintesis Melanin

Warna kulit normal bergantung pada pigmen pigmen seperti hemoglobin (baik dalam kondisi teroksidasi maupun tereduksi),

karotenoid, dan melanin. Penentu utama warna kulit adalah melanin.

Perbedaan ras dan etnis dalam warna kulit berhubungan dengan jumlah,

ukuran, bentuk, distribusi, dan degradasi dari organel yang mengandung

melanin yang disebut melanosom (Bleehen et al., 1995). Produksi

melanin oleh melanosit pada kulit maupun rambut disebut

melanogenesis (Kim et al., 2004).

Produksi melanin bergantung pada sinar UV atau paparan sinar

matahari. Hal ini merupakan mekanisme perlindungan alami dari kulit

ketika terdapat terlalu banyak sinar UV yang menembus kulit manusia.

Terlalu banyak sinar UV dapat menyebabkan sunburn (terbakar sinar

matahari), terhambatnya sintesis dari beberapa prekursor yang

dibutuhkan untuk membuat DNA manusia, serta terjadi peningkatan

radikal bebas. Melanin akan melekatkan radikal bebas serta

berpartisipasi dalam proses oksidasi reduksi lainnya dalam tubuh manusia (Bleehen et al., 1995).

Proses pigmentasi terdiri dari tiga fase : fase aktivasi (activation),

sintesis (synthesis), dan ekspresi (expression). Tahap pertama

merupakan aktivasi melanosit oleh beberapa pemicu seperti sinar UV

dan paparan radikal bebas. Tahap kedua merupakan sintesis dari fase

melanin. Melanosit akan membuat butir butir (granule) melanin yang disebut melanosom melalui serangkaian reaksi. Tahap terakhir adalah

tahap ekspresi. Pada tahap ini, melanosom dipindahkan dari melanosit

menuju lapisan atas sel sel kulit. Ketika melanin telah disintesis dan diisikan ke dalam melanosom, melanosom akan bergerak keluar menuju

lengan lengan melanosit. Setelah melanosom mencapai tepi dari tentakel tentakel (seperti dendrit) tersebut, melanosom akan didorong keluar dari melanosit dan diambil oleh keratinosit, yang merupakan sel

sel kulit yang terletak di atas melanosit pada epidermis. Keratinosit

9


akan mengambil melanosom tersebut dan membawanya ke permukaan

kulit untuk diekspresikan. Setelah proses perpindahan tersebut

berlangsung, warna melanin akan tampak pada permukaan kulit

(Williams et al., 1995).

Gambar 2.5 Anatomi kulit [Sumber : http://nuskin.com/corp/library/pdf/clinicals

/tpw_pigmentation_clinicals.pdf]

Melanin biasanya diklasifikasikan ke dalam dua kelompok utama

yaitu eumelanin hitam dan coklat yang tidak larut, dan feomelanin

kuning dan coklat-kemerahan yang larut dalam alkali. Kedua eumelanin

dan feomelanin diperoleh dari tirosin, melalui tahapan yang sama

(Bleehen et al., 1995; Parvez et al., 2007; Kobayashi et al., 1994).

Sintesis melanin dimulai dari konversi asam amino L-tirosin

menjadi L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) yang diikuti oksidasi L-

DOPA untuk memproduksi sebuah dopakuinon oleh tirosinase.

Dopakuinon kemudian ditransformasi lebih lanjut melalui beberapa

reaksi untuk menghasilkan melanin coklat hingga hitam yang

bertanggung jawab atas warna kulit mamalia. (Okombi, 2006; Lee,

2002; Ohguchi et al., 2003; Wang dan Hebert, 2006). Dua enzim

melanogenik lainnya, enzim TRP1 (tyrosine-related-protein1) dan

enzim TRP2 (tyrosine-related-protein2) yang juga disebut sebagai

enzim dopakrom tautomerase (DCT), juga terlibat dalam biosintesis

melanin (Kobayashi et al., 1994; Parvez et al., 2007).

10


Gambar 2.6 Biosintesis melanin [Sumber : Kobayashi et.al., 1994; Parvez et al., 2007]

11


2.2.1.2 Enzim Tirosinase

Tirosinase yang juga dikenal sebagai polifenol oksidase (PPO)

merupakan enzim yang mengandung tembaga yang terdistribusi di alam.

Tirosinase dapat ditemukan pada beberapa mikroorganisme, tumbuhan,

dan hewan (Matsuura et al., 2006) dan biasanya terlibat dalam

biosintesis melanin (Lerch, 1983). Tirosinase mengkatalisis hidroksilasi

dari monofenol, seperti tirosin menjadi o-difenol oleh monooksigenase,

dan oksidasi dari o-difenol menjadi o-kuinon. O-kuinon selanjutnya

akan terpolimerisasi dan mengalami serangkaian reaksi penting

enzimatik dan nonenzimatik untuk menghasilkan pigmen merah dan

coklat serta melanin hitam.

Pada serangga, diketahui bahwa enzim ini memiliki peranan

dalam pembentukan o-difenol dan kuinon untuk pigmentasi,

penyembuhan luka, enkapsulasi parasit dan sclerotization. Karena

fungsi fungsi tersebut digunakan dalam berbagai proses perkembangan dan pertahanan dalam serangga, enzim tersebut dapat

menjadi target dalam pengendalian hama serangga. Dalam makanan,

tirosinase bertanggung jawab terhadap perubahan warna buah dan

sayuran yang tidak diinginkan pada masa setelah panen. Reaksi tersebut

mengakibatkan terjadinya perubahan warna (menjadi kecokelatan), rasa,

dan nutrisi yang tidak diinginkan.

Pada manusia, tirosinase mengkatalisis proses biosintesis

melanin. Pigmen melanin juga ditemukan pada otak mamalia. Di dalam

otak manusia, tirosinase memiliki peranan penting dalam pembentukan

neuromelanin, yang mungkin memiliki kontribusi terhadap

neurodegenerasi terkait penyakit Parkinson. Melanin merupakan pigmen

utama yang mempengaruhi warna kulit, rambut, dan mata. Produksi

melanin secara berlebihan dapat dipicu oleh paparan sinar matahari

kronis, melasma atau penyakit penyakit hiperpigmentasi lainnya. Saat ini, inhibitor tirosinase menjadi komponen yang sangat penting dalam

dunia kosmetik dan obat untuk pengobatan penyakit dan kelainan kulit

terkait hiperpigmentasi melanin serta untuk mencegah timbulnya noda

dan bintik hitam (freckles) akibat terbakar sinar matahari (Tanimoto et

al., 2006).

2.2.1.3 Mekanisme Pemutihan Kulit dengan Bengkuang

Proses pemutihan kulit dengan penggunaan face cream

bengkuang dapat terjadi karena adanya penghambatan kinerja enzim

12


tirosinase. Penghambatan / inhibisi tirosinase merupakan salah satu

metode untuk mengurangi sintesis melanin (Khatib et al., 2005). Dalam

beberapa tahun terakhir, dengan mempertimbangkan orientasi

konsumen, beberapa jenis kosmetik seperti produk anti-kerut dan agen

pemutih telah dikombinasikan dengan senyawa senyawa dari alam atau obat obat herbal (Tanimoto et al., 2006). Akan tetapi, hanya beberapa senyawa natural dan sintetik, yang memiliki aktivitas sebagai

inhibitor tirosinase, yang dapat digunakan sebagai agen pemutih wajah /

kulit (skin whitening agent) karena adanya pertimbangan kesehatan dan

keselamatan (Okombi et al., 2006).

Beberapa inhibitor yang ditemukan pada tanaman tingkat tinggi

dapat diklasifikasikan ke dalam dua kelompok, yaitu polifenol dan

turunan aldehid (Parvez, 2007). Senyawa fenol merupakan material

penting dan dapat digunakan sebagai agen depigmentasi, karena

senyawa tersebut memiliki struktur kimia yang serupa dengan tirosin,

yang merupakan material dasar dari melanin dan substrat dari tirosinase

(Wang et al., 2006; Sandler, 2005; Sudjaroen et al., 2005).

Flavonoid merupakan salah satu gugus fenol tanaman yang

memiliki aktivitas inhibisi tirosinase yang sangat kuat. Seluruh

flavonoid dapat menghambat enzim karena kemampuannya mengikat

dan mengendalikan tembaga (chelate) pada sisi aktif tirosinase. Akan

tetapi, sifat tersebut dapat diterapkan hanya jika gugus 3-hidroksil dari

isoflavonoid bebas. Flavonoid yang memiliki gugus keto memiliki

aktivitas inhibisi tirosinase yang kuat. Hal ini disebabkan karena

terdapat kesamaan antara kerangka dihidroksifenol L-DOPA dan gugus

keto pada flavonoid.

Sejumlah besar aldehid dan turunan turunannya juga menunjukkan sifat sebagai inhibitor tirosinase. Hal ini disebabkan

karena aldehid dapat bereaksi dengan gugus nukleofilik seperti

sulfhydryl, amino, dan gugus hidroksil.

Kalkon yang sebagian terdiri dari fenol menunjukkan aktivitas

antioksidatif sebagai akibat dari kemampuannya menyumbangkan

sebuah elektron (atau menerima atom hidrogen) dan/atau logam transisi

chelate, seperti tembaga atau ion besi, sehingga dapat mengeliminasi

oksigen reaktif dan spesies nitrogen (ROS dan RNS) dan reaksi

propagasi radikal decay-free. Ketika kedua reaksi kuat, dapat timbul

sintesis melanin (Nerya et al., 2004; Khatib et al., 2005).

13


2.2.2 Efek Antioksidan pada Kulit

2.2.2.1 Paparan Sinar UV dan Sumber Utama Stres Oksidatif pada Kulit

Paparan sinar UV (180 400 nm) dapat menyebabkan berbagai kerusakan pada sel, dengan menghasilkan O2, *OH, H2O2, dan berbagai

ROS (reactive oxygen species). Sinar UVB (290 320 nm) diserap oleh kromofor epidermal seperti melanin dan asam urokanik sehingga

menyebabkan terjadinya kerusakan molekul selagi membentuk ROS.

Dengan adanya H2O2, radiasi UVB menyebabkan terjadinya

pembentukan *OH, yang dapat menimbulkan kerusakan DNA. Sinar

UVA (320 400 nm) dapat menembus lebih dalam ke lapisan dermis, dan meningkatkan produksi dari ROS.

Kulit secara kontinu dipengaruhi oleh berbagai faktor lingkungan,

khususnya radiasi UV. Dalam kulit, radikal bebas diinduksi oleh radiasi

UV sehingga dapat menyebabkan kerusakan pada DNA, protein, serta

menyebabkan ketidakstabilan membran keratinosit, yang dapat

mengakibatkan penuaan sel kulit yang prematur. Ketika terpapar radiasi

UV, kulit akan mengalami perubahan seperti inflamasi, dermatoheliosis,

dan berbagai penyakit kulit (Pouillot, et.al., 2011).

2.2.2.2 Mekanisme Kerja Antioksidan

Jaringan jaringan hidup pada dasarnya memiliki mekanisme kontrol untuk menjaga ROS tetap seimbang. Ketika ROS dihasilkan

secara in vivo, antioksidan memiliki peranan yang sangat penting.

Tingkat kepentingan dari antioksidan bergantung pada jenis ROS yang

dihasilkan, bagaimana dan di mana mereka dihasilkan, dan target

kerusakan dari ROS tersebut. Tubuh manusia memiliki mekanisme

perlindungan tersendiri dengan menggunakan antioksidan endogen

(yang dihasilkan di dalam tubuh). Akan tetapi, ketika jumlah

antioksidan endogen tidak memadai atau tidak seimbang dibandingkan

jumlah yang dibutuhkan untuk melawan oksidan, antioksidan eksogen

(yang tidak dapat dihasilkan di dalam tubuh dapat membantu

mengembalikan keseimbangan (Pouillot, et.al., 2011).

Antioksidan memiliki beberapa peranan sebagai berikut.

Menghambat produksi ROS melalui scavenging langsung

Mengurangi jumlah oksidan di dalam dan sekitar sel

Mencegah ROS mencapai target biologisnya

Membatasi propagasi oksidan

14


Menghalangi timbulnya stres oksidatif dengan mencegah fenomena penuaan

2.3 Ekstraksi

Ekstraksi secara umum dapat diartikan sebagai metode untuk

memindahkan suatu unsur pokok dari zat padat atau cair dengan cara

mengontakkannya dengan pelarut cair. Dalam pembuatan cream ini,

bahan yang harus diekstraksi adalah daging akar bengkuang dan daun

saga. Dengan demikian, ekstraksi yang dilakukan tergolong leaching,

karena zat aktif sebagai unsur pokok atau zat terlarut terdapat di dalam

suatu zat padat.

Keberhasilan dan efektivitas ekstraksi sangat dipengaruhi oleh

jenis pelarut yang digunakan. Terdapat beberapa hal yang harus

dipertimbangkan dalam memilih pelarut, antara lain :

1. Selektivitas Selektivitas ditandai dengan simbol yang analog dengan

volatilitas relatif di dalam proses distilasi. Di dalam proses

ekstraksi, harus bernilai lebih dari satu agar ekstraksi dapat berlangsung.

2. Koefisien distribusi Koefisien distribusi adalah hubungan zat terlarut yang

terdistribusi di antara dua pelarut atau perbandingan komposisi

rafinat dengan ekstrak pada keadaan setimbang. Semakin besar

nilai distribusi ini, maka jumlah pelarut yang dibutuhkan semakin

kecil.

3. Kelarutan pelarut Semakin rendah kelarutan zat terlarut pada dilute-nya, maka

semakin baik ekstraksi dapat terjadi.

4. Kemampuan pelarut untuk di-recover Untuk menekan biaya pemisahan secara ekstraksi seminimal

mungkin, maka pelarut yang digunakan harus dapat digunakan

kembali dalam proses selanjutnya.

5. Massa jenis Semakin besar perbedaan massa jenis fase-fase dalam keadaan

cair jenuh, proses ekstraksi semakin baik.

6. Tegangan permukaan Semakin besar tegangan permukaan, maka perpaduan emulsi

terbentuk dengan mudah, tetapi dispersi dari satu cairan ke cairan

15


lain akan semakin sulit dilakukan. Namun, karena perpaduan

lebih penting, dalam proses ini, maka tegangan permukaan yang

tinggi dapat menghasilkan ekstraksi yang lebih baik.

7. Reaktivitas kimia Pelarut harus bersifat stabil secara kimia dan inert.

8. Viskositas, tekanan uap, dan titik beku Nilai ketiga sifat pelarut ini harus rendah agar proses

pengolahan dan penyimpanan lebih mudah dilakukan.

9. Sifat nontoksik, tidak mudah terbakar, dan murah Pelarut yang sesuai untuk proses ekstraksi akar bengkuang

adalah pertoleum ether, etil asetat, metanol, kloroform,

diklorometana, dan n-butanol (Lukitaningsih, 2009). Sedangkan,

daun saga dapat diekstraksi dengan menggunakan etanol 70%

(Nurwaini et al., 2010). Namun, dalam proses pembuatan cream

ini, ekstraksi yang dilakukan adalah proses ekstraksi secara

mekanis. Kedua bahan utama, yaitu bengkuang dan daun saga

akan diekstraksi dengan cara sebagai berikut.

2.4 Krim

Produk perawatan kulit (skin care) umumnya berupa emulsi atau

olahan yang bening dan tembus pandang, yang teksturnya bervariasi

mulai dari cairan hingga padatan. Meskipun terdapat beraneka ragam

produk perawatan kulit yang dijual di pasaran, konsumen lebih memilih

produk olahan berbentuk emulsi. Hal ini disebabkan karena emulsi

dapat memberikan khasiat yang lebih optimal sebagai produk perawatan

kulit. Beberapa bentuk emulsi yang sering digunakan dalam produk

perawatan kulit antara lain : krim (cream) dan lotion.

Krim dan lotion merupakan emulsi yang terdiri dari dua cairan

imisibel (tidak saling larut), contohnya air dan minyak, dengan salah

satu cairan membentuk fase terdispersi dan cairan lainnya membentuk

media kontinu. Fase terdispersi didistribusikan dalam media kontinu

dalam keadaan stabil (Rieger, 2000).

Krim didefinisikan sebagai sediaan setengah padat, yang

mengandung air tidak kurang dari 60%, dan dimaksudkan untuk

pemakaian luar (Farmakope Indonesia III, 1979). Krim biasanya terdiri

dari air, minyak, dan berbagai humektan yang komposisinya disesuaikan

dengan tujuan penggunaan pada berbagai jenis kulit, kondisi kulit,

musim, usia, dan lingkungan. Krim dapat diklasifikasikan ke dalam dua

16


tipe (berdasarkan surfaktan dan bahan bahan minyak yang digunakan) yaitu krim M/A (minyak dalam air) dan krim A/M (air dalam minyak).

Untuk produk face whitening cream, bentuk sediaan yang dipilih

adalah krim M/A (minyak dalam air). Bentuk sediaan krim dipilih

karena sifatnya yang sangat mudah digunakan pada kulit dan merupakan

media pembawa dengan kapasitas yang cukup besar. Bentuk sediaan

lotion tidak digunakan karena pemakaiannya lebih tepat dilakukan pada

daerah tubuh yang berambut, sedangkan produk yang dibuat

diperuntukkan untuk pemakaian pada daerah wajah. Di samping itu,

krim dapat memberikan efek mengkilap, berminyak, lembab, mudah

tersebar merata, dan mudah berpenetrasi pada kuit. Jenis krim M/A

dipilih karena sifatnya yang mudah dicuci dengan air dan tidak terlalu

lengket jika dibandingkan dengan krim A/M.

Sediaan krim terdiri atas dua komponen utama, yaitu bahan aktif

dan bahan dasar (basis) krim. Bahan dasar krim terdiri dari fase minyak

dan fase air yang dicampur dengan adanya bahan pengemulsi

(emulgator) sehingga membentuk basis krim. Agar diperoleh suatu basis

krim yang baik, maka penggunaan dan pemilihan bahan pengemulsi

sangat menentukan. Selain itu, dalam suatu krim untuk menunjang dan

menghasilkan suatu karakteristik formula krim yang diinginkan, maka

ditambahkan bahan bahan tambahan seperti pengawet, pengkelat, pengental, pewarna, pelembab, pewangi, dan sebagainya (Lachman,

1994).

2.4.1 Asam Stearat

Asam stearat dalam sediaan topikal digunakan sebagai bahan

pengemulsi (emulsifier). Dalam pembuatan basis krim netral (anionik),

asam stearat dinetralisasi dengan penambahan alkali. Asam stearat

memiliki sifat mudah larut dalam benzen, karbon tetraklorida,

kloroform, dan eter; larut dalam etanol, heksan, dan propilen glikol; dan

praktis tidak larut dalam air. Umumnya bahan ini tidak bersifat toksik

dan tidak menyebabkan iritasi. Titik leleh dari asam stearat di atas suhu

54C. Konsentrasi asam stearat yang umumnya digunakan dalam

sediaan krim adalah sebesar 1-20% (Wade, 1994).

Gambar 2.7 Struktur asam stearat [Sumber : http://www.wikipremed.com/image.php?img=0401 04_68zzzz 258750_Stearic_acid_68.jpg&image_id=258750]

17


2.4.2 Setil Alkohol

Setil alkohol digunakan sebagai bahan pengemulsi (emulsifier)

dan bahan pengeras / thickener dalam sediaan krim. Setil alkohol dapat

meningkatkan viskositas krim dan meningkatkan stabilitas sediaan.

Sebagai bahan pengeras, konsentrasi umum setil alkohol yang

digunakan adalah 2-10% dan sebagai bahan pengemulsi digunakan pada

konsentrasi sebesar 2-5%. Setil alkohol sangat mudah larut dalam etanol

95% dan eter. Kelarutan setil alkohol dapat ditingkatkan dengan

peningkatan suhu. Titik leleh dari setil alkohol adalah 45-52C (Wade,

1994).

Gambar 2.8 Struktur setil alkohol [Sumber : http://en.wikipedia.org/wiki/Cetyl_alcohol#mediaviewer

/File:Cetyl_alcohol_structure.svg]

2.4.3 Gliseril Monostearat

Gliseril monostearat dapat digunakan sebagai bahan pengemulsi

non-ionik, emolien, penstabil, pelarut, dan sebagai plasticizer dalam

produk makanan, farmasetika, dan kosmetik. Gliseril monostearat larut

dalam etanol panas (95%), eter, kloroform, aseton panas, dan minyak

mineral; praktis tidak larut dalam air. Umumnya, gliseril monostearat

tidak bersifat toksik dan tidak menyebabkan iritasi. Sebagai bahan

pengemulsi tunggal bahan ini digunakan pada konsentrasi sekitar 5-20%

dari basis krim. Titik lelehnya adalah 55-60C (Wade,1994).

Gambar 2.9 Struktur gliseril monostearat [Sumber : http://www.chemicalbook.com/CAS%5CGIF%5C22610-63-5.gif]

2.4.4 Metil Paraben (Nipagin)

Metil paraben biasanya digunakan sebagai bahan pengawet dalam

formulasi farmasetika, produk makanan, dan terutama dalam kosmetik.

Metil paraben dapat digunakan sendiri maupun dikombinasikan dengan

jenis paraben lainnya. Efektivitas pengawet ini berada pada rentang pH

4-8. Dalam sediaan topikal, konsentrasi umum dari metil paraben yang

18


digunakan adalah 0,02-0,3%. Bahan ini sukar larut dalam air, larut

dalam air panas, etanol 95%, eter (1:10), dan metanol (Wade, 1994).

Gambar 2.10 Struktur metil paraben [Sumber : http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/

structure8/050/mfcd00002352.eps/_jcr_content/renditions/medium.png]

2.5 Stabilitas Krim

Stabilitas didefinisikan sebagai kemampuan suatu produk obat

atau kosmetik untuk bertahan dalam batas spesifikasi yang diterapkan

sepanjang periode penyimpanan dan penggunaan untuk menjamin

identitas, kekuatan, kualitas, dan kemurnian produk. Definisi sediaan

kosmetik yang stabil yaitu suatu sediaan yang masih berada dalam batas

yang dapat diterima selama periode waktu penyimpanan dan

penggunaan, di mana sifat dan karakteristiknya sama dengan yang

dimilikinya saat dibuat (Djajadisastra, 2004).

Ketidakstabilan fisika dari sediaan emulsi atau krim ditandai

dengan adanya pemucatan warna atau munculnya warna, timbul bau,

perubahan atau pemisahan fase, pecahnya emulsi, pengendapan suspensi

atau caking, perubahan konsistensi, pertumbuhan kristal, terbentuknya

gas dan perubahan fisik lainnya. Ketidakstabilan fisik suatu emulsi atau

suspensi dapat dipengaruhi oleh faktor faktor yang mempengaruhi kestabilan kimia dari pengemlusi (emulgator), bahan pensuspensi,

antioksidan,, pengawet, dan bahan aktif. Gejala gejala yang menjadi indikator terjadinya kerusakan emulsi antara lain (Martin, Swarbick, dan

Cammarata, 1993) :

1. Creaming adalah terjadinya lapisan lapisan dengan konsentrasi yang berbeda beda di dalam suatu emulsi. Creaming ke arah atas terjadi dalam suatu emulsi yang tidak stabil di mana fase

dalam mempunyai kerapatan lebih kecil daripada kerapatan fase

luar. Creaming ke arah bawah terjadi di dalam emulsi yang tidak

stabil di mana kerapatan fase dalam lebih besar daripada

kerapatan fase luar (Ansel, 1989).

2. Flokulasi adalah penggabungan partikel partikel akibat gaya tarik menarik melebihi gaya tolak menolak, jika potensial zeta

19


dikurangi di bawah harga tertentu. Potensial zeta inilah yang

mengatur derajat tolak menolak antara partikel partikel terdispersi yang bermuatan sama dan saling berdekatan.

Creaming dan flokulasi masih dapat diperbaiki dengan

pengadukan atau pengocokan, karena masih terdapat film antar

permukaan.

3. Breaking merupakan kondisi yang berbeda dengan creaming, karena breaking merupakan proses searah, sedangka creaming

merupakan proses bolak-balik. Krim yang mengalami creaming

dapat didispersikan kembali dengan mudah, dan dapat terbentuk

kembali suatu campuran yang homogen dengan pengocokan

karena bola-bola minyak masih dikelilingi oleh suatu lapisan

pelindung dari zat pengemulsi. Jika terjadi breaking,

pencampuran biasa tidak dapat mensuspensikan kembali bola bola minyak dalam suatu bentuk emulsi yang stabil, karena

lapisan yang mengelilingi partikel-partikel telah dirusak dan

minyak cenderung untuk bergabung.

4. Inversi adalah peristiwa di mana fase eksternal menajdi fase internal dan sebaliknya.

Nilai kestabilan suatu sediaan farmasetika atau kosmetik dalm

waktu yang singkat dapat diperoleh dengan melakukan uji stabilitas

dipercepat. Pengujian ini dimaksudkan untuk mendapatkan informasi

yang diinginkan dalam waktu sesingkat mungkin dengan cara

menyimpan sediaan sampel pada kondisi yang dirancang untuk

mempercepat terjadinya perubahan yang biasa terjadi pada kondisi

normal. Jika hasil pengujian suatu sediaan pada uji dipercepat selama

tiga bulan diperoleh hasil yang stabil, hal itu menunjukkan bahwa

sediaan tersebut stabil pada penyimpanan suhu kamar selama setahun

Pengujian yang dilakukan pada uji dipercepat yaitu (Juwita, 2011) :

1. Suhu yang dinaikkan Setiap kenaikan suhu 10C, maka laju reaksi akan meningkat

dua sampai tiga kali lipat, namun secara praktis cara ini cukup

terbatas karena kenyataannya perubahan yang terjadi pada suhu

yang jauh di atas normal, seperti pemisahan fase dan kerusakan

fisik jarang terjadi pada suhu normal.

2. Kelembaban yang dinaikkan Umumnya uji ini dilakukan untuk menguji produk dan

kemasannya. Jika terjadi perubahan pada produk dalam

20


kemasannya karena pengaruh kelembaban, maka hal ini

menandakan bahwa kemasannya tidak memberikan perlindungan

yang cukup dari atmosfer.

3. Cycling test Tujuan dari uji ini adalah sebagai simulasi adanya perubahan

suhu setiap tahun bahkan setiap harinya. Oleh karena itu, uji ini

dilakukan pada suhu atau kelembaban tertentu pada interval

waktu tertentu sehingga produk dalam kemasannya akan

mengalami stress yang bervariasi, bukan stress yang statis.

Contoh cycling test adalah melakukan penyimpanan sediaan pada

suhu 4C selama 24 jam lalu menyimpannya pada suhu 40C

selama 24 jam, waktu penyimpanan pada dua suhu yang berbeda

tersebut dianggap sebagai satu siklus dan dilakukan selama 12

hari. Perlakukan selama 12 hari tersebut akan menghasilkan stress

yang lebih tinggi daripada penyimpanan pada suhu 4C atau 40C

saja.

4. Centrifugal test / uji mekanik Tujuan dilakukan centrifugal test adalah untuk mengetahui

terjadinya pemisahan fase dari emulsi. Sampel disentrifugasi pada

kecepatan 3800 rpm selama 5 jam atau 5000 10000 rpm selama 30 menit. Hal ini dilakukan karena perlakuan tersebut sama

dengan besarnya pengaruh gaya gravitasi terhadap penyimpanan

krim selama setahun. Pada dasarnya, sentrifugasi pada kecepatan

tinggi cenderung dapat mengubah bentuk globul fase internal

yang terdispersi dan memicu terjadinya koalesens.

Parameter-parameter yang digunakan dalam uji kestabilan fisik

sediaan krim adalah:

1. Organoleptis atau penampilan fisik Pemeriksaan ini bertujuan untuk mengamati adanya perubahan

atau pemisahan emulsi, timbulnya bau atau tidak, dan perubahan

warna.

2. Sifat aliran (viskositas) Viskositas adalah tahanan suatu cairan untuk mengalir.

Umumnya krim termasuk dalam tipe aliran non-Newton (Martin,

Swarbick, dan Cammarata, 1993). Viskositas suatu sediaan

dipengaruhi oleh zat pengental, surfaktan, proporsi fase

terdispersi, dan ukuran partikel. Penurunan viskositas dipengaruhi

oleh peningkatan ukuran globul. Secara umum kenaikan

21


viskositas dapat meningkatkan kestabilan sediaan (berdasarkan

hukum Stokes) (Martin Swarbick, dan Cammarata, 1993).

3. Konsistensi Pemeriksaan ini bertujuan untuk mengetahui kekerasan krim.

Krim yang telah disimpan masih mempunyai konsistensi yang

cukup agar krim dapat dengan mudah disebarkan pada kulit.

4. Ukuran partikel Perubahan dalam ukuran partikel rata-rata atau distribusi ukuran

globul merupakan tolak ukur penting untuk mengevaluasi emulsi,

di mana pada emulsi keruh diameter globul berkisar antara 0,1-10

m. Ukuran partikel merupakan indikator utama kecenderungan

terjadinya creaming atau breaking (Martin, Swarbick, dan

Cammarata, 1993).

5. pH Krim sebaiknya memiliki pH yang sesuai dengan pH kulit, yaitu

4,5-6,5. pH yang terlalu basa akan menyebabkan kulit bersisik,

sedangkan pH yang terlalu asam akan menimbulkan iritasi pada

kulit.

BAB 3

METODE PEMBUATAN

22


3.1 Diagram Alir Pembuatan

3.1.1 Ekstraksi Pachyrizus erosus

Gambar 3.1 Diagram alir ekstraksi Pachyrhizus erosus

3.1.2 Ekstraksi Abrus precatoris

Gambar 3.2 Diagram alir ekstraksi Abrus precatoris

3.1.3 Pembuatan Emulsi Whitening Cream

Gambar 3.3 Diagram alir pembuatan emulsi whitening cream

3.2 Alat Alat

Pisau

23


Pisau merupakan alat untuk memotong. Alat ini secara umum

terbagi menjadi dua bagian utama, yaitu bagian pemotong dan

bagian gagang. Pada pembuatan whitening cream ini, pisau

digunakan untuk mengupas bahan dasar, yaitu bengkuang atau

Pachyrizus erosus. Pengupasan dilakukan untuk membuang

bagian kulit yang tidak diperlukan dalam ekstraksi. Pengupasan

ini juga dilakukan karena bagian tumbuhan bengkuang selain

akarnya tidak memberikan manfaat, sebalinya mengandung zat

beracun.

Gelas beker Gelas beker merupakan wadah yang terbuat dari kaca. Fungsi

dari wadah ini adalah untuk menampung zat cair yang akan diuji

atau direaksikan di laboratorium baik. wadah ini dapat dipanaskan

langsung di atas heater karena titik lelehnya yang tinggi. Pada

pembuatan whitening cream ini, gelas beker digunakan untuk

menampung pelarut yang digunakan dalam ekstraksi, yaitu

petroleum ether dan berbagai jenis emulsifier, pelembab dan

sebagainya sebelum dan sesudah proses pencampuran.

Heater Heater merupakan alat dengan sumber daya berupa listrik yang

digunakan untuk memanaskan senyawa. Pada pembuatan

whitening cream ini, heater digunakan sebagai alat untuk

memanaskan pelarut yang digunakan dalam Soxhelt extraction

dan memanaskan campuran fasa minyak dan air sebelum

dicampurkan untuk membentuk emulsi cream yang diinginkan.

Alat pengaduk Alat pengaduk adalah alat berbahan dasar kaca, kayu atau

logam yang digunakan untuk mengaduk suatu campuran agar

pencampuran terjadi dengan merata. Pada proses pembuatan

cream ini, alat pengaduk yang digunakan adalah pengaduk kaca

karena penggunaan pengaduk berbahan dasar kayu dan logam

dapat menghasilkan kontaminan pada cream yang berupa emulsi

sehingga menurunkan stabilitas emulsi, bahkan menyebabkan

tidak terbentunya emulsi.

Mortar dan Alu

24


Mortar dan alu adalah alat yang digunakan untuk menghaluskan

atau mengerus zat. Kedua alat ini digunakan untuk

menghancurkan daun-daun yang digunakan sebagai bahan

pembuatan cream. Mortar menjadi wadah penampung zat yang

akan dihaluskan, sedangkan alu adalah alat untuk menghaluskan

zat dengan tekanan. Mortar dan alu yang digunakan terbuat dari

keramik. Tujuan penggunaan kedua alat dengan bahan dasar

keramik ini adalah agar tidak ada zat yang tertinggal pada mortar,

karena bahan ini dapat dibersihkan dengan lebih muda.

Kain Penyaring Kain yang digunakan untuk menyaring pada pembuatan cream

ini adalah kain mori yang biasanya digunakan untuk menyaring

tahu. Kain ini merupakan hasil tenunan dari kapas dan berwarna

putih. Kain ini memiliki pori-pori yang sesuai untuk menyaring

hasil penghancuran daun-daun yang digunakan, sehingga

didapatkan ekstrak dedaunan yang bersih dari ampasnya.

3.3 Bahan

Whitening cream berupa emulsi minyak dalam air (M/A) yang

akan dibuat memiliki komposisi yang tertera pada Tabel 3.1.

Tabel 3.1 Komposisi Face whitening cream M/A

Bahan Bentuk

Sediaan

Komposisi

(% m/m)

Massa

(g)

Ekstrak Pachyrhizus

erosus Padat 3,5 0,175

Ekstrak Abrus precatoris Cair 1,5 0,075

Asam stearat Padat 10,0 0,500

Setil alkohol Padat 3,0 0,150

Gliseril monostearat Padat 10,0 0,500

Metil paraben Padat 0,3 0,015

Air Cair 71,7 3,585

Total 100 5,000

25


3.4 Metode Pembuatan

3.4.1 Ekstraksi Pachyrhizus erosus

Massa bengkuang yang dibutuhkan untuk membentuk tepung

bengkuang dengan massa 0,175 g adalah 6,9125 g umbi bengkuang

bersih. Hal pertama yang harus dilakukan dalam proses ekstraksi

Pachyrhizus erosus (bengkuang) adalah mencuci bersih umbi akar

bengkuang. Selanjutnya, mengupas kulit dari umbi tersebut. Daging

umbi bersihtersebut kemudia diparut dengan menggunakan pemarut

sehingga ukuran umbi yang lebih kecil dan halus. Kemudian, hasil

pemarutan ini disaring dengan menggunakan kain, untuk diambil

filtratnya yang merupakan ekstrak Pachyrhizus erosus. Ekstrak yang

dihasilkan ini selajutnya didiamkan kurang lebih 1 jam agar terbentuk

endapan tepung Pachyrhizus erosus.

3.4.2 Ekstraksi Abrus precatoris

Pertama, daun-daun saga (Abrus precatoris) dengan massa 0,3 g

terlebih dahulu dicuci bersih dengan air. Selanjutnya, daun ini ditumbuk

sampai menghasilkan ekstraknya dengan bantuan sedikit air. Hasil

ekstraksi ini kemudian disaring dengan kain agar didapatkan ekstrak

yang lebih homogen. Massa ekstrak yang dihasilkan dalam proses ini

adalah 0,075g.

3.4.3 Proses Pembentukan Whitening Cream Langkah langkah yang dilakukan dalam proses pembentukan whitening cream adalah sebagai berikut. Pertama, memanaskan asam

stearat, setil alkohol, dan gliseril monostearat yang memiliki fase

minyak di atas pada suhu 75C, sesuai dengan komposisi di atas.

Selanjutnya, mencampurkan bahan-bahan yang larut ke dalam air

(ekstrak akar Pachyrizus erosus, ekstrak daun Abrus precatoris, dan

metil paraben) ke dalam air dengan massa 3,585 g. Campuran fase air

ini kemudian juga dipanaskan di atas suhu 75C. Setelah pemanasan

dilakukan, campuran fase air dimasukkan perlahan-lahan ke dalam fase

minyak dengan pengadukan berlanjut hingga terbentuk whitening cream

yang diinginkan.

26


3.5 Pengawet

Bahan pengawet yang digunakan pada whitening cream ini adalah

metil paraben (nipagin), yang karakteristiknya dijelaskan pada bagian

Tinjauan Pustaka.

3.6 Pewarna

Whitening cream ini tidak menggunakan pewarna.

3.7 Rencana Kemasan

Gambar 3.4 Contoh kemasan whitening cream [Sumber : http://www.makingcosmetics.com]

Whitening cream ini akan dikemas di dalam kemasan

polypropylene berukuran 5 g. Sifat dari cream pot berbahan dasar ini

adalah memiliki ketahanan yang baik terhadap bahan kimia, impact

strength yang rendah, serta tidak mudah mengalami stress cracking

akibat perubahan lingkungan. Kemasan dalam bentuk pot yang

digunakan memiliki tutup dapat mencegah tumpah atau bocornya

cream. Ukuran yang kecil dari kemasan ini diharap dapat meningkatkan

nilai kepraktisan untuk para konsumen karena dapat dengan mudah

dibawa-bawa.

27


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakterisasi Struktur, Komposisi, Morfologi, serta

Kandungan Zat Aktif

4.1.1 Bengkuang

Karakterisasi dan penentuan struktur dari zat aktif (seperti

senyawa fenolik dan flavonoid) yang terkandung dalam bengkuang

dapat dilakukan berdasarkan data spektroskopik, termasuk spektra UV,

spektra IR, spektra 1H NMR (400,13 MHz), spektra

13C NMR (100,61

MHz), spektra massa.

Langkah-langkah penentuan aktivitas pemutihan (whitening

activity) dapat dilakukan dalam empat tahap, yaitu : penentuan

kandungan fenol total, penentuan kandungan flavonoid total, aktivitas

penghambatan tirosinase, dan penentuan tipe penghambatan tirosinase.

1. Penentuan kandungan total fenol Jumlah senyawa fenol dalam ekstrak bengkuang dapat

ditentukan dengan menggunakan metode kolorimetri Folin-

Ciocalteau seperti yang dijelaskan oleh Singleton dan Rossi

(1965) dengan sedikit perubahan. Sebuah aliquot (200 L) dari

ekstrak atau larutan standar asam galat (20, 40, 60, 80, dan 100

ppm) ditambahkan ke dalam labu volumetrik, yang berisi air

suling. Sebuah reagen berupa H2O terdeionisasi disiapkan. 200

L reagen fenol Folin-Cioacalteau ditambahkan ke dalam

campuran kemudian dikocok. Setelah 5 menit, 2 mL dari larutan

7% Na2CO3 ditambahkan ke dalam campuran. Larutan kemudian

diencerkan hingga 5 ml dengan H2O terdeionisasi. Setelah

inkubasi selama 90 menit pada temperatur ruang, absorbansi

diukur terhadap larutan kosong (blank solution) dengan panjang

gelombang 755 nm dengan spektrofotometer UV-Vis 1240.

Kandungan fenol total dari ekstrak dinyatakan sebagai gallic acid

equivalent (GAE) dalam mg/g ekstrak. Penentuan dilakukan

sebanyak tiga kali.

2. Penentuan kandungan total flavonoid Kandungan flavonoid total diukur dengan menggunakan uji

kolorimetri dengan aluminium klorida seperti yang dijelaskan

oleh Zhisen et al. (1999) dengan sedikit modifikasi. Sebuah

aliquot (1 mL) dari ekstrak atau larutan standar katekin (20, 40,

28


60, 80, dan 100 ppm) ditambahkan ke dalam labu volumetrik 10

mL yang berisi 4 mL H2O terdeionisasi dan kemudian 0,3 mL

dari 5% NaNO2 ditambahkan. Setelah 5 menit, 0,3 mL dari 10%

AlCl3 ditambahkan, diikuti dengan 2 mL dari 1M NaOH pada

menit keenam. Larutan kemudian diencerkan hingga 10 mL

dengan H2O terdeionisasi. Larutan dicampurkan dan absorbansi

diukur dengan menggunakan reagen kosong (blank reagent) pada

500 nm. Penentuan dilakukan sebanyak tiga kali dan dihitung

berdasarkan kurva kalibrasi yang diperoleh dengan katekin. Total

flavonoid dinyatakan sebagai mg catechin equivalents (CE)/ g

ekstrak.

3. Aktivitas penghambatan tirosinase Aktivitas penghambatan tirosinase dari ekstrak diukur

berdasarkan metode yang diajukan Hearing (1987) dan

Rangkadilok et al. (2006) dengan sedikit modifikasi, dengan

menggunakan tirosinase jamu sebagai enzim, L-DOPA sebagai

substrat, dan kojic acid sebagai kontrol positif. Sebuah aliquot (50

L) dari sampel dalam DMSO dicampurkan dengan 100 L dari

200 IU/ml dari tirosinase jamur dan 100 L phospate buffered

saline (pH 6,8). Larutan uji melalui tahap pre-inkubasi pada suhu

37C selama 10 menit dan kemudian dilakukan penambahan 100

L larutan L-1,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) 7,6 mM.

Reaksi kemudian diinkubasi lebih lanjut selama 15 menit pada

37C. Dopakrom diukur pada 475 nm dengan menggunakan

spektrofotometer UV/Vis. DMSO digunakan sebagai reagen

kosong. Dalam uji kontrol warna, buffer fosfat digunakan bukan

enzim tirosinase. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali.

4. Penentuan tipe penghambatan tirosinase Penentuan tipe penghambatan tirosinase dari beberapa

komponen yang telah diisolasi (flavonoid dan senyawa fenolik)

dilakukan berdasarkan metode yang diajukan oleh Chen dan

Kubo (2002) dengan sedikit modifikasi. Aktivitas enzim

ditentukan pada suhu 25C dengan mengikuti kenaikan

absorbansi pada panjang gelombang 475 nm yang menyertai

oksidasi substrat (L-DOPA). Satu unit (U) dari aktivitas enzim

didefinisikan sebagai jumlah enzim yang meningkatkan 0,001

absorbansi pada 475 nm dalam kondisi ini. Dalam metode ini,

tirosinase jamur (1,0 mg/mL dalam 0,1 M buffer fosfat dengan

29


pH 6,8) pertama-tama diencerkan sebanyak 50 kali dengan air,

dan kemudian 50 L dari larutan ditambahkan ke dalam 200 L

dari sebuah larutan substrat uji dengan 25 L DMSO yang

mengandung senyawa terisolasi dengan konsentrasi yang berbeda.

Peningkatan absorbansi UV/Vis dari campuran ini kemudian

segera diukur pada 475 nm selama 20 menit untuk mendeteksi

dopakrom yang terbentuk. Konsentrasi dari larutan substrat

(larutan DOPA dalam buffer fosfat dengan pH 6,8) yang

digunakan dalam eksperimen ini adalah 0,6; 0,8; 1,0; 1,5; dan 2,0

mM. Kurva perkembangan reaksi substrat dianalisis untuk

memperoleh konstanta laju reaksi (V) yang dinyatakan dalam

satuan/menit. Konstanta laju reaksi (V) merupakan slope dari plot

kurva absorpsi (sumbu Y) dan waktu (sumbu X). Plot

Lineweaver-Burk, yang menyatakan hubungan antara

1/[konsentrasi dari larutan DOPA] vs. 1/V dalam konsentrasi

komponen terisolasi yang berbeda, dibuat untuk mengevaluasi

tipe penghambatan tirosinase dari senyawa terisolasi. Senyawa

terisolasi dapat diklasifikasikan dalam kelompok inhibitor

kompetitif, jika peningkatan konsentrasi senyawa menghasilkan

sejumlah garis dengan intercept yang serupa pada sumbu 1/V

tetapi memiliki slope yang berbeda. Jika peningkatan konsentrasi

senyawa menghasilkan sejumlah garis dengan intercept yang

sama pada sumbu 1/S, juga dengan slope yang berbeda, senyawa

dapat diklasifikasikan ke dalam kelompok inhibitor non-

kompetitif.

4.1.2 Daun Saga

Pada sampel kering, beberapa komponen antioksidan yang

berbeda diestimasi dengan menggunakan metode standar. Asam

askorbat dapat ditentukan dengan menggunakan metode titrimetrik

dengan menggunakan pewarna 2,6-diklorofenol-indofenol. -Tocopherol diekstraksi melalui saponifikasi langsung dari sampel kering

dan diestimasi berdasarkan pembentukan kompleks merah dari reaksi - -bipiridil dengan ion ferrous karena adanya reduksi ion ferric oleh tocopherol. -karoten dikuantifikasi melalui kromatografi kolom terbuka, yang diikuti pengukuran absorbansi dari elusi pada 450 nm

terhadap -karoten standar. Glutation tereduksi ditentukan berdasarkan pembentukan senyawa kuning akibat reaksi dari DTNB (5,5-ditiobis-2-

30


asam nitrobenzoat) dengan senyawa yang mengandung gugus

sulfihidril. Fenol total diekstraksi dari sampel kering seberat 50-500 mg

dengan 5 mL 1,2 M HCl dalam 50% metanol aqueous selama 2 jam dan

dengan 70% aseton yang dikocok selama 2 jam dan dianalisis dengan

metode Folin-Ciocalteau (Palvai et al., 2014).

Beberapa metode kromatografi untuk estimasi dengan

penggunaan detektor UV telah digunakan dan eluen dimonitor pada 254

nm setelah elusi isokratik. Kolom C18 digunakan dengan sebuah fasa

gerak yang mengandung baik metanol atau asetonitril sebagai

komponen organik beserta dengan fase aqueous yang mengandung asam

asetat maupun asam fosfat. Kandungan glisirizin, yang merupakan salah

satu jenis saponin, dalam jaringan tanaman akan bervariasi secara

signifikan pada periode waktu yang berbeda dalam satu tahun. Estimasi

kuantitatif dari glisirizin dapat dilakukan dengan high performance

liquid chromatographic (HPLC) sedangkan konfirmasi identitas dapat

dilakukan dengan menggunakan spektrometri massa (De et al., 2012).

4.2 Uji Stabilitas Produk

Uji stabilitas produk dapat dilakukan dengan melalui beberapa

tahapan berikut.

Uji stabilitas pada suhu 72C, 272C, dan suhu 402 C Tiap formulasi krim (dibuat beberapa sampel untuk diuji)

disimpan pada suhu 72C, 272C, dan suhu 402 C. Untuk

masing masing formulasi, dilakukan pengukuran parameter- parameter kestabilan seperti bau, warna, pH, dan diameter globul.

Pengamatan dilakukan setiap 2 minggu dengan waktu evaluasi

total selama 8 mingu.

Cycling test Sampel disimpan pada suhu 72C selama 24 jam lalu

dipindahkan ke dalam oven bersuhu 402C selama 24 jam,

waktu penyimpanan untuk kedua variasi suhu tersebut dianggap

sebagai satu siklus. Uji stabilitas dilakukan sebanyak 6 siklus,

kemudian diamati ada tidaknya pemisahan fase dan inversi.

Centrifugal test / uji mekanik Sampel krim dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian

dimasukkan ke dalam sentrifugator pada kecepatan 3800 rpm

selama 5 jam. Pengamatan dilakukan terhadap krim yang telah

31


disentrifugasi untuk mengamati jika terjadi pemisahan fase air

dan minyak.

4.3 Uji Sitotoksik

4.3.1 Bengkuang (Pachyrhizus erosus)

Biji bengkuang memiliki sifat insektisida dan pestisida yang

membunuh tungau dan kutu karena kandungan rotenon dan isoflavonoid

lainnya. Rotenon dapat melawan beberapa cell line tumor pada manusia.

Akan tetapi, mekanisme aksi dari senyawa aktif ini belum dapat

dipahami secara utuh (Edgar et al., 2014). Sifat sitotoksik dari bahan ini

dapat diujikan pada cell line leukimia pada manusia (K562) yang

didapatkan dari American Type Culture Collection (ATCC, Rockville,

MD, USA) dan dikultur di Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) dengan suplemen berupa 10% serum fetal bovine yang telah

dinonaktifkan melalui pemanasan, 100 U/mL penisilin G, 100 U/mL

streptomisin sulfat dan 0,25 g/mL amphothericin B (Invitrogene

Carlsbad, CA, USA). Kultur ini dijaga pada kondisi 37C pada atmosfer

yang telah dihumidifikasi dengan 5% CO2 (Gonzalez-Sanches et al.,

2011).

Sitotoksik ekstrak bengkuang pada sel K562 dapat dilakukan

dengan metode MTT assay yang telah dimodifikasi dengan tiga

perlakuan yang berbeda. Sel K562 disemai pada 96 well plate dengan

konsentrasi 7x103 sel/well yang mengandung 200 L medium yang

telah disebutkan di atas. Setelah 24 jam, sel-sel ditambahkan dengan

ratonen dengan konsentrasi yang berbeda dalam volum 50 L, sehingga

menghasilkan volum total sebesar 250 L. Viabilitas sel kemudian

ditentukan 48 jam kemudian. Pada tahap penentuan tersebut, medium

dihilangkan dan 20 mL MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazolium bromida 2,5 mg/mL (Sigma, St. Louis, MO, USA)

dalam PBS dengan pH 7,2 ditambahkan. Setelah 2 jam, 0,2 mL DMSO

ditambahkan pada setiap well, diikuti dengan pengocokan perlahan.

Absorbansi kemudian diukur pada panjang gelombang 540 nm dengan

menggunakan Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader, BioTek

(BioTek, Winooski, VT, USA). Jumlah formazan yang terdeteksi

proporsional dengan jumlah sel yang hidup, dan penghambatan

pertumbuhan sel dapat ditentukan dengan persamaan :

32


Penghambatan pertumbuhan sel (%) = (1 absorbansi sel yang diuji/absorbansi sel yang tidak diuji) x 100

Rotenon menunjukkan aktivitas sitotoksik yang penting (IC50 = 13,05

M).

Genotoksiksitas retonen dideteksi dengan menggunakan comet

assay. Pada metode ini sel yang diuji masih sama, yaitu K562. Sel-sel

yang akan diuji disemai pada cawan petri 60x15mm (Coming, NY)

sebanyak 2x104 sel per cawan dan diuji dengan rotenon (13,05 M)

pada 1,3 dan 12 h; hidrogen peroksida (10%) digunakan selama 15

menit sebagai kontrol positif karena senyawa ini menghasilkan

pemutusan untaian tunggal dan ganda terinduksi pada konsentrasi

bersatuan milimolar sekalipun (Orescanin et al., 2009). Comet assay

versi alkalin digunakan menurut Lu et al. pada tahun 2010. Singkatnya,

setelah dilakukan pengujian, sel-sel leukimia tersebut terpisah dan 2 mL

dari suspensi ini dihomogenisasi dengan 300 L agarosa dengan titik

leleh rendah (0,8%) dengan larutan lisis (300 mM NaOH, 1mM

Na2EDTA, Triton X-100 1%, dan 10% DMSO), buffer elektroforesis

(300 mM NaOH, 1 mM Na2EDTA dengan Ph 13,0 dan suhu 4C) dan

campuran agarosa dengan pelelehan normal dan rendah sebanyak 0,6%.

Selanjutnya, elektroforesisi dilakukan pada tegangan 30 V dan 300 mA

selama 20 menit, dan kemudian ptotongan dipisahkan dan direndam

dengan buffer netralisasi (0,4 M Tris-HCl pada pH 7,5) sebanyak 3 kali,

masing-masing selama 15 menit. Selanjutnya, slides dikeringkan pada

suhu ruang selama 5 menit sebelum dinodai dengan 5 L gel merah

(1:50.000), dan comet divisualisasi dan difoto dengan mikroskop

fluorescence (Lu et al., 2010).

Efek in vitro dari rotenon pada plasmid pDEST26 ditaksir dengan

elektroforesis jel agarosa. Singkatnya, ratonen (13,05 atau 130 M),

vehicle (DMSO 0,28%) dan kontrol positif berupa reagen Fenton

(30mM de H2O2, 50 nM asam askorbik, dan 80 nM de FECl3) dan

endonuklease Eco RI (Siddiqui et al., 2011) dicampur dengan 0,5 g

pDEST26 DNA plasmid dalam tabung mikrosentrifugasi 200 L.

Volum akhir dari campuran reaksi sebesar 12 L dengan

DNAse/RNAse bebas air dan diinkubasikan selama 1 jam pada suhu

37C. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 80V selama 2 jam. Gel

kemudian ditambahkan dengan gel red (0,5 g/L). DNA

divisualisasikan dengan UV-transilluminator dengan menggunakan

33


Biomaging System Software (UVP) dan difoto dengan sistem Gel Doc

(Ultra-Violet Product UVP Ltd., Cambridge, U.K.).

Caspase-3 yang telah diaktivasi dievaluasi dengan

immunocytofluorescence. Sel K562 (5x105) diinkubasikan selama 24

jam dengan rotenon (13,05 M), taxol (250 nM) dan DMSO (0,28%).

Setelah itu, sel diletakkan pada cawan petri dengan coverslip dan

selanjutnya difiksasi dengan 4% paraformaldehida (PFH) selama 30

menit pada suhu 4C. Setelah dilakukan fiksasi, PFH dihilangkan dan

sel dicuci sebanyak tiga kali dengan TBS dan 0,1% Tween. Sel

dipermeabilisasi dengan 0,1% Trixton X-100 dalam TBS dengan 0,1%

Tween selama 1 jam, dan diblok dengan bovine serum albumin (BSA)

5% selama 1 jam. Sel diinkubasi dengan antibodi polyclonal rabbit anti-

capcase-3 (1:250) pada suhu 4C selama satu malam. Alexa Fluor 546

anti-rabbit IgG diinkubasi pada kondisi gelap selama 1 jam pada suhu

kamar sebagai antibodi sekunder (A11030; 1:500; Invitrogen, Grand

Island, NY). Cover slip disusun dengan menggunakan media penyusun

4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Sampel diobservasi pada mikroskop dengan kamera digital. Percobaan dilakukan sebanyak tiga

kali. Coverslip tanpa antibodi primer diproses secara paralel sebagai

kontrol negatif. Positif kontrol yang digunakan adalah taxol (250 nM).

Metode analisis statistik dengan menggunakan metode ANOVA

satu ujung digunakan untuk menganalisis semua hasil yang didapatkan.

Tiga jenis isoflavonoid lain yang dapat diisolasi dari bengkuang tidak

bersifat sitotoksik. Kemampuan rotenon menginduksi kematian sel, dan

aktivasi caspase-3 diindikasi dengan TUNEL assay, dan

immunocytofluorescence. Plasmid nicking assay mengindikasikan

bahwa rotenon tidak berinteraksi secara langsung dengan DNA.

4.3.2 Daun Saga (Abrus precatoris)

Berdasarkan buku Medicinal Plants of The World, aktivitas

sitotoksik dibuktikan menggunakan ekstrak dari stem yang dikeringkan

(menggunakan etanol 95%), dan selanjutnya dikultur. Aktifitas

sitotoksiknya inaktif pada CA-9KB, ED50> 30,0 mcg/mL. Ekstrak air

dan etanol pada daun yang telah dikeringkan dikultur, sehingga

memproduksi aktivitas yang kuat pada Sarcoma Yoshida ASC, ED50

0,004 mcg/mL. Ekstrak dari daun saga memberikan hasil aktif pada CA-

9KB, ED50< 20,0 mcg/mL. Kemudian, ekstrak dari daun juga aktif pada

pengujian Poecilocera picta.

34


Selain itu, adapun cara lainnya untuk membuktikan toksisitas

daun saga adalah melalui uji coba terhadap tikus. Tikus yang digunakan

adalah 20 tikus wistar dengan berat rata-rata 180 hingga 250 g.

Kemudian, 20 tikus ini dibagi menjadi 4 kelompok, yakni kelompok A,

B, C, dan D. Setiap 1 kelompok, terdiri atas 5 ekor tikus. Kelompok A

berfungsi sebagai kontrol percobaan, sedangkan kelompok B, C, dan D

diberi dosis ekstrak sebanyak 400 mg/kg, 800 mg/kg, dan 1600 mg/kg.

Ekstrak daun yang digunakan memiliki konsentrasi sebesar 500 mg/mL

yang telah melalui tahap maserasi. Kemudian dilakukan filtrasi dan hasil

filtrat diberikan kepada tiap-tiap kelompok tikus berdasarkan dosis yang

telah ditentukan sebelumnya.

Teknik pengambilan sampel darah dan serum dikumpulkan dari

jantung tiap tikus yang telah dianastesi menggunakan dietil eter. Sampel

darah disimpan di dalam botol non-heparinised. Penentuan parameter

hematologi mengikuti aturan Schalm, Jain & Caroll (1975)

menggunakan metode cyanomethahaemoglobin. Packed Cell Volume

(PCV) ditentukan melalui metode konvensional dengan mengisi

pembuluh kapiler dengan darah, seperti yang telah dituliskan oleh

Schalm et al. (1975). Eritrosit setelah itu dihitung menggunakan

haemocytometer. Total leukosit juga dihitung dalam percobaan ini.

Indeks eritrosit ditentukan berdasarkan nilai yang tertera pada

penghitungan RBC, konsentrasi hemoglobin, dan nilai PCV. Penentuan

parameter serum biokimia ditentukan melalui penghitungan protein total

menggunakan reaksi biuret, albumin dihitung menggunakan estimasi

warna dengan Sigma Diagnostics reagen albumin yang mengandung

bromocresol green (BCG). Globulin dapat diperkirakan sebagai

pembeda total protein dan albumin.

Dari uji coba yang telah dilakukan, terjadi perubahan secara

hematologis, dimana kelompok B, C, dan D mengalami penurunan

hemoglobin yang signifikan (P < 0,05) dengan rata-rata tingkat PCV

relatif terhadap kontrol, meskipun tidak mengindikasikan adanya

anemia. Hemoglobin menurun drastis pada tikus B dan D, namun tidak

pada tikus 800 mg/kg. Selanjutnya, pada leukogram juga menunjukan

adanya penurunan yang cukup signifikan pada jumlah sel darah putih

kelompok tikus B. Penurunan signifikan juga terjadi pada limfosit dari

tikus yang diberikan perlakuan B dan C. Pada pengujian serum

biokimia, terjadi kenaikan yang cukup signifikan pada total protein,

albumin dan globulin kelompok D. Pengujian enzim menunjukkan

35


adanya kenaikan yang cukup signifikan pada tingkat ALP (alkalin

fosfatase) pada tikus kelompok D. Sedangkan pada tikus kelompok B,

mengalami penurunan ALP (alkalin fosfatase) yang cukup signifikan.

Pada tikus kelompok C, terjadi reduksi yang signifikan pada total

bilirubin dan bilirubin terkonjugasi, dan kebalikannya, tikus kelompok

D mengalami kenaikan yang cukup signifikan pada total bilirubin dan

bilirubin terkonjugasi.

Dari percobaan diatas dapat disimpulkan bahwa daun saga memiliki

potensi sitotoksik berdasarkan perubahan jumlah eritrosit, limfosit dan

total bilirubin pada tikus.

4.3.3 Asam Stearat

Dua formulasi lotion yang mengandung 2,8% asam stearat diuji

fototoksisitasnya. Formulasi dalam bentuk larutan 100, 75, 50 dan 25%

diaplikasikanpada 4 daerah yang berbeda pada punggung 10 Hartley

albino guinea pigs dengan berat 324-486 g dan 284-452 g. Bagian in

kemudian dipaparkan dengan radiasi UV. Sepuluh guinea pigs dengan

berat 268-434 dan 344-464 g dijadikan sebagai kontrol dan mendapat

aplikasi yang sama, tetapu tidak diberikan iradiasi UVA. Bagian ini

dievaluasi 1 dan 24 jam setelah perlakuan diberikan. Tidak ada

formulasi yang teruji menghasilkan bersifat fototoksik pada guinea pigs

pada kondisi yang diberikan karena kelompok kontrol mengalami tanda-

tanda iritasi jika dibandingkan dengan kelompok yang diiradiasi. Satu

guinea pigs pada kelompok kontrol mati. Reaksi kelompok-kelompok

yang diuji menunjukkan eritema yang tergolong dipertanyakan hingga

sedang pada 6 (konsentrasi 50%) ke 10 bagian (75%, 100%). Formulasi

dengan konsentrasi 25% tidak menghasilkan tanda-tanda fototoksik

pada kedua uji. Kelompok kontrol pada kedua studi menunjukkan efek

yang tergolong dipertanyakan hingga sedang (bagian 50-100%, bagian

50-75%) dan penyakit eritema (bagian 100%). Tidak ada iritasi yang

ditunjukkan pada bagian kontrol yang diberi perlakukan dengan

formulasi 25%.

Selain itu, uji coba juga telah dilakukan pada manusia atau bagian

tubuhnya. Sebuah face cream yang mengandung 13% asam stearat diuji

photosensitization pada 52 subjek manusia dan 4 patch induksi serta 1

orang patch tantangan. Patch yang tertutup dan terbuka 24 jam

diaplikasikan dan bagian tempat dilakukannya pengujian diiradiasi

dengan spektrum cahaya Xenon UV penuh, masing-masing sebanyak

36


tiga kali Minimal Erythermal Dose (MED) predeterminasi. Dan setelah

48 jam, setelah tantangan untuk patch dilakukan selama 24 jam, bagian

yang diuji diradiasi dengan sinar UVA (sumber Xenon yang dilengkapi

dengan filter Schott WG345) selama 3 menit. Tidak terjadi reaksi

apapun pada bagian yang diuji, baik untuk patch yang terbuka maupun

tertutup pada bagian yang diinduksi maupun ditantang.

4.3.4 Setil Alkohol

Uji sitotoksik setil alkohol diuji dengan menggunakan binatang.

Dalam hal ini, pengujian setil alkohol dibagi menjadi beberapa bagian,

yakni pengujian terhadap pernapasan, penggunaan pada bagian bibir,

pengujian iritasi pada kulit dan iritasi okular (iritasi di bagian kulit

sekitar mata). Hasil serta cara pengujian dapat ditunjukkan melalui tabel

berikut.

Tabel 4.1 Toksisitas Inhalasi Akut

Sumber : Anonim, 1988

Tabel 4.2 Toksisitas Oral Akut


37


Tabel 4.3 Toksisitas Dermal Akut


Tabel 4.4 Iritasi Kulit


38


Tabel 4.5 Iritasi Ocular


Penghirupan uap setil alkohol (26 ppm) oleh tikus, anak tikus,

dan guinea pig menyebabkan iritasi ringan pada membran mucous pada

mata, hidung, tenggorokan, dan organ pernapasan lainnya. Pada

konsentrasi 2220 mg/m3, senyawa ini dapat menyebabkan kematian

pada hewan. Untuk pengujian pemaparan secara oral, setil alkohol yang

digunakan dan diuji pada tikus adalah > 8.3 g/kg. Setelah pengujian,

hewan mengalami depresi di bagian sistem saraf dan pernapasan

menjadi tersendat. Setil alkohol dengan kandungan sebesar 2,0; 3,25;

dan 4,0% tidak memberikan efek beracun.

Berdasarkan percobaan diatas, setil alkohol aman untuk

digunakan sebagai bahan kosmetik jika digunakan pada dosis yang

tepat.

39


4.3.5 Gliseril Monostearat

Uji sitotoksik gliseril monostearat dilakukan pada cell line murine

fibroblas (NIH/3T3) yang dikultur di dalam DMEM dengan

displementasikan dengan FBS 10% yang telah dinonaktifkan dengan

pemanasan, 100 U/mL penisilin, 100 g/mL sterptomisin, 10mM

HEPES yang dijaga pada suhu 37C di dalam atmosfer yang telah

dihumidifikasi dengan 5% CO2 dan pH 7,4. Setiap 2-3 hari, sel

dihilangkan supernatannya sebanyak 90% dan digantikan dengan media

segar. Pada semua percobaan, keberlangsungan hidup sel dievaluasi

pada awal eksperimen dengan ekskulsi Trypan Blue.

Viabilitas sel dapat dilihat melalui MTT assay. Pengujian ini

mengevaluasi fungsi mitokondria sebagai parameter yang menentukan

viabilitas sel, yang mengizinkan deteksi pada sel sebelum sel-sel

tersebut kehilangan integritas dan bentuk. Singkatnya, sel NIH/3T3

(1x104 mL

-1) disemai pada 96 plat tetes dan diinkubasikan selama 24

jam. Selanjutnya, media kultur digantikan dengan gliseril monostearat

dengan rentang 50 hingga 1000 g/mL. Setelah inkubasi selama 24 jam,

sel dicuci dengan media kultur segar dan 5 mg/mL MTT ditambahkan

dengan diikuti dengan inkubasi selama 2 jam pada suhu 37C.

Presipitasi formazan yang dilarutkan di dalam DMSO dan absorbansi

diukur pada panjang gelombang 540 nm menggunakan micro-well

system reader (Organin Teknika, Turnhout, Belgium). Konsentrasi

sitotoksik (CC50) dikalkulasi dengan Hill concentration-response curve.

Selain itu, gliseril monostearat telah diuji pada hamster jantan.

Senyawa ini diberikan kepada hamster yang diet 15% dengan

konsentrasi 5-10% selama 22-28 minggu. Terjadi penurunana

peningkatan berat pada pada kelompok ini. Hati hamster mengalami

pembesaran tetapi tidak terjadi perubahan histopatologikal (Orten dan

Dajani, 1957).

Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa tidak ada efek yang

membahayakan bagi manusia, yang dihasilkan oleh gliseril monostearat

ini (World Health Organization, 1974).

4.3.6 Metil Paraben

Turunan paraben yang lain, yaitu propilparaben. Pengujian

dilakukan pada sel vero (diturunkan dari ginjal monyet) yang

ditumbuhkan pada suhu 37C pada labu dengan luas 75 cm2

(Falcon,Becton Dickinson, USA) pada kondisi atmosfer yang

40


mengandung 5% CO2 dengan DMEM yang disuplementasikan dengan

5% fetal calf serum (FSC), 100 U/mL penisilin, 100 mg/mL

streptomisin dan 2 mM L-glutamin (semua dari Lonza, Switzerland).

Pertumbuhan sel secara eksponensial disemai pada massa jenis 80.000

sel/mL ke dalam 24 plat tetes untuk evaluasi kuantitatif, atau ke dalam

12 plat tetes yang mengandung kaca cover-slip steril untuk studi dengan

mikroskop. Setelah menghilangkan medium kultur sel dan mencuci PBS

(phosphat-buffered saline), sel vero diinkubasi selama 24 jam dengan

medium baru yang mengandung PPB dengan pengenceran berseri.

Larutan PPB dipersiapkan dari DMSO dan dijaga pada suhu kamar dan

kegelapan. Konsentrasi maksimum DMSO pada mediung adalah 0,5%

termasuk kelompok kontrol.

Tiga colorimetric assay digunakan untuk mengevaluasi aktivitas

sitotoksik senyawa ini. Netral red uptake (NRU) ke dalam lisosom dari

sel hidup dievaluasi. Singkatnya, setelah PBB kultur media digantikan

dengan meda baru yang mengandung 50 g/mL neutral red.

Selanjutnya dilakukan inkubasi selama 3 jam, media dihilangkan dan

pewarna intraseluler diekstrak dengan mendambahkan larutan etanol

50% yang mengandung 1% asam asetat. MTT assay, termasuk reduksi

garam tetrazolium (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenil tetrazolium

bromide) dengan sel hidup menjadi formazan ungu. Setelah diberi PPB,

sel diinkubasi selama 2 jam dengan MTT dalam DMEM pada

konsentrasi akhir 0,5 mg/mL. Media digantikan dengan DMSO untuk

melarutkan formazan. Pertumbuhan sel dan/atau cell detachment

diestimasi dengan menghitung total protein content (TPC), dengan

reagen brilliant blue.

Paraben di dalam formulasi kosmetik yang diaplikasikan ke kulit

akan mengalami penetrasi pada stratum corneum dengan hubungan

berkebalikan dengan panjang rantai ester. Karboksilesterase

menghidrolisis paraben pada kulit. Paraben tidak terakumulasi di dalam

tubuh (Anonim, 2008). Konsentrasi serum paraben, bahkan setelah

masuk ke dalam pembuluh darah cenderung rendah dan melambat. Studi

toksisitas akut pada hewan mengindikasikan bahwa paraben bersifat

nontoksik sebagian.

Sejumlah uji genotoksik lain dilakukan pada metilparaben, seperti

Ames testing, dominant lethal assay, host mediated assay, dan cytogenic

assay, mengindikasikan bahwa paraben bersifat nonmutagenik,

meskipun etilparaben dan metilparaben menambah aberasi kromosom

41


pada ovary cell assay Chinese Hamster. Etilparaben, propilparaben, dan

butilparaben dalam diet menghasilkan poliferasi sel dalam forestomach

tikus, dengan aktivitas yang secara langsung berhubungan dengan

panjang rantai alkil, tetapi isobutilparaben dan butilparaben tidak

bersifat karsinogenik pada studi chronic feeding pada tikus.

Metilparaben bersifat tidak karsinogenik ketika diinjeksikan secara

subkutan pada tikus. Metilparaben tidak bersifat teratogenik pada

kelinci, tikis, dan hamster. Paraben, meskipun pada level tertentu

menghasillkan toksisitas maternal, tidak menghasilkan anomali fetal

pada studi yang dilakukan pada hewan. Paraben telah diteliti secara

ekstensif untuk mengevaluasi toksisitas pada reproduktif laki-laki. Pada

salah satu uji in vitro, sperma tidak dapat bertahan hidup pada

konsentrasi 6 mg/mL metilparaben, 8 mg/ mL etilparaben, 3 mg/ mL

propilparaben, atau 1 mg/ mL butilparaben, tetapi pada uji in vivo dari

0,1% sampai 1,0% metil

Makalah Whitening Cream

Documents

Transcript of Makalah Whitening Cream