PEMERIKSAAN KULTUR, BIOKIMIA DAN SENSITIVITY

TEST

PEMERIKSAAN KULTUR

• Pemerisaan kultur/pembiakan di laboratorium butuh media sbg nutrisi(zat hara),yg dibutuhkan o/MO u/pertumbuhan, sintesis sel ,bergerak dan kebutuhan energi dalam metabolisme.

• Media/perbenihan harus berisi air, sumber energi, sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen, hidrogen, dan unsur-unsur trace element,dpt juga ditambah faktor pertumbuhan, as.amino, vitamin,/nukleotid.

MEDIA :Pendahuluan :

• Menyediakan media untuk biakan bakteri, sangat ditentukan oleh tindakan persiapan sblumnya,

juga beberapa tindakan setelah siap jadi dan saat digunakan.

• Mutu media ditentukan sjk stok bahan baku dipesan,disimpan sampai dibuat dan disimpan lg stlh jadi.

• Berbagai kesalahan dpt terjadi pd proses pembuatan,shg butuh uji kualitas dari masing2 bahan stlh jadi dgn bakteri standar.

* Untuk menyimpan stok media perlu diperhatikan suhu ruangan,lemari pendingin yg

sesuai dgn petunjuk suhu penyimpanannya.• Umumnya media atau reagent sangat higroskopis,shg

penutupan hrs benar.KESALAHAN AKIBAT PROSES PEMBUATAN :• Kualitas aquades yg jelek.• Wadah tidak steril.• Proses pembuatan terlalu panas.• Terlalu lama disimpan pd suhu 50 drjt C.• pH tidak sesuai.• Cara melarutkan tdk sempurna.• Kesalahan penyimpanan bahan baku media.

AKIBAT DARI KESALAHAN PEMBUATAN MEDIA :

• Terjadi kekeruhan/pengendapan.• Warna terlalu gelap(gosong).• Agar-agar terlalu lunak.• Pertumbuhan kuman yang jelek/tidak tumbuh

Media dpt digolongkan jadi 2 yaitu :

1. MEDIA HIDUP :• Digunakan di Lab Virologi, u/ membiak bbg.

Virus.• Di Lab. Bakteriologi hanya beberapa bakteri yg

di biak dlm media hidup(Rickettsia & Chlamydia).

• Contoh : Hewan peercobaan tmsk manusia, telur berembrio, biakan jaringan,& sel bakteri tertentu u/ pertumbuhan Bakteriophage.

2. MEDIA MATI :

• Banyak macamnya seperti :A. Media Padat :• Dibuat dgn cara menambah agar.• Bisa dibuat sebagai agar miring, deep dan

plate.• Dpt digunakan sbg media murni.• Dapat melihat morphologi koloni dari MO.

Contoh :Media ENDO AGAR :• Digunakan u/ mentukn (determinasi)bakteri

yg hdp ddlm usus(dlm feces),selalu ada Escherishia coli, baik pd org sehat dan sakit.

• Escherishia coli dlm media ini berwarna koloni merah,bakteri lain yg patogen warna mrhmda.

Media BUYLION AGAR:• Koloni dari tiap bakteri memiliki btk tetap,shg

dgn melihat btk bakteri sdh dpt menduga jenis bakteri yg sedang diselidiki.

Contoh :

• Koloni Vibrio cholerae,bening sep.ttes embun.• Koloni Staphylococcus dan Streptococcus

pyogenes, keruh seperti nanah/pus (koloni Staphylococcus lbh bsr dr Staphylococcus ).

• Koloni Vibrio cholerae ,permukaan dan tepi koloninya licin /Smooth colony(Type S).

• Koloni Corynebacterium diphteriae, permukaan dan tepi koloni bergerigi(Type R).

Media AGAR DARAH :• Dbuat dari media Buylion agar ditambah

darah yg tdk beku, steril sebanyak 10 %.• Penambahan darah u/ menyuburkan media.• Digunakan u/ menumbuhkan bakteri yg sulit

tmbh pd media biasa.• Ada 2 kelompok bakteri yg tumbuh disini yaitu

a) Bersifat HAEMOLYSIS : - Menghabiskan eritrosit,shg disekitar koloni

tmpk ada zona jernih sep : Streptococcus hemolyticus; Vibrio eltor,dll.

b) Bersifat HEMODIGESTI/HEMOGLOBINOPEPSI

• Bakteri mhslkn toxin,shg Hb keluar dari eritrosit, krn ada H2O2,mk warna berubah jd kehijauan,shg dsktr koloni tampak adanya zona kehijauan.sep. Vibrio cholerae; dll.

c) Media Mac CONKAY AGAR : • Khusus yg tumbuh disini hanya bakteri GRAM

NEGATIP.(media selektip).• Escherishia coli akan bwarna merah mengkilat.• Salmonella typhi,tdk berwarna/transparant.

B. Media SETENGAH PADAT :• Dibuat sama dengan media padat, yang

berbeda hanya komposisi agarnya, atau dikenal juga dgn media semi solid.

• Digunakan untuk mengamati gerak kuman secara mikroskopik.

C.Media CAIR/BROTH :AIR PEPTON :• Pepton adl hasil pemecahan protein.• Pepton akan diurai jd asam amino sbg sumber

energi membangun sitoplasma.

KALDU BUYLION :• Susunannya sama dgn air pepton, hanya air

diganti dgn kaldu.• Kaldu banyak mengandung proteiin dan

mineral yg dbutuhkan u/ khdpn bakteri.• 1kg daging tanpa lemak bisa dibuat 2 liter

kaldu.

PERBENIHAN GULA-GULA/BOUNTREY :• Berisi air pepton ditambah gula.• Gula yg digunakan ada 5 yaitu Glc, Lac, Mn, Mlt

& Sac + Indikator.• Bakteri yg menguraikan gula, akan selalu

mhslkn asam, dan dpt diamati dgn adanya indicator yg digunakan sbb:

INDIKATOR SUASANA BASA SUASANA ASAMPhenol red Merah KuningMethyl red Kuning MerahBrom cresol green Biru Kuning.

* Bakteri kdg mghslkn gas,maka ditambah tabung Durham terbalik,u/ melihat adanya gas.

• Sifat bakteri dlm menguraikan gula adl tetap,shg digunakan sbg salah satu cara identifikasi bakteri

• BAKTERI GLUCOSA LACTOSA MANITOL MALTOSA SACHAROSA• Salmonella typhi + - + + -• Salmonella paratyphi A +g - +g +g -• Vibrio cholerae + - + + +• Shigella shiga + - - - -

• Catatan : + = Dapat menguraikan• - = Tidak dapat menguraikan.• g = Menghasilkan Gas

Perbenihan Taroszi :

• Khusus u/ mnumbuhkan bakteri Anaerob sep: Clostridium tetani.

• Perbenihan ini kaldu hati dgn 5% gula.• Tujuan dgnkn kaldu hati u/ mdpt enzim

peroxidase.(ada dlm hati).u/bakt.anaerob.• U/ Anaerob ,maka permukaan ditutup parafin

liquid,dan t6bg ditutup dgn parafin solid.

MEDIA MENURUT KEGUNAANNYA :• Media Transport :Stuart, Amies, Carry&Blair,dl• Media Enrichment:Media penyubur u/ bakteri yg sulit

tumbuh dan selektip sep . Air Pepton Alkali, Broth darah/kaldu darah,dll

• Media Isolasi : Media yg digunakan u/ mengisolasi bakteri, sep. Agar Darah.

• Media Maintenance :media pemeliharaan sep. Buylion Agar, BHI Agar,dll.

• Media Karakteristik :media khusus u/ melihat jenis bakteri sep. Bountry/gula-gula.

• Media Screening :Selektip u/ Enterobacteriaceae ;sep. Media TSIA(Triple Sugar Iron Agar).

Penanaman dan Isolasi :• Kultur/penanaman MO, pertama dilakukan

dengan cara menanam dalam media broth ,baru kmd untuk mendapatkan biakan murni dilakukan dgn menginokulasi ke dalam media padat, menggunakan alat inokulasi yaitu ose dan jarum ent,pipet,dll.

• Inokulasi dilakukan secara aseptic didepan nyala api, dgn tujuan untuk menghindari terjadinya kontaminasi.

• Alat inokulasi ose dan jarum ent sebaiknya ,

Dibuat dari kawat nikrom atau platina, dgn mensterilkan ose dan jarum ent• Mulut tabung reaksi berisi isolat jg harus

dipanaskan didepan api (aseptic),baru kmd dpt digunakan u/ mengambil isolat/inokulum dan menginokulasikan dalam media padat, secara goresan.

• Kultur atau penanaman jg dpt menggunakan pipet, atau cara pengenceran.

• Biakan murni yg didapat akan dilanjutkan dengan uji Biokimia, yg mrpkn uji identifikasi.

Bbrp patogen memiliki kekhususan,yi membutuhkan media yg disuplementasi dgnPeptida, gula dan prekursor asam nukleat(ada

dlm darah dan serum).• Selain itu kondisi atmosfer jg hrs tersedia, sep.

u/ golongan aerob, anaeron dlsb, bahkan temperatur pengeraman (jamur 30 derajat C).

• Identifikasi dilakukan berdasarkan morphologi koloni pd media padat, Pewarnaan Gram, pewarnaan spora, serangkaian uji biokimia sederhana seperti katalase dan koagulase,

uji bountry : glukosa, Laktosa, Manitol, Maltosa Sacharosa, jg urease, Methyl Red, Simon Citrat,• Voges Proskauer,SIM (sulfur Indol methyl),dan

TSIA=Triple Sugar Iron Agar.• Setelah identifikasi sampai dengan species

selesai, maka koloni ditanam kembali dalam media Broth dgn kekeruhan tertentu, dgn inkubasi 4 jam 37 derajat C.u/ uji sensitivity.

• Inokulum ditanam dgn cara swab pd permkan agar Mueller Hinton secara merata, untuk melakukan uji sensitivity thd anti biotik.

* Media MHA yg sudah ditanami isolat, bubuhkan antibiotik disk diatas permukaannya.• Dieramkan 37 derajat C selama 24 jam, dan

keesokan diamati, adakah zona jernih disekitar disk antibiotik.

• Ukur zona jernih yg ada menggunakan kertas milimeter,catat hasilnya dan cocokan dgn buku pedoman, diameter tsb apakah Sensitive ,Intermediate atau Resisten. Bila tidak ada zona jernih, maka otomatis disk antibiotik tsb adl resisten.

Pemeriksaan Serologi-Imunologi :

• Infeksi dpt didiagnosis dgn mendeteksi respon imun terhadap patogen.

• Metode yg digunakan meliputi aglutinasi, fiksa si komplemen, netralisasi virus, dan EIA (Enzyme Immunoasssay).

• Diagnosis ditegakkan dgn mendeterksi peningkatan atau penurunan kadar antibodi pd specimen,yg diperoleh pd rentang waktu berselang lbh dr 1 mgg, atau dgn mendeteksi adanya IgM spesifik.

Contoh : Tehnik aglutinasi dpt dignkan u/ men- deteksi antigen kapsular bakteri pd LCS.Pemeriksaan Molekuler :Southern Blotting dan Hibridisasi Asam

Nukleat.• Suatu probe DNA berlabel akan berikatan dgn

specimen jika mengandung sekuen spesifik yg dicari.

• Probe yg terikat,akan terdeteksi melalui aktifitas label. Tehnik ini spesifik, cpt, kurang sensitif dibanding metode amplifikasi.

Metode Amplifikasi Asam Nukleat :• Metode ini dgnkn u/ mendiagnose infeksi.• Msg-msg mggnkan metode yg sdkt beda dlm

mengamplifikasi DNA atau RNA target patogen ,sampai duplikat ckp u/ terdeteksi.

• Contohnya dlm uji amplifikasi asam nekleat (NAAT), DNA patogen dipisah menjadi untai tunggal dan primernya didesain u/ terikat ke sekuen target, kmd polimerase mengkatalisis sintesis dari DNA baru. Hasil yg positip dpt di peroleh hanya dari 1 DNA target.

* Tehnik ini berguna u/mendiagnose MO, yg sulit ,lambat atau bahaya u/ dibiak, seperti :

• Mycobacterium tuberculosis dan Chlamydia trachomatis.

• Berbagai metode dignakan u/mendeteksi gen resistensi antibiotik , shg memberikan hasil kerentanan yg mewakili.(sep. mendeteksi mutasi gen u/ resistensi rifampisin pada Mycobacterium tuberculosa ).

S e l e s a i