SKRIPSI BIR RIBHIL LABIB 108102000064 FAKULTAS...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Validasi Metode Penetapan Kadar Lansoprazol

dalam Darah secara In Vitro dengan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT)

SKRIPSI

BIR RIBHIL LABIB

108102000064

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JANUARI 2013

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Validasi Metode Penetapan Kadar Lansoprazol

dalam Darah secara In Vitro dengan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

BIR RIBHIL LABIB

108102000064

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JANUARI 2013

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Bir Ribhil Labib

NIM : 108102000064

Tanda Tangan : ...........................

Tanggal : 22 Januari 2013

v

HALAMAN PENGESAHAN

vi

ABSTRAK


Program Studi : Farmasi

Judul : VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR

LANSOPRAZOL DALAM DARAH IN VITRO SECARA

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT).

Lansoprazol adalah agen benzimidazol tersubstitusi untuk antisekresi lambung,

obat ini sebesar 97% terikat pada protein plasma. Kadar Lansoprazol dalam darah

adalah pada kisaran konsentrasi 0,05-5,0 µg/mL. Konsentrasinya dalam darah

kecil sehingga diperlukan metode analisis yang sensitif, selektif dan valid untuk

analisis. Pada penelitian ini, dilakukan optimasi kondisi analisis dan validasi

untuk analisis Lansoprazol dalam darah manusia menggunakan kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT). Sistem kromatografi terdiri dari kolom Acclaim® Polar

Advantage II (C18) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283

nm, dan volume penyuntikan 10 μL pada komposisi eluen metanol:dapar fosfat

(65:35) dengan penambahan trietilamin hingga pH 7,4. Proses ekstraksi darah

dilakukan dengan penambahan EDTA, kemudian plasma diekstraksi dengan

prinsip pengendapan protein menggunakan metanol kemudian dikocok dengan

vorteks selama 60 detik dan disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 10

menit. Pada validasi dalam darah memperlihatkan nilai linearitas yang baik (r =

0,9875), nilai perolehan kembali rata-rata Lansoprazol 103,45% serta nilai LOQ

2,05 µg/ml. Metode ini juga memenuhi kriteria akurasi dan presisi intra hari dan

antar hari selama 2 hari dengan %diff yang tidak melampaui ± 15%.

Kata kunci : Lansoprazol, KCKT, Validasi, Metanol.

vii

ABSTRACT

Name : Bir Ribhil Labib

Program Study : Farmasi

Title : Validation of Analytical Method of Lansoprazol in Blood In

Vitro by High Performance Liquid Chromatography

Lansoprazole is a subtituted benzimidazole gastric antisecretory agent, it is 97%

bound to plasma proteins. Plasma protein binding is constant over the

concentration range of 0.05 to 5.0 μg/mL. Its concentration in blood is small so it

requires a sensitive method of analysis, selective and valid for analysis. In this

study, carried out optimization of analytical conditions and validation for the

analysis of Lansoprazole in whole blood. Chromatography condition was

performed on a Acclaim® Polar Advantage II column (C18) under isocratic

elution with methanol-phosphate buffer (65:35, v/v adjusted pH to 7,4 with

triethylamine). Detection was made at 283 nm and analyses were run at a flow-

rate of 0,8 ml/min with injection volume is 10 µL. Blood extraction was done by

adjusted EDTA to obtain plasma, then deproteination with methanol, be shaken

with vortex for 60 seconds, then centrifuge it on 10000 rpm for 10 minutes. In

blood validation, the assays exhibited good linearity (r = 0.9875), the recovery

was 103,45%, and the limit of quantification (LOQ) in plasma was 2,05 µg/ml.

The method also fulfill the criteria for accuracy and precision intra and inter day

by % diff values not exceed ± 15%.

Keywords : Lansoprazole, HPLC, Validation, Methanol.

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, rasa syukur serta pujian senantiasa kita panjatkan kehadirat

Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya serta segala

anugerah-Nya berupa kesehatan, pemikiran dan ide sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini. Salawat serta salam semoga selalu tercurah kepada

junjungan Nabi Muhammad SAW, keluarga, para sahabat dan pengikutnya yang

senantiasa mengikuti sunnahnya hingga akhir zaman.

Skripsi ini penulis susun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh

ujian akhir guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta. Adapun judul skripsi ini adalah “Validasi Metode

Penetapan Kadar Lansoprazol Dalam Darah secara In Vitro dengan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)”.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini tidak akan selesai dengan baik tanpa

bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih

kepada:

1. Zilhadia, M.Si., Apt selaku Pembimbing I dan Supandi, M.Si., Apt selaku

Pembimbing II, yang telah meluangkan waktu, tenaga dan pikiran serta

dengan sabar membimbing dan mengajari sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini.

2. Kementrian Agama RI selaku pemberi beasiswa, sehingga penulis dapat

mengenyam pendidikan di Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta.

3. Prof. Dr, (hc) dr. M. K. Tadjudin, Sp.And selaku dekan Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akademika Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

ix

6. Ayahanda tercinta, AL Baidlowi dan Ibunda tercinta, Mun Afifah terima

kasih atas doa yang selalu tercurah untukku, kasih sayang, semangat dan

dukungannya yang menguatkan penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

7. Adikku tersayang Lautry Luthfiya Sari Labib, yang dengan canda tawanya

mampu mengusir kepenatan penulis dalam menyusun skripsi ini.

8. Teman–teman seperjuangan Farmasi Angkatan 2008, terimakasih atas sebuah

persahabatan, kekeluargaan dan persaudaraan kita selama ini.

9. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak

dapat disebutkan namanya satu persatu.

Penulis menyadari bahwa dalam skripsi ini terdapat banyak kekurangan

dan masih jauh dari kesempurnaan. Penulis mengharapkan kritik dan saran dari

pembaca untuk perbaikan dalam pembuatan skripsi.

Ciputat, 22 Januari 2013

Penulis

x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatulllah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :


NIM : 108102000064

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya,

dengan judul :

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR LANSOPRAZOL DALAM

DARAH SECARA IN VITRO DENGAN KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI (KCKT).

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada Tanggal : 22 Januari 2013

Yang menyatakan,

Bir Ribhil Labib

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................ ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ........................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................ iv

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... v

ABSTRAK ........................................................................................................ vi

ABSTRACT ...................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ...................................................................................... viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ................. x

DAFTAR ISI ..................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiii

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiv

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xv

BAB I PENDAHULUAN ....................................................................... 1

1.1. Latar Belakang ...................................................................... 1

1.2. Perumusan Masalah .............................................................. 3

1.3. Tujuan Penelitian .. ................................................................ 3

1.4. Hipotesis .. .............................................................................. 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA .............................................................. 4

2.1.Lansoprazol .. .......................................................................... 4

2.2. Darah ...................................................................................... 6

2.3. Analisa Obat dalam Darah .................................................... 6

2.4.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi........................................... 10

2.4.1. Cara Kerja KCKT ....................................................... 10

2.4.2. Wadah Fase Gerak pada KCKT ................................... 11

2.4.3. Fase Gerak pada KCKT ............................................... 11

2.4.4. Pompa pada KCKT ...................................................... 12

2.4.5. Penyuntikan Sampel pada KCKT ................................ 12

2.4.6. Kolom pada KCKT ...................................................... 12

2.4.7. Fase Diam pada KCKT ................................................ 13

2.4.8. Detektor KCKT ............................................................ 13

2.4.9. Penggunaan KCKT dalam Analisis Farmasi ............... 14

2.4.10. Keuntungan KCKT .................................................... 14

2.5. Validasi Metode Analisi ......................................................... 14

2.5.1. Ketepatan (Akurasi) ..................................................... 15

2.5.2. Presisi ........................................................................... 15

2.5.3. Batas Deteksi (limit of detection, LOD) ....................... 16

2.5.4. Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ) ....... 17

2.5.5. Linieritas ..................................................................... 17

2.5.6. Uji Kesesuaian Sistem ................................................ 18

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................ 19

3.1. Alur Penelitian ....................................................................... 19

3.2. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................... 20

xii

3.3. Bahan dan Alat ...................................................................... 20

3.3.1. Bahan ........................................................................... 20

3.3.2. Alat .............................................................................. 20

3.4. Prosedur kerja ........................................................................ 20

3.4.1. Pembuatan Larutan Induk Lansoprazol ..................... 20

3.4.2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Untuk ..

Analisis................................................... .................... 20

3.4.3. Penetapan Fase Gerak ............................................... 21

3.4.4. Uji Kesesuaian Sistem ............................................... 21

3.4.5. Penetapan Metode Ekstraksi ..................................... 21

3.4.6. Validasi Metode Analisis Lansoprazol dalam Darah . 21

3.4.6.1. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas

dalam Darah In Vitro .................................................. 22

3.4.6.2. Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantifikasi (LOQ) 22

3.4.6.3. Uji Selektifitas ........................................................... 22

3.4.6.4. Uji Akurasi ............................................................... 23

3.4.6.5. Uji Presisi ................................................................. 23

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 24

4.1. Hasil .................................................................................... 24

4.1.1. Penentuan Metode Analisis Lansoprazol ................... 24

4.1.1.1. Penetuan Panjang Gelombang Maksimum ............... 24

4.1.1.2. Penetapan Komposisi Fase Gerak ............................. 24

4.1.1.3. Uji Kesesuaian Sistem ............................................. 25

4.1.1.4. Penetapan Metode Ekstraksi .................................... 26

4.1.2. Validasi Metode Analisis dalam Darah secara In

Vitro ............................................................................ 26

4.1.2.1. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas

dalam Darah In Vitro .................................................. 26

4.1.2.2. Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi dalam

Darah In Vitro ............................................................. 27

4.1.2.3. Uji Selektivitas ......................................................... 27

4.1.2.4. Uji Akurasi ............................................................... 28

4.1.2.5. Uji Presisi ................................................................. 28

4.2. Pembahasan ........................................................................... 29

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................. 34

5.1. Kesimpulan ........................................................................... 34

5.2. Saran .................................................................................... 34

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 35

LAMPIRAN .................................................................................................... 38

xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1. Struktur Kimia Lansoprazol ....................................................... 4

Gambar 2.2. Diagram Alir Alat KCKT ........................................................... 11

Gambar 4.1. Kurva Kalibrasi Lansoprazol dalam Darah ................................ 27

Gambar 6.1. Spektrum Panjang Gelombang Maksimum Lansoprazol dalam

Metanol pada Konsentrasi 10 µg/mL ......................................... 38

Gambar 6.2. Alat Komatografi Cair Kinerja Tinggi Dionex Ultimate 3000 ... 39

Gambar 6.3. Kromatogram Penetapan Fase Gerak 65:35 + TEA ................... 40

Gambar 6.4. Kromatogram Penetapan Fase Gerak 70:30 ............................... 40



Gambar 6.7. Kromatogram Hasil Analisa Lansoprazol 10 ppm ..................... 42

Gambar 6.8. Kromatogram Hasil Analisa Blanko ........................................... 43

Gambar 6.9. Kromatogram Hasil Analisa Lansoprazol 1 ppm dalam Darah .. 44

Gambar 6.10 Kurva Kalibrasi Lansoprazol dalam Darah ............................... 46

xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 4.1. Penetapan fase gerak metanol:dapar fosfat .................................... 25

Tabel 4.2. Hasil uji rata-rata kesesuaian sistem sampel Lansoprazol.............. 25

Tabel 4.3. Hasil penetapan pelarut pengendap protein plasma ....................... 26

Tabel 4.4. Hasil uji batas deteksi, batas kuantitasi ................ ......................... 27

Tabel 4.5. Hasil uji rata-rata selektivitas ......................................................... 28

Tabel 4.6. Hasil uji rata-rata akurasi ............................................................... 28

Tabel 4.7. Hasil uji rata-rata presisi (intra day) ....... ...................................... 29

Tabel 4.8. Hasil uji rata-rata presisi (inter day) .............................................. 29

Tabel 6.1. Uji kesesuaian sistem ..................................................................... 45

Tabel 6.2. Hasil uji linearitas .......................................................................... 46

Tabel 6.3. Hasil uji batas deteksi, batas kuantitasi ......................................... 47

Tabel 6.4. Hasil uji rata-rata selektivitas ........................................................ 48

Tabel 6.5. Hasil uji rata-rata akurasi ............................................................... 49

Tabel 6.6. Hasil uji rata-rata presisi ................................................................ 50

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum .............. 38

Lampiran 2. Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) .................... 39

Lampiran 3. Kromatogram Hasil Analisa .................................................... 40

Lampiran 4. Uji Kesesuaian Sistem ............................................................. 45

Lampiran 5. Uji Liniearitas dan Pembuatan Kurva Kalibrasi Lansprazol

dalam sampel darah. ................................................................ 46

Lampiran 6. Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ................................... 47

Lampiran 7. Uji Selektivitas ........................................................................ 48

Lampiran 8. Uji Akurasi .............................................................................. 49

Lampiran 9. Uji Presisi ................................................................................ 50

Lampiran 10. Perhitungan konsentrasi Lansoprazol dalam darah ................. 51

Lampiran 11. Cara perhitungan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ............. 52

Lampiran 12. Cara perhitungan Simpangan Baku, Koefisien Variasi, %

diff, dan Uji Perolehan Kembali .............................................. 53

Lampiran 13. Sertifikat analisa Lansoprazol BPFI ......................................... 54

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Lansoprazol adalah agen benzimidazol tersubstitusi untuk antisekresi

lambung, digunakan secara oral untuk pengobatan jangka pendek dan

mengurangi gejala-gejala aktif duodenum serta tukak lambung dan sebagai

terapi pemeliharaan untuk penyembuhan ulkus duodenum. Lansoprazol juga

digunakan secara oral dalam kombinasi dengan amoksisilin (terapi ganda)

atau dengan klaritromisin dan amoksisilin (terapi triple) untuk pengobatan

infeksi Helicobacter pylori. Secara struktural dan farmakologis, Lansoprazol

berkaitan dengan Omeprazol. Perbedaan secara struktural dari obat ini adalah

adanya trifluoroetoksi di posisi 4 dari cincin piridin dan tidak adanya metil

dan gugus metoksi pada cincin piridin dan benzimidazol (McEvoy, 2008).

Lansoprazole sebesar 97% terikat pada protein plasma. Pengikatan protein

plasma adalah konstan pada kisaran konsentrasi 0,05-5,0 µg/mL (Anonim,

2000).

Monitoring obat rute oral yang paling umum dilakukan adalah kuantifikasi

obat dalam plasma, oleh karena sebagian besar sel-sel jaringan diperfusi oleh

darah, maka pemeriksaan kadar obat dalam darah merupakan suatu metode

yang paling akurat untuk pemantauan pengobatan dan pengoptimalan terapi

obat (Shargel & Andrew, 2005). Untuk dapat melakukan pemantauan

terhadap suatu senyawa obat, diperlukan metode analisis yang harus

divalidasi sesuai aturan yang ditetapkan untuk validasi metode analisis.

Validasi metode analisis menurut United States Pharmacopeia (USP)

dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik,

reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu

metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa

parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem

analisis dan menjamin bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan

penggunanya. Beberapa parameter validasi metode meliputi akurasi, presisi,

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

linearitas, perolehan kembali, stabilitas, limit deteksi, dan limit kuantitasi

serta selektivitas (Gandjar & Rohman, 2007).

Penetapan kadar zat aktif dalam darah membutuhkan metode analisis yang

mempunyai selektivitas dan sensitifitas tinggi, dikarenakan banyaknya

komponen lain yang terdapat dalam darah dan plasma, sehingga dalam

penelitian ini digunakan metode analisis dengan menggunakan Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi (KCKT) karena dapat menganalisis komponen dalam

sampel dengan kadar yang sangat kecil yaitu dalam jumlah nanogram (10-9

g)

bila menggunakan detektor serapan UV, bahkan hingga dalam jumlah

pikogram (10-12

g) bila dengan detektor fluoresensi dan elektrokimia (Johnson

& Stevenson, 1991).

Penetapan kadar Lansoprazole dalam plasma manusia telah dilakukan

beberapa peneliti sebelumnya menggunakan Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi. Pada penelitian Reddy.Battu dan Reddy. G pada tahun 2009,

pemisahan kromatografi dicapai secara isokratis pada kolom C18 (Inertsil C18,

5 µm, 150 mm x 4,6 mm) memanfaatkan fase gerak asetonitril/dapar fosfat

(70:30, v / v, pH 7,0) dengan kecepatan aliran 0,8 ml/menit dengan deteksi

UV pada 260 nm. Penelitian yang dilakukan oleh Uno et al. menggunakan

TSK-PW precolumn untuk pembersihan dan kolom C18 STR ODS-II untuk

analisis. Kemudian M.D. Karol et al, melakukan analisis Lansoprazol dengan

KCKT dengan menggunakan baku dalam. Lansoprazol, metabolitnya, dan

baku dalam (Omeprazol) diekstraksi ke dalam dietil eter-metilen klorida dan

diperoleh pemisahan menggunakan asetonitril 35% (dengan penambahan 1

ml/l n-octylamine dan NAHA) pada pH 7.0, memperoleh LLOQ (Lower

Limit of Quantification) adalah 10 ng/ml untuk semua senyawa.

Metode analisis yang telah dipublikasikan seringkali dimodifikasi untuk

menyesuaikan kondisi dengan peralatan yang tersedia di laboratorium

pengujian. Modifikasi ini harus divalidasi untuk memastikan pelaksanaan

pengujian yang sesuai dari metode analisis. Pada penelitian ini, akan

dilakukan modifikasi terhadap metode analisis yang telah dipublikasikan dan

validasi dari modifikasi tersebut. Modifikasi metode yang dilakukan pada

fase gerak yang menggunakan metanol. Hal ini didasarkan pada kelarutan

3


Lansoprazol yang larut dalam metanol, sehingga dapat digunakan dalam

penentuan kadar Lansoprazol secara in vitro dalam darah manusia.

1.2. Perumusan Masalah

a. Bagaimanakah metode ekstraksi yang paling baik dan optimasi fase gerak

untuk penetapan kadar Lansoprazol dalam darah manusia dengan KCKT?

b. Apakah penetapan kadar Lansoprazol dalam darah in vitro secara

kromatografi cair kinerja tinggi memiliki nilai validitas yang sesuai

dengan persyaratan untuk suatu metode bioanalisis?

1.3. Hipotesis

Metode ekstraksi dan komposisi fase gerak untuk penetapan kadar

Lansoprazol dalam darah in vitro secara kromatografi cair kinerja tinggi

memiliki nilai validitas yang sesuai dengan persyaratan untuk suatu metode

bioanalisis.

1.4. Tujuan Penelitian

a. Menentukan metode ekstraksi yang paling baik dan optimasi fase gerak

untuk penetapan kadar Lansoprazol dalam darah manusia dengan KCKT.

b. Memperoleh validitas metode analisis untuk penetapan kadar Lansoprazol

dalam darah manusia secara in vitro dengan kromatografi cair kinerja

tinggi.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Lansoprazol

Struktur Lansoprazol:

Gambar 2.1. Struktur kimia Lansoprazole (Sweetman, 2009)

Nama kimia : 2-(2-benzimidazolylsulfinylmethyl)-3-methyl-4-(2,2,2-tri-

fluoroethoxy)pyridin

Rumus Molekul : C16H14F3N3O2S

Bobot Molekul : 369,37

Pemerian : berbentuk bubuk putih atau kecoklatan

Titik lebur : 178-182°C

Kelarutan : larut dalam metanol, sedikit larut dalam diklorometana

dan asetonitril, dan praktis tidak larut dalam air.

Penyimpanan : dalam wadah kedap udara dan terlindung dari cahaya.

(Sweetman, 2009; Anonim, 2000)

Lansoprazol adalah agen benzimidazol tersubstitusi untuk antisekresi

lambung. Lansoprazol digunakan secara oral untuk pengobatan jangka

pendek dan mengurangi gejala-gejala aktif duodenum serta tukak lambung

dan sebagai terapi pemeliharaan untuk penyembuhan ulkus duodenum.

Lansoprazol juga digunakan secara oral dalam kombinasi dengan amoksisilin

(terapi ganda) atau dengan klaritromisin dan amoksisilin (terapi triple) untuk

pengobatan infeksi Helicobacter pylori. Lansoprazol secara struktural dan

farmakologis berkaitan dengan omeprazole, perbedaan secara struktural dari

obat ini adalah dengan kehadiran sekelompok trifluoroetoksi di posisi 4 dari

5


cincin piridin dan tidak adanya metil dan gugus metoksi pada cincin piridin

dan benzimidazol. Obat ini secara kimia dan farmakologi tidak terkait dengan

antagonis reseptor H2, antimuskarinik, atau analog prostaglandin (McEvoy,

2008).

Lansoprazol mengikat hidrogen/kalium adenosin triphosphatase (H+K

+ -

ATPase) pada sel parietal lambung, inaktivasi dari sistem enzim (juga dikenal

sebagai pompa proton, hidrogen, atau asam) menghambat langkah terakhir

dalam sekresi asam klorida oleh sel-sel ini. Oleh karena itu, agen antisekresi

lambung seperti lansoprazole dan omeprazole sering disebut sebagai inhibitor

asam atau penghambat pompa proton. Lansoprazole merupakan basa lemah,

tidak secara langsung menghambat sistem enzim, tetapi sebaliknya, ia

berkonsentrasi pada kondisi asam dari sekretori kanalikuli sel parietal,

dimana obat ini mengalami penataan ulang untuk metabolit aktif sulfenamida;

metabolit aktif kemudian bereaksi dengan kelompok sulfhidril dari H+K

+

-ATPase menonaktifkan pertukaran pompa proton. Karena metabolit

sulfenamida membentuk ikatan kovalen permanen pada H+K

+ -ATPase,

sekresi asam dihambat sampai tambahan enzim disintesis, menghasilkan

durasi tindakan berkepanjangan (McEvoy, 2008).

Lansoprazole dengan cepat diserap setelah dosis oral, dengan konsentrasi

puncak plasma dicapai setelah sekitar 1,5 sampai 2 jam. Bioavailabilitas

dilaporkan menjadi 80% atau lebih bahkan dengan dosis pertama, meskipun

obat tersebut harus diberikan dalam bentuk salut enterik karena lansoprazole

tidak stabil pada pH asam. Makanan memperlambat penyerapan dan

mengurangi bioavailabilitas lansoprazole dengan sekitar 50%. Lansoprazol

adalah secara ekstensif dimetabolisme di hati, terutama oleh CYP2C19,

isoenzim sitokrom P450 untuk membentuk 5-hidroksi-lansoprazole dan oleh

CYP3A4 untuk membentuk lansoprazole sulfon. Metabolit diekskresikan

terutama di feses melalui empedu, hanya sekitar 15 sampai 30% dari dosis

diekskresikan dalam urin. Waktu paruh eliminasi dalam plasma adalah sekitar

1 sampai 2 jam tetapi durasi kerjanya lebih lama. Lansoprazole sekitar 97%

terikat pada protein plasma. Klirens menurun pada pasien usia lanjut, dan

dalam kerusakan hati (Sweetman, 2009; APhA, 2008).

6


2.2. Darah

Darah terdiri atas plasma darah dan sel-sel darah. Sebagian besar darah

terdiri atas sel darah merah atau eritrosit, sedangkan jumlah sel darah putih

atau leukosit relatif sedikit, yaitu 2 permil dari jumlah eritrosit. Disamping

eritrosit dan leukosit masih ada partikel lain yang disebut trombosit.

Trombosit ini mempunyai fungsi penting pada penggumpalan darah.

Apabila darah yang telah diberi antikoagulan diputar dengan pemusing

(sentrifuga), maka sel-sel darah akan mengendap, sedangkan plasma darah

akan berada diatasnya. Bobot jenis darah bervariasi antara 1,054-1,060,

sedangkan bobot jenis plasma darah ialah kira-kira 1,024-1,028. Viskositas

(derajat kekentalan) darah kira-kira 4,5 kali viskositas air (Pudjiadi, 1994).

Volume total plasma pada orang dewasa normal sekitar 2,5 - 3 liter atau

mencapai 55 - 58% volume darah. Plasma mengandung suatu senyawa

pembeku dan akan membeku bila terpapar oleh udara. Namun untuk

mencegah pembekuan plasma dapat ditambahkan suatu antikoagulan seperti

sitrat atau heparin (Sherwood, 1996).

2.3. Analisis Obat dalam Plasma Darah

Untuk kepentingan analisis obat, sampel plasma merupakan sampel yang

paling umum digunakan karena ada hubungan yang baik antara konsentrasi

obat dalam plasma dengan efek terapetik yang ditimbulkan (Kelly, 1992).

Dalam beberapa kasus, konsentrasi obat dalam plasma yang diukur mencapai

level mikrogram sampai nanogram atau pikogram. Untuk itu, dapat

digunakan metode KCKT karena salah satu keuntungan dari KCKT adalah

dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah (Johnson &

Stevenson, 1991).

Namun matriks biologis seperti halnya plasma mengandung sejumlah

besar komponen endogen yang dapat mengganggu analisis. Oleh karena itu,

sampel plasma perlu diberi perlakuan sebelum diinjeksikan (pre treatment)

untuk memisahkan analit yang akan dianalisis dari komponen endogen

plasma yang dapat mengganggu analisis. Beberapa teknik penyiapan sampel

yang digunakan untuk analisis dalam matriks plasma:

7


a. Pengendapan protein

Pada metode ini, digunakan asam/ pelarut organik yang bercampur dengan

air untuk mendenaturasi dan mengendapkan protein. Asam seperti

trikloroasetat dan asam perklorat sangat efisien untuk mengendapkan protein

pada konsentrasi 5-20%. Pelarut organik seperti metanol, asetonitril, aseton,

dan etanol memiliki efisiensi yang relatif lebih rendah untuk mengendapkan

protein. Akan tetapi, pelarut-pelarut tersebut banyak digunakan untuk

bioanalisis karena sesuai dengan fase gerak pada KCKT dan dapat

mengekstraksi senyawa berdasarkan prinsip kepolaran. Pelarut organik akan

menurunkan solubilitas protein sehingga protein akan mengendap (Evans,

2004; Kelly, 1990).

b. Ekstraksi cair- cair

Ekstraksi cair - cair berguna untuk memisahkan analit dari pengotor

dengan menyekat sampel diantara 2 fase larutan tak tercampurkan. Fase

pertama umumnya berupa fase aqueous, sedangkan fase kedua berupa fase

organik. Analit yang akan diekstraksi harus larut diantara satu fase larutan

tersebut. Prinsip ekstraksi cair – cair ini adalah senyawa yang bersifat lebih

hidrofilik akan larut ke fase aqueous dan senyawa yang bersifat lebih

hidrofobik akan cenderung mudah ditemukan di fase organik. Analit yang

terekstraksi ke dalam fase organik akan dengan mudah diperoleh kembali

melalui penguapan, sedangkan analit yang terekstraksi ke dalam fase aqueous

dapat langsung disuntikkan ke dalam kolom KCKT fase balik. Larutan

aqueous yang dapat digunakan adalah air, larutan yang bersifat asam/basa,

garam, dan lainnya. Pelarut organik yang dapat digunakan adalah heksan, etil

asetat, toluen, dan lainnya. Kelemahan dari metode yaitu tidak dapat

diaplikasikan ke semua analit, contohnya analit yang bersifat sangat polar

sulit menggunakan metode ini (Evan, 2004; Kelly, 1990).

c. Ekstraksi fase padat

Pada ekstraksi fase padat ini digunakan kolom berukuran kecil (cartridge)

dengan adsorben yang mirip dengan yang digunakan pada saat analisis dan

biasanya disesuaikan dengan sifat analit yang diperiksa. Ekstraksi fase padat

adalah suatu teknik yang dapat mengatasi beberapa masalah yang ditemui

8


pada ekstraksi cair-cair. Prinsip umum dari ekstraksi ini yaitu adsorpsi obat

dari larutan ke dalam adsorben atau fase diam (Harahap, Y., 2010).

d. Ekstrasi cair- padat

Ekstraksi cair padat merupakan teknik yang sering digunakan untuk

perlakuan sampel pada KCKT. Apabila ekstraksi cair - cair merupakan proses

pemisahan satu tahap, maka ekstraksi cair - padat merupakan prosedur

pemisahan mirip kromatografi dan memiliki beberapa keuntungan

dibandingkan ekstraksi cair - cair. Keuntungan tersebut antara lain dihasilkan

ekstraksi analit yang lebih sempurna, pemisahan analit yang lebih efisien dari

pengotor, pengurangan penggunaan pelarut organik, pengumpulan fraksi

analit total yang lebih mudah, penghilangan partikulat, dan pengoperasian

yang lebih mudah. Empat tahapan pada proses ekstraksi cair – padat yaitu

pengkondisian alat, pemasukan sampel, pengaliran larutan pencuci untuk

menghilangkan pengotor, dan proses perolehan kembali analit (Evans, 2004;

Kelly, 1990).

Konsentrasi obat dalam plasma umumnya rendah pada dosis terapi, oleh

karena itu diperlukan persiapan sampel khusus untuk analisis obat dalam

plasma. Dalam plasma, obat terikat pada permukaan protein sehingga harus

dibebaskan terlebih dahulu, lansoprazol dalam plasma berikatan dengan

protein plasma sebesar ± 97% (Sweetman, 2009), sehingga diperlukan

perlakuan tertentu untuk membebaskannya sebelum dianalisis.

Beberapa metode analisis Lansoprazol dalam plasma yang telah dilakukan

oleh beberapa peneliti terdahulu yaitu:

a. Penetuan kadar Lansoprazol dalam plasma darah dan tablet dengan

menggunakan RP-HPLC.

Kondisi : Pemisahan kromatografi dicapai secara isokratis pada kolom C18

[Inertsil C18, 5 µ, 150 mm x 4,6 mm] memanfaatkan fase gerak asetonitril /

dapar fosfat (70:30, v / v, pH 7,0) dengan kecepatan aliran 0,8 ml / menit

dengan deteksi UV pada 260 nm. Waktu retensi Lansoprazole adalah 2,53

min. Metode ini akurat (99,15-101,85%), tepat konsentrasi (0,13-1,56%

dan antar-hari variasi 0,30-1,60% intra-hari variasi) dan linier dalam

jangkauan 0,1-30 μg/ml (R2 = 0,999) dan telah berhasil digunakan dalam

9


pemantauan obat. yang tersisa. Batas deteksi Lansoprazole pada signal-to-

noise ratio of 3 adalah 1,80 ng/ml dalam plasma manusia sementara batas

kuantifikasi dalam serum manusia adalah 5,60 ng/ml (Reddy.Battu dan

Venkateswara, 2009).

b. Penentuan kadar Lansprazol dalam plasma darah menggunakan KCKT

column-switching.

Kondisi : metode untuk penentuan secara simultan dari Lansoprazol,

inhibitor pompa proton dan metabolit utamanya: 5-hidroksilansoprazol

dan Lansoprazole sulfon dalam plasma manusia. Senyawa uji diekstrak

dari 1 mL plasma menggunakan dietil eter-diklorometana (7:3, v / v) dan

ekstrak disuntikkan ke dalam kolom I (TSK-PW precolumn, 10 µm, 3,5

mm × 4,6 mm) untuk pembersihan dan kolom I (STR BPO-II C18 analitis

kolom, 5 pM, 150mm × 4.6mm id) untuk pemisahan. Puncaknya terdeteksi

oleh detektor ultraviolet ditetapkan pada panjang gelombang 285 nm, dan

total waktu untuk pemisahan kromatografi adalah ~ 25 menit. Metode ini

divalidasi untuk rentang konsentrasi 3-5000 ng / mL. Perolehan kembali

rata-rata adalah 74,0% untuk Lansoprazol, 68,3% untuk 5-

Hidroksilansoprazol, dan 79,4% untuk Lansoprazol sulfon. RSD dari Intra

dan inter day kurang dari 6,1 dan 5,1% untuk Lansoprazol, 5,8 dan 5,8%

untuk 5-Hidroksilansoprazol, 4,4 dan 5,9% untuk Lansoprazol sulfon,

masing-masing, pada rentang konsentrasi yang berbeda (Uno et al., 2005).

c. Penentuan kadar Lansoprazol dalam plasma darah manusia menggunakan

KCKT dengan baku dalam.

Kondisi : Lansoprazol, metabolitnya, dan baku dalam (Omeprazol)

diekstraksi ke dalam dietil eter-metilen klorida (7:3, v/v) dan disentrifugasi

pada 2000 rpm; 6OC selama 10 menit dan diperoleh pemisahan

menggunakan kolom fase terbalik dalam kondisi isokratik. Metode ini

memiliki deteksi ultraviolet pada 285 nm monokromatik, dan ekstraksi

tunggal, penguapan penanganan sampel tunggal. Batas bawah kuantisasi,

berdasarkan baku yang dapat diterima dengan koefisien variasi, adalah 10

ng / ml untuk semua senyawa. Tidak ada senyawa endogen ditemukan

telah menginterferensi (Karol et al. 1995).

10


2.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut

dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan

pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT

merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas dan paling cepat

berkembang untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu

sampel.

Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa

organik, anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian

(impurities); analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil);

penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan

pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir

sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements),

dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan

metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis

kualitatif maupun kuantitatif (Gandjar & Rohman, 2007; Harmita, 2006).

2.4.1. Cara Kerja KCKT

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut

terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati

suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi

solut dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair secara

sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan

secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom,

fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu

kolom, dan ukuran sampel.

Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok,

yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk

memasukkan sampel, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase

gerak, tabung penghubung, dan suatu komputer atau integrator atau perekam

(Gandjar & Rohman, 2007).

11


Keterangan : 1 = Tempat fase gerak + penyaring; 2 = saluran penghubung dengan frit; 3 =

pompa; 4 = injektor sampel (autosampler); 5 = kolom; 6 = detektor; 7 = pembuangan; 8 =

pengolah data

Gambar 2.2. Diagram Alir Alat KCKT (Meyer, V., 2010)

2.4.2. Wadah Fase Gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembab (inert). Wadah pelarut kosong

ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah

ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase

gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang

ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen

lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis


2.4.3. Fase Gerak pada KCKT

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.

Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,

polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sample. Untuk fase

normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi

meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase

12


terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi

menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Gandjar & Rohman, 2007).

2.4.4. Pompa pada KCKT

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus

inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah

gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan

sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu

mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit. Untuk tujuan

preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak

dengan kecepatan 20 ml/menit (Gandjar & Rohman, 2007).

2.4.5. Penyuntikan Sampel pada KCKT

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase

gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat

penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang

dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Pada saat pengisian sampel sampel digelontor melewati keluk sampel dan

kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar

sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor

sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk sampel ini dapat

mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntik ini mudah digunakan untuk otomatisasi

dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT (Gandjar & Rohman,

2007).

2.4.6. Kolom pada KCKT

Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom

mikrobor. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama

dibandingkan dengan kolom konvensional, yakni:

a. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil

dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor

kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 µl/menit).

b. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor

lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

13


c. Sensitifitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas

misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin (Gandjar &

Rohman, 2007).

2.4.7. Fase Diam Pada KCKT

Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara

kimiawi, silica yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan

divinilbenzen. Permukaan silica adalah polar dan sedikit asam karena adanya

residu gugus silanol (Si-OH).

Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-

reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus

silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Hasil

reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap

hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang

dimodifikasi ini mempunyai karakteristik kromatografik dan selektifitas yang

berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi (Gandjar &

Rohman, 2007).

2.4.8. Detektor KCKT

Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor

universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik,

dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor

spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan

mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,

detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel,

b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada

kadar yang sangat kecil,

c. Stabil dalam pengoperasiannya,

14


d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8 µl atau

lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 µl atau lebih

kecil lagi,

e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solute pada

kisaran yang luas (kisaran dinamis linier), dan

f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak


2.4.9. Penggunaan KCKT Dalam Analisis Farmasi

Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan

kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan maupun dalam sampel hayati.

Hal ini disebabkan KCKT merupakan metode yang memberikan sensitifitas

dan spesifisitas yang tinggi (Gandjar & Rohman, 2007).

2.4.10. Keuntungan KCKT

KCKT mempunyai banyak keuntungan jika dibandingkan dengan KC

(Kromatografi Cair) tradisional, yaitu:

a. Kecepatan waktu analisis,

b. Daya pisahnya baik dan selektif,

c. Peka, karena detektor dapat mendeteksi konsentrasi yang kecil,

d. Kolom dapat dipakai kembali,

e. Ideal untuk molekul besar dan ion, dan

f. Mudah memperoleh kembali cuplikan.

(Johnson & Stevenson, 1991).

2.5. Validasi Metode Analisis

Validasi merupakan suatu proses yang terdiri atas paling tidak 4 langkah

nyata, yaitu: (1) validasi perangkat lunak (software validation), (2) validasi

perangkat keras/instrument (instrument/hardware validation), (3) validasi

metode, dan (4) kesesuaian sistem (system suitability).

Validasi metode analisis menurut United States Pharmacopeia (USP)

dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik,

reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis.

15


Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa

parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem

analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika:

a. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu.

b. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau

karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku

tersebut harus direvisi.

c. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah

berubah seiring dengan berjalannya waktu.

d. Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh

analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.

e. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara

metode baru dan metode baku.


2.5.1. Ketepatan (akurasi)

Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai

terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau

nilai rujukan. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh

kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu

sampel. Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan

membandingkan hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar (standard

reference material, SRM). Suatu metode dikatakan tepat jika ia menghasilkan

hasil yang sama dalam sederet penentuan ulangan (Gandjar & Rohman, 2007;

Johnson & Stevenson, 1991).

2.5.2. Presisi

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya

diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang

berbeda signifikan secara statistik. Sesuai dengan ICH (International

Conference on Harmanization), presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang

berbeda yaitu: keterulangan (repeatibility), presisi antara (intermediate

precision) dan ketertiruan (reproducibility).

16


a. Keterulangan yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang

sama (berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun

waktunya.

b. Presisi antara yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang

berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya.

c. Ketertiruan merujuk pada hasil-hasil dari laboratorium yang lain.

Dokumentasi presisi seharusnya mencakup: simpangan baku, simpangan

baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV), dan kisaran kepercayaan.

Pengujian presisi pada saat awal validasi metode seringkali hanya

menggunakan 2 parameter yang pertama, yaitu: keterulangan dan presisi

antara. Reprodusibilitas biasanya dilakukan ketika akan melakukan uji

banding antar laboratorium. Presisi seringkali diekspresikan dengan SD atau

standar deviasi relatif (RSD) dari serangkaian data.

Data untuk menguji presisi seringkali dikumpulkan sebagai bagian kajian-

kajian lain yang berkaitan dengan presisi seperti linearitas atau akurasi.

Biasanya replikasi 6-15 dilakukan pada sampel tunggal untuk tiap-tiap

konsentrasi. Pada pengujian dengan KCKT, nilai RSD antara 1-2% biasanya

dipersyaratkan untuk senyawa-senyawa aktif dalam jumlah yang banyak;

sedangkan untuk senyawa-senyawa dengan kadar sekelumit, RSD berkisar

antara 5-15% (Gandjar & Rohman, 2007).

2.5.3. Batas Deteksi (limit of detection, LOD)

Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat

dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan

apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu. Definisi batas deteksi yang

paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah bahwa batas deteksi

merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blangko (yb)

ditambah dengan 3 simpangan baku blangko (3Sb).

LOD seringkali diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pada rasio signal

terhadap derau (signal to noise ratio) yang biasanya rasionya 2 atau 3

dibanding 1. ICH mengenalkan suatu konversi metode signal to noise ratio

ini, meskipun demikian ICH juga menggunakan 2 metode pilihan lain untuk

17


menentukan LOD yakni: metode non instrumental visual dan dengan metode

perhitungan. Metode non instrumental visual digunakan pada teknik

kromatografi lapis tipis dan pada metode titrimetri. LOD juga dapat dihitung

berdasarkan pada standar deviasi (SD) respon dan kemiringan (slope, S)

kurva baku pada level yang mendekati LOD sesuai dengan rumus, LOD = 3

(SD/S). Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan pada standar

deviasi blanko, pada standar deviasi residual dari garis regresi, atau standar

deviasi intersep y pada garis regresi (Gandjar & Rohman, 2007).

2.5.4. Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ)

Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima

pada kondisi operasional metode yang digunakan. Sebagaimana LOD, LOQ

juga diekspresikan sebagai konsentrasi (dengan akurasi dan presisi juga

dilaporkan). Kadang-kadang rasio signal to noise 10:1 digunakan untuk

menentukan LOQ. Perhitungan LOQ dengan rasio signal to noise 10:1

merupakan aturan umum, meskipun demikian perlu diingat bahwa LOQ

merupakan suatu kompromi antara konsentrasi dengan presisi dan akurasi

yang dipersyaratkan. Jadi, jika konsentrasi LOQ menurun maka presisi juga

menurun. Jika presisi tinggi dipersyaratkan, maka konsentrasi LOQ yang

lebih tinggi harus dilaporkan.

ICH mengenalkan metode rasio signal to noise ini, meskipun demikian

sebagaimana dalam perhitungan LOD, ICH juga menggunakan 2 metode

pilihan lain untuk menentukan LOQ yaitu: (1) metode non instrumental visual

dan (2) metode perhitungan. Sekali lagi, metode perhitungan didasarkan pada

standar deviasi respon (SD) dan slope (S) kurva baku sesuai rumus: LOQ =

10 (SD/S). Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan standar

deviasi blanko pada standar deviasi residual garis regresi linier atau dengan

standar deviasi intersep-y pada garis regresi (Gandjar & Rohman, 2007).

2.5.5. Liniearitas

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-

hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada

kisaran yang diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa

18


baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan

konsentrasi (x). Linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran

tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya

diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan

nilai kemiringan (slope), intersep, dan koefisien korelasinya (Gandjar &

Rohman, 2007).

2.5.6. Uji Kesesuaian Sistem

Seorang analis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur yang

digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima. Hal ini dapat

dilakukan dengan percobaan kesesuaian sistem yang didefinisikan sebagai

serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode tersebut dapat menghasilkan

akurasi dan presisi yang dapat diterima. Persyaratan-persyaratan kesesuaian

sistem biasanya dilakukan setelah dilakukan pengembangan metode dan

validasi metode.

United States Pharmacopeia (USP) menentukan parameter yang dapat

digunakan untuk menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis. Parameter-

parameter yang digunakan meliputi: bilangan lempeng teori (N), faktor

tailing, kapasitas (k’ atau α) dan nilai standar deviasi relatif (RSD) tinggi

puncak dan luas puncak dari serangkaian injeksi. Pada umumnya, paling tidak

ada 2 kriteria yang biasanya dipersyaratkan untuk menunjukkan kesesuaian

sistem suatu metode. Nilai RSD tinggi puncak atau luas puncak dari 5 kali

injeksi larutan baku pada dasarnya dapat diterima sebagai salah satu kriteria

baku untuk pengujian komponen yang jumlahnya banyak (komponen mayor)

jika nilai RSD ≤ 1% untuk 5 kali injeksi. Sementara untuk senyawa-senyawa

dengan kadar sekelumit, nilai RSD dapat diterima jika antara 5-15% (Gandjar

& Rohman, 2007).


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

5.1. Alur Penelitian

Lansoprazole (LPZ) digunakan secara luas sebagai antiulcer dan produk

obat yang beredar harus diyakini keefektivitasannya secara farmakologi

Dilakukan penetapan kadar Lansoprazole secara in vitro dalam

darah

Metode ekstraksi LPZ

dalam darah

Pembuatan larutan induk Lansoprazol

Pengukuran λ maksimum LPZ dengan spektrofotometer UV-Visible

Penetapan metode

ekstraksi

Validasi metode

Akurasi

Presisi

Liniearitas

Limit deteksi dan

limit kuantitasi

Selektivitas Perolehan

kembali

20


5.2. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia Medisinal (PMC),

Laboratorium Bioavailabilitas dan Bioekivalensi (PBB), dan Laboratorium

Bahan Alam (PNA) Program Studi Farmasi FKIK Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta pada September 2012 sampai Januari 2013.

5.3. Bahan dan Alat

5.3.1. Bahan

Lansoprazol BPFI (BPOM), metanol (Merck), kalium dihidrogenfosfat

(Merck), natrium hidroksida (Merck), trietilamin, dietil eter (Merck), metilen

klorida (Merck), darah (PMI DKI Jakarta), aquabidest (Ikapharmindo

Putramas), gas nitrogen.

5.3.2. Alat

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Dionex UltiMate® 3000) yang terdiri

dari; pompa, autosampler, kolom Acclaim®

Polar Advantage II (C18; 3 µm;

4,6 x 150 mm), detektor DAD (Diode Array Detector), program komputer PC

(Chromeleon®

). Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel (Hitachi U-2910),

vorteks, sentrifugator dengan tabung sentrifugasi, timbangan analitik, alat-alat

gelas, mikropipet, lemari pendingin, dan evaporator (TurboVap® LV)

5.4. Prosedur Kerja

5.4.1. Pembuatan Larutan Induk Lansoprazol

Ditimbang sebanyak 20,1 mg Lansoprazole. Dilarutkan ke dalam metanol

hingga volume akhir 100 mL. Diencerkan menjadi konsentrasi 100 µg/mL

dalam 50 ml. Konsentrasi 100 µg/mL digunakan sebagai larutan induk.

5.4.2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum untuk Analisis

Dibuat spektrum serapan ultraviolet larutan Lansoprazol dengan

konsentrasi 10 µg/mL dalam metanol pada panjang gelombang 200 – 400 nm

menggunakan Spektrofotometer UV-Visibel, ditentukan panjang gelombang

maksimumnya.

21


5.4.3. Penetapan Fase Gerak

Larutan standar Lansoprazol pada konsentrasi 10 g/mL diinjeksikan

sebanyak 10 µL pada komposisi fase gerak methanol:dapar fosfat pada

perbandingan 70:30, 65:35, dan 60:40 (pH 7) serta perbandingan 65:35

dengan penambahan trietilamin (TEA) sampai pH 7,4 dan kecepatan alir 0,8–

1,2 mL/menit dan dideteksi pada panjang gelombang terpilih, kemudian

dicatat waktu retensi, luas puncak, dihitung jumlah plat teoritis, HETP

(Height Equivalent Theoritical Plate), faktor kapasitas, dan asimetrisitas.

5.4.4. Uji Kesesuaian Sistem

Larutan Lansoprazole pada konsentrasi 10 g/mL diinjeksikan sebanyak

10 L ke alat KCKT dengan fase gerak terpilih, diulangi sebanyak enam kali.

Kemudian dihitung jumlah plat teoritis, HETP (Height Equivalent Theoritical

Plate), faktor kapasitas, asimetrisitas, dan %RSD (Relative Standard

Deviation).

5.4.5. Penetapan Metode Ekstraksi (Evans,1994; Kelly,1990)

Ke dalam tabung sentrifus dimasukkan 1,05 ml darah + 0,1 mL EDTA

10% disentrifugasi selama 10 menit pada 2500 rpm. Kemudian diambil

supernatan (plasma) dan dicampur metanol dengan perbandingan 1:2, 1:3,

dan 1:4 pada tabung sentrifugasi. Kemudian dikocok dengan vorteks selama 1

menit dan disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit, lalu supernatan

diinjeksikan sebanyak 10 L ke alat KCKT. Kemudian dianalisis

kromatogram dari masing-masing perbandingan untuk mengetahui kondisi

kromatogram blanko darah.

Kemudian dilakukan hal yang sama terhadap darah yang sudah

mengandung larutan Lansoprazol masing-masing dengan konsentrasi 5 ppm,

3 ppm, dan 1 ppm, kemudian diekstraksi sesuai dengan perbandingan terpilih,

dan diinjeksikan sebanyak 10 L ke alat KCKT kemudian dicatat waktu

retensi dan luas puncaknya.

5.4.6. Validasi Metode Analisis Lansoprazol Dalam Darah (Gandjar &

Rohman, 2007; Harmita, 2006; Food Drug and Administration, 2001;

United Nations Office on Drug and Crime, 2009)

22


5.4.6.1.Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas dalam Darah In Vitro

Dibuat larutan blangko dan larutan Lansoprazol dalam darah dengan

konsentrasi 2-6 g/mL, kemudian dipreparasi sesuai prosedur. Lalu

supernatan masing-masing sebanyak 10 μL disuntikkan ke alat KCKT pada

kondisi terpilih. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak

terhadap konsentrasi Lansoprazol dalam darah dari masing-masing

konsentrasi dan dibuat kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi linier

(y = a + bx). Dihitung koefisien korelasi (r) dari kurva tersebut.

5.4.6.2.Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantitasi (LOQ)

Larutan Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 2-6 g/mL

dipreparasi sesuai prosedur. Kemudian supernatan sebanyak 10 μL dari

masing-masing larutan tersebut disuntikkan ke alat KCKT pada kondisi

terpilih. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap

konsentrasi Lansoprazole dalam darah dari masing-masing konsentrasi dan

dibuat kurva kalibrasinya.

LOQ dihitung melalui persamaan garis regresi linier dari kurva kalibrasi,

dengan rumus :

LOQ =

sedangkan nilai batas deteksi (LOD) diperoleh dengan rumus :

LOD =

dimana (Sy/x) adalah simpangan baku residual, b adalah slope dari persamaan

regresi.

5.4.6.3.Uji Selektivitas

Sebanyak 10 μL supernatan sampel darah yang telah dideproteinase dan

mengandung Lansoprazol pada konsentrasi 5 μg/mL disuntikkan ke dalam

instrumen KCKT dengan kondisi fase gerak dan kecepatan alir terpilih,

diulang sebanyak 6 kali. Kemudian dihitung nilai % RSD (Relative Standard

Deviation) dengan nilai ≤ 15% dan akurasinya (% diff) dengan nilai ± 15%.

23


5.4.6.4.Uji Akurasi

Dibuat larutan Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 3 μg/mL, 4

μg/mL, dan 5 μg/mL. Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur. Supernatan

sebanyak 10 μL disuntikkan ke alat KCKT dengan kondisi fase gerak dan

kecepatan alir terpilih, diulangi sebanyak tiga kali. Kemudian dihitung

persentase akurasi (% diff) dan perolehan kembali (% recovery) dari masing-

masing konsentrasi larutan tersebut. Nilai rata-rata % diff disyaratkan ± 15%.

Sedangkan nilai perolehan kembali dihitung dengan cara membandingkan

konsentrasi Lansoprazol dalam darah yang diperoleh dari hasil ekstraksi

dengan konsentrasi Lansoprazol yang sebenarnya dikalikan dengan 100%.

Perolehan kembali disyaratkan pada ± 15% dalam sampel biologis.

5.4.6.5.Uji Presisi

Dibuat larutan Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 3 μg/mL, 4

μg/mL, dan 5 μg/mL. Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur. Supernatan

sebanyak 10 μL disuntikkan ke alat KCKT dengan kondisi fase gerak dan

kecepatan alir terpilih, diulangi sebanyak tiga kali. Dilakukan pengukuran

intra-hari dan inter-hari (selama 2 hari berturut-turut), kemudian dihitung

persentase simpangan baku relatif atau % RSD (Relative Standard Deviation)

dari masing-masing konsentrasi dengan nilai ≤ 15%.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

9.1. Hasil

9.1.1. Penentuan Metode Analisis Lansoprazol

9.1.1.1.Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan

menggunakan spektrofotometer ultraviolet-visibel, diperoleh serapan

maksimum Lansoprazol pada panjang gelombang 283 nm. Spektrum serapan

Lansoprazol dapat dilihat pada lampiran 1 gambar 6.1.

9.1.1.2.Penetapan Komposisi Fase Gerak

Penetapan kadar Lansoprazol dalam darah in vitro dilakukan pada kondisi

optimum dengan kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom

Acclaim® (C18) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283

nm, dan volume penyuntikan 10 μL Komposisi fase gerak semula terdiri dari

metanol:dapar fosfat pH 7 (70:30). Pada komposisi ini, waktu retensi

Lansoprazol yaitu 2,95 menit. Kemudian dilakukan modifikasi fase gerak

yaitu komposisi kedua metanol-dapar fosfat pH 7 (65:35) dan komposisi

ketiga metanol-dapar fosfat pH 7 (60:40). Pada komposisi metanol-dapar

fosfat pH 7 (65:35) waktu retensi Lansoprazol yaitu 3,67 menit. Sedangkan

pada komposisi metanol-dapar fosfat pH 7 (60:40) waktu retensi Lansoprazol

yaitu 5,04 menit. Laju alir yang digunakan adalah 0,8 ml/menit. Namun hasil

optimasi ini memberikan data kromatogram dengan puncak yang lebar dan

pada komposisi 60:40 dihasilkan double peak.

Kemudian dilakukan modifikasi lagi dengan penambahan TEA

(Trietilamin) dengan komposisi metanol:dapar fosfat (65:35) dengan

penambahan TEA hingga pH 7,4. Dengan komposisi fase gerak ini,

didapatkan waktu retensi sekitar 3,77 menit. Metode ini dipilih karena

menghasilkan plat teoritis yang lebih banyak daripada komposisi fase gerak

yang lain, HETP (Height Equivalent Theoritical Plate) yang lebih kecil,

25


faktor kapasitas yang memenuhi persyaratan (1-10) serta asimetrisitas yang

baik (<2,5) sebagaimana tercantum tercantum pada tabel 4.1.

Tabel 4.1. Hasil penetapan komposisi fase gerak pada konsentrasi 10 µg/mL,

kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283 nm, dan volume

penyuntikan 10 μL.

Keterangan:

TR = Time Retention (waktu retensi)

N = Plat Teoritis

HETP = Height Equivalent Theoritical Plate

9.1.1.3.Uji Kesesuaian Sistem

Pada uji kesesuaian sistem terdapat parameter-parameter untuk

menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis, yaitu meliputi plat teoritis

(N), resolusi atau daya pisah, dan nilai koefisien variasi dari luas area dari

serangkaian injeksi (minimal 6 kali injeksi). Syarat utama adalah %RSD

(Relative Standard Deviation) dari luas area, yaitu ≤ 2%. Uji kesesuaian

sistem yang dilakukan telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan, kecuali

parameter plat teoritis (N). Data mengenai uji kesesuaian sistem terdapat pada

tabel 4.2 dan data selengkapnya tercantum dalam lampiran 4 tabel 6.1.

Tabel 4.2. Hasil uji rata-rata kesesuaian sistem sampel Lansoprazol pada

konsentrasi 10 μg/mL dengan komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35)

dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mL/menit,

panjang gelombang 283 nm dan volume penyuntikan 10 μL.

Parameter Uji Persyaratan Hasil Uji Rata-rata

Plat Teoritis >2500 1091,67

Asimetris <2,5 0,88

Faktor Kapasitas 1-10 1,22

%RSD (Relative Standard Deviation) ≤2% 0,576

Fase

Gerak

(v/v)

TR

(menit)

Luas

Puncak

(µAU)

N HETP Faktor

Kapasitas Asimetri

65:35

(+TEA)

3,773 3592,9 1130 0,0133 1,22 0,86

3,767 3576,1 1084 0,0138 1,22 0,85

70:30 2,950 7162,2 351 0,0427 0,73 1,62

65:35 3,890 7691,9 303 0,0495 1,24 1,66

60:40 4,997 8172,3 251 0,598 1,92 1,71

26


9.1.1.4.Penetapan Metode Ekstraksi

Penetapan metode ekstraksi pada awalnya dilakukan penambahan EDTA

10% pada darah untuk memperoleh plasma. Kemudian dilakukan modifikasi

metode ekstraksi dengan mengendapkan protein darah sekaligus menarik

Lansoprazol, dari hasil percobaan didapatkan bahwa pelarut yang baik

digunakan adalah metanol dengan perbandingan 1 bagian supernatan

(plasma) dan 4 bagian metanol dalam 1,5 mL, dikarenakan pada

perbandingan tersebut tidak terdapat interferen pada waktu retensi

Lansoprazol. Kemudian dilakukan pengukuran untuk darah yang telah

mengandung Lansoprazol dengan konsentrasi 5 µg/ml, 3 µg/ml, dan 1 µg/ml.

Data mengenai penetapan pelarut pengendap protein plasma (pelarut

ekstraksi) terdapat pada tabel 4.3.

Tabel 4.3. Hasil penetapan pelarut pengendap protein plasma

Pengendap

Protein

Kosentrasi

(µg/ml)

Waktu Retensi

(menit)

Luas Puncak

(µAU)

Faktor

kapasitas

Metanol

5 3,833 1626,4 1,22

3 3,826 714,1 1,23

1 - - -

9.1.2. Validasi Metode Analisis dalam Darah secara In Vitro

9.1.2.1.Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas dalam Darah in vitro

Uji ini dilakukan pada seri larutan standar Lansoprazol dalam darah

dengan konsentrasi 2-6 μg/mL, dari uji ini akan didapat persamaan regresi

linier dan koefisien korelasi (r). Hasil uji diperoleh persamaan garis y =

477,35x - 776,42, dan koefisien korelasi (r) 0,9875, kurva kalibrasi dari

persamaan garis tersebut terdapat dalam gambar 4.1. Data hasil percobaan

selengkapnya tercantum pada lampiran 5 dalam tabel 6.2.

27


Gambar 4.1. Kurva kalibrasi Lansoprazol dalam darah

9.1.2.2.Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi dalam Darah in vitro

Uji batas deteksi dan batas kuantitasi dilakukan untuk mengetahui batas

deteksi dan batas kuantitasi terendah dari sampel yang masih dapat

menghasilkan data dengan akurasi dan presisi yang baik. Batas deteksi yang

diperoleh dari hasil pengujian sebesar 0,619 μg/mL dan batas kuantitasi 2,05

μg/mL. Data mengenai uji batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dilihat

pada tabel 4.4 dan data hasil percobaan selengkapnya tercantum pada

lampiran 6 dalam tabel 6.3.

Tabel 4.4. Hasil uji batas deteksi, batas kuantitasi dan koefisien fungsi

Parameter Nilai

Simpangan Baku Residual (S y/x) 98,17

Limit Deteksi (LOD) 0,619 μg/mL

Limit Kuantitasi (LOQ) 2,05 μg/mL

9.1.2.3.Uji Selektivitas

Uji selektivitas dilakukan terhadap sampel konsentrasi 5 μg/mL dilakukan

sebanyak 6 kali untuk mengetahui spesifitas metode tersebut. Syarat untuk uji

selektivitas adalah %RSD (Relative Standard Deviation) dengan nilai ≤ 15%

dan akurasinya (% diff) dengan nilai ± 15%. Data hasil uji rata-rata terdapat

pada tabel 4.5 dan Data hasil percobaan tercantum pada lampiran 7 dalam

tabel 6.4.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 1 2 3 4 5 6 7

Lu

as

Are

a (

µA

U)

Konsentrasi (μg/mL)

Kurva Kalibrasi Lansoprazol dalam Darah

28


Tabel 4.5. Hasil uji rata-rata selektivitas

C

(μg/mL)

Rata-rata Luas

Puncak (µAU)

SD

RSD

(%)

% diff

rata-rata

5 1630,92 13,26 0,813 -0,793 Keterangan:

C = Konsentrasi

SD = Simpangan Baku

KV = Koefisien Variasi

9.1.2.4.Uji Akurasi

Uji akurasi dilakukan pada 3 konsentrasi sampel, yaitu pada 3 μg/mL, 4

μg/mL dan 5 μg/mL dilakukan sebanyak 3 kali untuk masing-masing

konsentrasi. Syarat hasil uji akurasi adalah % diff dengan nilai ≤ 15%.

Kemudian dihitung pula nilai perolehan kembali (% recovery), nilai ini

disyaratkan pada ≤ 15% dalam sediaan biologis. Hasil uji rata-rata dapat

dilihat pada tabel 4.6 dan data hasil percobaan selengkapnya tercantum pada

lampiran 8 dalam tabel 6.6.

Tabel 4.6. Hasil uji rata-rata akurasi

9.1.2.5.Uji Presisi

Uji dilakukan pada 3 konsentrasi sampel, yaitu pada 3 μg/mL, 4 μg/mL

dan 5 μg/mL diulangi sebanyak 3 kali untuk masing-masing konsentrasi,

dilakukan pada pengujian intra-hari (dalam 1 hari) dan inter-hari selama 2

hari berturut-turut. Syarat hasil uji presisi adalah simpangan baku relatif atau

%RSD (Relative Standard Deviation) dari masing-masing konsentrasi dengan

nilai ≤ 15%. Hasil uji rata-rata presisi dapat dilihat pada tabel 4.7 dan 4.8

serta data hasil percobaan selengkapnya tercantum pada lampiran 9 dalam

tabel 6.7.

C

(μg/mL)

Rata-rata

Luas Puncak

(µAU)

Rata-rata

Perolehan

Kembali (%)

SD

RSD

(%)

% diff

rata-rata

3 714,3 104,09 8,57 1,2 4,09

4 1231,5 105,16 2,89 0,24 5,16

5 1636,27 101,09 18,1 1,11 1,09

29


Tabel 4.7. Hasil uji rata-rata presisi H-1 (intra day)

C

(μg/mL)

Rata-rata Luas

Puncak (µAU) SD

RSD

(%) % diff rata-rata

3 714,3 8,57 1,2 4,09

4 1231,5 2,89 0,24 5,16

5 1636,27 18,1 1,11 1,09

Tabel 4.8. Hasil uji rata-rata presisi H-2 (inter day)

C

(μg/mL)

Rata-rata Luas

Puncak (µAU) SD

RSD

(%) % diff rata-rata

3 710,83 9,35 1,31 3,85

4 1205,47 5,8 0,48 3,79

5 1612,73 12,45 0,77 0,1

9.2. Pembahasan

Pada penelitian ini telah dilakukan validasi metode analisis Lansoprazol

dalam darah in vitro secara KCKT. Penetapan kadar Lansoprazol dalam darah

in vitro dilakukan sebagai pengujian terhadap sediaan farmasi dari segi

farmakokinetiknya, bagaimana ketersediaan hayati obat dalam tubuh

sehingga keefektivitasannya terbukti. Optimasi dan validasi juga perlu

dilakukan guna mendapatkan metode yang terbaik untuk analisa kadar

Lansoprazol dalam darah. Metode analisis dengan menggunakan alat KCKT

ini dipilih karena memiliki banyak kelebihan yaitu waktu analisisnya cepat,

cara kerjanya sederhana dan sensitif.

Sebelum memasuki tahap analisis, perlu dilakukan penentuan panjang

gelombang analisis optimum dengan menggunakan spektrofotometer

ultraviolet–visibel dan didapatkan hasil bahwa Lansoprazol memiliki serapan

maksimum pada 283 nm. Pemilihan panjang gelombang analisis ini berguna

untuk meningkatkan selektivitas dan sensitifitas analisis dari sampel yang

digunakan.

Tahap selanjutnya adalah penentuan komposisi fase gerak dan laju alir.

Pada pemilihan fase gerak, dilakukan dengan menggunakan kolom Acclaim®.

Optimasi fase gerak semula terdiri dari metanol:dapar fosfat pH 7 dengan

30


komposisi (70:30), (65:35), dan (60:40). Pada komposisi metanol-dapar fosfat

pH 7 (70:30) waktu retensi Lansoprazol yaitu 2,95 menit, dan pada komposisi

(65:35) waktu retensinya 3,67 menit. Sedangkan pada komposisi (60:40)

waktu retensi Lansoprazol yaitu 5,04 menit. Laju alir yang digunakan adalah

0,8 ml/menit. Namun hasil optimasi ini memberikan data kromatogram

dengan puncak yang lebar dan pada komposisi 60:40 dihasilkan double peak.

Kemudian dilakukan modifikasi lagi dengan penambahan TEA (Trietilamin)

dengan komposisi metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan TEA

hingga pH 7,4 dan laju alir sebesar 0,8 ml/menit. Dengan komposisi fase

gerak ini, didapatkan waktu retensi sekitar 3,77 menit dengan plat teoritis

sekitar 1130 (>2500), HETP (Height Equivalent Theoritical Plate) sekitar

0,0133, faktor kapasitas sebesar 1,22 (1-10) serta faktor asimetris sekitar 0,86

(<2,5). Dari hasil ini, fase gerak yang ditetapkan telah memberikan hasil

parameter yang memenuhi persyaratan, kecuali untuk parameter plat teoritis

yang kurang dari kondisi ideal yaitu >2500.

Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan kesesuaian dan

keefektifan sistem yang digunakan agar diperoleh kondisi operasional dan

kromatogram yang baik. Dari hasil percobaan diperoleh nilai rata-rata, yaitu

jumlah plat teoritis 1091,67 (>2500), faktor kapasitas 1,22 (1-10), asimetris

0,88 (<2,5), dan koefisien variasi 0,576% (<2%).

Pada penetapan metode ekstraksi, awalnya dilakukan penambahan EDTA

pada darah untuk memperoleh plasma. Kemudian dilakukan metode

pengandapan protein menggunakan pelarut organik yaitu metanol.

Pengendapan protein ini bertujuan untuk menghilangkan komponen-

komponen yang ada dalam protein plasma yang dapat mengganggu analisis

dan kromatogram. Protein plasma dapat diendapkan dengan berbagai pelarut;

seperti pelarut organik, pelarut asam, dan pelarut basa. Pada penelitian ini

dilakukan dengan pelarut organik yang akan mengendapkan protein sehingga

obat akan lepas dari ikatan protein dan tertarik ke dalam pelarut organik.

Hasil yang didapatkan pelarut organik yang digunakan adalah metanol

dengan perbandingan 1:4 dengan plasma darah yang memberikan

31


kromatogram yang lebih baik daripada perbandingan 1:2 maupun 1:3,

didasarkan pada tidak adanya interferen pada waktu retensi Lansoprazol.

Validasi metode penetapan kadar Lansoprazol dalam darah in vitro

dilakukan dengan tujuan untuk memastikan bahwa metode tersebut akurat

dan dapat digunakan sebagai metode penetapan kadar secara in vivo. Validasi

metode yang dilakukan adalah validasi sebagian dengan mempertimbangkan

bahwa metode yang dilakukan pada penelitian ini merupakan modifikasi dari

metode yang telah dilakukan sebelumnya. Parameter validasi yang dilakukan

meliputi liniearitas, limit deteksi dan limit kuantitasi, selektivitas, akurasi,

presisi, dan perolehan kembali.

Liniearitas merupakan kemampuan metode analisis yang memberikan

respon yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit dalam

sampel. Dari percobaan dibuat larutan standar Lansoprazol dalam darah

dengan rentang konsentrasi 2-6 µg/mL, dan didapat hasil persamaan garis

regresi linier y = 477,35x - 776,42, dan koefisien korelasi (r) 0,975.

Langkah selanjutnya adalah penetapan batas deteksi dan batas kuantitasi

dari sampel. Batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel

yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibanding

dengan blangko. Sedangkan batas kuantitasi merupakan kuantitas terkecil

analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria akurat dan seksama.

Hasil dari uji batas deteksi ini adalah 0,619 μg/mL dan batas kuantitasi

sebesar 2,05 μg/mL.

Uji selektivitas dilakukan untuk mengetahui bahwa metode yang

ditetapkan kemampuannya hanya untuk mengukur zat tertentu saja dengan

cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam

matriks sampel. Uji ini dilakukan terhadap sampel dengan konsentrasi 5

μg/mL. Persyaratan untuk uji selektivitas ini adalah nilai koefisien variasinya

(KV) dengan nilai ≤ 15% dan akurasinya (% diff) dengan nilai ± 15%. Hasil

pengujian selektivitas pada sampel adalah %RSD (Relative Standard

Deviation) sebesar 0,813% dan % diff sebesar 0,793%, hasil ini telah

memenuhi persyaratan untuk uji selektivitas.

32


Uji akurasi dilakukan untuk mengetahui kedekatan hasil penetapan yang

diperoleh dengan hasil sebenarnya. Akurasi diperiksa dengan menghitung

perbedaan nilai yang terukur dengan nilai sebenarnya (% diff) Uji akurasi

dilakukan dengan menetapkan kadar sampel pada 3 konsentrasi yaitu 3

µg/mL, 4 µg/mL, dan 5 µg/mL. Persyaratan yang ditentukan adalah % diff ±

15%. Pada konsentrasi 3 μg/mL didapatkan hasil % diff rata-rata sebesar -

4,09%, konsentrasi 4 μg/mL didapatkan % diff rata-rata sebesar 5,16% dan

pada konsentrasi 5 μg/mL didapatkan % diff rata-rata sebesar 1,09%.

Kemudian dihitung pula nilai perolehan kembalinya (% recovery) dengan

cara membandingkan konsentrasi Lansoprazol dalam darah yang diperoleh

dari hasil ekstraksi dengan konsentrasi Lansoprazol yang sebenarnya

dikalikan dengan 100%. Perolehan kembali disyaratkan pada ± 15% dalam

sediaan biologis. Nilai uji perolehan kembali pada konsentrasi 3 μg/mL

berkisar 104,09%, konsentrasi 4 μg/mL berkisar 105,16% dan pada

konsentrasi 5 μg/mL sekitar 101,09%. Pengujian perolehan kembali ini

dilakukan pada tiga konsentrasi dengan tujuan untuk memberikan batas range

bahwa konsentrasi analit yang terukur pada daerah tersebut masih terukur

dengan baik oleh detektor. Hasil untuk uji akurasi dan perolehan kembali ini

telah memenuhi persyaratan uji pada sediaan biologis.

Presisi adalah ukuran yang menunjukan derajat kesesuaian antara hasil uji

individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika

prosedur diterapkan secara berulang pada sampel. Uji presisi dilakukan intra-

hari dan inter-hari, pada pengujian intra-hari, konsentrasi rendah 3 μg/mL

didapat %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 1,2%, pada konsentrasi

sedang 4 μg/mL diperoleh %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar

0,24% dan pada konsentrasi tinggi 5 μg/mL didapat %RSD (Relative

Standard Deviation) sebesar 1,11%. Sedangkan pada pengujian inter-hari,

konsentrasi rendah 3 μg/mL didapat %RSD (Relative Standard Deviation)

sebesar 1,31%, pada konsentrasi sedang 4 μg/mL diperoleh %RSD (Relative

Standard Deviation) sebesar 0,48% dan pada konsentrasi tinggi 5 μg/mL

didapat %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,77%. Pengukuran

inter-hari yang dilakukan selama 2 hari berturut-turut didapat hasil %RSD

33


(Relative Standard Deviation) ≤ 15%. Pada uji presisi ini, hasil tersebut telah

memenuhi syarat untuk uji presisi pada sediaan biologis. Uji dilakukan pada

intra-hari dan inter-hari untuk memastikan bahwa setelah sediaan disimpan

masih stabil dan tidak mengganggu hasil analisa.

Hasil dari parameter-parameter validasi metode analisis yang telah

dilakukan secara keseluruhan telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan

untuk pengujian pada sediaan biologis. Hal ini menunjukan bahwa metode

analisis Lansoprazol dalam darah in vitro valid dan dapat digunakan untuk

penetapan kadarnya secara in vivo.


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

5.1.1. Optimasi metode analisis Lansoprazol diperoleh hasil bahwa Lansoprazol

dapat dianalisis dengan menggunakan kolom Acclaim® Polar Advantage

C18, dengan kondisi optimum fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35)

dengan penambahan trietilamin hingga pH 7,4, kecepatan alir 0,8

mL/menit, panjang gelombang 283 nm. Pada proses optimasi ekstraksi

Lansoprazol dalam darah, hasil ekstraksi terbaik untuk metode analisis

pada KCKT adalah dengan pencampuran plasma dengan metanol pada

perbandingan 1:4, waktu vorteks 60 detik dan proses sentrifugasi pada

kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.

5.1.2. Hasil validasi metode menunjukkan bahwa metode analisis yang

digunakan sudah memenuhi persyaratan yang berlaku untuk akurasi,

presisi, linearitas, dan selektifitas.

5.2 Saran

Untuk penelitian selanjutnya, disarankan untuk dapat menggunakan

larutan pengendap protein yang lain, seperti asam trikloroasetat, asam

perklorat, maupun kombinasi asam-asam tersebut dengan pelarut organik

sehingga diharapkan hasil ekstraksi protein dari plasma menjadi lebih

sempurna. Bila memungkinkan dapat pula digunakan cara ekstraksi protein

dalam plasma yang lain seperti ekstraksi cair-cair maupun ekstraksi cair-

padat.

35


DAFTAR PUSTAKA

American Pharmacists Association (APhA). 2008. Drug Information Handbook

17th Edition. Ohio : Lexi-Comp.

Anonim. 2000. PREVACID®

. http://www.drugbank.ca/system/fda_labels/

DB00448.pdf?1265922801. Diakses pada hari Senin, 2 Juli 2012 pukul 08.12.

A. Avgerinos, et al.. 1998. Determination of Lansoprazole in Biological Fluids

and Pharmaceutical Dosage by HPLC. European Journal of Drug Metabolism

and Pharmacokinetics, Vol. 23, No. 2, 1998, pp. 329-332.

Evans, G (Ed.). 2004. A Handbook of Bioanalysis and Drug Metabolism. USA:

CRC Press.

Food and Drug Administration. 2001. Bioanalytical Method Validation.

Rockville: Center for Veterinary Medicine.

Gandjar, I. G. dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:

Pustaka Pelajar.

Gerald K. McEvoy (Ed.), Jane Miller (Ed.), dan Kathy Litvak (Ed.). 2004. AHFS

Drug Information 2004. American Society of Health-System Pharmacists.

Harahap, Y. (2010). Peran Bioanalisis dalam Penjaminan Kualitas Obat dan

Peningkatan Kualitas Hidup Pasien. Depok: UI Press.

Harmita. 2006. Analisis Fisikokimia. Departemen Farmasi FMIPA UI.

Johnson, E.L. dan R.Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Terj. Kosasih

Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB Press.

36


Karol, M.D., et al.. 1995. Determination of lansoprazole and five metabolites in

plasma by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed

Appl, 1995; 668:182-6.

Katsuki, H., et al.. 2001. High-Performance Liquid Chromatographic Assay for

the Simultaneous Determination of Lansoprazole Enantiomers and Metabolites in

Human Liver Microsomes. Journal of Chromatography B, Vol. 757, No. 1, pp.

127-133.

Kelly, M.T. 1992. Drug Analysis in Biological Fluids. Dalam: Chemical Analysis

in Complex Matrices. New York: Ellis Horwood.

Lunn, G. 1999. HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis, Volume 3: E – O.

New York : Wiley-Interscience.

McEvoy, Gerald K. (ed.). 2008. AHFS Drug Information 2008. Bethesda, MD:

American Society of Health-System Pharmacists.

Meyer, Veronika R.. 2010. Practical High-Performance Liquid Chromatography

5th

Edition. Chichester : Wiley.

Noubarani, M. et al.. 2010. Improved HPLC Method for Determination of Four

PPIs, Omeprazole, Pantoprazole, Lansoprazole and Rabeprazole in Human

Plasma. J Pharm Pharmaceut Sci, 13(1), hal 1-10.

Pudjiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press. Hal. 209-210

Reddy. Battu, P. dan Venkateswara Reddy. G. 2009. Validation and Stability of

RP-HPLC for The Determination of Lansoprazole in Tablet Dosage Form and

Human Plasma. The Pharma Research, vol. 1, hal 60-66.

37


Sweetman, Sean C. 2009. Martindale The Complete Drug Reference 36th

edition.

London: The Pharmaceutical Press, 1739-1740.

Shargel, L. dan Andrew B.C.Yu. 1988. Biofarmasetika dan Farmakokinetika

Terapan. Terj. Siti Sjamsiah. Surabaya: Universitas Airlangga Press.

Sherwood, Lauralee. 1996. Fisiologi Manusia Dari Sel ke Sistem edisi kedua.

Terj. Brahm U. Pendit. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Hal: 346-363

Supandi. 2008. Optimasi dan Validasi Metode Penetapan Kadar Famotidin

Kombinasi dengan Magnesium Hidroksida, Hidrotalcite dan Simetikon dalam

Plasma in vitro dan in vivo secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Tesis.

Program Pasca Sarjana FMIPA-Universitas Indonesia. Tidak dipublikasikan: 101

hlm

United Nation Office on Drug and Crime. 2009. Guidance for the Validation of

Analytical Methodology and Calibration of Equipment used for Testing of Illicit

Drugs in Seized Materials and Biological Specimens. Vienna: United Nations

Publication.

Uno, T., et al.. 2005. Determination of Lansoprazole and Two of its Metabolites

by Liquid-Liquid Extraction and Auto-mated Column Switching High-

Performance Liquid Chromatography: Application to Measuring CYP2C19

Activity. Journal of Chromatography B, Vol. 816, No. 1-2, February 2005, pp.

309-314.

35


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum

Gambar 6.1 Spektrum panjang gelombang maksimum Lansoprazol dalam

metanol pada konsentrasi 10 μg/mL.

36


Lampiran 2. Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Gambar 6.2. Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dionex Ultimate® 3000

37


Lampiran 3. Kromatogram Hasil Analisa

Gambar 6.3 Kromatogram Lansoprazol murni pada konsentrasi 50 µg/mL dengan

komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan TEA

hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283 nm dan

volume penyuntikan 10 μL.

Gambar 6.4. Kromatogram Lansoprazol dengan fase gerak metanol : dapar fosfat

pH 7 (70:30)

38


Lanjutan


pH 7 (65:35)


pH 7 (60:40)

39


Lanjutan

Gambar 6.7. Kromatogram Lansoprazol murni pada konsentrasi 10 µg/mL dengan

komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan TEA

hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283 nm dan

volume penyuntikan 10 μL.

40


Lanjutan

Gambar 6.8. Kromatogram sampel darah kosong (blanko) dengan komposisi fase

gerak metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada

kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283 nm dan volume penyuntikan

10 μL.

41


Lanjutan

Gambar 6.9. Kromatogram Lansoprazol dalam sampel darah pada konsentrasi 5

µg/mL dengan komposisi komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35)

dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mL/menit,

panjang gelombang 283 nm dan volume penyuntikan 10 μL.

42


Lampiran 4. Uji Kesesuaian Sistem

Tabel 6.1. Uji kesesuaian sistem Lansoprazol dengan fase gerak metanol:dapar

fosfat (65:35) dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada konsentrasi 10

µg/mL, kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283 nm, dan volume

penyuntikan 10 μL.

Waktu

Retensi

(menit)

Luas

Area

(µAU)

Plat

Teoritis

(N)

HETP Faktor

Kapasitas Asimetri

Koefisien

Variasi

(%)

3,773 3592,9 1130 0,0133 1,21 0,86

0,576

3,767 3576,1 1084 0,0138 1,22 0,85

3,770 3600,3 1133 0,0132 1,22 0,84

3,780 3582,1 1104 0,0135 1,23 0,89

3,769 3569,2 1064 0,0141 1,23 0,92

3,777 3541,8 1035 0,0145 1,21 0,90

Hasil Parameter Uji:

Plat Teoritis (>2500) : 1091,67

Asimetris (<2,5) : 0,88

Faktor Kapasitas (1-10) : 1,22

Koefisien Variasi (<2%) : 0,576

43


Lampiran 5. Uji Liniearitas dan Pembuatan Kurva Kalibrasi Lansprazol dalam

sampel darah.

Tabel 6.2. Data hasil uji liniearitas

Konsentrasi

(μg/mL)

Luas Puncak

(µAU)

2 80,7

3 714,1

4 1232,4

5 1626,4

6 2011,3

Gambar 6.10. Kurva Kalibrasi Lansoprazol dalam Darah

Keterangan :

- Persamaan garis : y = 477,35x - 776,42

- Koefisien korelasi : 0,99

- Kondisi Analisis :

Fase gerak : metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan TEA hingga

pH 7,4

Kolom : Acclaim® (C18; 15 cm x 4,6 mm)

Volume injeksi : 10 μL

Kecepatan alir : 0,8 mL/menit

Detektor : Diode Array Detector

Panjang Gelombang : 283 nm

0

500

1000

1500

2000

2500

0 1 2 3 4 5 6 7

Lu

as

Are

a (

µA

U)

Konsentrasi (μg/mL)

Kurva Kalibrasi Lansoprazol dalam Darah

44


Lampiran 6. Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Tabel 6.3. Data hasil uji batas deteksi dan batas kuantitasi

Konsentrasi

(μg/mL)

Luas

Puncak

(µAU)

[Y]

Luas Area

Berdasarkan

Persamaan

Regresi [Y1]

[Y-Y1] [Y-Y1]2

2 80,7 178,28 -97,58 9521,8564

3 714,1 655,63 58,47 3418,7409

4 1232,4 1132,98 99,42 9884,3364

5 1626,4 1610,33 16,07 258,2449

6 2011,3 2087,68 -76,38 5833,9044

Jumlah 28917,083

S (y/x) = √∑

= √

= 98,17

LOD =

=

= 0,619 μg/mL

LOQ =

=

= 2,05 μg/mL

45


Lampiran 7. Uji Selektivitas

Tabel 6.4. Data hasil uji selektivitas

Konsentrasi

(μg/mL)

Luas

Puncak

(µAU)

% diff Simpangan

Baku (SD)

RSD

(%)

% diff

rata-

rata

5

1636,4 1,09

13,26 0,813 0,793

1654,3 1,84

1618,1 -0,09

1630,2 0,83

1626,4 0,67

1620,1 0,41

46


Lampiran 8. Uji Akurasi

Tabel 6.5. Data hasil uji akurasi

Konsentrasi

(μg/mL)

Luas

Puncak

(µAU)

Uji

Perolehan

Kembali

(%)

Rata-rata

Uji

Perolehan

Kembali

(%)

% diff Simpangan

Baku (SD) RSD (%)

%diff

rata-

rata

3

723,2 104,72

104,09

4,72

8,57 1,2 4,09 706,1 103,52 3,52

723,7 104,06 4,06

4

1233,9 105,28

105,16

5,28

2,89 0,24 5,16 1232,4 105,21 5,21

1228,3 104,99 4,99

5

1636,4 101,09

101,09

1,09

18,1 1,11 1,09 1654,3 101,84 1,84

1618,1 100,32 0,32

47


Lampiran 9. Uji Presisi

Tabel 6.6. Data hasil uji presisi

Konsentrasi

(μg/mL)

Luas Puncak

(µAU) % diff

Simpangan

Baku (SD) RSD (%) % diff rata-rata

3

Hari ke-1

723,2 4,72

8,57 1,2 4,09 706,1 3,52

723,7 4,06

Hari ke-2

717,2 4,29

9,35 1,31 3,85 700,1 3,10

715,0 4,16

4

Hari ke-1

1233,9 5,28

2,89 0,24 5,16 1232,4 5,21

1228,3 4,99

Hari ke-2

1200,2 3,52

5,8 0,48 3,79 1204,5 3,74

1211,7 4,12

5

Hari ke-1

1636,4 1,09

18,1 1,11 1,09 1654,3 1,84

1618,1 0,32

Hari ke-2

1612,9 0,11

12,45 0,77 0,1 1625,1 0,62

1600,2 -0,44

48


Lampiran 10. Perhitungan konsentrasi Lansoprazol dalam darah

Konsentrasi awal = 201 mg dalam 100 mL metanol

= 201 ppm

Konsentrasi untuk larutan induk 100 ppm

→ 24,875 mL Lansoprazol 201 ppm dimasukkan dalam labu ukur 50 mL,

kemudian dicukupkan dengan metanol hingga tanda batas.

V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 201

ppm

= 50 mL x 100 ppm

V1 = 5000/201

= 24,875 Ml

Dari larutan induk 100 ppm, kemudian diambil beberapa mL dan dicukupkan

dengan darah hingga batas ukur pada labu ukur 5 mL sehingga menjadi darah

yang mengandung 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm, dan 6 ppm Lansoprazol.

Contoh untuk darah yang mengandung 6 ppm Lansoprazol:

V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 100 ppm = 5 mL x 6 ppm

V1 = 30/100

= 0,3 mL

49


Lampiran 11. Cara perhitungan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

S(y/x) = √∑

; dimana Y1 = a +bx

Sx0 =

; Sx0 = standar deviasi dari fungsi

Vx0 =

; Vx0 = koefisien variasi dari fungsi

LOD =

LOQ =

50


Lampiran 12. Cara perhitungan Simpangan Baku, Koefisien Variasi, % diff, dan

Uji Perolehan Kembali

a. Simpangan Baku (SD),

Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,……………….xn, maka simpangan bakunya

adalah :

SD = √∑

Contoh perhitungan:

SD = √

SD = 2,898

b. Simpangan baku relatif (%RSD) atau koefisien variasi (KV) adalah :

%RSD =

Contoh perhitungan :

%RSD =

%RSD = 0,235%

c. Persen (%) diff =

d. Uji Perolehan Kembali =

Keterangan: A : Kadar sebenarnya

B : Kadar terukur

: Jumlah rata-rata

51


Lampiran 13. Sertifikat analisa Lansoprazol BPFI

SKRIPSI BIR RIBHIL LABIB 108102000064 FAKULTAS...

Documents

Transcript of SKRIPSI BIR RIBHIL LABIB 108102000064 FAKULTAS...