LAPORAN BENIH DAN PASCAPANEN

MENGUJI KESEHATAN BENIH DENGAN UJI SEROLOGI MENGGUNAKAN TEKNIK ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay)

Oleh :

Andi Muhammad Noor Iksan

A34120014

Dosen:

Dr. Efi Toding Tondok, SP, M.Sc. Agr

Asisten:

1. Anggun

2. Cindy

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2015

PENDAHULUAN

Latar belakangPenyakit tanaman adalah terjadinya perubahan fungsi sel dan jaringan inang

sebagai akibat gangguan yang terus menerus oleh agensi patogen atau faktor lingkungan. Secara singkat penyakit tanaman adalah penyimpangan dari keadaan normal. Penyebab tanaman sakit bermacam-macam antara lain disebabkan oleh cendawan, bakteri, virus, kekurangan air, kekurangan atau kelebihan unsur hara (Pracaya 1999).

Ketersediaan benih yang bebas  penyakit merupakan tahap awal untuk keberhasilan produksi pertanian sehingga di dalam program pengembangan pertanian yang berkelanjutan, ketersediaan benih bebas patogen sangatlah diperlukan. Informasi mengenai penyakit benih dan cara  pengelolaannya diperlukan untuk mengetahui jenis patogen yang terbawa benih. Pencegahan penggunaan bibit yang terinfeksi virus dan bakteri dapat dilakukan melalui deteksi dini penyakit sebagai salah satu upaya mengurangi infeksi dan munculnya penyakit di lapangan. Metode yang dapat digunakan dapat melalui biomolekuler, yaitu dengan uji serologi menggunakan teknik ELISA (Enzim-Linked Immunosorbent Assay (Manzila 2003). Cara kerja teknik ELISA yaitu dengan memanfaatkan antibodi spesifik.

Prinsip utama uji serologi yaitu reaksi in vitro antara antigen dan antibodi. Pada teknik ELISA, melibatkan sebuah enzim (protein yang mengkatalisis suatu reaksi biokimia) serta antibodi dan antigen (kekebalan molekul). Pengujian dengan teknik ELISA digunakan untuk mendeteksi zat yang memiliki sifat antigenik, terutama protein (sebagai lawan dari molekul kecil dan ion seperti glukosa dan kalium). Pengujian dengan teknik serologi sangat bergantung kepada ketersediaan sejumlah antibodi yang spesifik untuk patogen sasaran. Metode umum yang digunakan dalam penguujian dengan teknik ELISA antara lain direct ELISA dan indirect ELISA.

TujuanPraktikum ini bertujuan mendeteksi patogen terbawa benih dan mengetahui

prosedur teknik serologi ELISA

BAHAN DAN METODE

Alat dan bahanAlat yang digunakan adalah PVC mikrotiter plate, pipet mikrotiter, ELISA-

reader, mortar dan pistil. Bahan yang digunakan adalah PBST wash buffer, buffer substrat, buffer conjugate, buffer ekstraksi, buffer coating, substrat PNP, antibodi dan sampel daun tanaman terinfeksi virus CMV

MetodePraktikum uji serologi yang digunakan adalah dengan teknik indirect ELISA.

Awalnya dilakukan coating dengan ditambahkannya buffer coating dan antibodi dengan perbandingan 1 µm : 1000 µm, sehingga didapatkan antibodi yang pertama sebanyak 1 µ dan buffer sebanyak 1 ml. Kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang. Plate dicuci dengan larutan PBST sebanyak 4 sampai 8 kali pencucian. Lalu, pemberian antigen dari sap tanaman terinfeksi yang didapatkan dari hasil pencampuran buffer ekstraksi dan daun sampel yang digerus bersamaan. Antigen yang sudah diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan plate mikrotiter. Diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang, semalam 4 ºC. Plate dicuci dengan larutan PBST sebanyak 4 sampai 8 kali. Antibodi yang kedua didapatkan dari buffer conjugate. Kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang. Plate dicuci dengan larutan PBST ebanyak 4 sampai 8 kali. Dimasukkan substrat PNP (P-nitrophenil phosphate) yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/fluorogenik/elektrokimia. Diinkubasi selama 0,5 sampai 1 jam. Hasil dikuantifikasi dengan pembacaan dari ELISA-reader.

PEMBAHASAN

Teknik ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) atau penetapan kadar immunosorben taut-enzim merupakan suatu uji serologis yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan antibodi atau antigen dalam sampel DNA dan patogen tanaman. Prinsip kerja ELISA adalah adanya ikatan antara kompleks antigen dan antibodi dengan penambahan substrat tertentu dan enzim peroksida yang akan memberikan perubahan warna pada hasil yang positif (Walker 2005). Interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/signal. ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi/antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer dan dengan cara menetukan jumlah penambahan kadar antibodi/antigen,sehingga dapat dibuat suatu kurva standard antara kadar antibodi atau antigen yang dapat dihitung berdasarkan absorbansinya. Kepekatan virus pada bagian tanaman berbeda-beda sehingga dianjurkan memilih bagian tanaman yang jelas terlihat gejalanya dan penggerusan sampel dengan ekstrak buffer yang paling efektif adalah dengan pengenceran 100 atau dengan perbandingan 1 : 10. Namun jika kepekatan virus pada tanaman tinggi, pengenceran ekstrak tanaman dapat ditingkatkan mencapai 10-3 (Manzila et al. 2003)

Pada dasarnya teknik uji serologi ELISA dibedakan menjadi dua metode, yaitu Direct ELISA dan Indirect ELISA. Prinsip kerja kedua metode tersebut berbeda dari segi protokol kerja dan jenis antibodi yang dipakai. Direct ELISA merupakan metode ELISA yang paling sederhana dan digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen pada sampel. Direct ELISA mendeteksi antigen dengan cara mengikat antigen dengan antibodi yang telah dilabel seara langsung dengan enzim. Reaksi pengikatan tersebut terjadi secara spesifik (Ausubel 2003). Teknik yang dilakukan pada Direct ELISA  dianalogikan seperti “Sandwich” karena coating antibody spesifik pertama dimasukkan ke sumur uji. Kemudian dimasukkan antigen dari sap tanaman dan dikonjugasikan dengan antibodi beralkalin fosfat. Perbandingan sap tanaman dan buffer untuk menjadi antigen yaitu 1:10µL. Microplate sampel uji dan indikator yang sudah diinkubasi dan dicuci dengan PBST, diberi pewarna PNP (P-Nitrophenylphosphate). Kemudian selama 30 -60 menit dinkubasi pada ruangan gelap.  PNP yang dapat bereaksi dengan DNA tanaman uji akan berubah warna menjadi kuning. Diret ELISA memiliki keuntungan diantaranya lebih cepat karena prosedur dan reagen yang dibutuhkan lebih sedikit, spesifitasnya tinggi, dapat digunakan untuk sampel kompleks dan mampu mendeteksi beberapa jenis antibodi dari 1 sampel serum (tergantung dari kit ELISA yang digunakan) (Sylvest 2010)

Pengamatan hasil ELISA dilakukan secara kuantitatif maupun kualitatif. Hasil ELISA secara kuantitatif dapat diamati dari nilai optical density (OD) yang diukur dengan menggunakan ELISA reader menggunakan panjang gelombang 405 nm. Hasil kuantitatif diinterpretasikan dalam perbandingan dengan kurva standar (purifikasi antigen) agar dapat secara tepat digunakan untuk menghitung

konsentrasi antigen dalam berbagai sampel (Sylvest 2010). Hasil dikatakan positif apabila terjadi perubahan warna menjadi kuning dan pada pambacaan ELISA reader nilai absorbansi sampel sama dengan atau lebih besar dua kali nilai kontrol negatif. Sebaliknya, apabila tidak terjadi perubahan warna dan pada pembacaan nilai absorbansi sampai lebih kecil dari dua kali nilai kontrol negatif, sampel dikatakan bernilai negatif. Microplate dibentuk dari bahan plastik polystyrene. Jenis plastik ini mampu membuat protein DNA tanaman uji dan formula menempel pada dinding dalam sumur plate. Apabila DNA sudah melekat, maka pencucian pada konsentrasi PBST sepekat apapun tidak akan menghilangkannya.

Hasil ELISA secara kualitatif dapat diamati dengan adanya perubahan warna menjadi kuning pada reaksi pengujian jika sampel yang diuji mengandung antigen. Semakin tinggi intensitas warna yang terbentuk, maka semakin tinggi pula konsentrasi antigen pada sampel tersebut (Miller 2006). Data ELISA biasanya digambarkan dengan nilai optical density (OD) dan konsentrasi log untuk menghasilkan kurva sigmodial. Hal ini dapat dilakukan dengan menggambar grafik langsung atau dengan software curve fitting yang biasanya ada pada ELISA reader (Sylvest 2010).

Senyawa kimia yang digunakan pada praktikum yang gunanya sebagai media (substrat) untuk reaksi enzimatik adalah P-nitrophenyl phosphatae (PNPP). Menurut Suryadi et al. (2009) bahwa enzim Alkaline phosphatase (AP) memerlukan PNPP yang dilarutkan dalam diethanolamine 10%, substrat ini dihidrolisis oleh enzim menjadi P-nitrophenyl (PNP) yang berwarna kuning. Semakin tinggi intensitas warna yang terbentuk, semakin tinggi pula konsentrasi virus yang terdapat pada sampel. Perubahan warna terjadi akibat hidroliza enzimatik pada reaksi antara konjugat antibodi-enzim dengan substratnya, sehingga hasil ELISA lebih peka dan dapat dikuantifikasi (Suryadi et al. 2009).

Pengujian dengan teknik ELISA memiliki beberapa kerugian, yaitu kemungkinan yang besar terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen lain. Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi.

KESIMPULANPengujian dengan metode uji serologi merupakan salah satu cara yang

digunakan untuk menguji kesehatan benih. Hasil positif atau negatif pada pengujian dengan teknik ELISA pada tanaman ditunjukkan dengan dihasilkannya perbedaan warna pada plat mikrotiter. Keuntungan dengan pengujian ELISA yaitu spesifitasnya tinggi, dapat digunakan untuk sampel kompleks dan mampu mendeteksi beberapa jenis antibodi dari 1 sampel serum. Sedangkan kerugiannya yaitu kemungkinan yang besar terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen lain.

DAFTAR PUSTAKAAusubel F.M, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith &

K. Struhl. 2003. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons Inc. USA.

Manzila I, Machmud M, Jumanto, Suryadi. 2003. Evaluasi lapangan perangkat ELISA dengan antibodi poliklonal untuk deteksi dan identifikasi RRSV dan Ralstonia solanacearum..[Internet]..http://www.indobiogen.or.id/terbitan/prosiding/fulltext_pdf/prosiding2003_328-339_ifa_avaluasi.pdf. [diunduh 27 April 2015]

Miller D. C. 2006. Mechanism of enhanced vascular cell response to polymeric biomaterials with nano-structured surface features. ProQuest Information and Learning Company, Ann Arbor.

Pracaya, 1999. Hama Dan Penyakit Tanaman. Jakarta:Penebar SwadayaSuryadi YI, Manzila, Machmud. 2009. Potensi pemanfaatan perangkat diagnostik

ELISA serta variannya untuk deteksi patogen tanaman. Jurnal Agrobiogen. 5(1):39-48

Sylvest, L. 2010. An Introduction to ELISA. (Online). http://www.abdserotec.com /resources/elisa-technical-resources-and-troubleshooting/an-introduction-to-elisa.html diakses 26 April 2015

Walker J M. 2005. Medical biomethods handbook. Humana Press Inc:New Jersey: