3.8.1 Kurva Kalibrasi dan Kontrol KualitasLarutan stok yang berisi karvedilol dibuat dalam asetonitril pada konsentrasi 1 mg/ml. larutan stok dibuat dalam beberapa seri kadar dari larutan stok dengan asetonitril. Larutan kemudian disimpan dalam tube pada suhu -20oC dalam kondisi gelap ketika tidak digunakan. Seri kadar larutan sampel untuk kurva kalibrasi dibuat konsentrasi 2, 5, 20 dan 100 ng/ml dengan menambah 100 l larutan stok (40,100,400 dan 2000 ng/ml) ke 1,9 ml plasma tikus bebas obat. Plasma yang telah diberi obat (50 l) kemudian disimpan dalam suhu -20oC hingga analisis dilakukan. 50 l sampel plasma tikus ditambahkan 150 l asetonitril kemudian divorteks selama pada kecepatan 2000 rpm. Supernatan kemudian diambil ke dalam gelas vial untuk kemudian diinjeksi ke HPLC.

3.8.2 Pengujian Farmakokinetik pada Hewan UjiTikus wistar albino digunakan sebagai hewan uji untuk bioavaibilitas. Hewan uji dipilih setelah dilakukan pemeriksaaan permukaan kulit tikus. Tikus yang memililki bobot 230 dan 250 g dipilih dalam penelitian ini. Sekitar 10 cm2 kulit dicukur pada bagian dorsal. Tikus berada dalam pengawasan selama 24 jam setelah pencukuran untuk melihat kemungkinan efek yang tidak diharapkan setelah pencukuran. Tikus kemudian dipuasakan dalam periode ini. Tikus kemudian dibagi menjadi 3 kelompok (n=5). Kelompok I : diberikan secara oral karvedilol 5 mg/kg bb Kelompok II : diiberikan dengan formula patch transdermal optimum Pengambilan darah diambil sebanyak 0,5 ml dari pembuluh vena pada interval waktu yang berbeda (1,2,3,5,8,12 dan 24 jam) kemudian ditempatkan di tube yang berisi 150l asetonitril. Sampel plasma kemudian dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 2000 rpm dan disimpan dalam vial pada suhu -20oC hingga sampel dianalisis. Konsentrasi karvedilol dalam plasma diukur dengan menggunakan HPLC Reverse Phase dengan kolom C18 dengan fase gerak campuran asetonitril dan 0,1 % asam format (70:30 v/v) dengan kecepatan alir 0,25 ml/menit. Suhu di kolom dijaga pada suhu 25oC dan 4oC. Waktu analisis berlangsung selama 2 menit dengan volume injeksi 2l.Jumlah kumulatif karvedilol yang berpenetrasi per unit area diplot dengan waktu dan kemiringan (slope) dari porsi linear dari plot diestimasikan sebagai steady state flux (Jss) . Koefisien permeabilitas dihitung dengan menggunakan persamaan Kp=Jss/Cv dimana Cv adalah total konsentrasi patch Konsentrasi plasma karvedilol pada interval waktu yang berbeda digunakan untuk menghitung parameter farmakokinetik seperti konsentrasi maksimum (Cmax), waktu untuk mencapai konsentrasi maksimum (T max) dan area dibawah kurva konsentrasi plasma-waktu (AUC0). AUC dihitung dengan menggunakan aturan trapezoidal. Konstanta kecepatan eliminasi (Ke) dihitung dengan analisis regresi dari garis kemiringan (slope) dan waktu paruh (t1/2) dihitung dengan menggunakan rumus 0,693/Ke. Biaoavaibilitas relatif karvedilol setelah penghantaran transdermal dibandingkan dengan oral dihitung sebagai berikut:

Penetapan kadar obat dalam plasma menggunakan HPLC dengan fase diam kolom C18 yang dijaga pada suhu 40oC. Sampel kemudian diinjeksikan secara otomatis dengan fase gerak metanol dan 50 mM KH2PO4 pH2,5 (60:40, v/v) dengan kecepatan alir 1 ml/menit. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang kisaran 247- 344 nm.Spiking plasma dengan obat Kolom terlebih dahulu dibersihkan 2 kali dengan 1 ml metanol diikuti dengan pencucian 1 ml aquades. 500 l dari 20 mM KH2PO4 pH 4 , 20 l plasma yang mengandung karvedilol ditambahkan ke kolom. 0,5 ml aquades diikuti 0,5 ml 20mM KH2PO4 pH 2,5 dilewatkan melalui kolom. Karvedilol yang tertinggal pada kolom kemudian dielusi dengan 500 l pelarut fase gerak ( methanol-20 mM KH2PO4 pH 2,5, 90: 10 v/v). 20 l volume diinjeksikan pada sistem HPLC. Kurva KalibrasiLarutan stok karvedilol dengan konsentrasi 15 ; 30 ; 62,5; 125; 250 ; 500 ; 1000 ng/ml dilarutkan dengan 20 mM KH2PO4 pH 4. Larutan diinjeksikan ke sistem HPLC setelah pra perlakuan yang sama dengan plasma bebas tanpa obat. Recovery20 l blanko plasma, 20l larutan karvedilol pada konsentrasi 30; 62,5; 125; 250;500;1000 ng/ml ( dilarutkan dengan 20 mM KH2PO4 pH 4 ) . Recovery didapatkan dengan membandingkan jumlah karvedilol yang diinjeksikan secara langsung dengan jumlah karvedilol yang terbaca di HPLC